CN110205335A - 以序列优化的分泌形式的FAPα为基础的肿瘤DNA疫苗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以序列优化的分泌形式的FAPα为基础的肿瘤DNA疫苗的应用，属于肿瘤DNA疫苗领域。涉及一种FAPα来源的分泌形式FAPα胞外段序列shF(m)及其密码子优化序列OshF(m)以及以两种序列为基础构建的DNA疫苗在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用。本发明通过免疫原性实验和抗肿瘤实验确定了上述DNA疫苗相比具有原始FAPα序列的DNA疫苗具有更强的抗肿瘤活性，同时序列OshF(m)与原始序列的同源性只有76％，且能更好的表达目的蛋白，在制备以FAPα为基础的各类肿瘤疫苗中具有更好的应用前景。

Description

以序列优化的分泌形式的FAPα为基础的肿瘤DNA疫苗的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤DNA疫苗领域，具体地说，本发明涉及靶向FAPα的重组DNA载体CpVR-shF(m)及其密码子优化后的重组DNA载体CpVR-OshF(m)在制备抗肿瘤疫苗中的应用。

背景技术

肿瘤微环境(TME)是肿瘤赖以生存的场所，为肿瘤生长提供必要的养分，同时将肿瘤细胞与免疫细胞隔离开来，组织免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。癌症相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中重要的组成部分，与肿瘤的生长，侵袭，转移密切相关，可以通过与肿瘤细胞直接相互作用，分泌可溶性细胞因子(例如基质细胞衍生因子：SDF-1)，重塑细胞外基质等手段促进肿瘤的生长。成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)是肿瘤微环境中CAFs表面的特异性标志物，具有胶原酶和二肽基肽酶活性，可以重塑肿瘤细胞外基质，促进肿瘤生长转移。研究表明通过敲除小鼠肿瘤内的FAPα阳性的CAFs能够明显抑制肿瘤的生长，并且促进了肿瘤内T细胞的浸润，增强了疫苗的抗肿瘤效果。而且在超过90％的人类上皮细胞癌组织中(如乳腺癌，结直肠癌，胰腺癌，肺癌等)，FAPα的表达量均明显提高，因此CAFs以及FAPα作为肿瘤治疗的靶点被广泛地研究。目前国内外针对它们的治疗策略包括：1)靶向FAPα的抗体治疗；2)反义RNA沉默FAPα表达；3)FAPα酶活性的抑制剂；4)靶向FAPα的肿瘤疫苗(DNA疫苗、树突状细胞疫苗、瘤苗等)；5)嵌合抗原受体T细胞疗法。

在我们的前期工作中，构建了一种靶向FAPα的DNA疫苗(CpVR-FAP)，其包含了全长的人源FAPα，而且为了提高疫苗的安全性，把FAPα由氨基酸序列第624位的丝氨酸(Ser624)进行了突变，以去除掉FAPα的酶活性。并且证明了这种疫苗具有一定的抗肿瘤活性。但当把疫苗的治疗时间点延后至肿瘤形成之后，CpVR-FAP的抗肿瘤活性几乎消失。这说明全长的FAPα在应用到肿瘤治疗上仍然具有一定安全性问题，而且疫苗的有效性也需要提高。近期研究表明，全长的FAPα可以通过非酶活性来促进肿瘤的生长，而且特定的跨膜区域对FAPα的二聚化及活性有重要的影响，这为我们疫苗的设计和优化提供了思路。

发明内容

本发明的目在于提供两种优化的具有抗肿瘤活性的FAPα来源的DNA片段，可应用制备抗肿瘤疫苗，并且本发明还构建了它们的DNA疫苗形式。同时该发明还提供了两种靶向FAPα的DNA疫苗在抗肿瘤治疗中的应用。

下面对本发明的技术方案介绍如下：

本发明所述的一种SEQ ID NO:1所示的shF(m)DNA片段，所述序列包含一段Kozak序列，一段分泌信号肽tPA序列，及FAPα胞外段核苷酸序列(氨基酸序列为27位到760位)。

本发明所述的一种SEQ ID NO:2所示的shF(m)DNA片段，具有与shF(m)相同的氨基酸序列，在序列SEQ ID NO:1基础上进行了密码子优化，提高了蛋白表达水平；SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:1的核苷酸序列同源性下降到76％，更有助于在体内对基因分布进行监测。

