CN110215447A - 甲芬那酸在避孕药物中的应用及其制备的杀精避孕药物 - Google Patents

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王玉柱
夏敏杰
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李卫华
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Abstract

本发明公开了一种甲芬那酸在杀精避孕药物中的应用，其制备的杀精避孕药物包括如式I所示的化合物。甲芬那酸作为主要杀精成分，其能快速引起***制动，对***粘膜上皮细胞的刺激性较低，安全性高。

Description

甲芬那酸在避孕药物中的应用及其制备的杀精避孕药物
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，更具体地说是涉及一种甲芬那酸在杀精避孕药物中的应用及其制备的杀精避孕药物。
背景技术
杀***药物是指放入***内引起***制动而达到避孕目的的药物，通常是将杀***剂与药物载体制成特定的剂型，性生活前放入***内，通过化学杀精和物理屏障作用达到避孕效果。杀精避孕药具可由妇女自主使用，并可通过添加相应药物而达到其它效果。
目前国内的杀***药物均以非离子表面活性剂壬苯醇醚(Nonoxynol-9，N-9)为活性成分，品种极为单一。虽然N-9的杀精作用迅速而强烈，但国外临床研究已表明，反复使用N-9会损伤***黏膜上皮，提高性疾病的传播和艾滋病感染的风险，其安全性已受到严重质疑。为此，研发新型的高效、低毒、质量可控的杀精避孕药物已成为研究热点。
甲芬那酸(N-2，3-二甲苯基邻氨基苯甲酸)别名甲灭酸、扑湿痛，为美国FDA批准上市的非甾体类抗炎镇痛药物，具有镇痛、解热和抗炎作用，口服剂量250-500mg，每日可用四次，甲芬那酸(MA-01)也已获中国CFDA批准上市，纳入中国药典，用于抗炎和镇痛。最新研究发现，甲芬那酸还具有较好的杀***活性，具备研发成为新型杀精避孕药物的潜力。
因此，如何将甲芬那酸应用于制备杀精避孕药物中并提供一种以甲芬那酸为活性成分的避孕药物是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种甲芬那酸在杀精避孕药物中的应用及其制备的杀精避孕药物，避孕药物利用甲芬那酸作为主要杀精成分，其能快速杀灭***，对***粘膜上皮细胞的刺激性较低，安全性高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种甲芬那酸在杀精避孕药物中的应用。
以上技术方案达到的技术效果是：甲芬那酸通常为消炎镇痛药物，本发明首次将甲芬那酸应用于杀精避孕领域，开拓了其新的应用前景；甲芬那酸的避孕效果明显，可有效抑制***的活性，对***粘膜的损伤较小。
一种杀精避孕药物，包括如式I所示的化合物:
本发明的药物是局部给药、局部起效，给药途径是***给药。作为本发明优选的技术方案，所述杀精避孕药物适合***给药的剂型包括：凝胶剂、栓剂、膜剂、乳膏剂或缓释剂。
本发明所用的药物载体指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、生物粘附剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、乳化剂和防腐剂等。
本发明的活性化合物为甲芬那酸，是通过***给药，在***内直接接触***、使***丧失活动能力而达到避孕的目的。药物剂量范围小于25mg/天(以10倍MEC浓度，用量为4mL计)。
药物的使用方法为：本品为***内短效避孕药物，在性生活前0～2小时使用，将本品制剂置入***深处后，即可进行性生活。在性生活后再次使用可以获得更有效地避孕保护。
