CN110205316A - 一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法 - Google Patents

一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶法降解4‑氨基水杨酸的方法，包括提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；制作含有Sdc基因的重组质粒；构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；设置反应箱及反应体系。本发明取代传统降解4‑氨基水杨酸需经高温的技术条件，从而使分解反应更易进行且能耗更低、降解效率更高；利用基因工程可制备大量水杨酸脱羧酶，使水杨酸脱羧酶的应用工业化，提高单位时间内的代谢产量；配制代谢效率最高的反应体系，反应体系中加入的氯化亚铁，在反应箱上设置抽气泵，可提高酶反应活性，并且防止逆反应的发生，提升分解效率；质谱法测量酶活相比现有技术的比色法更加准确。

Description

一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种方法，尤其涉及一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法。
背景技术
水杨酸及其衍生物在医药、化工等领域应用广泛，但由于其有毒且自然降解时间长，会影响自然生态平衡和人类健康，因此，研究其降解方法对于实现绿色生产具有重要意义和必要性[1-3]。而且，水杨酸及其衍生物的脱羧产物——苯酚及其衍生物，也是重要的有机化工原料，在化学工业、医药工业有着广泛的应用，既可作为化学合成的中间体，也是重要的化学药品原料。
4-氨基水杨酸在40℃以上的水溶液中不稳定，分解并放出二氧化碳而成为间氨基酚。现有技术中分解4-氨基水杨酸主要依靠加热手段，工厂化应用会耗费大量热能，并且随着逆反应的进行而使分解效率低下。
发明内容
为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种酶法降解4- 氨基水杨酸的方法，包括以下步骤：
Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因；经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因；
Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒；对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切，并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养，其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1；
Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养；
Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行-80℃冰浴超声破碎制得粗酶液，其中，在100W条件下超声破碎3s，间歇3s，重复200个循环；粗酶液经0.45μm滤膜过滤，后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液；
Ⅴ、设置反应箱及反应体系；利用质谱法计算酶活；向反应箱中添加反应体系，包括1L PBS缓冲液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亚铁及 18～25g/L底物4-氨基水杨酸，并使反应体系的pH为4.0～5.0，温度为25～ 30℃；反应箱的上端设置排气口，排气口内安装抽气泵，将反应箱内的气体抽到外部环境中。
进一步地，质谱法计算酶活的方法为：
使用质谱分别测量单位体积下酶解前、后4-氨基水杨酸的含量，按照公式②计算酶活；
其中，反应消耗的底物量为反应前测量的4-氨基水杨酸含量减去反应后剩余的4-氨基水杨酸含量；酶含量为水杨酸脱羧酶的含量，经10％SDS-PAGE电泳及Bradford法测得。
进一步地，丝孢酵母为丝孢酵母Trichosporon moniliiforme WU-0401。
进一步地，-80℃冰浴通过将常温水在-80℃冰箱中放置过夜制得。
进一步地，Sdc大肠杆菌二级种子液的制备方法为：将固体培养基上的Sdc 大肠杆菌先接种到10ml的LB液体培养基中，并在LB液体培养基中加入100μg/ml 的氨苄西林，37℃，12000r/min的摇床上培养12小时制成一级种子液；按照 10％的接种量将一级种子液接种到800ml含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中，37℃，12000r/min的摇床上震荡培养6小时制成二级种子液。
