CN110205267A

CN110205267A - 一株产细菌素的植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110205267A
Application number: CN201910466514.9A
Authority: CN
Inventors: 邵丽; 臧雪梅; 马霞; 陈臣; 何艳
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2019-09-06

Abstract

本发明提供了一种产细菌素的植物乳杆菌，其特征在于，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.17119。该菌株分离于云南传统发酵食品“乳扇”。采用硫酸铵分级沉淀从该菌株的MRS发酵上清液中提取获得细菌素粗提物。实验证明，该菌株产生的细菌素粗提物对金黄色葡萄球菌S.aureus和大肠杆菌E.coli有很强的抑制作用，通过二倍稀释法测得最低抑菌浓度分别为312、625μg/mL。该菌株所产的细菌素能够被中性蛋白酶和胰蛋白酶等蛋白酶所水解，不会在体内蓄积。本发明所筛选到的植物乳杆菌及其细菌素在发酵食品中有着广泛的应用前景。

Description

一株产细菌素的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及食品微生物技术领域，特别是涉及一株产细菌素的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

细菌素(Bacteriocins)是由核糖体在微生物生长代谢过程中产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽或者前体多肽，当达到一定数量时可以杀死或有效抑制食物中食源性微生物及某些腐败菌的生长，且其具有高效、无毒、不会产生抗药性等优点而作为生物防腐剂受到广泛关注。

随着社会生产的不断发展和人们生活水平的不断提高，人民对食品添加剂的需求原来越趋向于天然、安全等方面，乳酸菌素作为天然防腐剂的开发具有广阔的市场前景。迄今已经发现的百余种乳酸菌素，应用于实际生产中的细菌素只有有限的几种，且未大规模的应用于产业化。其中一个主要原因就是乳酸菌细菌素产量低以及分离纯化复杂，成本太高，难以实现工业化生产。乳酸菌细菌素产量低是限制其大规模生产的瓶颈之一，如何提高细菌素产量是细菌素研究亟待解决的问题。

我国地域广阔，乳酸菌资源丰富，传统发酵食品的制作和食用历史悠久，经过几千年的传承，传统发酵食品中一些优良的乳酸菌被代代相传。同时不同地域的自然环境、气候和人们在制作传统发酵食品时的风味追求等方面的差异，使得我国乳酸菌资源生物多样性具有更加丰富。因此，从我国传统发酵食品中挖掘新型乳酸菌资源，并从中筛选出高产、高效、广谱的产细菌素乳酸菌，是开发天然防腐剂行之有效的方法。

发明内容

本发明目的是提供一种产细菌素的植物乳杆菌及其应用。

本发明从中国传统发酵食品中筛选并提供了一株产细菌素的植物乳杆菌，为新型细菌素的开发提供新菌种资源，为进一步研究其所产细菌素的性质、结构，开发新型、高效、广谱的细菌素打下基础。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一株产细菌素的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，C60)，分类命名为植物乳杆菌C60，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNO.17119，保藏日期为2019年1月7日。

本发明所提供的植物乳杆菌C60菌株是从云南传统发酵食品“乳扇”中分离得到，为兼性厌氧型，在MRS固体平板上菌落呈圆形、边缘整齐、淡黄色，表面湿润、光滑、***、易于挑起；经革兰氏染色呈紫色、阳性，菌体形态为杆状；经16S rDNA序列分析鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)。在MRS 液体培养基中培养，6h到达对数期，14h到达稳定期。

本发明所提供的植物乳杆菌C60菌株是从实验室保藏的百余株乳酸菌中，采用双层琼脂扩散法，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，排除有机酸、过氧化氢的干扰，筛选到的一株具有良好抑菌效果的菌株。

本发明还提供了一种细菌素，其特征在于，由上述的产细菌素的植物乳杆菌发酵制备得到。

本发明还提供了上述的细菌素的制备方法，其特征在于，包括：将上述的植物乳杆菌接种于MRS培养基中，于28～37℃、培养28～48h，制得发酵液；离心，得到发酵上清液，采用硫酸铵分级沉淀法，收集20％～80％饱和度的沉淀组分，经透析、冷冻干燥，得到细菌素粗提物。

本发明所提供的植物乳杆菌C60所产的细菌素粗提物，经蛋白含量分析、紫外光谱扫描分析和蛋白酶敏感程度分析，进一步确定为细菌素，纯化在88％以上。

本发明所提供的植物乳杆菌C60所产的细菌素粗提物对金黄色葡萄球菌S.aureus和大肠杆菌E.coli有很强的抑制作用，采用二倍稀释法测得最低抑菌浓度分别为312、625μg/mL。

