CN110204664A - 一种共载药物和基因用阳离子聚合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种共载药物和基因用阳离子聚合物及其应用。所构建的阳离子PCL‑ss‑P(GHA‑co‑PEGMA)聚合物侧链富含,使聚合物具有良好的生物相容性和水溶性;此外,壳层富含羟基能够促进药物/基因络合物的跨膜运输和提高基因在细胞内的转录与表达。在较高谷胱甘肽的条件下,导致药物/基因络合物中的主链裂解,导致聚合物胶束中的药物释放出来,从而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。药物的释放和基因的转录与表达能够组合治疗肺癌,并有效地克服抗癌药物在细胞内的耐药性。本发明所使用的实验条件较为温和,易于控制阳离子聚合物的结构,操作简单,原料易得,易于纯化,适合工业化的生产。因而可以用作抗癌药物和抑癌基因的共载体,并且将来具有较大的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域,具体涉及一种具有还原响应性阳离子聚合物的制备方法及其共载药物和基因组合治疗肺癌的应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一大类疾病,根据由国际癌症研究机构汇编发行(IARC)的2018年全球癌症数据库(GLOBOCAN 2018 database)可知,全球每年肺癌的发病率和死亡率位居世界第二位。而我国每年肺癌发病率和死亡率持续上升态势,如何有效地治疗癌症是急需解决的问题。目前常用的治疗手段为药物化疗、手术治疗、免疫治疗以及基因治疗。
基因治疗的核心是基因传递,进入细胞内从而进行基因表达。游离的DNA或RNA对血清中核酸酶的消化作用非常敏感,易于被降解,导致游离基因在细胞内的转染效率较低。因此,需要发展一种合适的基因传递***。而常用的基因载体分为病毒性载体和非病毒性载体,与病毒相比,非病毒基因载体,特别是阳离子载体,如聚乙烯亚胺(PEI)因其制备方便、基因载荷大、结构可调节等优点而备受关注。然而,由于PEI自身毒性和不够理想的转染效率,严重阻碍了阳离子载体的临床应用。但是,单一手段很难达到理想的治疗效果。因此,众多科研工作者开始利用组合治疗,尤其是药物与基因的组合治疗,以达到彻底治疗癌症的目的。
另据文献报道,富含羟基的聚阳离子基因载体能够有效地提高聚合物的水溶性、血液相容性以及基因转染效率。为实现药物和基因组合治疗癌症的目的,需要构建一种基因与药物的适用载体,使其能够同时携载基因与药物,这种方法可望在临床中得到应用。在现有技术中,一些关于药物和基因共载体的阳离子聚合物已被报道,不过依然存在粒径分布不均一、亲水性壳层固定的基因在一定负电荷存在的情况下稳定性差、跨膜运输和内涵体逃逸能力弱、释放效果差的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种共载药物和基因用阳离子聚合物胶束的制备方法,该阳离子聚合物胶束不仅能够包埋抗癌药物,还能够固定抑癌基因,从而实现组合治疗肺癌。
本发明采用如下技术方案:
一种共载药物和基因用阳离子聚合物,由下列化学结构式表达:
式中,x为30~70,y为60~85,z为5~20。
本发明共载药物和基因用阳离子聚合物的数据分子量为1.5´104~2.5´104 gmol-1;阳离子聚合物具有两亲性,可以自组装形成胶束,由疏水性聚己内酯形成胶束的内核,并且还可以对抗肿瘤药物进行包埋,由聚甲基丙烯酸酯聚乙二醇和多羟基的聚甲基丙烯酸酯来形成亲水层,能够起到稳定胶束和促进跨膜运输的作用。阳离子聚合物主链中含有双硫键,具有还原响应性,所形成的共载药物和基因用阳离子聚合物能够在高浓度谷胱甘肽的条件下,导致聚合物胶束裂解,从而释放出抗癌药物。
本发明还公开了所述共载药物和基因用阳离子聚合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸和二硫代二乙二醇为原料,在吸水剂、催化剂存在下,通过酯化反应得到4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯;
(2)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯为引发剂,己内酯为反应单体,在催化剂存在下,通过开环聚合反应,制备得到聚酯链转移剂;
(3)惰性气氛条件下,以甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯为反应单体,在聚酯链转移剂和引发剂存在下,通过可逆加成-断裂链转移反应制备聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物;
(4)利用氨基化合物对聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行开环反应,制备得到共载药物和基因用阳离子聚合物,称为PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)。
本发明还公开了一种共载药物和基因用阳离子聚合物胶束,其制备方法包括以下步骤:
(1)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸和二硫代二乙二醇为原料,在吸水剂、催化剂存在下,通过酯化反应得到4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯;
(2)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯为引发剂,己内酯为反应单体,在催化剂存在下,通过开环聚合反应,制备得到聚酯链转移剂;
