CN110205386B - 一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p及其应用 - Google Patents
一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR‑33a‑5p及其应用,属于生物基因治疗领域。该miRNA分子miR‑33a‑5p在子宫内膜癌组织中的表达率明显低于正常内膜组织,可用于制备子宫内膜癌辅助诊断或子宫内膜癌辅助治疗/预后评估试剂或试剂盒中。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和肿瘤学领域,具体涉及一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p及其应用。
背景技术
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,又称子宫体癌,是女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一。其多发生于围绝经期及绝经后妇女。随着人口平均寿命的增加以及生活***下,子宫内膜癌早期检测以及患者预后的评估以及晚期或复发性子宫内膜癌患者的治疗仍然是一种难题。
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性小型非编码的长约18-22个核苷酸的成熟形式的RNA,可以调节一组目标基因并导致mRNA降解或翻译抑制。miRNAs在癌症的起始和进展中扮演重要角色,在细胞生长与细胞分化,凋亡,增殖,胚胎发育以及干细胞更新等各种生物过程。miRNAs对肿瘤既可以是起抑癌作用,也可以起到促癌作用,已有研究报道一些miRNA在子宫内膜癌中表达失衡,提示miRNA在子宫内膜癌的发生和发展中扮演重要角色,已有研究表明, miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141和miR-429在子宫内膜癌中异常表达。但是并没有关于miR-33a-5p在子宫内膜癌组织中表达情况的相关报道。
发明内容
针对上述问题,本发明提供一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p和应用。该miRNA分子miR-33a-5p可作为子宫内膜癌的诊断标志,为子宫内膜癌的治疗提供分子靶点,针对其设计的mimics可应用于抗肿瘤的药物的制备。
为实现上述目的,本发明提供了一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p,其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
所述miRNA分子miR-33a-5p在子宫内膜癌辅助诊断或子宫内膜癌治疗/预后评估中的应用。
所述miRNA分子miR-33a-5p在制备子宫内膜癌辅助诊断或子宫内膜癌辅助治疗/预后评估试剂或试剂盒中的应用。
用于检测miRNA分子miR-33a-5p的试剂在制备子宫内膜癌辅助诊断或子宫内膜癌治疗/预后评估试剂或试剂盒中的应用。
所述用于检测miRNA分子miR-33a-5p的试剂包括用于扩增所述miRNA分子miR-33a-5p的特异性引物,该引物序列如下所示:
F:5’-GAC TTA AAC GTG GAT GTA CTT GC-3’ (SEQ ID NO .2)。
用于检测与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p的试剂盒在制备子宫内膜癌辅助检测或辅助诊断工具中的应用。
用于检测与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p的试剂盒在制备子宫内膜癌治疗/预后评估工具中的应用。
一种用于子宫内膜癌辅助诊断或预后评估的试剂盒,其中包括:
(1)用于扩增miR-33a-5p的特异性引物;
(2)标准DNA模板;
(3)PCR反应液。
一种检测miRNA的方法,包括如下步骤:
(1)提取样品总RNA;
(2)制备样品cdna;
(3)定量扩增miR-33a-5p。
其过表达miR-33a-5p的mimics由苏州吉玛基因股份有限公司设计。在获取了其具体的序列之后,并设计mimics序列进行转染;采用该片段过表达子宫内膜癌细胞系Ishikawa,发现肿瘤细胞的迁移侵袭能力下降。因此该分子的功能可能与癌细胞的迁移侵袭能力相关。
本发明提出子宫内膜癌中低表达的miRNA分子,其可作为子宫内膜癌分子标志物或靶点,应用于子宫内膜癌临床早期诊断、预后判断或靶向治疗,并有利于进一步阐明子宫内膜癌的发生发展机理、信号通路等,极具应用前景和理论价值。
附图说明
图1为 real-time-PCR中miR-33a-5p对应的溶解曲线与扩散曲线图,其中图1-1为对应的溶解曲线,图1-2为对应的扩增曲线图。
图2 为real-time-PCR中miR-33a-5p在癌组和非癌组的相对表达量图。
图3为子宫内膜癌组织中miR-33a-5p的ROC曲线分析图。
图4为PCR检测mimics miR-33a-5p在Ishikawa细胞中转染效率图。