本发明所提供的植物乳杆菌C60来源于传统发酵食品，属公认安全 (GenerallyRecognized As Safe，GRAS)菌种，可用于乳酸菌食品中。因此，本发明还涉及所述的植物乳杆菌C60在发酵食品中的用途。其中，所述含有植物乳杆菌C60的食品是发酵乳制品。

本发明还提供了上述的植物乳杆菌在制备发酵食品中的应用。

本发明还提供了一种发酵食品，其特征在于，其原料含有上述的植物乳杆菌。

优选地，所述的发酵食品为发酵乳制品。

本发明还提供了上述的细菌素在制备细菌抑制剂、食品添加剂或生物防腐剂中的应用。

本发明还提供了一种细菌抑制剂、食品添加剂或生物防腐剂，其特征在于，含有上述的细菌素。

近年来有大量关于乳酸菌产细菌素的报道，研究内容包括菌株的筛选、新型细菌素的理化性质、结构解析、抑菌谱和应用开发等。从中可以看到不同的菌株 (比如同属于植物乳杆菌)所产的细菌素的氨基酸组成、肽链结构、分子量大小、细菌素的理化性质存在差异，相应的带来的所产细菌素的抑菌(抑菌谱)差异很大，应用范围也不同。这些差异是由细菌素产生菌株的差异带来的，与菌株本身和生长环境有关。所以从不同来源的分离样品中筛选获得产细菌素的菌株，也是获得新型、高效、广谱的细菌素的有效途径，为新型细菌素的开发奠定基础。

正因如此，本发明从传统发酵食品(云南的乳扇)中分离获得的植物乳杆菌为新型细菌素的开发提供新菌种资源，为进一步研究其所产的细菌素的性质、结构，开发新型、高效、广谱的细菌素打下坚实的基础，并为乳酸菌细菌素产业化奠定理论基础。实验证明，该菌株产生的细菌素粗提物对金黄色葡萄球菌S.aureus 和大肠杆菌E.coli有很强的抑制作用，通过二倍稀释法测得最低抑菌浓度分别为 312、625μg/mL。该菌株所产的细菌素能够被中性蛋白酶和胰蛋白酶等蛋白酶所水解，不会在体内蓄积。本发明所筛选到的植物乳杆菌及其细菌素在发酵食品中有着广泛的应用前景。

保藏信息

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)C60，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.17119，保藏时间为2019年1月7 日。

附图说明

图1植物乳杆菌C60的发酵液抑菌效果图(其中4、5、6依次代表C60的MRS发酵上清液、排除酸抑制发酵上清液、排除过氧化氢抑制发酵上清液，以S.aureus为指示菌)；

图2植物乳杆菌C60的菌落形态(MRS平板)；

图3植物乳杆菌C60的菌体形态(×1000)；

图4植物乳杆菌C60硫酸铵分级盐析各段的抑菌活性(0％、45％、65％、 80％、100％盐析饱和度时抑菌圈，以S.aureus为指示菌)；

图5植物乳杆菌C60所产细菌素粗品的紫外光谱扫描图；

图6植物乳杆菌C60的生长曲线；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施实例1产细菌素乳酸菌的筛选和鉴定

(1)菌株活化

(a)产细菌素乳酸菌活化：

前期从各地采集的传统发酵食品，如农家自制酸奶、奶豆腐、泡菜、奶疙瘩、乳扇、甜醅等样品，采用MRS、M17培养基分离了百余株乳酸菌菌株，划线分纯后，冻干管保存于冰箱中。

将乳酸菌菌株划线MRS平板(购于海博生物)，置于37℃厌氧培养48h，挑取平板单菌落，再转接MRS液体培养基37℃活化24h，重复活化步骤2次后，备用。

(b)指示菌活化：以大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)作为指示菌，将甘油管保存的E.coli和S.aureus菌株各划线LB平板(购于海博生物)，37℃活化16-18h后，重复活化步骤一次，备用。

(c)指示菌菌悬液的制备：

在E.coli和S.aureus的LB平板上挑一环单菌落溶于装有1mL的无菌水的 EP管中，指示菌浓度控制在10⁶CFU/mL，备用。

(2)产细菌素乳酸菌的筛选：

(a)发酵上清液的制备:

