CN110220994B

CN110220994B - 一种同位素稀释质谱法测定血清miR-224含量的方法

Info

Publication number: CN110220994B
Application number: CN201910599052.8A
Authority: CN
Inventors: 王峰; 季伙燕; 吴安琪; 李袆; 鞠少卿; 王建新; 沈蕾
Original assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Current assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2039-07-04
Also published as: AU2020100444A4; CN110220994A

Abstract

本发明公开了一种同位素稀释质谱法测定血清miR‑224含量的方法，包括如下步骤：(1)合成miR‑224核酸单链并配成溶液，建立标准曲线；(2)合成核酸肽探针并配成溶液，用以捕获miR‑224；(3)合成同位素标记的多肽并配成溶液作为内标；(4)在血清样本中提取miRNA；(5)将提取出的miRNA生物素化；(6)将上述miRNA与链霉素琼脂糖球反应，形成miRNA‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物；(7)加入核酸肽探针捕获miR‑224‑生物素‑链霉亲和素琼脂糖球复合物；(8)将上述复合物清洗干净后加入胰蛋白酶酶解，然后将酶解产物固相萃取，将萃取出的多肽吹干并复溶；(9)将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析；(10)计算血清样本中miR‑224含量。本发明准确度高，结果可靠。

Description

一种同位素稀释质谱法测定血清miR-224含量的方法

技术领域

本发明涉及一种测定血清miR-224含量的方法，尤其涉及一种同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法。

背景技术

研究表明，miR-224是肿瘤相关的一个miRNA分子，在多种恶性肿瘤组织(如胃癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌)中呈现高表达。目前，miR-224的定量检测方法分间接法和直接法，其中间接法包括聚合酶链反应法、荧光共振能量转移法、基因芯片法、电化学催化法、下一代测序法、电化学法等。直接法包括双重特异性核酸酶辅助光谱检测法、微分干涉对比显微镜成像法、毛细管电泳法等。间接法通常需要首先对miR-224进行扩增或用化学试剂和酶进行修饰，然后进行凝胶成像或荧光素标记，需要耗费大量的时间和人力成本，而且结果易受各种因素的影响。上述miR-224直接法虽然一定程度上解决了间接法缺陷，但定量结果准确性较差。

同位素稀释质谱法是一种新的miR-224直接定量检测法，是目前公认的化合物准确定量的权威方法。该法利用质谱测定加入了同位素标记的待测物样品中标记与非标记待测物峰面积或峰高比值来推算待测物在样品中浓度。该法特异性高、灵敏度高、定量结果准确可靠、具有较宽的动态测量范围且定量结果具有较高的溯源性等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种安全可靠的miR-224含量测定的方法，本发明方法可以对血清样品中miR-224含量直接进行测定。

一种同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，包括如下步骤：

(1)将合成的miR-224核酸单链配成溶液，用于建立标准曲线；

(2)合成核酸肽探针配成溶液，用以捕获miR-224；

(3)将合成的同位素标记多肽并配成溶液作为内标；

(4)在血清样本中提取miRNA；

(5)将提取出来的miRNA进行生物素化；

(6)将上述生物素化的miRNA与链霉素琼脂糖球反应，形成miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

(7)加入核酸肽探针捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

(8)将核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物清洗干净后加入胰蛋白酶进行酶解，然后将酶解产物进行固相萃取，将萃取出的多肽吹干并复溶；

