CN110218718A - 固定化酮还原酶突变体及其在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物中的应用 - Google Patents
固定化酮还原酶突变体及其在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
固定化酮还原酶突变体及其在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物中的应用。本发明提供了固定化酮还原酶突变体，其特征在于，所述的固定化酮还原酶突变体为酮还原酶突变体的固定化细胞或固定化酶，固定化酶是所述的突变体固定化于固相支撑物上；固定化细胞是所述的酮还原酶突变体表达于固定化于固相支撑物上的微生物细胞中，所述的酮还原酶突变体选自ET016、ET017或ET031酮还原酶。本发明具有如下技术效果：1）本发明的固定化酮还原酶突变体，可作为催化剂，与辅酶再生体系共同用于制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物，反应转化率可达90%、95%或99%以上，产物的手性纯度值可达90%、95%或99%以上。2）固定化后的酶或细胞可以通过简单的过滤进行回收，回收后可以反复使用7‑10次，且重复使用时与初次使用的反应转化率和手性纯度值基本相同。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化酮还原酶突变体及其在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物中的应用，属于生物酶工程和微生物应用领域。
背景技术
盐酸奈必洛尔【nebivolol hydrochloride，双[2-(6-氟苯并二氢吡喃-2-基)-2-羟基乙基]胺盐酸盐】是由美国强生公司研发，是一种血管扩张活性的选择性β1肾上腺素受体拮抗剂，用于轻至中度高血压病人的治疗，亦可用于心绞痛和充血性心力衰竭的治疗，具有疗效显著、服用方便、不良反应小等特点。2016年全球销售额9.3亿美元，2017年全球销售额11.3亿美元。
奈必洛尔具有16种手性对映异构体，研究发现以(S,R,R,R)疗效最佳，因而NB-8(S,S)/NB-8(R,S)/NB-8(R,R)/NB-8(S,R)四种构型手性醇中间体的制备是盐酸奈必洛尔合成的关键步骤。
目前S-手性醇中间体的合成主要有化学合成和酶法合成两种途径。化学合成采用化学拆分和化学不对称合成来制备手性中间体，这两种方法均存在诸多问题，如化学拆分需要使用大量的拆分剂，反应步骤长，能耗高以及废物排放量大等；基于过渡金属手性配体催化氢化体系，存在着产品光学纯度不高以及重金属残留等问题，导致收率过低，成本居高不下。盐酸奈必洛尔的专利将在2020年到期，原料药价格会一再下探，传统化学合成途径因环保和成本问题受到极大冲击。
酶法合成手性醇中间体的研究报道较少。起初是利用脂肪酶代替过渡金属催化剂来进行手性拆分，虽然污染大为减少，但也存在拆分效率低、另一对映体无法利用等问题。后续研究利用酮还原酶来进行手性还原制备手性醇中间体。然而国内目前还未有可用于工业化生产的酶及其突变体的研究报道。
酶或细胞固定化技术即是将含酶的细胞或酶液用固定化载体材料，将酶束缚、限制在一定的空间内或连接在载体材料上，保留其催化活性，并可回收及重复使用的一类技术。此类方法可以将价格昂贵的酶产品在反应后再次多次地回收使用，从而降低酶的使用成本。同时固定化后细胞或酶蛋白由于连接到更大颗粒的固定化载体材料，使在工业上难于过滤的酶和细胞等小分子，凝聚成易于过滤的大颗粒，从而极大得降低了工业化过滤的操作难度和对应成本，解决了工业上酶催化剂和产物的分离纯化困难的问题。
固定化酶在文献中曾用水不溶酶、不溶性酶、固相酶、结合酶、固定酶、酶树脂及载体结合酶等名称。
酶的催化反应依赖于它的活性部位的完整性，因此在固定某一酶时必须选择适当条件，使其活性部位的基团不受影响，并避免高温、强酸及强碱等条件，不使蛋白质变性。酶的固定化方法主要有以下几种方法。
(a)载体结合法：最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。
(b)交联法依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
(c)包埋法：酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。
酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍(如5′-磷酸二酯酶的工业应用)甚至几百倍(如青霉素酰化酶的工业应用)。
固定化酶的形式多样，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产；或在反应器中进行批式搅拌反应；也可制成酶膜、酶管等应用于分析化学；又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。现在又有人用酶膜(包括细胞、组织、微生物制成的膜)与电、光、热等敏感的元件组成一种装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息的传递及环境保护中有害物质的检测。最常用的是酶膜与离子选择电极组成的生物传感器，例如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成，脲经脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又继续被硝化菌氧化，总耗氧量则通过氧电极反映出电流的变化，用以计算脲的含量。