将乳酸菌菌株分别接种于MRS液体培养基(购于海博生物)中，置于37℃静置培养28～48h，得到发酵液，经4℃、8000r/min离心10min，得到发酵上清液。

(b)抑菌实验

采用经典的琼脂扩散法进行产细菌素菌株的筛选。在无菌平皿内倒入第一层灭菌的1.2％LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂12g/L，水1000mL)，待琼脂冷却后，将含有约一环单菌落的指示菌悬液 1mL(指示菌浓度控制在10⁶CFU/mL),加入到100mL 50℃的0.8％LB琼脂培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂8g/L，水1000mL) 中，混合均匀后作为第二层培养基倒入平皿中。培养基凝固1h后，用无菌镊子取出牛津杯轻轻放置于琼脂表面(注意勿使牛津杯陷入第二层琼脂中)，加0.2mL 待测液，37℃培育12-18h，设多个重复，用MRS液体培养基作对照，用游标卡尺测量抑菌圈的直径。

(c)排除酸的抑制作用

将发酵上清用2mol/L NaOH溶液调pH到6.0进行抑菌试验；调pH之前先记录好原始pH，以相同pH值的乳酸和乙酸作为对照，排除有机酸的干扰。

(d)排除过氧化氢的抑制作用

将发酵上清于80℃保温10min去除过氧化氢的干扰，采用琼脂扩散法检测抑菌活性。

对实验室保藏的百多株乳酸菌，采用双层琼脂牛津杯法，以E.coli和S.aureus 为指示菌，测定各菌株MRS发酵上清液的抑菌圈大小。结果表明，近60株具有明显的抑菌圈，显示出较强的抑菌效果。由于乳酸菌代谢能够产生许多具有抑菌效果的物质，如有机酸、过氧化氢、双乙酰、细菌素等会抑制其他菌生长。因此筛选产细菌素的菌株，需要排除这些因素的干扰，其中有机酸和过氧化氢的影响较大。继而对60株菌进行酸抑制和过氧化氢抑制排除干扰实验。

实验结果表明，60株菌受试菌中有9株菌对E.coli、S.aureus仍有较强的抑菌效果(表1)，说明发酵液中可能存在细菌素类物质。综合排除酸抑制和过氧化氢抑制后抑菌的活性、菌株生长状态和培养时间长短，菌株C60表现出良好的抑菌活力(结果见图1)。

表1菌株复筛表

(3)产细菌素菌株的鉴定

(a)菌落菌体形态观察：将C60划线MRS固体平板，37℃厌氧培养48h，菌落呈圆形、边缘整齐、淡黄色，表面湿润、光滑、***、易于挑起(图2)；革兰氏染色呈紫色、阳性；菌体细胞杆状(图3)。

(b)16S rDNA序列分析：将C60菌株接种到MRS液体培养基培养到对数生长期，离心收集菌体。采用基因组DNA抽提试剂盒(TIAN GEN公司)提取。 PCR扩增采用两种合成的通用引物(16s 27F：GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG； 16s 1492R：CGGCTACCTTGTTACGACTT)，PCR产物采用切胶回收试剂盒 (BioFlux)回收，纯化后送上海生工测序公司测序。所得菌株C60的16srDNA 核苷酸序列为1508bp(序列表)，在GenBank NCBI网站做Blast分析。菌株C60 同源性最高菌株的是Lactobacillus.plantarum strain ATCC 8014，(GenBank accetionnumber：CP026743.1)同源性为100％。根据Goodfellow和O'Donnell 所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及16S rDNA的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当16S rDNA的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可以推断：菌株C60与Lactobacillus.plantarum strain ATCC 8014属于同一个种。因此，菌株C60鉴定为植物乳杆菌。

通过菌落、菌体形态观察以及16S rDNA序列分析，C60菌株鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)，该菌株已于2019年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.17119。

实施实例2菌株C60所产细菌素粗提物的制备

1)分级沉淀确定盐析饱和度

采用硫酸铵分级沉淀制备细菌素粗提物。

将乳酸菌菌株C60接种于MRS液体培养基中，置于37℃静置培养28～ 48h，得到发酵液，经4℃、8000r/min离心10min，得到发酵上清液。

首先确定分级沉淀盐析饱和度，将硫酸铵研磨成粉末，缓慢搅拌加入到发酵上清液中，当出现浑浊且2min不澄清，由盐析表计算此时的盐析饱和度，4℃冰箱中静置过夜，离心(4℃、8000r/min，20min)，分别收集上清液和沉淀。上清液以此时饱和度为初始盐析度，继续盐析，当出现第二次浑浊时，用相同方法进行操作并记录好数据，盐析至100％后，将几个梯度的盐析沉淀用水复溶后进行抑菌测试，选出抑菌效果最好的盐析饱和度，确定最终的细菌素粗提的饱和度。