本发明还包括上述DNA片段序列制备的DNA疫苗及其在抗肿瘤免疫治疗中的应用。

为了提高疫苗应用的安全性和有效性，本发明对全长FAPα进行了优化，新形式的FAPα只包含原始FAPα的胞外部分，这样可以完全去除FAPα促进肿瘤生长的作用以提高疫苗的安全性；同时有研究表明tPA信号肽能够促进目的蛋白的分泌表达更好的激活机体免疫***，因此我们在新形式的FAPα前端增加了tPA信号肽来提高疫苗的有效性。最后我们对新形式FAPα的序列进行了密码子优化，以提高目的基因在人和小鼠体内的表达，并且降低了与原始序列的同源性，这样更便于在体内对疫苗分布的监测。

本发明的优点在于截取FAPα的胞外段，并添加tPA信号肽，获得的新序列不仅具有更高的安全性，还具有分泌表达的能力，并且为了更好的提高序列的蛋白表达水平，以及方便对目的序列在体内分布的监测，对已优化的片段进行了密码子优化，这两种优化形式的FAPα片段未见报道，并且以上述片段为基础构建的DNA疫苗具有更强的抗肿瘤活性，这为基于肿瘤微基质抗原FAPα的DNA疫苗、病毒载体疫苗、RNA疫苗、树突状细胞疫苗的构建和应用奠定了基础。

附图说明

图1A：DNA疫苗载体CpVR；

图1B：DNA疫苗CpVR-shF(m)，该重组质粒为将DNA片段SEQ ID NO:1***CpVR载体中形成；

图1C：DNA疫苗CpVR-OshF(m)，该重组质粒为将DNA片段SEQ ID NO:2***CpVR载体中形成；

图1D：CpVR-shF(m)真核表达鉴定，CpVR载体(Vec，阴性对照)、CpVR-hF(m)(CpVR-FAP，阳性对照)、CpVR-shF(m)转染293T细胞后通过蛋白印记法证明目的蛋白表达；

图1E：CpVR-OshF(m)真核表达鉴定，CpVR载体(Vec，阴性对照)、CpVR-shF(m)(阳性对照)、CpVR-OshF(m)转染293T细胞后通过蛋白印记法证明目的蛋白表达；

图2A：免疫原性实验免疫策略和分组，小鼠按图分为3组，每组5只，共免疫三次每次间隔两周，最后一次免疫两周后进行检测；

图2B：检测小鼠脾细胞释放IFN-γ的能力，健康小鼠在完成免疫两周后，ELISPOT法检测脾细胞释放IFN-γ的能力，阴性刺激物为非特性小肽，阳性刺激物为对应FAP小肽；

图2C：检测小鼠CTL杀伤靶细胞能力，健康小鼠在完成免疫两周后，分离小鼠淋巴细胞作为效应细胞，与用特异FAP小肽标记的P815细胞作为靶细胞共孵育，CFSE荧光标记法检测免疫小鼠的CTL应答能力(E：T＝25：1、50：1、100：1)；

图3A：CpVR-shF(m)与CpVR-hF(m)在模拟术后辅助治疗模型上的治疗策略和分组，小鼠按图分为3组，每组8只，在皮下接种4T1乳腺癌细胞两天后进行治疗，共免疫3针，间隔一周，在第30天进行检测；

图3B：ELISPOT法检测小鼠脾细胞释放IFN-γ的能力，荷瘤小鼠在第30天处死，用ELISPOT法检测不同组小鼠脾细胞释放IFN-γ的能力，阴性刺激物为非特性小肽，阳性刺激物为对应FAP小肽；

图3C：小鼠的肿瘤重量对比，在第30天处死小鼠后剥离皮下肿瘤并称重记录，与Vec相比，CpVR-hF(m)组的肿瘤抑制率为38.4％，CpVR-shF(m)组的肿瘤抑制率为64.7％；

图3D：CpVR-shF(m)与CpVR-hF(m)在荷瘤模型上的的治疗策略和分组，小鼠按图分为3组，每组8只，在皮下接种4T1乳腺癌细胞七天后进行治疗(此时皮下已形成肿瘤)，共免疫3针，间隔一周，在第28天进行检测；

图3E：小鼠的肿瘤重量对比。在第28天处死小鼠后剥离皮下肿瘤并称重记录，与Vec相比，CpVR-hF(m)组失去了对肿瘤抑制的能力，CpVR-shF(m)组的肿瘤抑制率为21.0％；

