CN110225982A - 冠状动脉疾病的血液rna生物标记 - Google Patents

Abstract

本发明公开了在患有冠状动脉疾病(CAD)的患者中下调的基因转录本的独特组。一些所述转录本与CAD患者中调节性T细胞(Treg)的下调有关。提供了用于检测患者血样中的CAD的方法。

Description

冠状动脉疾病的血液RNA生物标记

相关申请的交叉参考

本申请要求2016年9月1日提交的美国临时申请号62/382,668的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及在患者中诊断冠状动脉疾病(CAD)，所述方法包括分析从患者抽取的血液并确定指示CAD的一组生物标记的水平。

发明背景

每年有超过一百万次心脏病发作，并且每天有2,200名美国人死于心脏病，大约每39秒1例死亡。冠状动脉疾病(CAD)的外向症状是胸痛，典型地向下放射到左臂，并且在用力时呼吸短促(呼吸困难)。然而，仅胸痛和呼吸困难并不是特别具体的警示体征。在呈现胸痛的患者的前瞻性分析中，最终确定大多数病例为肌肉骨骼疾病(20％)、胃肠道反流病(GERD)(13％)，而在11％的病例中诊断为CAD，并且其余病例为肺部、神经***或特发性疾病。高龄、男性、胆固醇升高、吸烟和高血压等费雷明汉风险因素(Framingham riskfactor)是长期风险的极佳预测因子素(30年风险，C统计＝0.803)，但其在急性临床设定中在确定一个人是否患有CAD方面的准确性要差得多(C统计＝0.667，其中0.5是随机机会)。因此，迫切需要改进CAD的诊断。在每年＞100万例心脏导管***中，622,000例导致干预，例如支架置入。尽管存在明显的症状和表明CAD的其他临床测试(例如应激心电图)，但20-40％的血管造影片未检测到任何闭塞的动脉。美国心脏病学会的登记处覆盖了398,978名患者，鉴定了39.2％的血管造影片，其中小于20％狭窄。因此，CAD的血液检测将有可能避免每年多达400,000例无需导管***。先前已显示，血液的表达剖析能用于诊断哪些患者将在裸金属支架上重新闭塞，并且因此可能受益于药物洗脱支架。因此，将RNA剖析扩展到冠状动脉疾病本身的诊断是可行并且重要的。

使用微阵列的几项先前研究表明在与CAD相关的血液中存在RNA特征。然而，这些关于确切哪些转录本被调制的研究之间的一致性非常低。所述差异可能有几种解释，但可能是由高丰度信号(例如珠蛋白)产生的噪声引起的，所述高丰度信号能淹没微阵列中的真实信号，并且因此潜在地掩盖低幅度的真实变化。因此，采用更先进的单分子RNA测序(RNAseq)方法来帮助鉴定诊断转录本。使用全血RNA的RNAseq，鉴定与CAD相关的T调节性(Treg)细胞功能障碍的潜在作用一致的转录本的亚组。

发明概要

本发明利用了如下事实：高达40％的经历冠状导管***的患者实际上没有有意义的冠状阻塞。通过比较患有CAD的患者与无CAD的那些患者的mRNA表达模式，鉴定了与CAD相关的转录本(TRAC)。这个模型的优势在于能在导管***之前采集血液，并且血管造影术的结果在数小时内即已知，这为设计基于转录组的测试提供了理想的学习环境。冠状血管造影片经主治医师数字解释后，患者被分为3组，≤20％狭窄(低CAD)，＞20％但＜70％任何血管狭窄(中CAD)，以及≥70％任何动脉狭窄(CAD)。

临床参数：呈现皮肤非紧急、非ST段升高心肌梗塞(非STEMI)主诉胸痛、劳力性呼吸困难或表明CAD的其他症状的患者被同意参与IRB批准的协议下的本研究。基本上所有受试者都同意选择加入其血液、DNA/RNA和DNA/RNA序列数据的生物银行。接受心脏导管***的患者在镇静前通过静脉穿刺收集了3个Tempus血液RNA管(每个3ml)(ThermoFisherScientific，Grand Island，NY)。收集另外的管用于血浆(EDTA)和血沉棕黄层(CPT)。静脉穿刺后，这些研究纯粹是观察性的，并没有以任何方式改变临床治疗。捕获所有相关的临床数据(包括完全血液计数(CBC))用于与基因组研究进行比较。

在心脏导管***之前，由医学专业人员执行心脏医疗史以确定如公认指南所定义的CAD风险因素。高血压定义为血压≥140/90mmHg和/或用抗高血压药物治疗的病史。通过空腹血糖≥126mg/dl和/或使用胰岛素或口服降血糖药来定义糖尿病。根据国家胆固醇教育计划成人治疗小组III指南或通过用降脂药物治疗来定义血脂异常。通过在呈现后3个月内主动吸烟来定义的目前的吸烟状态。CAD的家族史定义为一级亲属中的M1或心脏死亡。

根据Min[(Min等，Am J Med，128(8)：871(2015)]描述的心绞痛的标准准则对胸痛进行分类。典型心绞痛包括在用力时胸骨下、颌和/或手臂疼痛，并且在休息和/或使用***后15分钟内消退。非典型心绞痛涉及这些特征中的2种。患有非心绞痛胸痛的患者经历这些症状中的1种或更少。无胸痛的呼吸困难患者被归类为患有典型心绞痛。