图5为利用划痕实验法检测miR-33a-5p过表达对子宫内膜癌细胞迁移的影响图。
图6为利用transwell实验法检测miR-33a-5p过表达对子宫内膜癌细胞侵袭的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本领域技术人员知晓,可以根据相关标志物的序列,对本发明的引物序列作出适当调整和修改,这些经过修改的引物序列仍可用于检测所述的标记物。本发明也包括这些等同的技术方案。
实施例1 miR-33a-5p在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达情况。
1.标本采集。
样本采集收集中国医科大学附属盛京医院2011至2017年期间因子宫内膜癌、和宫颈上皮内瘤变 Ⅲ级(cervicalintraepithelialneoplasiaⅢ,CINⅢ) 行手术切除的正常子宫内膜组织。相应分为子宫内膜癌组(n=80)、正常对照组(n=40)。患者术前均未接受放化疗及激素治疗,且已经病理确诊。子宫内膜癌组手术临床分期及病理分级(FIGO 2009):早期:Ⅰ期加Ⅱ期60例,晚期:Ⅲ期和IV期20例;组织学分级(WHO标准):高分化子宫内膜癌33例,中分化32,低分化子宫内膜癌15例;***转移阳性11例,无***转移69例;浸润肌层<1/2共44例,浸润肌层≥1/2 共36例。本研究已通过中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的批准。
2.引物设计。
根据hsa-miR-33a-5p的序列,设计引物。具体序列如下:
hsa-miR-33a-5p的反转录引物序列SEQ ID No.2:F:5’-GAC TTA AAC GTG GATGTA CTT GC-3’;
U6的正向引物序列SEQ ID No.3:GGAACGATACAGAGAAGATTAGC;
U6的反向引物序列SEQ ID No.4:TGGAACGCTTCACGAATTTGCG。
上述引物由上海生工生物科技有限公司合成,其中U6为内参校准基因。
3、应用Real-time-PCR方法检测miR-33a-5p在子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织的表达量。
3.1、收集的组织标本总RNA提取。
(1)将取来的子宫内膜癌样本(已加入1mL trizol裂解液),冰上静置5min。
(2)加入200μL氯仿,振荡混匀后室温放置2-3min。4℃ 12,000g离心15min。
(3)吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面。
(4)加入等量的异丙醇混匀,-20℃沉淀。
(5)4℃ 12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。
(6)加入1mL 75%乙醇,悬浮沉淀。
(7)4℃ 12000g离心5min,尽量弃上清。
(8)室温晾干或真空干燥5-10min。注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。
(9)用20μL DEPC H2O溶解RNA样品。
(10)RNA纯度的测定和RNA的定量以DEPC H2O为对照(Blank),取2μL RNA溶液于酶标仪上检测样本浓度和质量。
3.2、逆转录合成。
(1)逆转录反应。
首先,进行miRNA的反转录预变性,配置预变性反应液,配置方法如表1所示。
37 ℃ 1h,85℃ 5min,后向各管中加入 90μL DEPC 水至总体积为 100μL,-20℃保存。
3.3、PCR。
荧光定量PCR扩增,如表2。
表2 PCR反应体系。
其中,内参U6的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No .3所示,反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
统计分析。
所有结果以均值± SEM值的形式呈现,并制成表格。数据统计分析使用的软件为SPSS22.0,作图软件为Graphpad prism 5(Graphpad Software ,San Diego ,CA),P<0 .05和P<0.01为显著性差异和极显著性差异的筛选标准。
结果分析。
数据分析。
用扩增仪配置的7500 Fast Software v2 .3软件处理定量PCR数据,建立每个基因的阈值和基线,溶解扩增曲线由软件生成,如图1,表明扩增结果良好。获得每个样本反应对应的CT值。为了确保结果数据的可靠性,认为内源对照基因CT值大于30的样品RNA质量较低,并将其从分析中排除,样品中的相对表达量采用2-ΔΔct 的算法。
在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中的表达水平利用Real-time PCR方法,如图2中结果,结果表明miR-33a-5p在子宫内膜癌组织中的表达显著低于在正常子宫内膜中的表达(P<0.05),进行ROC曲线分析,检查了miR-33a-5p的敏感性和特异性。并使用曲线下的相关区域(AUC)来确认miR-33a-5p的诊断功效。如图3所示,miR-33a-5p的AUC达到0.9166,(95%CI:0.865 to 0.9682)。 这些结果表明miR-33a-5p可以区分子宫内膜癌和正常子宫内膜组织。
