CN110205252A - 喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法 - Google Patents

喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法；步骤如下：首先进行拮抗酵母的活化培养以及菌体的收集；称取保护剂，加入生理盐水中，然后在水浴条件下搅拌溶解，得到保护剂溶液；优选保护剂为***胶和海藻糖；再将离心收得的菌体与保护剂溶液混合，在28℃条件下振荡后，得到混合液；设置喷雾干燥机的雾化器压强和进风温度，待出风温度达到80℃时，打开空气压缩机，调整蠕动泵的进料速率，以混合液作为原料进行进料，经喷雾干燥后，得到固体制剂；本发明喷雾干燥过程中，可以利用保护剂包覆拮抗酵母，提高存活率；同时具有干燥速率快和时间短的优点，可应用于桃果软腐病的控制，具有良好的应用前景。

Description

喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法。
背景技术
膜醭毕赤酵母被认为是安全的酵母之一，且经急性毒性试验证明为安全无毒类，对桃果采后由匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)引起的软腐病及自然腐烂均有显著的控制效果，因此在桃果采后病害的生物防治中具有良好的应用前景。在实际应用过程中，拮抗酵母极易受环境的影响而出现活力降低等情况，这也是制约生物防治实际应用的一个重要因素，因此高活力拮抗酵母制剂的制备显得尤为关键。但是到目前为止，国际上只有少数几种拮抗酵母制剂产品上市，而我国还未实现拮抗酵母制剂的商业化生产和应用。拮抗酵母制剂要真正应用到实际生产中，除了要求拮抗菌株具有稳定的遗传性和较强的适应力能力之外，还需要克服以下的困难：(1)提高实际应用中的生防效力；(2)在保证生防效力的前提下，最大限度的降低成本；(3)具备较长的贮备期限；(4)对多种果蔬的采后病害具有控制效果。
目前，拮抗酵母制剂主要有液体和固体两种形式。虽然拮抗酵母液体制剂的制备相对简单，但由于在运输和保存过程中，拮抗酵母活力易受环境影响而下降，因此制备拮抗酵母的固体制剂对其应用尤为重要。喷雾干燥是一种常用于将溶液、乳液和悬浮液快速干燥成固态产品的方法，具有干燥速率快和时间短(一般为15～40s)，工艺简单和可连续化生产等优点。与其他干燥方式如低温冷冻干燥法相比，喷雾干燥有着更高的干燥效率和更快的干燥速度，干燥的产品脱水彻底、质量轻、便于运输和贮藏，且低温冷冻干燥费用比喷雾干燥高6～10倍。喷雾干燥过程中，可以利用保护剂包覆活性微生物，使微生物本体与外界环境隔离，增强其抵抗氧、热等不良刺激的能力，从而提高微生物的存活率，所制备的固体制剂一般能在低温或常温条件下保存较长时间。但是目前，关于利用喷雾干燥制备膜醭毕赤酵母固体制剂的研究方法尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用喷雾干燥方法制备膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)固体制剂，在喷雾干燥过程中，可以利用保护剂包覆拮抗酵母，从而提高其的存活率具有潜在的应用价值。
为了实现上述目的，按照下述步骤进行：
(1)拮抗酵母的活化培养以及菌体的收集；
(2)称取保护剂，加入生理盐水中，然后于一定温度条件下水浴搅拌溶解，得到保护剂溶液；所述保护剂包括保护剂A和保护剂B或保护剂A；保护剂A为***胶、脱脂乳粉或酪蛋白酸钠的任意一种；保护剂B为β-环糊精、麦芽糊精、海藻糖的任意一种；
(3)将步骤(1)中离心收得的菌体与步骤(2)得到的保护剂溶液混合，在一定温度条件下振荡后，得到混合液；
(4)设置喷雾干燥机的雾化器压强和进风温度，待出风温度达到一定温度时，打开空气压缩机，调整蠕动泵的进料速率，然后以步骤(3)得到的混合液作为原料进行进料，经喷雾干燥后，得到固体制剂。
优选的，步骤(1)中所述拮抗酵母的活化培养以及菌体的收集的具体步骤为：将拮抗酵母接种于NYDA培养基上在28℃条件下培养2d；分别挑取2环培养后的酵母菌接种于50mL的NYDB培养基中，在28℃、180r/min振荡培养20h得到培养液，然后将培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集得到菌体。
优选的，步骤(1)中所述拮抗酵母为膜醭毕赤酵母。
优选的，所述NYDA培养基的成分如下，以1L计：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，121℃湿热灭菌20min；所述的NYDB培养基成分如下，以1L计：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，余量为蒸馏水，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