1916年Nelson和Griffin发现了酶的固定化现象后，科学家就开始的了固定化酶的研究工作(J.M.Nelson,E.J.Griffin.Adsorption of invertase.J.Am.Chem.Soc.,1916,38(5):1109-115)。固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。(邹泽昌；氧化硅介孔泡沫材料的制备及其木瓜蛋白酶固定化[D]；北京工业大学；2009年)
现有技术没有提供制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物的固定化的酮还原酶突变体及其应用效果。
现有技术中其他酮还原酶的固定化存在如下技术问题：1、固定化成本较高、操作手续复杂；2、固定化循环使用次数不多；3、固定化后催化效率下降等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种来源于高加索酸奶乳杆菌属物种(Lactobacillus kefir)酮还原酶Lk Kred基因，并提供对该酶和产酶的细胞进行固定化的方法，以及用该酶及其制备的固定化细胞和固定化酶，作为生物催化剂用于制备奈必洛尔手性中间体及其类似物的方法。
本发明的技术方案如下：
固定化酮还原酶突变体，其特征在于，所述的固定化酮还原酶突变体为酮还原酶突变体的固定化细胞或固定化酶，固定化酶是所述的突变体固定化于固相支撑物上；固定化细胞是所述的酮还原酶突变体表达于固定化于固相支撑物上的微生物细胞中；
所述的酮还原酶突变体选自ET016、ET017或ET031酮还原酶；
所述的ET017酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码所述的ET017酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的ET016酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，编码所述的ET016酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的ET031酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，编码所述的ET031酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
三种酮还原酶Lk Kred的基因序列通过金斯瑞生物科技有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET21a(+)载体进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒Lk Kred-pET21a(+)转入BL21(DE3)宿主菌中，从而构建该酮还原酶的体外异源表达体系。
根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，酮还原酶Lk Kred其表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。
本发明还提供了含酮还原酶Lk Kred细胞进行固定化细胞，及获得酶液进行固定化酶的方法。固定化细胞采用壳聚糖对含酶细胞和戊二醛溶液进行交联，用无水碳酸钠进行制粒，过滤后得到固定化细胞。固定化酶采用戊二醛交联活化后的树脂，加入酶液连接到树脂上，最后用丙氨酸封闭树脂上的活性位点，获得固定在树脂上的酶备用。以上固定化操作参见后面实施例。
本发明还提供了所述的固定化酮还原酶突变体作为催化剂在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物的应用，所述制备方法如下：在辅因子NADP存在下催化奈必洛尔酮基中间体[NB-7(S)/NB-7(R)]与奈必洛尔手性醇中间体[NB-8(S，S)/NB-8(R，S)/NB-8(R，R)/NB-8(S，R)]之间的立体特异性平衡反应，反应式如下：
反应式(I)
反应式(II)
反应式(III)
反应式(IV)
所述的制备奈必洛尔手性醇中间体及其他类似物的方法，包括下列方法的任意一种：
(a)采用异丙醇和Im-Lk Kred进行的反应
(b)采用葡萄糖结合葡萄糖脱氢酶(简写为Gdh)进行的反应
反应体系为：酮还原酶Lk Kred的固定化细胞或固定化酶，磷酸缓冲液，辅酶NADP，底物，辅酶再生底物异丙醇或葡萄糖。
其中，固定化细胞或固定化酶的用量在2-20g/10ml，缓冲液浓度在50-200mM，辅酶浓度为2-20mg/10ml，底物浓度在1-2g/10ml，辅酶再生底物浓度根据底物浓度进行调整。
优选地，所述的固定化细胞或固定化酶的用量在2g/10ml，缓冲液浓度在50mM，辅酶浓度为2mg/10ml，所述的反应的pH为7-11，所述的反应温度为35-40℃。
反应后产物通过乙腈萃取后经HPLC验证，反应转化率可达90％，或95％以上，产物的手性纯度值可达90％，或95％，或98％以上。从而可证明该酶突变体可用于原料NB-7(S)和NB-7(R)的生物不对称还原。