从这些临床参数中，根据Min等的方法对风险进行评分，其中将从年龄、性别、高血压、糖尿病、症状类型(典型/非典型胸痛)、家族史及吸烟状态累积的点与序数风险模型进行比较，以预测CAD的可能性。

转录组剖析：使用Tempus血液分离柱从冷冻的Tempus保存的血液中纯化RNA。在侵袭性溶液内DNA酶处理(Turbo^TM DNAse，ThermoFisher Scientific)后，2.5ml血液的典型RNA产量平均为约5μg，其中BioAnalyzer完整性评分＞8(10是最大值)。通过RiboZero(Ambion，ThermoFisher Scientific)将DNA酶处理的总RNA去除核糖体RNA(rRNA)，留下约500ng的rRNA耗尽的RNA。RNA测序：对于RNAseq，将100ng rRNA耗尽的RNA片段化并在Heliscope测序仪(SeqLL公司，Woburn，MA)上分析。然后使用Helisphere软件将原始读数(典型地38bp平均长度下4000万)与转录组或基因组进行计算比对。计数与每个转录本比对的读数的数量，从而在约77K已知的转录本同种型(HG19构建体)上产生数字基因表达(DGE)。然后通过转录本的大小调整原始读数计数，使得长转录本不会出现比短转录本更高的表达；并且通过每个试样的总读数的数量调整原始读数计数，以产生“每百万映射读数的每千碱基的转录本的读数”(RPKM)。因此，RPKM校正具有不同绝对读数的数量的试样之间的表达水平。尽管本实例是基于用于RNA测序和用于定量的ddPCR(BioRad，Hercules，CA)的SeqLL/Helicos单分子测序，但是用于确定RNA转录本的绝对和相对水平的其他方法(包括但不限于直接RNA测序方法、基于扩增的方法和杂交方法)是本领域普通技术人员所熟知的。将RPKM水平迁移至GeneSpring GX13(Agilent，Santa Clara，CA)，无需额外的标准化，以鉴定组间不同的转录本(TRAC)。

血液RNA保存/分离方法的比较：为了确定TRAC是否受所采用的血液RNA保存方法的类型的影响，同时从受试者中抽取3个Tempus管和3个Paxgene管(PreAnalytix GmbH，Hombrechtikon，Switzerland)，并且然后根据制造商的方案纯化RNA。如制造商所指示，将Paxgene管进行柱上DNA酶处理，而在分析前用TurboDNA酶处理Tempus RNA。使用iScriptRT试剂盒(RNAseH+)(BioRad)用随机六聚体逆转录由Nanodrop 260/280定量的等量RNA，并且然后用一组‘不变'PCR靶标(18S核糖体、β-肌动蛋白、GAPDH)，主要与淋巴细胞相关的靶标(SpiB、CD81、FoxP3)或主要与中性粒细胞相关的选择靶标(ALPL、DEFA1、IL8RB、IL8、NFkB、cMyc)进行分析。包含来自汇集的标准稀释液的cDNA并通过液滴数字PCR(ddPCR)在BioRad QX200实时***上使用EvaGreen荧光染料一式两份进行分析。如所指示，每个转录本的丰度是相对于这种试样的一个或多个“不变”转录本表示。

本生物标记在当前的医学实践中具有几个有用的申请。一些实施方案包括但不限于：

在一个实施方案中，本文公开的预测组和方法能替代或减少对优选实施方案中的冠状血管造影术的需要，或将评估RNA生物标记或其蛋白产品以确定具有CAD的一个或多个症状的患者可能需要通过冠状血管造影术进行干预测试的可能性。由于血管造影术需要轻度镇静、将导管引入冠状床以及注射造影剂，所以存在有限且已知的并发症风险，并且如果患者处于如通过本发明所确定的CAD的低风险下则可以避免可观的费用。

在一个实施方案中，本文公开的预测组和方法能指示冠状成像测试(例如磁共振(MR)血管造影术或计算机断层扫描(CT)血管造影术)的需要。在冠状成像仪器可用的情况下，此处描述的TRAC可用于预测诸如MR血管造影术或CT血管造影术等相对非侵入性测试是否合理。CT尽管侵入性比血管造影术小，但涉及对患者的一些辐射暴露。MR和CT血管造影术二者均可涉及使用可能具有不良后果的示踪剂化合物。此外，由于仪器的高成本，在美国和世界范围内的许多非城市地区不可用MR和CT。

在另一实施方案中，本文公开的预测组和方法能指示对医疗干预的需要。在优选实施方案中，TRAC生物标记在常规医疗护理下应用于受试者，并被认为具有升高的CAD风险，并且因此容易发生不利的事件，例如心脏病发作、中风和微动脉瘤。在这个实施方案中，具有一个或多个已知CAD风险因素(例如高血压、家族史、高龄和/或升高的胆固醇)的受试者将抽取血液用于TRAC测试并且结果用于确定对医疗干预的需要。早期CAD的常见药物干预包括使用他汀类药物以降低胆固醇，低剂量阿司匹林以减少血管炎症和血小板反应性，以及抗高血压药物，例如ACE抑制剂，利尿剂或β阻断剂。在一些情况下，通过饮食或药物更严格地控制血糖水平可能很重要。常见的生活方式改变包括减肥、戒烟、饮食改变、减轻压力和增加运动。