图4A：肿瘤内浸润的CD8⁺淋巴细胞检测，流式检测肿瘤中CD3⁺CD8⁺淋巴细胞在CD45⁺细胞中的比例，与CpVR-hF(m)相比，CpVR-shF(m)能促进更多的CD3⁺CD8⁺淋巴细胞浸润，P<0.05；

图4B：肿瘤组织中FAPα的表达量，提取肿瘤组织RNA并逆转录为cDNA，再通过荧光定量PCR检测FAPα在肿瘤中的表量，与CpVR-hF(m)相比，CpVR-shF(m)能够更好的清除FAPα，P<0.01；

图4C：肿瘤组织中SDF-1的表达量，提取肿瘤组织RNA并逆转录为cDNA，再通过荧光定量PCR检测SDF-1在肿瘤中的表量，与CpVR-hF(m)相比，CpVR-shF(m)能够更好的减少SDF-1，P<0.001；

图5A：CpVR-OshF(m)与CpVR-shF(m)在荷瘤模型上的的治疗策略和分组，小鼠按图分为3组，每组8只，在皮下接种4T1乳腺癌细胞七天后进行治疗(此时皮下已形成肿瘤)，共免疫3针，间隔一周，在第28天进行检测；

图5B：不同组荷瘤鼠脾细胞释放IFN-γ的能力，小鼠完成疫苗治疗后，在第28天用ELISPOT法检测脾细胞释放IFN-γ的能力，阴性刺激物为非特性小肽，阳性刺激物为对应FAP小肽；

图5C：不同组荷瘤鼠的CTL杀伤靶细胞能力，取小鼠的脾脏中分离出的淋巴细胞为效应细胞，与靶细胞共孵育，采用CFSE荧光标记法检测免疫小鼠的CTL应答(E：T＝50：1)；

图5D：小鼠的平均肿瘤体积生长，在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第11天开始，每隔两天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值+SD，P<0.0001

图5E：肿瘤组织中FAPα的表达量，提取肿瘤组织RNA并逆转录为cDNA，再通过荧光定量PCR检测FAPα在肿瘤中的表量，与CpVR-shF(m)相比，CpVR-OshF(m)能够更好的清除FAPα，P<0.05；

图5F：肿瘤组织中SDF-1的表达量，提取肿瘤组织RNA并逆转录为cDNA，再通过荧光定量PCR检测SDF-1在肿瘤中的表量，与CpVR-shF(m)相比，CpVR-OshF(m)能够更好的减少SDF-1，P<0.01。

具体实施方式

1.CpVR-shF(m)和CpVR-OshF(m)DNA疫苗的构建及鉴定

所用载体为引入CpG基序的真核表达质粒VR1012，简称为CpVR，包含有启动子CMV，内含子A、BGH序列，CpG序列，卡纳霉素抗性序列，共5305bp，图谱见图1A。

以CpVR-hF(m)(及CpVR-FAP)为模板，通过多步PCR获得核苷酸序列SEQ ID NO:1，并在两端引入BglII酶切位点和与载体两端序列相同的同源臂序列，将目的DNA片段和经过BglII酶切获得的载体片段进行DNA电泳和胶回收，获得目的片段和载体，使用同源重组试剂盒，50℃孵育15分钟，转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养过夜。挑选阳性菌落于5ml LB培养基中37℃下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒，用BglII酶切鉴定，并进行序列测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒CpVR-shF(m)，图谱见图1B。

分别将CpVR-hF(m)和CpVR-shF(m)以及CpVR空质粒转染293T细胞，48小时后收集细胞并裂解，获得蛋白样品进行western blot蛋白免疫印迹分析，结果如图1D所示：CpVR-shF(m)质粒与CpVR-hF(m)阳性对照质粒转染的293细胞所表达的蛋白能够FAPα特异性抗体染色，并且其分子量大小与预期分子量80kD相符合，CpVR阴性载体质粒没有检测到蛋白条带，结果说明CpVR-shF(m)能够正确表达目的基因编码的蛋白。