对照硫酸铵盐析饱和表分析，C60分别在45％、65％、80％、100％饱和度时析出沉淀，同时将各饱和度的发酵液离心收集的沉淀用等量无菌水复溶后用双层琼脂牛津杯法进行抑菌测试，以E.coli和S.aureus为指示菌，平行三次实验，结果见表2。

实验结果表明，在盐析饱和度达到100％时组分抑菌效果最好，初步确定C60 的MRS发酵上清液在盐析80％～100％饱和度时所提取的抑菌物质抑菌作用强，在后续实验中选取80％～100％饱和度的盐析成分，制备细菌素粗提物。

表2硫酸铵分级沉淀各组分抑菌活性结果

2)细菌素粗提物

收集80％～100％饱和度对应的粗提物复溶于水中，装入3500Da的透析袋中脱盐，用去离子水透析过夜，更换3次透析液，收集透析液。经冷冻干燥得到粉末状的细菌素粗品，称重计算C60在MRS培养基中培养，每升培养液能得到大约0.175±0.025g的细菌素粗品。

3)细菌素粗提物的抑菌活性测定

以E.coli和S.aureus为指示菌，以原发酵上清液作为对照，测定粗提物的抑菌活性。将冻干的细菌素粗品配制成12mg/mL浓度复溶于无菌蒸馏水中，参照前面的方法，测定抑菌圈大小，结果见表3。结果表明，经过分离纯化后的粗细菌素样品具有抑菌活性，与原上清液相比，抑菌活性显著增强。表明所得纯化样品很可能就是所需的细菌素，需进一步的实验来验证。

表3细菌素与原液抑菌效果比较

实施实例3C60所产细菌素粗提物性质的确定

(1)粗提物蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法测定粗提物蛋白含量，以浓度为1mg/mL的牛血清蛋白溶液作为标准蛋白溶液，以标准蛋白含量为横坐标，以595nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y＝1.021x+0.017(R²＝0.999)。实施实例2所得的细菌素粗提物用水复溶后，配成2.5mg/mL的浓度，适当稀释后，测定蛋白含量。经计算可得，细菌素粗品中蛋白含量为2.2mg/2.5mg，蛋白含量达到88％，说明细菌素粗品主要是蛋白类的物质，同时说明采用分级硫酸铵沉淀法获得的细菌素纯度较高。

(2)抑菌物质的紫外光谱分析

用无菌蒸馏水配制0.625mg/mL的实施实例2所得的细菌素粗提物溶液，于190～600nm波长范围内对其进行紫外光谱扫描分析。结果如图5所示，C60所产抑菌物质在220nm附近有强吸收峰，这是肽键在远紫外区特有的吸收特征，与文献中报道的相符合，也进一步证明所产抑菌物质是一种多肽类物质。

(3)抗菌物质的蛋白酶敏感实验

将冻干的实施实例2所得的细菌素粗提物样品复溶于无菌蒸馏水中(12 mg/mL)作为细菌素液备用，将中性蛋白酶和胰蛋白酶配成5mg/mL溶液，各取0.1mL于离心管中，分别加入准备好的细菌素液0.4mL，用0.1mol/L的盐酸将蛋白酶混合液pH调成6～7，同时以0.1mL蒸馏水加入0.4mL细菌素液作为对照，37℃酶解4h，进行抑菌实验。结果如表4所示，经过中性蛋白酶和胰蛋白酶水解处理后抑菌活性消失，而细菌素水溶液有抑菌活性，可推测该抑菌活性物质为蛋白质类。这与报道的细菌素对蛋白酶敏感，能够被蛋白酶所分解是一致的，进一步确认了所提取的粗提物就是细菌素。

表4抗菌物蛋白酶敏感实验结果

注：-:无抑菌圈

实施实例4二倍稀释法测定细菌素最低抑菌浓度

将实施实例2所制备的细菌素粗提物用去离子水溶解，采用二倍稀释法稀释，分别配制成10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156mg/mL溶液，以无菌水作为对照，以E.coli和S.aureus为指示菌，测定其抑菌活性。结果由表5可知，随着细菌素浓度的降低，对指示菌的抑菌活性也降低。对金黄色葡萄酒菌的最低抑菌浓度为0.312mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.625mg/mL。