在另一实施方案中，TRAC生物标记的小组用于对其初级保健医生呈现的患者的常规身体检查。在这样的实施方案中，TRAC的小组可用于鉴定患有早期CAD的患者，但是不知道他们的疾病进展。事实上，几乎有一半来自CAD相关事件的死亡人员是显然不知道自己患有CAD的人员。一旦鉴定，患者的风险可以通过上述药物和生活方式干预来减轻。

在一个实施方案中，包含多个选自表1-8中列出的那些转录本的转录本的TRAC生物标记指示受试者具有增加的患有或发展冠状动脉疾病的可能性。

在优选实施方案中，TRAC生物标记是选自包括以下的组：AML1、CD3E、CD4、CD25、CTLA4、DGKA、DLG1、ETS1、FOXP3、ICOSLG、IL2RB、IL2RG、IL2RA、IKZF4/Eos、RUNX1、SMYD3、TCF3、TRIM28和ZAP70。

附图说明

图1是每个患者的RNA产量(Y轴)相对于全血中的淋巴细胞计数(X轴)的图。

图2是相对于所有转录本(浅灰色点)具有指示的差异表达的转录本(暗灰色点)的RNAseq线性的图。

图3是选择的Treg标记水平(Y轴)相对于3组中的每一组中的CAD水平(X轴)的图。

图4是CAD的临床与RNA预测因子的比较。图A(左上)显示了针对每一组绘制的CAD的常规临床预测因子，显示年龄(数十/10)、性别(男性％)、症状类型(典型/非典型)、糖尿病(％)、高血压(HTN，％)、CAD的家族史(％)以及当前的吸烟率(％)。基于Min等的方法计算每个患者的累积CAD风险评分，并且为了图形目的除以10。通过接收者操作特性(ROC)和混淆矩阵计算累积风险评分与CAD之间的关系，以评估方法的准确性(左下)。图B(右上)显示了7个RNA转录本作为其基因符号(即DGKA、DLG1等)的性能，由CAD组表示为RPKM。计算累积评分，将每个转录本表示为与整个组中其表达的平均值的比率，以防止高度表达的转录本被过度表示。出于图形目的，TRIM28和累积分数为/10。在右下图中，通过类似于每组中48名患者的临床模型的ROC分析累积TRAC评分(恒定TRAC，以产生阳性ROC)与血管造影证实的CAD之间的关系。

图5示出了RNA收集/稳定剂溶液对TRAC和不相关的转录本的表达的影响。通过两种不同的收集和稳定方法从相同的供体(n＝3)制备全血RNA。RNA通过PaxGene(其主要基于阳离子洗涤剂CPC)或Tempus(基于强变性剂胍)制备。使用SuperScript III逆转录相同量的DNA酶处理的RNA，并且然后使用液滴数字PCR(ddPCR，BioRad)定量扩增。所示的转录本的水平(Y轴)是Tempus与Paxgene中转录本丰度的比率(X轴)，其是基于从＞20K液滴(+sem)的泊松分布计算的绝对量。

具体实施方式

实施例

实施例1.来自中点分析和转录组比对的生物标记的描述。

临床参数：总共113名患者进入研究，其中1名患者由于未检测到的心脏衰竭排除准则而在同意后被排除。因此，112名患者可用于分析，并且RNAseq在96名患者身上成功完成。以下实施例分析了前48名患者的RNAseq结果，以及整个队列的整体临床参数，以确定RNAseq的时间和费用是否对其余的患者合理。

临床预测模型：累积的临床风险因素每个患者产生5至12分的范围。使用JROCFIT在临床风险预测与基于血管造影片的70％狭窄的CAD的真阳性之间计算接收者操作曲线(ROC)。对于所有112名患者，拟合的ROC曲线产生C＝0.663，其中准确度为60.7％，灵敏度为57.7％，特异性为61.6％，并且对于96个RNAseq+患者，产生X、Y、Z的类似值。这些值略低于这个模型的公布值(C＝0.71-0.77)，这可能是由于狭窄阈值的差异(那处为50％，此处为70％)，并且与Diamond-Forrester预测模型相当(C＝0.64)。

分析参数：每个患者和每组的RNA产量和读数数量没有***地变化。另外16名患者在RNA测序的各种技术质量控制步骤中失败，RNAseq在96名患者身上完成。大多数失败发生在3个关键步骤：来自RNA纯化或核糖体耗尽的低产量、低效的cDNA合成或来自RNAseq的低读数产量。由于核糖体耗尽期间的高损失(＞90％)，并不总是有足够的RNA来重复RNAseq过程。

RNA产量的变异来源。用Paxgene或Tempus RNA保存管收集的患者血样显示RNA产量的惊人大的变化，Tempus通常产生更高的产量。在目前Tempus保存的试样中，总核酸产量(在DNA酶处理之前)范围为(0.6-35μg/3ml全血，平均值＝10.6μg)。RNA产量与任何单个血细胞计数之间的相关性非常弱，与绝对淋巴细胞计数的相关性最强(r＝0.55，N＝112(R²＝0.31)(图1)。尽管一个离群值似乎推动了这种相关性，但其实际上对相关性影响很小(r＝0.45w/o)。这证实白细胞计数仅负责RNA产量变异的约30％，并表明患者之间的RNA的回收率可能存在重要的差异。