核苷酸序列SEQ ID NO:1经过密码子优化并通过基因合成目的核苷酸序列SEQ IDNO:2，并引入酶切位点PstI和BamHI，将包含目的基因的质粒及载体经PstI和BamHI双酶切后用胶回收试剂盒回收目的片段和载体，以T4DNA连接酶，在16℃下连接过夜。转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37℃下培养过夜。挑选阳性菌落于5ml LB培养基中37℃下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒，用PstI和BamHI进行双酶切鉴定，并进行序列测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒CpVR-OshF(m)，图谱见图1C。

分别将CpVR-shF(m)和CpVR-OshF(m)以及CpVR空质粒转染293T细胞，48小时后收集细胞并裂解，获得蛋白样品进行western blot蛋白免疫印迹分析，结果如图1E所示：CpVR-OshF(m)质粒与CpVR-shF(m)阳性对照质粒转染的293T细胞所表达的蛋白能够被FAPα特异性抗体染色，并且其分子量大小与预期分子量80kD相符合，CpVR阴性载体质粒没有检测到蛋白条带，并且可以看到CpVR-OshF(m)质粒的蛋白表达更强，结果说明CpVR-shF(m)能够正确表达目的基因编码的蛋白，且表达能力更强。

2.CpVR-shF(m)DNA疫苗的免疫原性检测

为了比较新形式的疫苗与原始疫苗在诱导免疫反应上的差别，进行健康小鼠免疫原性实验。

将体重约16～18g的雌雄BALB/c小鼠按照图2A所示进行随机分组，每组5只。包括Vector空载体对照组，CpVR-hF(m)(此疫苗为课题组早期构建疫苗CpVR-FAP，包含全长的人源FAPα)疫苗组以及CpVR-shF(m)疫苗组。各组小鼠肌肉免疫对应疫苗共3次，每次间隔2周(图2A)。在最后一次免疫2周后，对小鼠进行安乐死，并取脾进行相关细胞免疫检测。分离各组小鼠的脾脏，剪碎研磨制备单细胞悬液，检测各组小鼠脾细胞中分泌FAPα特异性IFN-γ的淋巴细胞数目以及淋巴细胞CTL杀伤能力。如图2B所示，当用加入无关小肽(NS pep)刺激后，3组小鼠脾细胞分泌IFN-γ的水平没有明显差异，且数目都小于50，而当用FAPα小肽(Fpep)刺激后，同Vector组相比，免疫有NDA疫苗的两组IFN-γ分泌的斑点数明显提高(P<0.0001)，并且CpVR-shF(m)相比于CpVR-hF(m)疫苗提高的更为明显(P<0.01)。脾细胞的特异性杀伤活性检测如图2C所示，相比Vector组，免疫有微基因疫苗的两组特异性细胞杀伤活性明显提高(P<0.05)，并且CpVR-shF(m)相比于CpVR-hF(m)提高的更为明显(P<0.05)。以上结果表明，新形式的CpVR-shF(m)相比CpVR-hF(m)能够诱导的更强的特异性细胞免疫反应。

3.CpVR-shF(m)DNA疫苗的抗肿瘤应用

3.1.CpVR-shF(m)DNA疫苗在模拟术后***模型上的抗肿瘤应用

首先验证疫苗在辅助***上的应用，在小鼠皮下接种肿瘤细胞两天后开始对小鼠进行疫苗治疗。

按照图3A，对小鼠进行分组(体重为16～18g的BALB/c雌雄小鼠)，每组8只。包括包括Vector空载体对照组，CpVR-hF(m)疫苗组，CpVR-shF(m)疫苗组。各组小鼠皮下接种2万个4T1肿瘤细胞，两天后开始免疫对应疫苗，共免疫3次，每次间隔1周。在最后一次免疫2周后，对小鼠进行安乐死，剥离小鼠脾脏进行免疫反应检测，同时剥离皮下肿瘤进行称重和分析。分离各组小鼠的脾脏，制备单细胞悬液，检测脾细胞FAPα表位肽特异性IFN-γ分泌水平，如图3B所示，当用非特异性小肽(NS pep)刺激后，CpVR-hF(m)组和CpVR-shF(m)组IFN-γ的斑点数相比于Vec组明显提高(P<0.01)，其中CpVR-shF(m)相比较CpVR-hF(m)更加明显(P<0.05)，这说明CpVR-shF(m)和CpVR-hF(m)都能诱导FAPα特异性免疫反应，且形式的CpVR-shF(m)诱导能力更强。