优选的，步骤(2)中所述保护剂溶液中保护剂的总质量浓度为60～140g/L。
优选的，步骤(2)中所述保护剂为***胶和海藻糖，其中***胶和海藻糖的质量比为1～3：1～3；所述保护剂溶液中***胶和海藻糖的总质量浓度为80～100g/L。
优选的，步骤(2)中所述生理盐水的质量百分浓度为0.85％；所述一定温度为50℃～60℃。
优选的，步骤(3)中所述混合液中菌体的浓度为50g/L；所述一定温度为28℃；所述振荡时的转速为180r/min，时间为45min。
优选的，步骤(4)中所述雾化器压强为100～300kPa、进风温度为90～130℃；所述出风温度达到一定温度为80℃。
本发明制备的拮抗酵母固体制剂应用于桃果软腐病的控制。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂，具有干燥速率快和时间短的优点。
(2)本发明采用喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂，具有费用低、经济效益高的优点。
(3)本发明在喷雾干燥过程中，可以利用保护剂包覆拮抗酵母，从而提高其的存活率。
(4)本发明采用喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂及其应用尚未被文献公开；本发明制备的固体制剂可以有效控制桃果的软腐病，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中不同保护剂对固体制剂中酵母活菌数的影响。
图2为实施例2中***胶与海藻糖不同比例对固体制剂酵母活菌数的影响。
图3为实施例3中以***胶和海藻糖作为保护剂，其不同质量浓度对固体制剂酵母活菌数的影响。
图4为实施例4中雾化压强对固体制剂酵母活菌数的影响。
图5为实施例5中进风温度对固体制剂酵母活菌数的影响。
图6为实施例6中进料速率对固体制剂中活菌数的影响。
图7为实施例7制备的固体制剂在25℃和4℃保存时酵母菌的存活率。
图8为实施例7制备的固体制剂在25℃和4℃保存90d后对桃果软腐病的生防效果图。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步的详细描述。本发明使用的，保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉)，地址：武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M2018110。
本发明通过测定不同实施例的酵母菌活菌数来选择喷雾干燥条件。通过测定固体制剂保存过程中酵母菌的存活率、对桃果软腐病的控制效果确定固体制剂的保存稳定性。
(1)活菌数的测定
准确称取经喷雾干燥得到的固体制剂1g，溶于50mL、0.85％的无菌生理盐水中，28℃、180r/min振荡至完全溶解，梯度稀释后，分别吸取各梯度稀释液100μL，均匀涂布于NYDA培养基上，28℃培养2d，计算活菌数。
(2)保存期间酵母存活率的测定
准确称取适量固体制剂至无菌、干燥的50mL离心管中，密封后分别置于25℃和4℃条件下保存，每30d取样测定活菌数，计算固体制剂中的酵母存活率。每个处理3次平行，试验重复2次。
存活率(％)＝C1/C2
式中，C1为保存一定天数后的每克固体制剂的活菌数，C2为每克固体制剂的初始活菌数。
(3)固体制剂对桃果软腐病的控制效果
用无菌打孔器在桃果腰部等距离刺出3个5mm深、3mm宽的伤口，分别在伤口处进行以下处理：①加入30μL新鲜制备的酵母悬浮液；②加入30μL于25℃条件下保存90d的固体制剂悬浮液(1×108cells/mL)；③加入30μL于4℃条件下保存90d的固体制剂悬浮液(1×108cells/mL)；④加入30μL无菌生理盐水(阴性(CK)对照)；⑤加入30μL喷雾干燥所用保护剂水溶液(阳性对照)。室温放置2h后，每伤口加入30μL R.stolonifer孢子悬浮液(5×104spores/mL)，待桃果自然晾干后摆放至已消毒的塑料筐(47×35×12cm)内，保鲜膜密封，贮藏于恒温恒湿培养箱(20℃、RH 95％)内，2d后开始每隔12h观察和记录一次果实的腐烂率和腐烂直径。每个处理包含12个果实，3个重复。腐烂率的计算公式如下：
腐烂率(％)＝n/N×100％
式中，n为发病的果实总数，N为接种病原菌的果实总数。
通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
实施例1：