注：本领域内所说的杀精作用，通常是包括杀灭***作用(造成***质膜损伤死亡)或者制动***作用(使***完全失去活力)，从而达到避孕效果。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种杀精避孕药物及甲芬那酸在杀精避孕药物中的应用，达到的技术效果是：
1)首次发现甲芬那酸可用于***杀精避孕药物，是杀精剂研究中的新发现；
2)甲芬那酸用于***杀精避孕有效剂量低，效率高，用药安全系数高。
3)甲芬那酸可以显著抑制人***运动，且对***粘膜上皮细胞毒性较低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为甲芬那酸对***运动的抑制作用图；
图2附图为***超微结构图；其中左一为未经处理的***的超微结构图，中间附图为以甲芬那酸处理后的***超微结构图，右一附图为以N-9处理后的***的超微结构图；
图3附图为甲芬那酸对***上皮细胞VK2的细胞毒性图；
图4附图为甲芬那酸对***上皮细胞VK2的细胞膜损伤图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1验证甲芬那酸对***运动的抑制作用
本发明中的甲芬那酸购自Sigma公司，分子式是C15H15NO2，分子量为241.29，CAS登录号为61-68-7。
实验方法
***采集：人类***样本来源于自愿的已生育男性捐赠者，禁欲3-7天，***法采集***至***收集皿中，37℃静置30min待其完全液化，得到***上游液，备用；
筛选：参照《世界卫生组织人类***检查与处理实验室手册》中***上游法筛选出高活力***；
稀释：用EBSS(1％BSA)将高活力***样本调整至1×107个/mL，放置于37℃培养箱，备用。将甲芬那酸溶于DMSO制成浓度为0.5mol/L的甲芬那酸储备液，将甲芬那酸储备液用EBSS依次稀释至0.5、1、1.5、2和2.5mmol/L；
计数：将***上游液与不同浓度的甲芬那酸稀释液等体积混合均匀，吸取少量，加到提前预温37℃的***计数板上，于显微镜下进行计数。
然后根据药物的系列浓度与相应***活力数据，用SPSS软件对数据进行回归分析，计算得到制动***的最低有效浓度(Minimum Effective Concentration，MEC)和半数有效浓度(Median Effective Concentration，EC50)。
实验结果
甲芬那酸对***运动的抑制作用的实验结果参见图1。图1显示，当暴露时间为5min时，随着甲芬那酸浓度升高***活力呈现降低趋势，表明***运动活力和运动速度受到明显抑制，且呈现剂量依赖效应。此时，甲芬那酸对人类***的100％抑精浓度(MEC)值为2.5mmol/L，50％抑精浓度(EC50)值为1.0mmol/L。提示甲芬那酸具有较强的抑制人***运动的作用，在>2.5mmol/L浓度时可以使***完全失去活动能力，从而抑制***和卵子的结合，起到避孕的作用。
实施例2***复动试验
实验方法
将实施例1中的人***上游液与甲芬那酸稀释液等体积混合均匀，使其终浓度为2.5mmol/L，5min后EBSS洗涤2次，重悬后置于37℃培养箱孵育30min。于相差显微镜下观察制动后***活动的恢复和形态变化。制动后的***出现振荡运动即被认为复动。
实验结果
甲芬那酸制动后的***经EBSS洗涤后，***培养基孵育30min后不能恢复其活力。提示甲芬那酸具有较强的抑制人***运动的作用，且该作用不可逆。
实施例3甲芬那酸对***超微结构的影响
实验方法
将实验例1中的人***上游液与甲芬那酸稀释液等体积混合均匀，使其终浓度为2.5mmol/L，以壬苯醇醚溶液为现有市售药物对照。5min后EBSS洗涤2次，将***细胞悬液滴片风干，经2.5％戊二醛固定，洗涤后经梯度酒精脱水，CO2临界点干燥，金属镀膜，扫描电镜观察。
实验结果