(9)将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析；

(10)计算血清样品中miR-224含量。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(1)具体包括如下步骤：miR-224核酸单链合成量为4OD值，每管1OD值分装，在每管中准确加入250μLDEPC水，配制成浓度为20μmol/L的miR-224溶液并分装至1.5mL离心管中，每管分装50μL，然后在各管中加入950μL超纯水稀释至浓度为1μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装20μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在miR-224贮存液中加入DEPC水稀释成系列浓度用于建立标准曲线。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(2)具体包括如下步骤：核酸肽探针序列为5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’-PEG2-GDRALFVGEPNR，其中5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’(即SEQ ID NO:1)为探针核酸部分，与miR-224序列5’-UCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUAG-3’(即SEQ ID NO:2)互补配对；GDRALFVGEPNR为探针肽部分，其特征是非人类任何蛋白胰酶水解后的特异性肽段，包含胰酶水解位点精氨酸R；PEG2(聚乙二醇)连接核酸与肽；核酸肽探针合成量为20nmol，准确加入1mL超纯水，配制成浓度为20μmol/L的核酸肽探针溶液，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至浓度为2μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装50μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在核酸肽探针贮存液中加入1950μL超纯水稀释至0.05μmol/L，得到核酸肽探针工作液，现用现配。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(3)具体包括如下步骤：将合成的1mg同位素标记的多肽GDRA[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR(¹³C和¹⁵N双标亮氨酸L)首先用300μL乙腈超声溶解，然后加入700μL超纯水配制成浓度约为1mg/mL的同位素标记多肽贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至约为0.1mg/mL并分装至并1.5mL离心管中，每管分装10μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在浓度约为0.1mg/mL的同位素标记多肽溶液中加入990μL超纯水稀释至约为1mg/L，得到作为内标的同位素标记多肽工作液，现用现配，在定量中作为内标。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(4)为使用miRNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取血清样本中miR-224，具体包括如下步骤：

①用加样枪吸取0.25ml血清并加入0.75ml裂解液MRL，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中残余细胞；

②将上述样品剧烈震荡混匀，并在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解；

③加入0.15mL氯仿，盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟；

④于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中；水相层的容量大约为所加MRL体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作；

⑤加入0.6倍体积70％乙醇，颠倒混匀，并将得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)；

⑥10,000rpm离心45秒，收集下滤液(下滤液中含有miRNA)，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，颠倒几次混匀，将混合液倒入到吸附柱RB中(吸附柱RB容量约为700μL，所以要分几次离心加入同一吸附柱)，10,000rpm离心30秒弃掉废液；

⑦加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；

⑧加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；

⑨将吸附柱RB放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

⑩取出吸附柱RB，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-80μl RNase free water(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集得到纯净miRNA保存于-20℃或者更低备用。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(5)为使用Pierce^TM RNA 3’End Biotinylation Kit试剂盒对血清样品中提取出的miR-224进行生物素化，具体包括如下步骤：①冰上溶解试剂盒中所有成分(除30％PEG和DMSO)，室温溶解DMSO，将30％PEG在37℃孵育5-10min，直到变为液体；

②调节加热器到85℃，转移5μLNon-labeled RNA control和血清miRNA到微量离心管中；在85℃加热3-5min，然后立即放在冰上；

③进行标记反应，见表1：

表1准备RNA连接反应

注：连接反应需要过夜以提高连接效率。

④加70μL核酸free水；

⑤加100μL氯仿提取RNA连接酶；漩涡一下，在微量离心管中高速离心2-3min使各相分离；仔细吸取上面的水相并转移到核酸-free的管子中；

⑥加10μL 5M NaCl，1μL glycogen(糖原)和300μL冰冷的100％乙醇，在-20℃沉淀大于1h；

⑦大于13000g4℃离心15min，仔细移出上清，不要碰到沉淀物；

⑧用300μL冰冷的70％乙醇洗沉淀物，仔细移除酒精，晾干沉淀物(5min)；

⑨用冰冷的70％乙醇洗沉淀物，仔细移除酒精，晾干沉淀物(5min)；

⑩用20μL核酸free水重悬沉淀物即得生物素化miRNA(包含miR-224)。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(6)具体包括如下步骤：链霉素琼脂糖球首先与tRNA和BSA反应(每100uL琼脂糖球与10μL tRNA(10mg/mL)和10μL BSA(10mg/mL)反应)，然后将上述20μL生物素化miRNA与20μL经处理过的链霉素琼脂糖球反应，置于37℃摇匀2h，形成miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物(包含miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物)。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(7)具体包括如下步骤：在上述miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物中加入100μL核酸肽探针溶液(0.05μmol/L)和25μL缓冲液(10mM Tris，100mM KCl，1mM MgCl₂，pH 7.4)，置于杂交仪中杂交，65℃16h，以捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物，形成核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物。然后用PBS清洗复合物并离心，去除上清，反复多次，尽量将未结合的核酸肽探针去除，获得纯净核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(8)具体包括如下步骤：