(1)P.membranaefaciens于NYDA培养基上28℃培养2d。分别挑取2环于装有50mLNYDB培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、180r/min振荡培养20h；培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集菌体；
(2)称取一定量的***胶、脱脂乳粉和酪蛋白酸钠分别于装有0.85％生理盐水的三角瓶中，50℃下水浴搅拌至完全溶解，制备成质量浓度为100g/L的保护剂溶液；
同时选取***胶、脱脂乳粉和酪蛋白酸钠的任意一种与β-环糊精、麦芽糊精、海藻糖的任意一种剂按照等质量混合，分别加入0.85％生理盐水的三角瓶中，50℃下水浴搅拌至完全溶解，制备成质量浓度为100g/L的保护剂溶液；
(3)将离心收得的菌体与保护剂溶液混合，使菌体含量达到50g/L，28℃、180r/min下振荡混匀45min；
(4)设置喷雾干燥机参数为雾化器压强200kPa、进风温度120℃，待出风温度达到80℃时，打开空气压缩机，调整蠕动泵进料速率为20mL/min后进行喷雾干燥，得到固体制剂。
以每克干粉中活菌数的对数值作为指标选取合适的保护剂组合方式，结果如图1所示。
表1保护剂种类的筛选
在第一组试验中，当***胶单独作为保护剂时，制备的固体制剂P.membranaefaciens活菌数显著低于其分别与β-环糊精、麦芽糊精、海藻糖作为复合保护剂时的活菌数；其中***胶与海藻糖作为复合保护剂制备的固体制剂活菌数最高(lgCFU/g＝8.1)；第2组和第3组试验的结果与第1组类似，组内活菌数最高的分别是脱脂乳粉和酪蛋白酸钠与海藻糖作为复合保护剂的固体制剂；因此，***胶和海藻糖作为复合保护剂时效果最好，后续实施例选择***胶和海藻糖作为复合保护剂。
实施例2：
(1)P.membranaefaciens于NYDA培养基上28℃培养2d。分别挑取2环于装有50mLNYDB培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、180r/min振荡培养20h；培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集菌体；
(2)以***胶和海藻糖作为保护剂，称取***胶和海藻糖，***胶与海藻糖的质量比例为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3，分别于装有适量0.85％生理盐水的三角瓶中，60℃下水浴搅拌至完全溶解，制备成***胶和海藻糖的总质量浓度为100g/L的保护剂溶液；
(3)将离心收得的菌体与保护剂溶液混合，使菌体含量达到50g/L，28℃、180r/min下振荡混匀45min；
(4)在雾化器压强200kPa、进风温度120℃、进料速率20mL/min条件下，进行喷雾干燥，得到固体制剂。
以每克干粉中活菌数的对数值作为指标选取合适的保护剂比例，结果如图2所示；由图2可知，随着海藻糖所占比例的增加，固体制剂活菌数逐渐增加，当比例为1:1时活菌数最高(lgCFU/g＝8.07)；随着海藻糖所占比例的进一步升高，活菌数迅速降低；当***胶与海藻糖比例(w/w)为1:1时，效果最好。
实施例3：
(1)P.membranaefaciens于NYDA培养基上28℃培养2d。分别挑取2环于装有50mLNYDB培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、180r/min振荡培养20h；培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集菌体；
(2)称取***胶和海藻糖，二者按照1:1(w/w)的比例，于装有适量0.85％生理盐水的三角瓶中，50℃下水浴搅拌至完全溶解，分别制备***胶和海藻糖总质量浓度为60、80、100、120和140g/L的保护剂溶液；
(3)将离心收得的菌体与保护剂溶液混合，使菌体含量达到50g/L，28℃、180r/min下振荡混匀45min；
(4)在雾化器压强200kPa、进风温度120℃、进料速率20mL/min条件下，进行喷雾干燥，得到固体制剂。
以每克干粉中活菌数的对数值作为指标选取合适的保护剂质量浓度，结果如图3所示。
由图3可知，固体制剂中P.membranaefaciens活菌数随着保护剂质量浓度的增加而呈现先升高后降低的趋势，当壁材质量浓度达到100g/L时，活菌数最高。因此后续实施例选择保护剂质量浓度为100g/L。
实施例4：
(1)P.membranaefaciens于NYDA培养基上28℃培养2d。分别挑取2环于装有50mLNYDB培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、180r/min振荡培养20h；培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集菌体；