表5 C60所产细菌素最低抑菌浓度(mg/mL)

注：-:无抑菌圈

实施实例5菌株生长曲线的绘制

将活化好的Lactobacillus.plantarum C60按1％(v/v)接种量接入MRS液体培养基中，37℃恒温培养32h，每隔2h取样，测定培养液的OD₆₀₀和pH值。以 OD₆₀₀和pH值对培养时间作图，绘制菌株C60在MRS中的生长曲线。其结果如图6所示，菌株C60在MRS液体培养基培养，生长比较快，6h进入对数期， 14h进入稳定期。随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，进入稳定期后，pH下降趋势渐缓。培养结束时，培养液的pH值为3.89，培养液中活菌浓度可以达到2.5以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海应用技术大学

<120> 一株产细菌素的植物乳杆菌及其应用

<130> BCN1191013

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1508

<212> DNA

<213> Lactobacillus plantarum

<400> 1

cttgttacga cttcacccta atcatctgtc ccaccttagg cggctggttc ctaaaaggtt 60

accccaccga ctttgggtgt tacaaactct catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 120

cgggaacgta ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattccg acttcatgta 180

ggcgagttgc agcctacaat ccgaactgag aatggcttta agagattagc ttactctcgc 240

gagttcgcaa ctcgttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc 300

atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc tcaccagagt 360

gcccaactta atgctggcaa ctgataataa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 420

catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tatccatgtc cccgaaggga 480

acgtctaatc tcttagattt gcatagtatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgtagct 540

tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca 600

gccttgcggc cgtactcccc aggcggaatg cttaatgcgt tagctgcagc actgaagggc 660

ggaaaccctc caacacttag cattcatcgt ttacggtatg gactaccagg gtatctaatc 720

ctgtttgcta cccatacttt cgagcctcag cgtcagttac agaccagaca gccgccttcg 780

ccactggtgt tcttccatat atctacgcat ttcaccgcta cacatggagt tccactgtcc 840

tcttctgcac tcaagtttcc cagtttccga tgcacttctt cggttgagcc gaaggctttc 900

acatcagact taaaaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc aataaatccg gacaacgctt 960

gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaaata 1020

ccgtcaatac ctgaacagtt actctcagat atgttcttct ttaacaacag agttttacga 1080

gccgaaaccc ttcttcactc acgcggcgtt gctccatcag actttcgtcc attgtggaag 1140

attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc tcagtcccaa tgtggccgat 1200

taccctctca ggtcggctac gtatcattgc catggtgagc cgttacccca ccatctagct 1260

aatacgccgc gggaccatcc aaaagtgata gccgaagcca tctttcaaac tcggaccatg 1320

cggtccaagt tgttatgcgg tattagcatc tgtttccagg tgttatcccc cgcttctggg 1380

caggtttccc acgtgttact caccagttcg ccactcactc aaatgtaaat catgatgcaa 1440

gcaccaatca ataccagagt tcgttcgact tgcatgtatt aggcacgccg ccagcgttcg 1500

tcctgagc 1508

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gagagtttga tcctggctca g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cggctacctt gttacgactt 20

Claims

1.一株产细菌素的植物乳杆菌，其特征在于，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.17119。

2.一种细菌素，其特征在于，由权利要求1所述的产细菌素的植物乳杆菌发酵制备得到。

3.权利要求2所述的细菌素的制备方法，其特征在于，包括：将上述的植物乳杆菌接种于MRS培养基中，于28～37℃、培养28～48h，制得发酵液；离心，得到发酵上清液，采用硫酸铵分级沉淀法，收集20％～80％饱和度的沉淀组分，经透析、冷冻干燥，得到细菌素粗提物。

4.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备发酵食品中的应用。

5.一种发酵食品，其特征在于，其原料含有权利要求1所述的植物乳杆菌。

6.如权利要求5所述的发酵食品，其特征在于，所述的发酵食品为发酵乳制品。

7.权利要求2所述的细菌素在制备细菌抑制剂、食品添加剂或生物防腐剂中的应用。

8.一种细菌抑制剂、食品添加剂或生物防腐剂，其特征在于，含有权利要求2所述的细菌素。