①1mL超纯水重新溶解上述核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

②入10μL同位素标记多肽溶液(1mg/L)；

③入10μL胰酶(0.04μg/μL)，置于37℃酶解4h；由于胰酶可特异性水解精氨酸R与其它氨基酸羟基所形成的肽键，因此胰酶可将上述复合物水解成5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’-PEG2-GDR和ALFVGEPNR，将同位素标记多肽水解成GDR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；

④将酶解产物用

MAX cartridges(60mg,3mL)固相萃取柱进行纯化富集ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；

MAX cartridges固相萃取柱首先用3mL甲醇和3mL超纯水分别活化和平衡柱子，然后加入酶解产物，再用2mL超纯水清洗柱子，最后用1mL含0.2％甲酸的乙腈溶液萃取ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；

⑤将上述萃取物用氮气吹干；

⑥吹干后加入250μL 0.1％甲酸水溶液复溶ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR多肽混合物。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(9)具体包括如下步骤：采用岛津Nexera X2高效液相色谱***和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪，使用SymmetryShield^TM RP18(2.1×150mm,3.5μm)色谱柱在40℃条件下进行色谱分离。流动相为：A：含0.1％甲酸的水溶液；B：含0.1％甲酸的乙腈溶液；流速为0.2mL/min；进样量10μL；按照如下的梯度进行洗脱：B 5％(0-0.1min)→B 35％(0.1-6min)→B 80％(6-6.1min)→B 80％(6.1-8min)→B 5％(8-8.1min)→B 5％(8.1-12min)。选用正离子多反应监测(MRM)模式，监测ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR两条多肽的信号强度。质谱***的离子源为电喷雾电离源(ESI)，喷雾电压5500V；雾化压力(Nebulizer pressure)55psi；雾化温度550℃；雾化气流10L/min；Q1和Q3质量选择器均设定在单位质量分辨率；用于定量分析的离子分别为m/z 501.0→571.5(ALFVGEPNR)和m/z 505.5→572.2(A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR)；碰撞能量CE分别为25eV(ALFVGEPNR)和23eV(A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR)；去簇电压DP为130V；所有数据均通过AB Sciex MultiQuant工作站软件(3.0.2版)采集和处理。

本发明所述同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其中，所述步骤(10)具体包括如下步骤：

①立标准曲线，用DEPC水将浓度为1μmol/L的miR-224贮存液稀释成以下系列浓度：1000nmol/L、800nmol/L、500nmol/L、300nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、80nmol/L、60nmol/L、40nmol/L、20nmol/L、10nmol/L和5nmol/L，然后按步骤(5)～(9)具体步骤进行操作，采用岛津Nexera X2高效液相色谱和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪对萃取多肽产物ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR的峰面积进行测定，以miR-224浓度为横坐标(x)、上述两条多肽峰面积比(y)为纵坐标建立标准曲线，曲线方程为y＝0.0103x+0.2147(R²＝0.995)；

②收集血清样本，按步骤(4)～(9)具体步骤进行操作，采用岛津Nexera X2高效液相色谱和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪对萃取多肽产物ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR的峰面积进行测定，将二者峰面积比代入上述曲线方程，即可计算得血清样品种miR-224含量。

有益效果

与现有技术相比，本发明方法的优点如下：

本发明方法采用同位素稀释质谱基准技术对血清样品中的miR-224直接进行定量，不仅检测限低，且定量结果准确可靠；在测定过程中不需要对miR-224进行扩增，避免了扩增效率的影响；岛津Nexera X2高效液相色谱***和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪可容纳大约100个样本同时检测，分析速度和分析通量显著优于普通方法。

附图说明

图1本发明中浓度为0.5μmol/L的核酸肽探针5’-CTAAACGGAACCACTA

GTGACTTGA-3’-PEG2-GDRALFVGEPNR和浓度为1mg/L的同位素标记多肽GDRA[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR经胰酶酶解后典型UHPLC-MS/MS色谱图；