可进行上述生物催化反应的酶包括相应的固定化细胞或者固定化酶等其他存在形态。
本发明所用的辅酶再生体系为葡萄糖-葡萄糖脱氢酶体系或异丙醇-醇脱氢酶体系。其中葡萄糖脱氢酶体系采用的酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等的体外重组酶，优选为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)的基因重组酶。异丙醇-醇脱氢酶体系所用的酶主要来源于酮还原酶Lk Kred或其固定化的载体形式。具体的为，本发明下面如无特殊说明，采用的辅酶再生体系为异丙醇-酮还原酶酶Lk Kred的辅酶再生体系。
本发明具有如下技术效果：
1)本发明的固定化酮还原酶突变体，可作为催化剂，与辅酶再生体系共同用于制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物，反应转化率可达90％、95％或99％以上，产物的手性纯度值可达90％、95％或99％以上。
2)固定化后的酶或细胞可以通过简单的过滤进行回收，回收后可以反复使用7-10次，且重复使用时与初次使用的反应转化率和手性纯度值基本相同。
附图说明
图1是实施例7的SFC检测结果。
图2是实施例8的SFC检测结果。
图3是实施例9的SFC检测结果。
图4是实施例10的SFC检测结果。
图5是实施例11的SFC检测结果。
图6是实施例12的SFC检测结果。
图7是实施例13的SFC检测结果。
图8是实施例14的SFC检测结果。
图9是实施例15的SFC检测结果。
图10是实施例16的SFC检测结果。
图11是实施例17的SFC检测结果。
图12是实施例18的SFC检测结果。
图13是现有技术中的固定化方法。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
实施例1原核表达体系的构建
三种酮还原酶Lk Kred基因片段由金斯瑞生物科技有限公司合成，并重组到pET21a载体上。
将阳性重组质粒Lk Kred-pET21a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，得到原核表达菌株Lk Kred-pET21a(+)/BL21(DE3)，作为后续催化反应原代菌株。
用于辅酶再生的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)(LOC111893255)和醇脱氢酶(TbADH)(LOC101068320)基因由金斯瑞生物科技有限公司合成，后续重组表达质粒的构建同LkKred-pET21a(+)质粒的构建，转入BL21(DE3)中后分别得到BsGDH-pET21a(+)/BL21(DE3)、TbADH-pET21a(+)/BL21(DE3)表达菌株。
实施例2酶的发酵制备
上述构建的表达菌株Lk Kred-pET21a(+)/BL21(DE3)、BsGDH-pET21a(+)/BL21(DE3)、TbADH-pET21a(+)/BL21(DE3)在加有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基【10g/l胰蛋白胨(OXIOD)，5g/l酵母粉(OXIOD)，10g/l氯化钠(国药试剂)】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1％(V/V)比例接种于含有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG)，并在25℃诱导过夜。菌体在8000rpm条件下离心收集，备用。取一部分菌体，以1g湿菌体对应4g磷酸缓冲液的比例，悬浮于50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，超声破碎(200W，3s/5s，10min)，4℃、12000rpm离心20min，取上清备用。
实施例3酶的催化活性检测
将上述得到的酶液用于底物催化反应。将1g底物(NB-7(S)或NB-7(R))溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，随后加入1.5g葡萄糖，待搅拌溶解后加入2mg NADP+、2.5g GDH湿菌体，加入2ml酶上清液将体积补充到10ml。反应液置于37℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应10mim后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到30％，产物手性纯度值>99％。
转化率定义为产品峰/(产品峰+底物峰)*100％的数值，酶活定义为40度下每min每ml酶液反应生成产物的微摩尔数。计算过程如下：酶活＝转化率*(1/221)*1000000/10/10。本次10min后的转化率为30％，则酶活＝30％*(1/221)*1000000/10/10＝13.6U/min/ml。
实施例4 HPLC检测方法建立
底物转化率的检测通过HPLC进行，检测的条件如下：仪器为安捷伦HPLC1100、液相柱为安捷伦Agllent 5TC-C18(2)250*4.6mm、流动相Buffer A为含0.1％甲酸水相、流动相Buffer B为含0.1％甲酸乙腈相，梯度程序：0～20min80％A到10％A，20-25min 10％A到10％A，25min后10％A到80％A。柱温箱温度30℃、流速1mL/min、检测波长282nm、进样量10uL。检测后将产物的峰面积除以产物和底物的峰面积之和，求得转化率。