本发明取代传统降解4-氨基水杨酸需经高温的技术条件，使分解反应更易进行且能耗更低、降解效率更高；利用基因工程使水杨酸脱羧酶的应用工业化，提高单位时间内的代谢产量；配制代谢效率最高的反应体系，反应体系中加入的氯化亚铁，在反应箱上设置抽气泵，可提高酶反应活性，并且防止逆反应的发生，提升分解效率；质谱法测量酶活相比现有技术的比色法更加准确。
附图说明
图1为本发明的步骤流程图。
图2为不同pH对酶活的影响。
图3为不同温度对酶活的影响。
图4为不同金属离子及EDTA对酶活的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1所示的一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法，包括以下步骤：
Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因；丝孢酵母为丝孢酵母Trichosporon moniliiforme WU-0401，该种丝孢酵母可以代谢水杨酸脱羧酶，水杨酸脱羧酶对4-氨基水杨酸具有脱羧生成间氨基酚；将水杨酸脱羧酶Sdc基因经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因，以制备大量的水杨酸脱羧酶。
Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒；对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切，并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养，其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1；依靠基因工程手段将Sdc基因整合到质粒基因上，依靠质粒对大肠杆菌的转化作用使Sdc基因在大肠杆菌中表达。
Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养；
Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行-80℃冰浴超声破碎制得粗酶液，其中，在100W条件下超声破碎3s，间歇3s，重复200个循环；粗酶液经0.45μm滤膜过滤，后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液；制得精酶液中蛋白含量经10％SDS-PAGE电泳及 Bradford法测得为0.732mg/mL。
超声可以将大肠杆菌破碎，从而释出内容物，其中就包括表达的水杨酸脱羧酶。由于在超声破碎的过程中会使温度升高，为了防止升高的温度使水杨酸脱羧酶变性，因此使用冰浴法，以保证温度不会因超声而升高。进一步的，- 80℃冰浴通过将常温水在-80℃冰箱中放置过夜制得，使冰浴的温度相比-20℃或0℃的冰更加耐用，可以减少换冰次数，降低操作复杂度。
其次，Sdc大肠杆菌二级种子液的制备方法为：将固体培养基上的Sdc大肠杆菌先接种到10ml的LB液体培养基中，并在LB液体培养基中加入100μg/ml的氨苄西林，37℃，12000r/min的摇床上培养12小时制成一级种子液；按照10％的接种量将一级种子液接种到800ml含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中， 37℃，12000r/min的摇床上震荡培养6小时制成二级种子液。二级种子液相比一级种子液具有更高的菌种活性、生长速率更快，可在短时间内达到稳定期，使大肠杆菌菌体数量高、表达蛋白的活性强，可以积累的水杨酸脱羧酶含量最高。
Ⅴ、设置反应箱及反应体系；向反应箱中添加反应体系，包括1L PBS缓冲液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亚铁及18～25g/L底物4-氨基水杨酸，并使反应体系的pH为4.0～5.0，温度为25～30℃；反应箱的上端设置排气口，排气口内安装抽气泵，将反应箱内的气体抽到外部环境中。
根据公式①所示，4-氨基水杨酸经脱羧反应生成间氨基酚和二氧化碳，且反应可逆。
其中生成的二氧化碳气体会排放在空气中，部分与水结合生成碳酸，碳酸的水解与生成是相互平衡可逆的，在密闭的反应箱中设置抽气泵，一方面可以促进反应箱中的二氧化碳及时排出，降低反应箱内压强，减少二氧化碳溶解；另一方面是反应箱中二氧化碳的含量减少，为了保持平衡，4-氨基水杨酸的分解反应会向分解方向促进，从而防止逆反应发生，使分解完全。
在确立反应体系之前，本发明测量了不同条件下的酶活，以确定酶解4-氨基水杨酸的效果最佳，其中包括：
(1)酶活的测量方法：
使用质谱法分别测量单位体积下酶解前、后4-氨基水杨酸的含量，从而计算酶活，计算公式如公式②所示，测量精酶液的酶活时，底物4-氨基水杨酸浓度为水杨酸脱氢酶浓度的10倍，以确保水杨酸脱氢酶的充分反应。
(2)不同pH对酶活的影响：
配制pH3.0～6.0的底物反应缓冲液，30℃下将精酶液分别与不同pH的底物反应缓冲液混合，通过上述酶活的测量方法测量不同pH下的酶活，从而确定最适pH，结果如图2所示，可知在pH为4.0～5.0之间酶活力较高，且pH为4.5时，活力最好。
(3)不同温度为酶活的影响：