图2 miR-224标准曲线图；

图3质控样品典型UHPLC-MS/MS色谱图；

图4经核酸肽探针捕获的血清样品miR-224和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR经胰酶酶解后典型UHPLC-MS/MS色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

仪器与试剂：

AB Sciex 5500三重四级杆质谱仪(美国，Applied Biosystem公司)配有电喷雾离子源；岛津Nexera X2超高效液相色谱仪(日本，岛津公司)配有二元高压泵、自动进样器、柱温箱；ABN2ZA氮气发生器(美国，PEAK公司)；SymmetryShield^TM RP18色谱柱(2.1×150mm,3.5μm)(美国，Waters公司)Allegra^TM 64R Centrifuge台式高速冷冻离心机(美国，BECKMANCOULTER公司)；Eppendorf移液器(德国，Eppendorf公司)；G560E涡旋混合器(美国，Scientific Industries公司)；N2Evaporation System NV-15G氮吹仪(德国，AgelaTechnologies公司)；杂交仪(中国，无锡沃信仪器制造有限公司)；DKB-501S恒温水浴箱(中国，上海精宏实验设备有限公司)；CSB-10BT超声波清洗器(中国，杭州艾普仪器设备有限公司)；Milli-Q超纯水仪(德国，默克密理博公司)。

色谱纯甲醇和乙腈购自J.T.Baker公司(美国)；NH₄HCO₃和甲酸(FA)购自Fluke公司(美国)；碘乙酰胺(IAM)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素、PBS购自Sigma-Aldrich公司(美国)；

MAX cartridges(60mg,3mL)固相萃取柱购自Waters公司(美国)；序列修饰级胰酶购自Promega公司(美国)；超纯水由本实验室Milli-Q超纯水仪制备；Pierce^TM RNA 3’EndBiotinylation Kit购自Thermo Fisher Scientific公司(美国)；Streptavidin agarose购自Life Technologies公司(美国)；RNase-free BSA、Yeast tRNA购自Ambion公司(美国)；核酸肽探针由杭州泰禾生物技术有限公司合成(中国)；同位素标记多肽由上海强耀生物科技有限公司合成(中国)；miR-224核酸单链由上海生工生物工程有限公司合成(中国)；方法学研究实验的血清样本来自于南通大学附属医院医学检验中心血清样本。

本实施例的一种测定血清中miR-224的同位素稀释超高效液相色谱质谱联用方法，包括以下步骤：

(1)miR-224核酸单链溶液、核酸肽探针溶液和同位素标记多肽内标溶液配制：

miR-224核酸单链每管为1OD值，用移液器准确加入250μL DEPC水，配制成浓度为20μmol/L的miR-224溶液并分装至1.5mL离心管中，每管分装50μL，然后在各管中加入950μL超纯水稀释至浓度为1μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装20μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；

核酸肽探针合成量为20nmol，用移液器准确加入1mL超纯水，配制成浓度为20μmol/L的核酸肽探针溶液，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至浓度为2μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装50μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；

同位素标记多肽GDRA[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR合成量为1mg，首先用300μL乙腈超声溶解，然后加入700μL超纯水配制成浓度约为1mg/mL的同位素标记多肽贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至约为0.1mg/mL并分装至并1.5mL离心管中，每管分装10μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；

用DEPC水将浓度为1μmol/L的miR-224贮存液稀释成以下系列浓度：1000nmol/L、800nmol/L、500nmol/L、300nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、80nmol/L、60nmol/L、40nmol/L、20nmol/L、10nmol/L和5nmol/L；

使用超纯水将核酸肽探针贮存液稀释至0.05μmol/L作为核酸肽探针工作液；使用超纯水将同位素标记多肽贮存液稀释至约为1mg/L作为同位素标记内标多肽工作液；

(2)建立miR-224标准曲线：

分别精密吸取各浓度miR-224溶液5μL，按照Pierce^TM RNA 3’End BiotinylationKit试剂盒说明书操作步骤对其进行生物素化，具体包括如下步骤：