(2)称取***胶和海藻糖，二者按照1:1(w/w)的比例，于装有适量0.85％生理盐水的三角瓶中，50℃下水浴搅拌至完全溶解，制备成总质量浓度为100g/L的保护剂溶液；
(3)将离心收得的菌体与保护剂溶液混合，使菌体含量达到50g/L，28℃、180r/min下振荡混匀45min；
(4)设置喷雾干燥机雾化器压强分别为100、150、200、250和300kPa，进风温度120℃、进料速率20mL/min条件下，进行喷雾干燥，得到固体制剂。
以每克干粉中活菌数的对数值作为指标选取合适的雾化器压强，结果如图4所示。
如图4所示，随着雾化压强的增大，固体制剂中P.membranaefaciens活菌数逐渐升高，当雾化压强达到200kPa时，活菌数最高(lgCFU/g＝8.08)；当雾化压强超过200kPa时，制剂活菌数开始下降。因此后续实施例选择雾化压强为200kPa。
实施例5：
(1)P.membranaefaciens于NYDA培养基上28℃培养2d。分别挑取2环于装有50mLNYDB培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、180r/min振荡培养20h；培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集菌体；
(2)称取***胶和海藻糖，二者按照1:1(w/w)的比例，于装有适量0.85％生理盐水的三角瓶中，50℃下水浴搅拌至完全溶解，制备成总质量浓度为100g/L的保护剂溶液。
(3)将离心收得的菌体与保护剂溶液混合，使菌体含量达到50g/L，28℃、180r/min下振荡混匀45min。
(4)设置喷雾干燥机进风温度分别为90、100、110、120和130℃，在雾化器压强200kPa、进料速率20mL/min条件下，进行喷雾干燥，得到固体制剂。
以每克干粉中活菌数的对数值作为指标选取合适的进风温度，结果如图5所示。
由图5可知，随着进风温度的升高，固体制剂中P.membranaefaciens活菌数呈上升趋势，在110℃达到最大值，但与100℃无显著性差异。继续升高进风温度至120℃，活菌数维持不变，但超过120℃后，制剂中活菌数迅速降低。综合考虑温度对酵母菌活性的影响、酵母活菌数和能耗等因素，最终选择100℃作为后续实施例的进风温度。
实施例6：
(1)P.membranaefaciens于NYDA培养基上28℃培养2d。分别挑取2环于装有50mLNYDB培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、180r/min振荡培养20h；培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集菌体；
(2)称取***胶和海藻糖，二者按照1:1(w/w)的比例，于装有适量0.85％生理盐水的三角瓶中，50℃下水浴搅拌至完全溶解，制备成总质量浓度为100g/L的保护剂溶液；
(3)将离心收得的菌体与保护剂溶液混合，使菌体含量达到50g/L，28℃、180r/min下振荡混匀45min；
(4)将蠕动泵进料速率分别设置为10、15、20、25和30mL/min，在雾化器压强200kPa、进风温度100℃条件下，进行喷雾干燥，得到固体制剂。以每克干粉中活菌数的对数值作为指标选取进料速率，结果如图6所示。
如图6所示，随着进料速率的提高，活菌数呈现先上升后下降的趋势，当进料速率为15mL/min时，固体制剂中P.membranaefaciens活菌数最高，具体数值为lgCFU/g＝8.35；当进料速率超过15mL/min后，活菌数开始迅速下降；因此进料速率为15mL/min时，活菌数最高。
实施例7：
(1)P.membranaefaciens于NYDA培养基上28℃培养2d。分别挑取2环于装有50mLNYDB培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、180r/min振荡培养20h；培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集菌体；
(2)称取***胶和海藻糖，二者按照1:1(w/w)的比例，于装有适量0.85％生理盐水的三角瓶中，50℃下水浴搅拌至完全溶解，制备成总质量浓度为100g/L的保护剂溶液；
(3)将离心收得的菌体与保护剂溶液混合，使菌体含量达到50g/L，28℃、180r/min下振荡混匀45min；
(4)设置喷雾干燥机参数为雾化器压强200kPa、进风温度100℃，待出风温度达到80℃时，打开空气压缩机，调整蠕动泵进料速率为15mL/min后进行喷雾干燥，得到固体制剂。