中点下TRAC的初始鉴定：如图2所示，RPKM中RNA水平超过25log₂数量级具有出色的线性定量能力，无需任何人工正规化数据。为了鉴定TRAC，患者被分为低CAD(＜20％狭窄)、中CAD(20-69％)和高CAD(＞70％)组。为了鉴定差异表达的转录本，比较了低与高CAD组，并且需要＞1.4倍的变化和t测试p＜0.05未校正，产生在图2中以深灰色突出显示的238个转录本。这种组合的倍数变化/t测试策略已经在使用加标试样作为鉴定真实差异的可靠方法的大型多中心对照研究中建立。表1中提供了238个转录本清单，其中相关转录本用本领域常见的几种不同描述符，尤其是由Santa Cruz的University of California维护的UCSC ID(即uc002rtm.2)以及由USNational Center for Biotechnology Information(NCBI)维护的RefSeq ID(即NM_001113494)以及共有基因符号和基因描述来识别。

分类算法：使用ANOVA，重新分析了所有3个组并鉴定84个差异表达的转录本(表2)。使用Genespring GX13软件，构建100％灵敏且特异的支持向量机(SVM)算法。应用于相同试样的留一交叉验证(LOOCV)发现所述模型在诊断CAD时准确度为87.5％(33.3％为随机的)。为了比较目的，使用CardioDx转录本(Elashoff等，2011)构建可比较的SVM，产生仅36.7％的准确度(CAD 37.5％，低45.1％，中10％，w/33％＝随机)。然而，CardioDx转录本的这个SVM并不包括其采用的算法。为了参考，按性别对48名患者进行分类，鉴定了34个主要来自X和Y染色体的转录本，并产生100％准确的SVM预测模型。

实施例2.来自96患者的RNAseq数据的转录组比对的RNA生物标记的描述。

使用Helicos(现在的SeqLL)平台对整个112名患者队列进行RNA测序。RNA纯化、核糖体RNA耗尽和RNA测序后，确定96名患者试样适于进一步分析。

发现和验证组。这96个试样被随机化为45名患者的‘发现组’和51名患者的‘验证集’组。

发现组。根据如在抽取血液进行RNAseq的同一天确定的CAD的程度将45名患者细分成组。所述组如上所述，并且由低(0-20％狭窄)、中(21-69％)和高(≥70％)构成。为了鉴定具有相对较高的置信度的相对较小组的生物标记，通过组合的T测试将低组与中+高组进行比较(p＜0.001未校正，最小倍数变化为1.5)，产生59个转录本(见表3)。

基于倍数变化和转录本的科学分析，仅构建了前5个变化转录本的较小清单。仅基于DISC组中的5个转录本构建的PLSD模型的准确度为84％(低为91％，中+为77％)(见表4)。

由于低组包括基本上0％狭窄的真正‘正常’和一些具有少量CAD的患者，对发现组进行了另一分析，其通过‘正常’(0％)与‘异常’(＞0％)重新排列患者并进行类似的T测试，从而产生500个转录本(见表5)。

用96名患者构建的整体预测模型。为了获得最强大的模型，将所有试样包括在内，并将其在发现/验证设计中分为低与中/高(中+)。每组产生48名患者。使用这种设计，首先过滤转录本以排除70％的试样中RPKM＜0.01的转录本，并且然后通过0.001的未校正p值下的低与中+患者的单向ANOV鉴别TRAC，从而产生198个转录本(见表6)。这198个转录本含有一些重复，其基本上覆盖相同的RNA转录本，从而产生169个非冗余的、独特的RNA转录本。

构建在这198个转录本上的PLSD模型在辨别时非常准确，显示总体准确度为98.9％(低为100％，高为97.9％)。即使经过N次内部验证，这仍然相当稳健，从而总体准确度为80％(低为77％，中+为83％)。

过滤用于更高水平表达。通过对两组中具有＞第20百分位水平的那些过滤198个转录本，清单缩小到比198个转录本具有相对较高绝对表达的96个转录本。然而，这并未提高构建在其上的PLSD模型的预测能力，总体准确度为93％(低为92％，中+为94％)，但仍然产生了相当强大的测试，并且转录本较少(见表7)。

鉴定一小组预测转录本。为了进一步缩小清单，使用LvM+准则比较整个队列中预测的198个转录本与DISC组中预测的转录本的重叠(表3，59个转录本)。这两个清单的共同点是用于为整个队列构建新模型的14个转录本。PLSD模型仍然强大，总体准确度为86％(低为87％，中+为85％)，LOOCV的总体准确度降至80％(见表8)。

鉴定预测转录本的最全面的清单。对于诊断和潜在的治疗用途，了解可能采用的最全面的转录本清单是有价值的。因此，通过将ANOVA严格性放宽至p＜0.005(针对在先前实施例中为0.001)，鉴定出1132个转录本的较大组(见表9)。