参见图2，对照组***质膜光滑，顶体结构保持完整，甲芬那酸处理后的***质膜完整，未见明显损伤，可见顶体后边界和后环；而阳性对照N-9处理后***头部呈现明显质膜损伤，细胞质泄露，颈部发生断裂。说明甲芬那酸制动***不完全是通过破坏***质膜完成的，这与目前临床使用的N-9杀精剂不同。
实施例4甲芬那酸对人***粘膜上皮细胞VK2/E6E7的细胞毒性
实验方法
培养：取对数生长期的VK2/E6E7(购自ATCC细胞库，由本课题组传代，冻存)细胞接种于装有DefinedKeratinocyte-SFM(购自GIBICO公司)培养基的96孔培养板中，1×105个细胞/孔，置于CO2细胞培养箱37℃预培养过夜；
将各培养孔内培养基倾倒干净。空白组和对照组加入100μL新鲜培养基，处理组每孔加入100μL实施例1中的浓度分别为0.5、1、1.5、2和2.5mmol/L甲芬那酸稀释液；以Defined Keratinocyte-SFM为空白对照，以壬苯醇醚溶液为现有市售药物阳性对照。作用4小时后，各孔更换新鲜培养基，并加入10μL、浓度为5mg/mLMTT溶液置于96孔板中，于CO2细胞培养箱37℃继续培养4小时；
去除培养液，每孔加入100μL DMSO溶液将细胞裂解，用酶标仪测定各孔在570nm波长处的光密度值，计算细胞活力抑制率：
细胞活力抑制率(％)＝1－处理组OD570nm/对照组OD570nm×100％
实验结果
参见图3，结果显示，不同浓度的甲芬那酸作用4h后，其对VK2/E6E7细胞活力的抑制率分别为77.30％、81.91％、83.45％、88.40％和89.08。以相同实验条件，壬苯醇醚在100％抑制***运动的浓度下，对VK2/E6E7细胞活力的抑制率可达96.13％。提示甲芬那酸对人类***上皮细胞毒性不高于壬苯醇醚，具有研发成为***内杀精避孕药物的潜力。
实施例5甲芬那酸对***粘膜上皮VK2/E6E7细胞质膜的损伤
实验方法
取对数生长期的VK2/E6E7细胞接种于24孔培养板中，1×105个细胞/孔，置于CO2细胞培养箱37℃预培养过夜；
将各培养孔内培养基倾倒干净。空白组和对照组加入500μL新鲜培养基，处理组每孔加入500μL实施例1中的浓度分别为0.5、1、1.5、2和2.5mmol/L甲芬那酸稀释液；以DefinedKeratinocyte-SFM为空白对照，以壬苯醇醚溶液为现有市售药物阳性对照。作用4小时后，每孔加入SYBR-14和PI各2.5μl，并使其终浓度分别达到100nM和12nM，混匀后将混合液放在37℃，5％CO2培养箱中孵育20min，在荧光显微镜下观察。
实验结果
参见图4，对照组VK2/E6E7细胞因质膜保持完整，PI不能通过完整的细胞膜，SYBR-14可使细胞呈绿色荧光；甲芬那酸处理组大部分细胞呈绿色荧光，仅个别细胞因质膜被破坏，PI进入细胞内与DNA结合而呈红色荧光。可见，甲芬那酸对***粘膜上皮VK2/E6E7细胞质膜的损伤相对轻微。而N-9处理组只呈现细胞核结构的红色荧光，表明细胞膜损伤严重，细胞结构不完整。
总结：当甲芬那酸在完全抑制***运动的浓度下，可保持部分***质膜的完整性，不会引起***质膜的严重损伤，提示其灭活***的机制并非完全依赖破坏***质膜，还可能通过影响***线粒体功能或离子通道而起到抑制***运动的作用。而市售杀***剂壬苯醇醚N-9的灭活***的机制主要是破坏***质膜，该机制可导致其对***粘膜损伤的副作用。因此运用甲芬那酸制备***内杀精避孕药物时，其副作用可望小于目前市售的以N-9为活性成分的***内杀***剂。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种甲芬那酸在制备杀精避孕药物中的应用。
2.一种杀精避孕药物，其特征在于，包括如式I所示的化合物:
3.根据权利要求2所述的一种杀精避孕药物，其特征在于，所述杀精避孕药物的给药途径是***给药，其剂型包括：凝胶剂、栓剂、膜剂、乳膏剂或缓释剂。
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