获得的固体制剂分别在25℃和4℃条件下保存，保存过程中制剂中酵母菌活菌数如图7所示。在两种保存条件下，固体制剂中P.membranaefaciens存活率均随着保存时间的延长而缓慢降低，保存90d后，P.membranaefaciens在25℃和4℃条件下的存活率分别为66.97％和82.91％。
固体制剂在25℃和4℃条件下保存90d后，其对桃果软腐病的控制效果如图8所示；其中CK组：无菌水处理；阳性对照：保护剂(***胶和海藻糖)悬浮液处理；新鲜酵母：现制备的酵母悬浮液(1×108cells/mL)；固体制剂A：25℃下保存90d的固体制剂悬浮液；固体制剂B：4℃下保存90d的固体制剂悬浮液；
由图可以看出，CK组和阳性对照组的腐烂率无显著性差异(P>0.05)。新鲜酵母、25℃和4℃条件下保存90d的固体制剂处理对桃果软腐病均有显著的控制效果。4℃保存90d的固体制剂的控制效果(发病率37.04％)与新鲜制备的酵母(腐烂率31.48％)虽有显著性差异(P<0.05)，但控制效果仍然非常明显。因此该固体制剂于4℃保存90d后，仍然具有良好的防治效力，具备商业化开发和实际应用的价值。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)拮抗酵母的活化培养以及菌体的收集；
(2)称取保护剂，加入生理盐水中，然后于一定温度条件下水浴搅拌溶解，得到保护剂溶液；所述保护剂包括保护剂A和保护剂B或保护剂A；保护剂A为***胶、脱脂乳粉或酪蛋白酸钠的任意一种；保护剂B为β-环糊精、麦芽糊精、海藻糖的任意一种；
(3)将步骤(1)中离心收得的菌体与步骤(2)得到的保护剂溶液混合，在一定温度条件下振荡后，得到混合液；
(4)设置喷雾干燥机的雾化器压强和进风温度，待出风温度达到一定温度时，打开空气压缩机，调整蠕动泵的进料速率，然后以步骤(3)得到的混合液作为原料进行进料，经喷雾干燥后，得到固体制剂。
2.根据权利要求1所述的喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，步骤(1)中所述拮抗酵母的活化培养以及菌体的收集的具体步骤为：将拮抗酵母接种于NYDA培养基上在28℃条件下培养2d；分别挑取2环培养后的酵母菌接种于50mL的NYDB培养基中，在28℃、180r/min振荡培养20h得到培养液，然后将培养液于8000r/min离心15min，弃上清，收集得到菌体。
3.根据权利要求1所述的喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，步骤(1)中所述拮抗酵母为膜醭毕赤酵母。
4.根据权利要求2所述的喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，所述NYDA培养基的成分如下，以1L计：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，121℃湿热灭菌20min；所述的NYDB培养基成分如下，以1L计：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，余量为蒸馏水，pH自然，121℃湿热灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，步骤(2)中所述保护剂溶液中保护剂的质量浓度为60～140g/L。
6.根据权利要求1所述的喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，步骤(2)中所述保护剂为***胶和海藻糖，其中***胶和海藻糖的质量比为1～3：1～3；所述保护剂溶液中***胶和海藻糖的总质量浓度为80～100g/L。
7.根据权利要求1所述的喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，步骤(2)中所述生理盐水的质量百分浓度为0.85％；所述一定温度为50℃～60℃。
8.根据权利要求1所述的喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，步骤(3)中所述混合液中菌体的浓度为50g/L；所述一定温度为28℃；所述振荡时的转速为180r/min，时间为45min。
9.根据权利要求1所述的喷雾干燥制备拮抗酵母固体制剂的方法，其特征在于，步骤(4)中所述雾化器压强为100～300kPa、进风温度为90～130℃；所述出风温度达到一定温度为80℃。
10.根据权利要求1～9任一所述的方法制备的拮抗酵母固体制剂应用于桃果软腐病的控制。
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