处死小鼠后剥离肿瘤，瘤重结果(图3C)显示：对比Vector载体组，两者都能抑制肿瘤生长(P<0.01),且相比于CpVR-hF(m)，CpVR-shF(m)能更好的抑制4T1荷瘤鼠肿瘤生长的作用(P<0.05)；根据各组小鼠瘤重的平均重量计算抑瘤率，CpVR-shF(m)疫苗的抑瘤率为38.4％，CpVR-shF(m)疫苗的抑瘤率更是高达64.7％。说明CpVR-shF(m)疫苗的抑瘤效果优于CpVR-hF(m)疫苗。，

综上，CpVR-shF(m)和CpVR-hF(m)疫苗均可以有效诱导FAPα特异性的细胞免疫反应，进而抑制肿瘤生长，并且新形式的CpVR-shF(m)诱导的特异性反应更强，抗肿瘤活性更高。

3.2.CpVR-shF(m)DNA疫苗在肿瘤形成后模型上的抗肿瘤应用

为了更好的验证疫苗的抗肿瘤效果，将疫苗的治疗时间点延后到小鼠皮下形成肿瘤节，考察疫苗对肿瘤的治疗作用

选取体重为16～18g的BALB/c小鼠，在第0天以致死剂量(2万个)的4T1肿瘤细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第7天皮下肿瘤成瘤。按照图3D，随机将小鼠分为3组，每组8只，包括包括Vector空载体对照组，CpVR-hF(m)疫苗组，CpVR-shF(m)疫苗组。在第7天开始采用腿部肌肉注射的方式，对各组小鼠进行免疫，共3次，每次间隔7天。在接种瘤后的第28天进行剥瘤称重。瘤重结果(图3E)显示：对比Vector载体组，CpVR-hF(m)疫苗已经失去了抑制肿瘤的作用，而CpVR-shF(m)疫苗仍然具有很强的抗肿瘤效果(P<0.01)；根据平均瘤重计算抑瘤率，CpVR-shF(m)疫苗抑瘤率为21％，而CpVR-hF(m)疫苗的抑瘤率为0。

以上结果说明，在肿瘤形成后再展开治疗，新形式CpVR-shF(m)仍然具有较强的抗肿瘤效果。

综合3.1，3.2结果，表明新形式CpVR-shF(m)相比全长FAPα疫苗CpVR-hF(m)在荷瘤小鼠上能够更好地诱导FAPα特异性地免疫反应，同时具有更好的抗肿瘤效果。进而说明这种只含有胞外段FAPα，并且带有分泌信号肽的shF(m)DNA片段在制备抗肿瘤产品中更具有优势。

4.CpVR-shF(m)疫苗优于CpVR-hF(m)疫苗的机理探究。

为了探究CpVR-shF(m)在抗肿瘤活性上好于CpVR-hF(m)的原因，将剥离的肿瘤细胞进行胶原酶处理，分离成单细胞悬液，进行抗体染色流式细胞仪分析；同时提取肿瘤组织RNA，逆转录成cDNA，进行荧光定量PCR检测目的基因的相对表达量。

肿瘤单细胞悬液用PBS缓冲液洗两次后，用混有CD3、CD8和CD45的抗体的染色液进行染色，然后再洗涤两次后用染色液重悬进行流式细胞仪检测，分析CD3⁺CD8⁺T细胞在CD45⁺细胞中的比例，结果如图4A所示，相比CpVR-hF(m)疫苗，CpVR-shF(m)疫苗能够诱导更多的CD3⁺CD8⁺T细胞浸润到肿瘤内部，而CD3⁺CD8⁺T细胞是疫苗杀伤肿瘤的主要方式(P<0.05)。荧光定量PCR结果显示，CpVR-shF(m)疫苗相比于CpVR-hF(m)疫苗更好地清除了肿瘤中的FAPα(图4B，P<0.01)和SDF-1(图4C，P<0.001)。

同时shF(m)DNA片段只含有FAPα的胞外段，因此可以完全封闭FAPα的活性，具有更高的安全性，同时因为加入tPA分泌信号肽，可以更好地分泌表达蛋白，并诱导机体的免疫应答。