产物手性纯度的检测通过超临界流体色谱(SFC)检测。检测后将S型产物的峰面积除以S型产物和R型产物的峰面积之和，求得手性纯度。
上述检测样品均采用流动相稀释到合适浓度后，用0.22μm的滤膜过滤进仪器检测。
实施例5固定化细胞的制备
将50g菌体细胞加入50ml水搅拌均匀，另取50ml水中加入2～3g壳聚糖并加入3ml冰乙酸，充分搅拌至壳聚糖完全溶解。将50ml壳聚糖溶液倒入已经搅拌均匀的细胞溶液充分搅拌30min，加10ml异丙醇搅拌。取50％浓度戊二醛4～5ml加水稀释至12ml并加入以上壳聚糖细胞溶液中充分搅拌。搅拌交联30～50min。将3g无水碳酸钠加入150ml水中充分搅拌溶解。将碳酸钠溶液缓慢加入以上交联好的壳聚糖固定化细胞中充分搅拌，此时为中性。过滤得到固定化细胞，滤饼用500ml水冲洗2～3次，用200ml的20mM磷酸缓冲淋洗一次。过滤得到滤饼称重约80g，滤干放入4℃冰箱保存。
将上述得到的固定化细胞用于底物催化反应。将1g底物(化合物I)溶解于40ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，随后加入800mg葡萄糖，待搅拌溶解后加入5mg NADP+、2.5g GDH湿菌体，加入2g固定化细胞，并加入10ml磷酸缓冲将体积补充到50ml。反应液置于40℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应10mim后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到19％，产物手性纯度值>99％。
转化率定义为产品峰/(产品峰+底物峰)*100％的数值，酶活定义为40度下每min每g固定化细胞反应生成产物的微摩尔数。计算过程如下：酶活＝转化率*(1/221)*1000000/10/2。本次10min后的转化率为19％，则酶活＝19％*(1/221)*1000000/10/2＝43U/min/g。
实施例6固定化酶的制备
将100g树脂用5倍体积的纯水洗涤2次，再用4倍体积pH8.0 25mmol磷酸缓冲洗涤2次。将树脂加入4倍树脂体积6％的戊二醛，室温下搅拌6小时，进行交联活化。然后用5倍树脂体积的纯水洗涤2次，再用4倍体积pH8.0 25mmol磷酸洗涤2次，过滤收集活化好的树脂，备用。
在备用的树脂上加入5倍体积的实施例2中的酶液，20℃以下，缓慢搅拌过夜。离心收集树脂。取5倍体积pH8.0 25mmol磷酸缓冲溶解15g L-丙氨酸，加入上一步骤的树脂，搅拌1小时。离心收集树脂，用3倍树脂体积的pH8.0 25mmol磷酸缓冲洗涤2次。离心收集树脂，得固定化酶约98g，4℃保藏。
将上述得到的固定化酶用于底物催化反应。将1g底物NB-7(S)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，随后加入1.5g葡萄糖，待搅拌溶解后加入5mg NADP+、2.5g GDH湿菌体，加入2g固定化酶，并加入2ml磷酸缓冲将体积补充到10ml。反应液置于40℃恒温水浴锅中，磁力搅拌反应。反应10mim后取样，进行HPLC检测，底物转化率达到22％，产物手性纯度值>98％。
转化率定义为产品峰/(产品峰+底物峰)*100％的数值，酶活定义为40℃下每min每g固定化细胞反应生成产物的微摩尔数。计算过程如下：酶活＝转化率*(1/221)*1000000/10/10。本次10min后的转化率为12％，则酶活＝12％*(1/221)*1000000/10/10＝5.4U/min/g。
实施例7固定化Lk Kred细胞的生物催化
将1g底物NB-7(S)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，加入2g上述制备的ET016固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行SFC检测。
请见图1。
经过计算，得出底物转化率>98％,手性纯度值>98％。
实施例8固定化Lk Kred细胞的生物催化
将1g底物NB-7(S)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，1.5g葡萄糖、0.02g GDH冻干粉，加入2g上述制备的ET016固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行SFC检测。结果请见图2。
经过计算，得出底物转化率>98％,手性纯度值>98％。
实施例9固定化酶Lk Kred的生物催化
将1g底物NB-7(S)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，加入2g上述用树脂交联制备的ET017固定化酶，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1MNaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行SFC检测。结果请见图3。
经过计算，得出底物转化率>98％,手性纯度值>98％。
实施例10固定化酶Lk Kred的生物催化