解释TRAC特征：中点和完全分析均显示几乎所有差异表达的转录本都在CAD患者中下调，这种模式在RNA表达分析中很少发生，其中增加的转录本与减少的转录本之间典型地存在平衡。此外，这些变化基本上都是相同的幅度(平均值＝约1.7倍)，而通常会预期幅度的范围。在对TRAC进行广泛分析之后，最可能的解释是TRAC是特定细胞类型的标记，并且具有发展中或现有CAD的人中的细胞类型大量减少。大量文献记载了两种相对选择性细胞类型可以在患有CAD的患者中大量改变。

TRAC作为被修饰的循环细胞群体的标记。获得转录本均匀减少的一种方法是，如果这些转录本优先与细胞亚组相关联，并且所述亚组在CAD患者中减少。在中点分析中鉴定的某些转录本(例如CCL28、CD2BP2、CD3E、CD5、CD81、KDM2B、LEF1和M1B2)先前已与各种干细胞和祖细胞群体相关联。CD81由于其在诱导的多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)中具有充分表征的作用而令人感兴趣。

有大量文献一致报道患有稳定CAD或临床前动脉粥样硬化的患者中循环祖细胞(CPC)群体的减少。高胆固醇血症、吸烟和肥胖与循环祖细胞水平降低相关。相反，急性MI病例中循环内皮祖细胞(EPC)增加。然而，罕见(＜1％)的EPC数量的减少不太可能导致全血中检测到的RNA水平的显著变化。相反，EPC减少和RNA谱可能是动脉粥样硬化中血液细胞组成的一些较大变化的两个方面。

TRAC作为Treg的推定标记：TRAC的第二种可能的解释是已知动脉粥样硬化中淋巴细胞的T调节性(Treg)亚组减少。大量文献记载了患有CAD的患者中Treg丰度降低，以及Treg与T效应(Teff)细胞的相对不平衡。为了测试Treg的潜在变化，检查了3个CAD组中已知Treg标记的调节。如图3所示，FoxP3和其他标记(例如CD4、CD25、ETS1和RUNX1 mRNA)表达水平显示表达从低、中到CAD逐步降低。相比之下，无关标记(例如***素E受体3(PTGER3))的表达未显示这种CAD相关趋势。

Treg不平衡足以产生观察到的RNA表达模式。为了确定血液中Treg细胞计数的减少是否在量级上足以产生观察到的RNA水平变化，研究了8篇报道正常和CAD患者(例如不稳定型心绞痛或急性冠状综合征(ACS))中的Treg％的公开，并计算了Treg％的变化。通过流式细胞术典型地定义为CD4+CD25+CD127低的Treg的平均减少为30.25％，假设这些标记基本上是Treg独特的，这将转化为Treg RNA水平的1.43倍差异。因此，共有FoxP3标记的mRNA的1.47倍减少与CAD中Treg细胞数量的报道的减少非常一致。

实施例3：生物标记通过它们与Treg样途径的关系来鉴别。

没有预先指定的特异于Treg成熟和分化过程的途径或基因本体。由Li和Rudensky以及其他人撰写的最近综述文章被改编以创建Treg信号传导的功能途径，以与观察到的RNA变化模式进行比较。在DGE和已知的Treg信号传导中观察到显著的重叠。

CAD的生物标记也可以通过它们与Treg途径的生物学关系来定义，因此我们鉴定了一系列与Treg分化具有已知关系并且随CAD状态***地变化的标记。这些标记包括FOXP3、CTLA4、ZAP70等(见表10)。

使用与Treg细胞的相对特异性相关的仅3个转录本(FoxP3、Runx1、IL2RA/CD25)、但未在其他TRAC列表中涵盖的基因列表，在96名患者队列上构建预测模型，其中48名受试者分类为低，并且48名分类为中或高(中+)。仅使用这3个转录本，PLSD模型显示60％的总体准确度(低为67％，中+为54％)。然而，在N次验证后，这使得总体准确度降至46％(低为47％，中+为44％)。这表明尽管TRAC可能与Treg数量或功能有关，但TRAC在预测CAD方面比已知的Treg细胞标记表现更好。

实施例4：先前的CAD预测模型。

其他已公布和获得专利的作品已经基于Affymetrix阵列技术和PaxGene血液RNA保存管鉴定了具有CAD预测值的转录本(美国专利号9,122,777和8,914,240，其内容通过引用并入)。使用PaxGene保存的血液的微阵列剖析的先前研究已导致一种基于血液RNA的诊断(CardioDx的Corus CAD)。尽管CardioDx测试(C＝0.745)在纯临床风险评估上略有改善(C＝0.732)，但目前的RNAseq测试证明显著更准确(C＝0.870)。此外，CardioDx的CorusCAD测试使用受试者的年龄和性别来计算他们的风险评分，而目前的TRAC方法仅基于基因表达水平。

为了更直接地比较这些方法，从那些专利和公开中鉴定了17个最佳匹配的转录本，而不知道当前数据集中的表达水平或预测值。那17个CardioDx标记的表达水平在我们的RNAseq数据集中的低和中+患者之间没有差异(见表11)。尽管如此，试图使用其构建分类模型，并且PLSD模型中的这17个转录本具有73％的总体准确度(低为75％，中+为71％)，但在N次验证中准确度降至63.5％，并且50％将是随机的机会。因此，尽管由于它们是根本上不同的方法而难以进行准确的头对头比较，但现有的TRAC生物标记在预测CAD方面比现有的RNA生物标记更好。