因此CpVR-shF(m)疫苗相比原始疫苗能够诱导更多的效应细胞进入肿瘤微环境中，靶向FAPα，调节肿瘤微环境。

5.CpVR-OshF(m)疫苗与CpVR-hF(m)疫苗抗肿瘤效果比较。

5.1CpVR-OshF(m)疫苗与CpVR-hF(m)疫苗的抑制肿瘤生长活性

选取体重为16～18g的BALB/c雌雄小鼠，在第0天以致死剂量(2万个)的4T1肿瘤细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第7天皮下肿瘤成瘤。按照图5A，随机将小鼠分为3组，每组8只，包括Vector空载体对照组，CpVR-OshF(m)疫苗组，CpVR-shF(m)疫苗组。在第7天开始采用腿部肌肉注射的方式，对各组小鼠进行免疫，共3次，每次间隔7天。跟踪进行肿瘤体积的测定，肿瘤生长曲线(图5B)显示：对比Vector组，CpVR-OshF(m)疫苗与CpVR-hF(m)疫苗都表现了明显的抑制4T1荷瘤鼠肿瘤生长的作用(P<0.0001)，但是二者没有明显地差异。同时脾细胞分泌IFN-γ水平(图5C)和脾细胞的特异性杀伤活性(图5D)，二者相较于Vector都有明显地提高(P<0.01)，但同样二者没有明显区别。

以上结果表明，CpVR-OshF(m)疫苗与CpVR-hF(m)疫苗在诱导细胞免疫和抑制肿瘤地生长上作用相似，没有明显差异。

5.2 CpVR-OshF(m)疫苗与CpVR-shF(m)疫苗在调节微环境上的差别

取适量肿瘤组织，提取RNA逆转录为cDNA，再进行荧光定量PCR检测目的基因的相对表达量。结果显示，相比CpVR-hF(m)疫苗，CpVR-OshF(m)疫苗更显著地降低了FAPα的表达量(图5E,P<0.05),同时也降低了与FAPα相关的因子SDF-1(图5F，P<0.01)。说明CpVR-OshF(m)疫苗具有更好地微环境调节能力。

综合5.1与5.2，说明CpVR-OshF(m)疫苗与CpVR-shF(m)疫苗在激起免疫反应和抑制肿瘤生长作用上没有明细差异，但是CpVR-OshF(m)疫苗能够更好地调节肿瘤微环境。当CpVR-OshF(m)疫苗联合其他肿瘤疫苗和治疗手段(化疗，放疗，手术，免疫调节剂等)，也许会有更好地抗肿瘤效果。同时，由于OshF(m)DNA片段在经过密码子优化后与原始FAPα的序列同源性降到了76％，因此便于对体内目的片段分布监测，更适合临床实验研究。

Claims (9)

1.一种DNA片段，其特征在于，来源于人源成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)。

2.根据权利要求1所述的DNA片段为shF(m)，其特征在于，包含一段Kozak序列，一段分泌信号肽tPA序列，及FAPα胞外段核苷酸序列(氨基酸序列为27位到760位)，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种经过密码子优化的DNA片段,该DNA片段为权利要求2所述shF(m)的核苷酸序列优化后的DNA片段OshF(m),其特征在于，提高了在人和鼠体内的表达，与shF(m)的序列同源性降至76％，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求1～3任一项所述的DNA片段，DNA片段的转录产物，由此DNA片段生产的蛋白类制品在制备防治肿瘤的产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自高表达FAPα的肿瘤。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品中包括疫苗。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括表达权利要求1～3中DNA片段的重组DNA疫苗及其衍生疫苗；优选地，其中的DNA疫苗包含一种SEQ ID NO:1所示的shF(m)核酸序列或SEQ ID NO:2所示的OshF(m)核酸序列；更优选地，其中的DNA疫苗的载体骨架为CpVR，在所述CpVR载体上以多克隆酶切位点的连接方式***SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示的核酸序列；更优选地，其中所述***的多克隆位点为BglII或者PstI/BamHI。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述疫苗包括权力要求1～3中的DNA片段的病毒载体疫苗、树突状细胞疫苗，包含由权利要求1～3中的DNA片段转录出的RNA制备的RNA疫苗、包含由权利要求1～3中的DNA片段生产的蛋白类疫苗以及上述疫苗的衍生疫苗。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品中还可包括免疫佐剂和/或化疗药物；优选地，其中所述的免疫佐剂包括但不限于CpG、IL-2、IFN-γ、可溶性PD-1/PD-L1分子，其中所述的化疗药物包括但不限于多柔比星、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、尼莫司汀、紫杉醇、顺铂、奥沙利铂。