将1g底物NB-7(S)溶解于8ml含有20％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，1.5g葡萄糖、0.02g GDH冻干粉，加入2g上述用树脂交联制备的ET017固定化酶，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行SFC检测。结果请见图4。
经过计算，得出底物转化率>98％,手性纯度值>98％。
实施例11固定化Lk Kred细胞的生物催化
将1.5g底物NB-7(S)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，加入2g上述制备的ET017固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行SFC检测。SFC结果请见图5。
经过计算，得出底物转化率>95％,手性纯度值>98％。
实施例12固定化Lk Kred细胞的生物催化
将1.5g底物NB-7(S)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，1.5g葡萄糖、0.02g GDH冻干粉，加入2g上述制备的ET017固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，结果请见图6。
经过计算，得出底物转化率>96％,手性纯度值>98％。
实施例13固定化酶Lk Kred的生物催化
将1.5g底物NB-7(S)溶解于160ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入0.02g NADP+，加入2g上述用树脂交联制备的ET017固定化酶，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行SFC检测，结果请见图7。
经过计算，得出底物转化率>95％,手性纯度值>99％。
实施例14固定化酶Lk Kred的生物催化
将1.5g底物NB-7(S)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，加入2g上述用树脂交联制备的ET017固定化酶，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应过程中每隔2h用0.1MNaOH将pH调节到7.0左右，反应24h后进行SFC检测，结果请见图8。
经过计算，得出底物转化率>90％,手性纯度值>98％。
实施例15固定化Lk Kred细胞的生物催化
将2g底物NB-7(S)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，1.5g葡萄糖、0.02g GDH冻干粉，加入2g上述制备的ET017固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，结果请见图9。
经过计算，得出底物转化率>85％,手性纯度值>98％。
实施例16固定化Lk Kred细胞的生物催化
将2g底物NB-7(R)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，1.5g葡萄糖、0.02g GDH冻干粉，加入2g上述制备的ET017固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于40℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，结果请见图10。
经过计算，得出底物转化率>86％,手性纯度值>98％。
实施例17固定化Lk Kred细胞生物催化的反复使用
将1g底物NB-7(R)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，1.5g葡萄糖、0.02g GDH冻干粉，加入2g上述制备的ET031固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，结果请见图11。
经过计算，得出底物转化率>98％,手性纯度值>99％。
将上述反应液过滤后取得固定化Lk Kred细胞的沉淀，将这些沉淀细胞再次投入上述体系反复再使用7次，所有产品测得的手性纯度值>98％。
实施例18固定化Lk Kred细胞生物催化的反复使用
将1g底物NB-7(R)溶解于8ml含有10％异丙醇的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液中，待搅拌溶解后加入2mg NADP+，1.5g葡萄糖、0.02g GDH冻干粉，加入2g上述制备的ET017固定化细胞，并用缓冲液将体积补充到10mL。反应过程中每隔2h用0.1M NaOH将pH调节到7.0左右，反应液置于35℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行SFC检测，结果请见图12。
经过计算，得出底物转化率>98％,手性纯度值>98％。
将上述反应液过滤后取得固定化Lk Kred细胞的沉淀，将这些沉淀细胞再次投入上述体系反复再使用7次，所有产品测得的手性纯度值>98％。
序列表
<110> 南京趣酶生物科技有限公司
上海仁酶生物科技有限公司
<120> 固定化酮还原酶突变体及其在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
<400> 1
atgaccgacc gtctgaaggg caaagttgcg atcgtgaccg gtggcaccct gggtatcggt 60