①冰上溶解试剂盒中所有成分(除30％PEG和DMSO)，室温溶解DMSO，将30％PEG在37℃孵育5-10min，直到变为液体；

③进行标记反应，见表1：

④加70μL核酸free水；

⑦大于13000g4℃离心15min，仔细移出上清，不要碰到沉淀物；

表1准备RNA连接反应

注：连接反应需要过夜以提高连接效率。

将20μL生物素化的miRNA与20μL经处理过的链霉素琼脂糖球反应，置于37℃摇匀2h，形成miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物(包含miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物)。在上述miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物中加入100μL核酸肽探针溶液和25μL缓冲液，置于杂交仪中杂交，65℃16h，以捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物，形成核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物，然后用PBS清洗复合物并离心，去除上清，反复多次，尽量将未结合的核酸肽探针去除，获得纯净核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物。用1mL超纯水复溶上述核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物，加入10μL同位素标记多肽溶液，加入10μL胰酶(0.04μg/μL)，置于37℃恒温水浴箱中酶解4h。将酶解产物用

MAX cartridges(60mg，3mL)固相萃取柱进行纯化富集ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；

MAXcartridges固相萃取柱首先用3mL甲醇和3mL超纯水分别活化和平衡柱子，然后加入酶解产物，再用2mL超纯水清洗柱子，最后用1mL含0.2％甲酸的乙腈溶液萃取ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；将上述萃取物用氮气吹干；吹干后加入250μL 0.1％甲酸水溶液复溶ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR多肽混合物。

在相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，将体积10μL的一系列具有不同已知浓度的复溶后多肽和同位素标记多肽样品分别注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得一系列具有不同已知浓度的miR-224标准曲线工作液的色谱图；

以复溶后多肽ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR色谱峰峰面积的比值为纵坐标，以相应miR-224标准曲线工作液的浓度为横坐标，建立miR-224标准曲线；

色谱条件：

色谱柱：SymmetryShield^TM RP18(2.1×150mm,3.5μm)色谱柱；流动相：A：含0.1％甲酸(体积浓度)的水溶液；B：含0.1％甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱，洗脱程序：B 5％(0-0.1min)→B 35％(0.1-6min)→B 80％(6-6.1min)→B 80％(6.1-8min)→B 5％(8-8.1min)→B 5％(8.1-12min)；流速：0.2mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：正离子模式；毛细管/喷雾电压：5500V；离子源雾化温度：550℃；雾化气流：10L/min；离子源雾化压力(Nebulizer pressure)：55psi；离子源加热辅助气：60psi；气帘气：30psi；碰撞气：4psi；气体均为氮气；扫描模式：多反应监测，多反应监测条件如下表2所示：

表2 ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR的多反应监测条件

所有数据均通过AB Sciex MultiQuant工作站软件(3.0.2版)采集和处理。

(3)采集血清样品溶液的色谱图：

使用miRNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取血清样本中miRNA，然后精密吸取miRNA样品5μL，按照建立miRNA-224标准曲线的生物素化过程进行实验；

在与(2)步骤中相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，取体积10μL的萃取吹干并复溶后样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得血清样品溶液的色谱图；

(4)血清样品中miR-224浓度的确定：

将血清样品溶液色谱图中多肽ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR色谱峰峰面积的比值带入已建立的miR-224标准曲线方程中，即可计算出血清样品中miR-224的浓度；

(5)采集质控样品和加标回收样品溶液的色谱图：

精密吸取miR-224质控品(300nmol/L)5μL，按照建立miRNA-224标准曲线的生物素化过程进行实验；

使用miRNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取miR-224浓度已知的血清样本中miRNA(一式二份)，终体积均为20μL(管1和管2)，在各管中加入不同浓度miR-224标准溶液(5μL)，充分混匀后，在各管中各精密吸取加标样品5μL，按照建立miRNA-224标准曲线的生物素化过程进行实验；

在与(2)步骤中相同的预设超高效液相色谱质谱条件下，取体积10μL的萃取吹干并复溶后样品溶液注入超高效液相色谱质谱联用仪中，获得质控品和加标样品溶液的色谱图；

将质控品和加标样品溶液色谱图中多肽ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR色谱峰峰面积的比值带入已建立的miR-224标准曲线方程中，计算出质控品和加标样品中miR-224的浓度；