实施例5：一小组具有高预测能力的转录本。

基于中等大小的TRAC列表、特别是表6(198个转录本，169个独特的)，基于其在人类诊断中的适合性的特定准则选择较小组的转录本。这些准则涉及转录本与高表达水平的的Treg细胞的推定关联，以及与亲密基因家族成员的相对独立性。使用这些准则，选择7个转录本：DLG1、DGKA、ICOSLG、IKZF4/Eos、SMYD3、TCF3和TRIM28。这些转录本的水平从RNAseq数据中提取，表示为整个队列中所述转录本的平均表达的百分比(比率)，以最小化高表达的转录本的超重，并且然后添加7个TRAC的正规化水平以产生累积分数，如图4(右图)所示。基于这个单独TRAC评分，患者分为CAD或低CAD的分类高度准确(80.2％)，ROC面积(AUC，C-stat)为0.873。相比之下，单独使用临床预测因子(图4左图)，仅能达到54％的准确度(随机机会为50％)和0.636的C-stat(随机机会为0.500)。

实施例6：血液RNA稳定剂对TRAC检测的影响。

如所讨论的，其他发明描述了其与本发明的组完全不同的用于CAD的基因组。那些研究使用了称为PaxGene的血液RNA的防腐剂，其基于阳离子洗涤剂；而目前的研究采用Tempus防腐剂，其基于胍样变性剂。为了确定防腐剂是否对TRAC的检测有影响，将来自相同供体的血液吸入PaxGene或Tempus管中，按照制造商的说明制备RNA，然后在用iScript(BioRad)逆转录后，通过液滴数字PCR定量等量的RNA。图5中显示的结果清楚地指示，在Tempus防腐剂中检测到的测量的所有TRAC(7)比在Paxgene防腐剂中更佳1.5倍(TRIM28)至＞7倍(ICOSLG)的范围内。因此，RNA保存方法对于检测这些TRAC是重要的，并且使用不同的防腐剂可以解释结果之间的一些差异。

通过基于血液的测试的CAD的准确诊断在临床医学中提供了几个主要优点。首先，其避免了侵入性测试(例如心脏导管***)，以及允许更慎重地使用成像资源(例如CT和MR血管造影术)。其次，其能改善世界范围内农村地区CAD的诊断，在这些地区无法获得先进的成像方法。最后，生物标记小组内的个别生物标记既能用作治疗靶标，也能用作标记以监测新疗法或现有疗法(例如他汀类药物)的功效。例如，已显示Treg数量对他汀类药物疗法有反应，并且因此可能使用TRAC来监测疗法。

免疫***与动脉粥样硬化之间的联系是众所周知的。血液组分、尤其是单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和血小板在机理上有助于CAD的发展。目前的结果与CAD与Treg/Teff比率变化相关的广泛证据是一致的，Treg/Teff比率被认为与动脉粥样硬化进展在机理上相关。

目前的结果在机理上表明免疫***的变化可能与CAD的存在相关，这已经是多年的实质性调查，逐渐构建动脉粥样硬化中的脂质不平衡、炎症、微生物组变化和自身免疫之间的联系。表达.有大量且相当一致的文献证实患有CAD的患者中Treg/Teff比率的变化，并且观察到的那些细胞变化在方向和幅度上与mRNA表达的当前变化一致。他汀类药物的有益作用的一种解释是，除了降低LDL胆固醇外，他汀类药物还可通过调节TGF-β信号传导诱导FoxP3+Treg细胞。除了可重复的临床相关性之外，动脉粥样硬化小鼠模型中Treg水平的实验操作使潜在的因果关系更为可信。此外，已经表明免疫调节方法可以为动脉粥样硬化提供治疗潜能。推定他汀类药物对Treg数量的刺激作用可能有助于其抗动脉粥样硬化作用，这一作用尚未见报道用于PCSK9抑制剂。

通过各种自身免疫疾病中动脉粥样硬化的众所周知的发生率，可以看出Treg功能障碍与动脉粥样硬化之间的另外的关系，但在全身性红斑狼疮(SLE)的病例中最显著。尽管Treg与SLE之间的关系很复杂，但人们普遍认为缺乏Treg数量和/或功能是SLE的一个因素，因此，也可能是SLE相关动脉粥样硬化的组分。同样，与Treg不平衡相关的牛皮癣和牛皮癣关节炎与动脉粥样硬化具有充分确立的关联。免疫介导的移植动脉硬化中明显的因果关系进一步加强了免疫-CAD的联系。

潜在地，免疫-CAD联系的最有力证据来自雷帕霉素和作为抗生素/免疫抑制剂的相关化合物的已证实的阻止再狭窄的功效。已知雷帕霉素在临床相关水平上增加Treg数量和功能。