ctggcgattg cggataagtt cgttgaggaa ggtgcgaaag tggttattac cggtcgtcac 120
gcggacgtgg gcgagaaggc ggcgaaaagc atcggtggca ccgatgttat tcgttttgtg 180
cagcacgacg cgagcgatga agcgggctgg accaagctgt tcgacaccac cgaggaagcg 240
tttggcccgg ttaccaccgt ggttaacaac gcgggtattg cggtggacgt tagcgtggag 300
gataccacca ccgaggaatg gcgtaaactg ctgagcgtta acctggatgg tgtgttcttt 360
ggcacccgtc tgggtatcca acgtatgaag aacaaaggtc tgggcgcgag catcattaac 420
atgagcagca ttgaaggtct ggttggcgac ccgaccctgg gtgcgtacaa cgcgagcaag 480
ggtgcggtgc gtatcatgag caaaagcgcg gcgctggatt gcgcgctgaa ggactatgat 540
gttcgtgtga acaccgttca cccgggcccg attaaaaccc cgctgctgga cgatctggag 600
ggtttcgagg aaatgcacag ccagcgtacc aagaccccga tgggtcacat cggcgaaccg 660
aacgacatcg cgtggatttg cgtgtacctg gcgagcgatg agagcaaatt cgcgaccggt 720
gcggaatttg tggttgacgg tggctatacc gcgcaa 756
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
<400> 2
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Asp
85 90 95
Val Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Leu Asp Asp Leu Glu Gly Phe Glu Glu Met His Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 3
<211> 756
<212> DNA
<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
<400> 3
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ctggcgattg cggataagtt cgtggaggaa ggtgcgaaag tggttattac cggccgtcac 120
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cagcacgacg cgagcgatga agcgggctgg accaagctgt tcgacaccac cgaggaagcg 240
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gacaccacca ccgaggaatg gcgtaaactg ctgagcgtga acctggatgg tgttttcttt 360
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<211> 252
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<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
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<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
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ctggcgattg cggataagtt cgttgaggaa ggtgcgaaag tggttattac cggtcgtcat 120
gcggatgtgg gcgagaaggc ggcgaaaagc atcggtggca ccgatgttat tcgttttgtg 180
cagcacgacg cgagcgatga agcgggctgg accaagctgt tcgacaccac cgaggaagcg 240
tttggcccgg ttaccaccgt ggttaacaac gcgggtattt tcgtggacgt tagcgtggag 300
gataccacca ccgaggaatg gcgtaaactg ctgagcgtta acctggatgg tgtgttcttt 360
ggcacccgtc tgggtatcca acgtatgaag aacaaaggtc tgggcgcgag catcattaac 420
atgagcagca ttgaaggtct ggttggcgac ccgaccctgg gtgcgtacaa cgcgagcaag 480