(6)加标回收率计算：

(7)线性关系、最低检测限和最低定量限：

在与(2)步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，精密吸取10μL不同浓度的miR-224标准曲线工作液分别注入超高效液相色谱仪，每个浓度平行分析3次；记录各浓度工作液中多肽ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR峰面积(如图1，图1为浓度为0.5μmol/L的核酸肽探针5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’-PEG2-GDRALFVGEPNR和浓度为1mg/L的同位素标记多肽GDRA[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR经胰酶酶解后获得ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR典型UHPLC-MS/MS色谱图)，以多肽ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR色谱峰峰面积的比值为纵坐标，以相应的miR-224标准曲线工作液的miR-224浓度为横坐标进行线性回归，回归方程y＝0.0103x+0.2147，相关系数R²＝0.995，如图2，表明本实施例所建方法在预设的线性范围内具有良好的线性关系；

以线性最低点浓度(0.5nmol/L)作为最低定量限(LLOQ)，以低于LLOQ两倍浓度(0.25nmol/L)作为最低检测限(LLOD)，每个浓度样品平行分析6次考察所建方法灵敏度，结果表明，本实施例所建方法的LLOD检测结果准确性为105.9％，相对标准偏差(RSD)为9.56％，LLOQ检测结果准确性为94.5％，RSD为7.84％，表明本实施例所建方法的灵敏度高，低浓度检测准确度高；

(9)精密度试验：

按照质控样品处理方法制备低浓度(42.8nmol/L)、中浓度(236.4nmol/L)、高浓度(856.3nmol/L)质控样品，分别标记为QCL、QCM、QCH，每个浓度质控样品连续检测3次作为日内精密度，连续检测5天作为日间精密度；结果：不同浓度质控样品中miR-224的日内和日间精密度的RSD均小于5.86％，表明本实施例所建方法精密度良好，结果见表3；

(10)稳定性试验：

按照质控样品QCL、QCM、QCH：1)置于4℃自动进样器，于0、2、4、6、8、12h测定，考察血样品中miR-224存放自动进样器12小时的稳定性；2)于室温放置2h后处理，考察血样品中miR-224室温放置2小时的稳定性；3)在-70℃冰箱放置，反复冻融1次、冻融3次，考察血样品中miR-224在反复冻融过程的稳定性，在与(2)步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，测定上述不同浓度质控样品，每个浓度质控样品平行制备6份；结果：不同浓度质控样品中miR-224稳定性的RSD均小于3.25％，表明血样品中miR-224的稳定性良好，结果见表3；

表3 miR-224的精密度、稳定性试验结果(n＝6,RSD)

(11)加标回收率试验：

在已知miR-224浓度为105.7nmol/L的血清样品中加入miR-224标准品，按照加标回收率样品处理方法分别制备低浓度、中浓度、高浓度加标回收率样品，分别标记为RL、RM、RH，每个浓度样品平行制备6份，考察本实施例所建方法测定血样品中miR-224的准确度；结果：不同浓度加标回收率样品的平均回收率在99.6～104.6％，RSD均小于7.04％，表明本实施例所建方法准确度良好，结果见表4；获得的质控样品和加标回收率样品溶液的典型UPLC-MS/MS色谱图，如图3所示；

表4 miR-224加标回收率结果(n＝6)

血清样品中miR-224的测定：

按照血清样品处理方法制备血样品，在与(2)步骤中相同的超高效液相色谱质谱条件下，精密吸取10μL分别注入超高效液相色谱仪，获得血清样品色谱图，如图4；结果见表5；

表5血清样品miR-224测定结果(nmol/L)

上述结果可以看出，本实施例所构建的一种测定血清中miR-224的同位素稀释超液相色谱质谱联用方法，用于血清中miR-224的测定，简单快速、准确度高、专属性强、精密度高、灵敏度好。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，包括如下步骤：

（1）将合成的miR-224核酸单链配成溶液，用于建立标准曲线；

（2）合成核酸肽探针配成溶液，用以捕获miR-224；

（3）将合成的同位素标记多肽配成溶液作为内标；

（4）在血清样本中提取miRNA；

（5）将提取出来的miRNA进行生物素化；

（6）将上述生物素化的miRNA-224与链霉素琼脂糖球反应，形成miRNA-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