许多TRAC与Treg功能具有已知关系。最重要的是，叉头盒转录因子FoxP3被认为是Treg亚组的确定标记，并且被认为转录调节参与Treg功能的一组转录本。FoxP3本身通过启动子去甲基化进行表观遗传控制以允许Treg中稳定表达，并进而通过已知的启动子结合位点调节Treg特异性转录。其他研究指示，二酰基甘油激酶的两种同种型(DGKA、DGKZ)参与T细胞无反应，并且DGKZ通过c-rel调节NFkB信号传导参与天然Treg的产生。已知FoxP3转录因子与Ets转录因子相互作用，并且先前对主动脉瘤转录本剖析的工作表明，这种动脉粥样硬化病况与主动脉组织中Ets转录因子依赖性信号传导的协调变化相关。Zap70，即ζ链相关蛋白，在TCR接合期间优先在Treg细胞中磷酸化。

尽管目前未知Treg不平衡的根本原因，但是越来越多的证据表明微生物组的变化可以改变释放到循环中的短链脂肪酸的类型，从而调节GI和循环Treg分化。

除了构成诊断测试之外，TRAC也可能有助于阐明CAD的一些潜在组分，并且可能有助于阐明治疗的新靶标，特别是通过调节Treg/Teff比率。通过高通量筛选，可以快速评估数十种刺激Treg生成的FDA化合物。

这里鉴定的转录本谱可以适于在症状个体中创建CAD的筛选测试，其中早期检测将允许风险修改和药物、疗法。使用微阵列，我们使用类似的血液RNA方法来产生对其他心血管疾病起源的新见解，例如阿霉素心脏毒性和阿司匹林抗性(AR)，并且创新观察到AR可能是由于自身免疫抗血小板综合征。

本研究存在某些局限性：1)混淆变量：TRAC特征可能与组之间不同的风险因素或药物治疗有关。然而，基于所收集的临床变量，我们无法鉴定出差异足以产生这种作用的共病条件或处方药使用，但难以将其完全排除。2)特异性：TRAC可能检测到任何动脉中的疾病，但即使测试检测到其他动脉中的动脉粥样硬化，其仍然具有巨大的诊断价值。胸痛和血液中阳性TRAC谱的组合将有力证明应保证导管***或其他后续诊断。同样，腿部麻木结合阳性TRAC测试将足以证明外周血管超声的合理性。心电图组观察到其对CAD的预测因子也预测了主动脉粥样硬化，这表明血液标记可能是动脉粥样硬化的一般预测因子。先前的工作表明，动脉粥样硬化的位置有效地是与给定患者中的特定风险因素相关的内表型，可以推测其可能与特定血管床中普遍存在的特定自身抗原有关。

Claims (47)

1.一种用于确定患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加的方法，所述方法包括：

从受试者获得血样；

从所述血样萃取RNA；

量化至少一部分所述萃取的RNA中的RNA水平；

计算所述萃取的RNA中的多个RNA转录本的表达水平；

比较所述多个TRAC RNA转录本的所述表达水平与相同RNA转录本的对照表达水平；以及

确定所述萃取的RNA中的所述多个TRAC RNA转录本的所述表达水平是否共同地显著不同于所述相同RNA转录本的所述对照表达水平，其中表达水平的显著差异指示所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述血样包括全血。

3.如权利要求1所述的方法，其还包括在量化所述至少一部分所述萃取的RNA之前从所述萃取的RNA耗尽核糖体RNA。

4.如权利要求3所述的方法，其中从所述萃取的RNA耗尽核糖体RNA包括用对核糖体RNA特异的探针处理所述萃取的RNA。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述多个RNA转录本包括FOXP3、CD4、CD25、ETS1和RUNX1，并且其中当表达水平存在显著差异时，FOXP3、CD4、CD25、ETS1和RUNX1中每一者的表达水平下调。

6.如权利要求5所述的方法，其中当表达水平存在显著差异时，FOXP3、CD4、CD25、ETS1和RUNX1中每一者的所述表达水平下调1.5倍与2倍之间。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述多个RNA转录本包括DGKA、DLG1、ICOSLG、IKZF4/Eos、SMYD3、TCF3和TRIM28，并且其中当表达水平存在显著差异时，DGK、DLG1、ICOSLG、IKZF4/Eos、SMYD3、TCF3和TRIM28中每一者的表达水平下调。

8.如权利要求7所述的方法，其中当表达水平存在显著差异时，DGKA、DLG1、ICOSLG、IKZF4/Eos、SMYD3、TCF3和TRIM28中每一者的所述表达水平下调1.5倍与2倍之间。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人类。

10.如权利要求1所述的方法，其还包括在从所述受试者获得所述血样之前，选择已经被鉴定为具有冠状动脉疾病的一个或多个风险因素的受试者。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述风险因素是选自由以下组成的组：高血压、高龄、胆固醇升高和冠状动脉疾病家族史。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述方法鉴定阳性预测值大于80％的冠状动脉疾病。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法鉴定阳性预测值大于90％的冠状动脉疾病。

14.如权利要求1所述的方法，其还包括基于所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加的决定，用他汀类药物、阿司匹林、ACE抑制剂、利尿剂、葡萄糖控制药剂或β阻断剂中的一者或多者治疗所述受试者。

15.如权利要求1所述的方法，其还包括基于所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加的决定，对所述受试者进行冠状血管造影术。

16.如权利要求1所述的方法，其中基于无冠状动脉疾病的个体的经验表达水平数据确定所述对照表达水平。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述无冠状动脉疾病的个体已通过冠状导管***血管造影术被鉴定为无冠状动脉疾病。