采用pH 4.5的反应缓冲液，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、 35℃、40℃、45℃、50℃、55℃及60℃下测定酶活。结果如图3所示，可知温度为25～35℃时酶活力均较好，尤其是30℃左右为最佳。
(4)不同金属离子及EDTA对酶活的影响：
在pH 4.5的反应缓冲液中分别加入终浓度为5mmol/L的Ca2+、Mg2+、K+、 Fe2+、Pb2+、Hg2+、Mn2+、Ag+、Ni+、Li+及EDTA，30℃下测定酶活，以不加金属离子的反应液作为空白对照。结果如图4所示，其中相比对照组，Fe2+对水杨酸脱羧酶具有较好的促进作用，而铅离子、汞离子、银离子、镍离子及锂离子均对水杨酸脱氢酶具有抑制作用，EDTA对水杨酸脱羧酶影响很小或几乎没有影响。
(5)水杨酸脱羧酶米氏常数的确定。
通过测定不同浓度底物下的酶活力，按照米氏方程，得出1/[S]与1/[V]的关系，并用双倒数作图法，求出水杨酸脱羧酶在底物4-氨基水杨酸中的米氏常数。双倒数作图法得到的方程式为：y＝36.82x+2.3496，进一步计算得到 Km＝15.67mmol/L，Vmax＝0.426mmol/(min·L)。根据米氏方程，计算当酶反应速率为90％时的底物浓度为141mmol/L，即21.4g/L，因此最适的4-氨基水杨酸底物浓度为21.4g/L。米氏方程如公式③所示。
本发明相比现有技术主要有以下优点：
a、取代传统降解4-氨基水杨酸需经高温的技术条件，水杨酸脱羧酶具有特异性，酶促反应具有较高的专一性，温和反应条件，从而使分解反应更易进行且能耗更低、降解效率更高；
b、利用基因工程可制备大量水杨酸脱羧酶，使水杨酸脱羧酶的应用工业化，提高单位时间内的代谢产量；
c、配制代谢效率最高的反应体系，反应体系中加入的氯化亚铁，在反应箱上设置抽气泵，可提高酶反应活性，并且防止逆反应的发生，提升分解效率；
d、质谱法测量酶活相比现有技术的比色法更加准确。
上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因；经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因；
Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒；对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切，并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养，其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1；
Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养；
Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行-80℃冰浴超声破碎制得粗酶液，其中，在100W条件下超声破碎3s，间歇3s，重复200个循环；粗酶液经0.45μm滤膜过滤，后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液；
Ⅴ、设置反应箱及反应体系；利用质谱法计算酶活；向反应箱中添加反应体系，包括1LPBS缓冲液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亚铁及18～25g/L底物4-氨基水杨酸，并使反应体系的pH为4.0～5.0，温度为25～30℃；反应箱的上端设置排气口，排气口内安装抽气泵，将反应箱内的气体抽到外部环境中。
2.根据权利要求1所述的酶法降解4-氨基水杨酸的方法，其特征在于：所述质谱法计算酶活的方法为：
使用质谱分别测量单位体积下酶解前、后4-氨基水杨酸的含量，按照公式②计算酶活；
其中，反应消耗的底物量为反应前测量的4-氨基水杨酸含量减去反应后剩余的4-氨基水杨酸含量；酶含量为水杨酸脱羧酶的含量，经10％SDS-PAGE电泳及Bradford法测得。
3.根据权利要求1所述的酶法降解4-氨基水杨酸的方法，其特征在于：所述丝孢酵母为丝孢酵母Trichosporon moniliiforme WU-0401。
4.根据权利要求1所述的酶法降解4-氨基水杨酸的方法，其特征在于：所述-80℃冰浴通过将常温水在-80℃冰箱中放置过夜制得。
5.根据权利要求1所述的酶法降解4-氨基水杨酸的方法，其特征在于：所述Sdc大肠杆菌二级种子液的制备方法为：将固体培养基上的Sdc大肠杆菌先接种到10ml的LB液体培养基中，并在LB液体培养基中加入100μg/ml的氨苄西林，37℃，12000r/min的摇床上培养12小时制成一级种子液；按照10％的接种量将一级种子液接种到800ml含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中，37℃，12000r/min的摇床上震荡培养6小时制成二级种子液。
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