（7）加入核酸肽探针捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

（8）将核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物清洗干净后加入胰蛋白酶进行酶解，然后将酶解产物进行固相萃取，将萃取出的多肽吹干并复溶；

（9）将复溶后的多肽和同位素标记的多肽样品进行质谱分析；

（10）计算血清样品中miR-224含量；

所述步骤（8）具体包括如下步骤：

①用1mL超纯水重新溶解上述核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

②加入10μL 1mg/L同位素标记多肽溶液；

③加入10μL 0.04μg/μL胰酶，置于37℃酶解4h；

④将酶解产物用60mg, 3mL Oasis^® MAX cartridges固相萃取柱进行纯化富集ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；Oasis^® MAX cartridges固相萃取柱首先用3mL甲醇和3mL超纯水分别活化和平衡柱子，然后加入酶解产物，再用2mL超纯水清洗柱子，最后用1mL含0.2%甲酸的乙腈溶液萃取ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；

⑤将萃取物用氮气吹干；

⑥吹干后加入250μL 0.1% 甲酸水溶液复溶ALFVGEPNR和A[13C615N]LFVGEPNR多肽混合物；

所述步骤（9）具体包括如下步骤：采用岛津Nexera X2高效液相色谱***和AB Sciex5500三重四级杆液质联用仪，使用60mg, 3mL的Symmetry Shield^TM RP18色谱柱在40℃条件下进行色谱分离；流动相为：A：含0.1%甲酸的水溶液；B：含0.1%甲酸的乙腈溶液；流速为0.2mL/min；进样量10μL；按照如下的梯度进行洗脱：B 5%，0-0.1min→B 35%，0.1-6min→B80%，6-6.1min→B 80%，6.1-8min→B 5%，8-8.1min→B 5%，8.1-12min→B 5%；选用正离子多反应监测模式，监测ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR两条多肽的信号强度；质谱***的离子源为电喷雾电离源，喷雾电压5500 V；雾化压力55 psi；雾化温度550℃；雾化气流10 L/min；Q1和Q3质量选择器均设定在单位质量分辨率；用于定量分析的离子分别为 m/z 501.0→571.5和 m/z 505.5→572.2；碰撞能量CE分别为25eV和23eV；去簇电压DP为130V；所有数据均通过AB SciexMultiQuant工作站软件采集和处理；

所述步骤（10）具体包括如下步骤：

①建立标准曲线，用DEPC水将浓度为1μmol/L的miR-224贮存液稀释成以下系列浓度：1000nmol/L、800nmol/L、500nmol/L、300nmol/L、200nmol/L、100nmol/L、80nmol/L、60nmol/L、40nmol/L、20nmol/L、10nmol/L和5nmol/L，然后按步骤（5）～（9）具体步骤进行操作，采用岛津Nexera X2高效液相色谱和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪对萃取多肽产物ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR的峰面积进行测定，以miR-224浓度为横坐标（x）、两条多肽峰面积比（y）为纵坐标建立标准曲线，曲线方程为y=0.0103x+0.2147，R ²=0.995；

②收集血清样本，按步骤（4）～（9）具体步骤进行操作，采用岛津Nexera X2高效液相色谱和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪对萃取多肽产ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR的峰面积进行测定，将二者峰面积比代入上述曲线方程，即可计算得血清样品中miR-224含量。

2.根据权利要求1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体包括如下步骤：miR-224核酸单链合成量为4OD值，每管1OD值分装，在每管中准确加入250μL DEPC水，配制成浓度为20μmol/L的miR-224溶液并分装至1.5mL离心管中，每管分装50μL，然后在各管中加入950μL超纯水稀释至浓度为1μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装20μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在miR-224贮存液中加入DEPC水稀释成系列浓度用于建立标准曲线。

3.根据权利要求1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤（2）具体包括如下步骤：

核酸肽探针序列为5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’-PEG2-GDRALFVGEPNR，