将miR-33a-5p在子宫内膜癌中的表达水平与临床病理因素之间的关系如表3所示,其中入组患者一共80人,将其按年龄,临床分期,分化程度,浸润深度,以及***转移情况进行分组。结果表明,早期内膜癌(Ⅰ~Ⅱ期) miR-33a-5p表达明显高于于晚期内膜癌(Ⅲ~Ⅳ期)的表达,差异均有统计学意义(P <0.05)。临床病理分析结果表明,miR-33a-5p的表达与子宫内膜癌患者的临床分期有关。
表3 miR-33a-5p在在子宫内膜癌组织中的表达与其临床病理参数的关系。
注:
P = 0.2036, High differentiation vs. Middle differentiation;
P = 0.1507, High differentiation vs.Low differentiation。
实施例2 体外细胞实验。
1.Ishikawa人子宫内膜癌中分化细胞系分别购自中科院上海细胞库。
细胞培养基RPMI1640和胎牛血清均购自Gibico公司,过表达mimics合成购自苏州吉玛技术有限公司,应用6孔培养板培养Ishikawa细胞,当细胞生长达到80%左右时进行转染,过表达的miR-33a-5p 为mimics-33a-5p,miR-NC为对照组、Ishikawa细胞为空白对照组,lip3000作为转染试剂,进行转染。转染48h后提取细胞RNA,RNA抽提试剂RNAiso Plus购自宝生物工程有限公司,逆转录定量试剂盒购自宝生物公司。进行检测转染效率。如图4,结果表明,成功在Ishikawa细胞中将miR-33a-5p进行过表达。
2.细胞的迁移能力用划痕实验来检测,6孔板中的细胞培养状态良好,无污染,细胞培养至融合度为百分之九十,力度均匀的用中枪头划笔直直线,用无血清培养基继续培养细胞,在此期间,每12h,24h,48,60h在显微镜下拍摄划痕愈合的照片,检测细胞迁移能力。结果表明,与miR-NC组相比,miR-33a-5p过表达组的Ishikawa细胞迁移能力显著降低(图5),说明过表达miR-33a-5p可以抑制子宫内膜癌细胞的迁移能力。
3.将试剂盒的基质胶按说明书稀释,在小室上铺20µL的稀释好的基质胶,小室置于24孔板上,小室下加入700 µL完全培养基。显微镜下观察细胞状态良好,用0.25%胰酶消化液细胞,将混合液置入离心管中,1000rpm离心5分钟;去上清,用不含血清的培养液洗涤细胞,显微镜下细胞计数,将transwell小室上室放入200 µL细胞悬液,细胞数约5*104个细胞。在孵育培养箱中细胞穿16小时,后中止拿出transwell小室,用PBS轻轻洗涤2次,4% 多聚甲醛固定细胞,每孔加入700ul细胞固定液,固定液中固定60min,PBS洗净小室,晾干小室,苏木素中染色50min,将小室放入染色,后用PBS洗涤小室3次,在倒置20倍镜下观察,随机取3个视野,统计细胞个数,检测细胞的侵袭能力。transwell结果表明,与对照组进行比较,miR-33a-5p过表达组的Ishikawa细胞的侵袭能力显著降低,说明过表达miR-33a-5p可以抑制子宫内膜癌细胞的侵袭能力(图6)。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例,应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案,均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。
序列表
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
GUGCAUUGUA GUUGCAUUGC A 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GACTTAAACG TGGATGTACT TGC 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
GGAACGATACAGAGAAGATTAGC 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
TGGAACGCTTCACGAATTTGCG 22
Claims (4)
1.用于检测miRNA分子miR-33a-5p的试剂在制备子宫内膜癌辅助诊断或子宫内膜癌治疗/预后评估试剂或试剂盒中的应用。
2.用于检测miRNA分子miR-33a-5p的试剂包括用于扩增所述miRNA分子miR-33a-5p的反转录引物,该引物序列如下所示:
F:5’-GAC TTA AAC GTG GAT GTA CTT GC-3’。
3.用于检测与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p的试剂盒在制备子宫内膜癌辅助检测或辅助诊断工具中的应用。
4.用于检测与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p的试剂盒在制备子宫内膜癌治疗/预后评估工具中的应用。
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