18.一种用于确定患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加的方法，所述方法包括：

获得已从受试者的血样萃取的RNA；确定所述萃取的RNA中多个生物标记的表达水平；比较所述萃取的RNA中所述多个生物标记的表达水平与对照中的相同生物标记的表达水平；以及

确定所述萃取的RNA中所述多个生物标记的所述表达水平是否共同地显著不同于所述对照中所述相同生物标记的所述表达水平；

其中至少20％的所述多个生物标记是选自由以下组成的组：AML1、CD4、CD3E、CD25、CTLA4、DGKA、DLG1、ETS1、FOXP3、ICOSLG、IKZF4/Eos、IL2RA、IL2RB、IL2RG、SMYD3、RUNX1、TCF3、TRIM28和ZAP70。

19.如权利要求18所述的方法，其还包括如果所述多个生物标记的所述表达水平显著不同于所述对照中所述相同生物标记的所述表达水平，则进行冠状导管***血管造影术。

20.如权利要求18所述的方法，其中80％以上的所述生物标记个别地、差异性地下调1.5倍以上。

21.如权利要求18所述的方法，其中所述方法鉴定阳性预测值大于90％的冠状动脉疾病。

22.如权利要求18所述的方法，其还包括基于所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加的决定，用他汀类药物、阿司匹林、ACE抑制剂、利尿剂或β阻断剂中的一者或多者治疗所述受试者。

23.如权利要求18所述的方法，其中所述受试者是人类。

24.一种分析受试者的RNA试样的方法，所述方法包括：确定所述RNA试样中多个生物标记的表达水平，其中所述多个生物标记包括患有冠状动脉疾病的个体中的表达水平不同于无冠状动脉疾病的个体中的表达水平的生物标记；

其中所述多个生物标记的所述表现水平与对照的比较指示，所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述RNA试样是已从全血分离的RNA试样。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述对照是包括无冠状动脉疾病的个体中所述多个生物标记的表达水平的数据库。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括表8中列出的转录本。

28.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括表7的转录本。

29.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括表6的转录本。

30.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括表5的转录本。

31.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括表4的转录本。

32.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括表3的转录本。

33.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括表2的转录本。

34.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括表61的转录本。

35.如权利要求24所述的方法，其中所述多个生物标记包括至少50％、60％、70％、80％、90％和/或95％的表3-10中列出的所述生物标记中的任一者的所述转录本。

36.如权利要求24所述的方法，其中当确定所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加时，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和/或95％的所述多个生物标记下调至少1.5倍。

37.如权利要求24所述的方法，其中至少50％、60％、70％、80％、90％和/或95％的所述多个生物标记是选自表3-10中列出的所述生物标记中的任一者。

38.一种治疗已被鉴定为具有冠状动脉疾病的一个或多个风险因素的受试者的方法，所述方法包括：

使用如权利要求24所述的方法分析RNA试样；以及

基于所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加的决定，对所述受试者施用药物或对所述受试者执行医疗程序。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述风险因素是选自由以下组成的组：高血压、高龄、胆固醇升高和冠状动脉疾病家族史。

40.一种用于确定患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加的方法，所述方法包括：

从受试者获得血样；

从所述血样萃取蛋白质；

量化至少一部分所述萃取的蛋白质中的蛋白质水平；

计算所述萃取的蛋白质中多种蛋白质的浓度；

比较所述多种蛋白质的表达水平与相同蛋白质的对照水平；以及

确定所述萃取的蛋白质试样中所述多种蛋白质的所述水平是否共同地显著不同于所述相同蛋白质的所述对照水平，其中蛋白质水平的显著差异指示所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述多种蛋白质包括AML1、CD4、CD3E、CD25、CTLA4、DGKA、DLG1、ETS1、FOXP3、ICOSLG、IKZF4/Eos、IL2RA、IL2RB、IL2RG、SMYD3、RUNX1、TCF3、TRIM28和ZAP70。

42.一种分析受试者的蛋白质试样的方法，所述方法包括：确定所述蛋白质试样中多个生物标记的表达水平，其中所述多个生物标记包括患有冠状动脉疾病的个体中的表达水平不同于无冠状动脉疾病的个体中的表达水平的生物标记；

其中所述多个生物标记的所述表现水平与对照的比较指示，所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述多个生物标记包括至少50％、60％、70％、80％、90％、和/或95％的由表3-10中列出的生物标记中的任一者编码的蛋白质。

44.如权利要求42所述的方法，其中当确定所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加时，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和/或95％的所述多个生物标记下调至少1.5倍。

45.如权利要求42所述的方法，其中至少50％、60％、70％、80％、90％和/或95％的所述多个生物标记是选自表3-10中列出的所述生物标记中的任一者。

46.一种治疗已被鉴定为具有冠状动脉疾病的一个或多个风险因素的受试者的方法，所述方法包括：

使用如权利要求42所述的方法分析蛋白质试样；以及

基于所述受试者患有或发展冠状动脉疾病的可能性增加的决定，对所述受试者施用药物或对所述受试者执行医疗程序。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述风险因素是选自由以下组成的组：高血压、高龄、胆固醇升高和冠状动脉疾病家族史。