ggtgcggtgc gtatcatgag caaaagcgcg gcgctggatt gcgcgctgaa ggactatgat 540
gttcgtgtga acaccgttca cccgggcccg attaaaaccc cgctgctgga cgatctggag 600
ggttttgagg aaatgcacag ccagcgtacc aagaccccga tgggtcacat cggcgaaccg 660
aacgacatcg cgtggatttg cgtgtacctg gcgagcgatg agagcaaatt cgcgaccggt 720
gcggaatttg tggttgacgg tggctatacc gcgcaa 756
<210> 6
<211> 252
<212> PRT
<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
<400> 6
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Phe Val Asp
85 90 95
Val Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Leu Asp Asp Leu Glu Gly Phe Glu Glu Met His Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
Claims (6)
1.固定化酮还原酶突变体，其特征在于，所述的固定化酮还原酶突变体为酮还原酶突变体的固定化细胞或固定化酶，固定化酶是所述的突变体固定化于固相支撑物上；固定化细胞是所述的酮还原酶突变体表达于固定化于固相支撑物上的微生物细胞中；
所述的酮还原酶突变体选自ET016、ET017或ET031酮还原酶；
所述的ET017酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码所述的ET017酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的ET016酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，编码所述的ET016酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述的ET031酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，编码所述的ET031酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的固定化酮还原酶突变体，其特征在于，所述的固定化细胞的方法为采用壳聚糖对含酶细胞和戊二醛溶液进行交联，用无水碳酸钠进行制粒，过滤后得到固定化细胞。
3.根据权利要求1所述的固定化酮还原酶突变体，其特征在于，所述的固定化酶采用戊二醛交联活化后的树脂，加入酶液连接到树脂上，最后用丙氨酸封闭树脂上的活性位点，获得固定在树脂上的酶。
4.如权利要求1-3任意一项所述的固定化酮还原酶突变体作为催化剂在制备奈必洛尔手性醇中间体及其类似物的应用，其特征在于，所述制备方法如下：在辅因子NADP存在下催化奈必洛尔酮基中间体[NB-7(S)/NB-7(R)]与奈必洛尔手性醇中间体[NB-8(S,S)/NB-8(R,S)/NB-8(R,R)/NB-8(S,R)]之间的立体特异性平衡反应，反应式如下：
。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，其特征在于，所述的制备奈必洛尔手性醇中间体及其他类似物的方法，包括下列方法的任意一种：
(a)采用异丙醇和Im-Lk Kred进行的反应，反应路线如下：
(b)采用葡萄糖结合葡萄糖脱氢酶Gdh进行的反应，反应路线如下：
所述的转化反应体系中包括酮还原酶Lk Kred的固定化细胞或固定化酶、磷酸缓冲液、辅酶NADP、底物和辅酶再生底物异丙醇或葡萄糖；
其中，固定化细胞或固定化酶的用量在2-20g/10ml，缓冲液浓度在50-200mM，辅酶浓度为2-20mg/10ml，底物浓度在1-2g/10ml，辅酶再生底物浓度根据底物浓度进行调整，所述的反应的pH为7-11，所述的反应温度为35-40℃。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的固定化细胞或固定化酶的用量在2g/10ml，缓冲液浓度在50mM，辅酶浓度为2mg/10ml。
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|---|---|---|---|---|
| CN116790574A (zh) * | 2023-07-06 | 2023-09-22 | 中科阿尔诺(深圳)生物科技有限公司 | 一种开菲尔乳杆菌固定化菌剂、开菲尔乳杆菌冻干粉及其制备方法 |
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-
2019
- 2019-06-19 CN CN201910529412.7A patent/CN110218718A/zh active Pending
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