其中5’-CTAAACGGAACCACTAGTGACTTGA-3’为探针核酸部分，与miR-224序列5’-UCAAGUCACUAGUGGUUCCGUUUAG-3’互补配对；GDRALFVGEPNR为探针肽部分，其特征是非人类任何蛋白胰酶水解后的特异性肽段，包含胰酶水解位点精氨酸R；PEG2连接核酸与肽；核酸肽探针合成量为20nmol，准确加入1mL超纯水，配制成浓度为20μmol/L的核酸肽探针溶液，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至浓度为2μmol/L作为贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装50μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在核酸肽探针贮存液中加入1950μL超纯水稀释至0.05μmol/L，得到核酸肽探针工作液，现用现配。

4.根据权利要求1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤（3）具体包括如下步骤：将合成的1mg同位素标记的多肽GDRA[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR首先用300μL乙腈超声溶解，然后加入700μL超纯水配制成浓度约为1mg/mL的同位素标记多肽贮存液并分装至1.5mL离心管中，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至约为0.1mg/mL并分装至并1.5mL离心管中，每管分装10μL，并将分装好的核酸肽探针溶液置于-70℃冰箱保存；使用前，在浓度约为0.1mg/mL的同位素标记多肽溶液中加入990μL超纯水稀释至约为1mg/L，得到作为内标的同位素标记多肽工作液，现用现配，在定量中作为内标。

5.根据权利要求1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤（4）为使用miRNA快速提取试剂盒提取血清样本中miR-224，具体包括如下步骤：

④于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中；水相层的容量大约为所加MRL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作；

⑤加入0.6倍体积70％乙醇，颠倒混匀，并将得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中,其中，吸附柱套在收集管内；

⑥10,000rpm离心45秒，收集下滤液，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，颠倒几次混匀，将混合液倒入到吸附柱RB中，10,000rpm离心30秒弃掉废液；

⑦加入700μL漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；

⑧加入500μL漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；

⑩取出吸附柱RB，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-80μL RNase free water，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集得到纯净miRNA保存于-20℃或者更低备用。

6.根据权利要求1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤（5）为使用Pierce^TM RNA 3’ End Biotinylation Kit 试剂盒对血清样品中提取出的miR-224进行生物素化，具体包括如下步骤：

①除30%PEG和DMSO外，在冰上溶解试剂盒中其他所有成分，室温溶解DMSO，将30% PEG在37℃孵育5-10min，直到变为液体；

②调节加热器到85℃，转移5μL Non-labeled RNA control和血清miRNA到微量离心管中；在85℃加热3-5min，然后立即放在冰上；

③进行标记反应：

④加70μL核酸free水；

⑥加10μL 5M NaCl，1μL糖原和300μL冰冷的100%乙醇，在-20℃沉淀大于1h；

⑦大于13000g 4℃离心15min，仔细移出上清，不要碰到沉淀物；

⑧用300μL冰冷的70%乙醇洗沉淀物，仔细移除酒精，晾干沉淀物；

⑨用冰冷的70%乙醇洗沉淀物，仔细移除酒精，晾干沉淀物；

⑩用20μL核酸free水重悬沉淀物即得生物素化miRNA，其中包含miR-224。

7.根据权利要求1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤（6）具体包括如下步骤：链霉素琼脂糖球首先与tRNA和BSA反应，然后将步骤（5）的20μL生物素化miRNA与20μL经处理过的链霉素琼脂糖球反应，置于37℃摇匀2h，形成miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物，其中包含miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物。

8.根据权利要求1所述的同位素稀释质谱法测定miR-224含量的方法，其特征在于，所述步骤（7）具体包括如下步骤：在步骤（6）所得miRNA-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物中加入100μL 0.05μmol/L核酸肽探针溶液和25μL缓冲液，置于杂交仪中杂交，65℃ 16h，以捕获miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物，形成核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；然后用PBS清洗复合物并离心，去除上清，反复多次，将未结合的核酸肽探针去除，获得纯净核酸肽探针-miR-224-生物素-链霉亲和素琼脂糖球复合物；

其中，所述缓冲液为10 mMTris，100 mMKCl，1 mM MgCl₂，pH 7.4。