(3)惰性气氛条件下,以甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯为反应单体,在聚酯链转移剂和引发剂存在下,通过可逆加成-断裂链转移反应制备聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物;
(4)利用氨基化合物对聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行开环反应,制备得到共载药物和基因用阳离子聚合物;
(5)将共载药物和基因用阳离子聚合物在溶液中通过自组装形成共载药物和基因用阳离子聚合物胶束;所制备的胶束含有疏水性内核和带正电荷的亲水性壳层。
本发明还公开了一种共载药物和基因的阳离子聚合物胶束,其制备方法包括以下步骤:
(1)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸和二硫代二乙二醇为原料,在吸水剂、催化剂存在下,通过酯化反应得到4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯;
(2)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯为引发剂,己内酯为反应单体,在催化剂存在下,通过开环聚合反应,制备得到聚酯链转移剂;
(3)惰性气氛条件下,以甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯为反应单体,在聚酯链转移剂和引发剂存在下,通过可逆加成-断裂链转移反应制备聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物;
(4)利用氨基化合物对聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行开环反应,制备得到共载药物和基因用阳离子聚合物;
(5)将共载药物和基因用阳离子聚合物与药物混合,在溶液中通过自组装形成载药胶束;然后将载药胶束与基因复合,制备共载药物和基因的阳离子聚合物胶束。
本发明中:
步骤(1)中,惰性气氛为氮气气氛;吸水剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺;催化剂为4-二甲氨基吡啶;4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸、二硫代二乙二醇、N,N’-二异丙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(8~15)∶(1~5)∶0.5;
步骤(2)中,惰性气氛为氮气气氛;催化剂为辛酸亚锡;4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯、己内酯、辛酸亚锡的摩尔比为1∶(30~90)∶0.5;
步骤(3)中,惰性气氛为氮气气氛;引发剂为偶氮二异丁腈;聚酯链转移剂、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯的摩尔比为1∶1∶(60~90)∶(8~15);
步骤(4)中,氨基化合物为N-羟乙基乙二胺;聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)、N-羟乙基乙二胺的摩尔比为1∶(10~20)。
本发明中:步骤(1)中,酯化反应时,反应温度为20 ℃~40 ℃,反应时间为30 h~60 h;步骤(2)中,开环聚合反应的温度为80 ℃~110 ℃,时间为5 h~15 h;步骤(3)中,可逆加成-断裂链转移反应时,反应温度为60 ℃~80 ℃,反应时间为5 h~15 h;步骤(4)中,侧链开环反应时,反应温度为60 ℃~80 ℃,反应时间为5 h~15 h。
本发明中,将共载药物和基因用阳离子聚合物与药物在溶液中通过自组装形成载药阳离子聚合物胶束;然后将基因溶液与载药阳离子聚合物胶束溶液混合,涡旋,然后静置,得到共载药物和基因的阳离子聚合物胶束。涡旋的时间为10秒~30秒,静置的时间为30分钟。
本发明还公开了上述共载药物和基因用阳离子聚合物或者共载药物和基因用阳离子聚合物胶束作为药物和/或基因的载体中的应用;或者上述共载药物和基因用阳离子聚合物或者共载药物和基因用阳离子聚合物胶束或者共载药物和基因的阳离子聚合物胶束在制备***的药物中的应用。优选的,肿瘤为肺癌。
本发明中,药物选自小分子药物,比如阿霉素、紫杉醇、喜树碱、姜黄素中的一种。
本发明中,4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯的化学结构式为:
聚酯链转移剂的结构式为:
聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物的结构式为:
本发明利用开环聚合和可逆加成-断裂链转移聚合的方法,构建了具有还原响应性阳离子;在水溶液中形成核壳结构的聚合物胶束,具有较好的稳定性,所制备的聚合物前药胶束不仅具有还原响应性的特性,还能够固定游离基因。基因/药物的复合物在肿瘤细胞环境中导致胶束裂解,释放出小分子药物和基因,从而达到抑制肿瘤增殖的目的,并且制备方法较为简单,易于工业化生产。
近一步的技术方案,在步骤(1)~(4)完成后,分别对产物进行提纯处理,所述纯化过程包括以下步骤:
(i) 4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯的纯化:反应结束后,除去反应产生的白色固体,将溶液浓缩。然后,利用柱层析的方法进一步提纯粗产物,以二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂,浓缩收集产物。将产物置于真空干燥箱中烘干至恒重。得到红棕色粘稠状产物为4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯。
(ii) 聚酯链转移剂的纯化:反应结束后,将反应瓶冷却至室温后,加入少量CH2Cl2溶解粗产物,加入2-3滴冰醋酸,搅拌后,在冷无水***中沉淀三次,目的是除去未反应单体和催化剂。最后,将终产物置于真空干燥箱中烘干至恒重;即可得到聚酯链转移剂。
(iii) 聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)的纯化:迅速降温终止反应。选用透析袋对聚合反应的溶液进行透析,透析时间为48 h,每6 h更换一次透析水,目的是除去未参加反应的单体。将透析液冷冻干燥,获得白色絮状的固体为聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)。
(iv) 聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物的纯化:待反应结束后。选用透析袋对反应原液进行透析,透析时间为24 h,每6 h更换一次透析水,目的是除去未参加反应的N-羟乙基乙二胺。将透析液冷冻干燥,获得白色絮状粉末为聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物。
上述技术方案中:步骤(i)中,所述乙酸乙酯和二氯甲烷体积比为1∶3~6;步骤(iii)和(iv)中,透析时采用截留分子量为12000~14000 Da的透析袋。
本发明公开的是基于开环聚合和可逆加成-断裂链转移聚合构建具有还原响应性的PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)阳离子聚合物,在水溶液中形成核壳结构的聚合物胶束,具有较好的稳定性,所制备的聚合物前药胶束不仅具有还原响应性的特性,还能够固定游离基因。基因/药物的复合物在肿瘤细胞环境中导致胶束裂解,释放出原药和基因,从而达到抑制肿瘤增殖的目的。
由于上述方法的实施,本发明与现有的技术相比,具有以下优点:
1.本发明利用开环聚合和可逆加成-断裂链转移聚合构建具有还原响应性的PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)阳离子聚合物,能够控制分子量和载药量的大小。
2.本发明制备的阳离子聚合物能够同时包埋药物和固定基因,有效地克服药物在细胞内的多药耐药性。
3.本发明制备的阳离子聚合物由于侧链富含羟基,不仅使阳离子聚合物具有良好的生物相容性,而且还能够促进聚合物胶束内涵体逃逸以及提高基因的转染效率。
4.本发明所制备的聚合物结构可控,实验条件较为温和,操作简单,提纯方便,适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例一中4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯的核磁共振氢谱图,溶剂为氘代氯仿;
图2为实施例二中4-CPDB-ss-PCL的核磁共振氢谱图,溶剂为氘代氯仿;
图3为实施例三中聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物的核磁共振氢谱图,溶剂为氘代氯仿;
图4为实施例三中4-CPDB-ss-PCL和PCL-ss-P(GMA-co-PEGMA)的凝胶渗透色谱图;
图5为实施例四中PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)的核磁共振氢谱图,(氘代二甲基亚砜);
图6为实施例五中芘荧光发射图谱中荧光强度比值(I 3/I 1)与聚合物胶束浓度对数(Log C)的关系变化;
图7为实施例五中PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)和载药聚合物胶束在pH 7.4缓冲溶液中自组装形成的胶束动态光散射曲线和透射电镜照片;
图8为实施例六中为不同N/P比的载药聚合物胶束/基因络合物的Zeta电位值;
图9为实施例六中为不同氮磷比的载药聚合物胶束/基因络合物的凝胶阻滞电泳图像以及载药聚合物胶束/基因络合物在加入不同的肝素钠溶液后的凝胶阻滞电泳图像;
图10为实施例七中载药聚合物胶束在不同还原条件下的药物释放曲线;
图11为实施例八中聚合物PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)胶束的细胞毒性测试图;
图12为实例八中含有不同DOX浓度的DOX-PGHAP/p53复合物分别与(A)A549细胞和(B)H1299细胞分别培养48 h后的细胞毒性测试图;
图13为实施例九中A549细胞在游离DOX+p53-GFP混合溶液和载药聚合物胶束/基因络合物的内吞照片图。
具体实施方式
本发明设计构建侧链富含羟基的阳离子聚合物,不仅可以包埋小分子药物和固定基因,还能够在细胞内释放出药物和提高基因转染效率,从而更好地抑制肺癌细胞的增殖。作为基因载体,本发明的阳离子聚合物具有一定的生物相容性和生物可降解性;作为共载基因与药物组合治疗肺癌,还具有下列优点:(1) 阳离子聚合物能够在水溶液中能够自组装形成胶束,粒径分布较为均一。(2) 疏水性的内核可以包埋不同量的小分子药物,亲水性壳层带有正电荷可以固定基因,并在一定负电荷存在的情况下保持复合物的稳定性。(3)阳离子聚合物胶束可以有效地与基因形成稳定的络合物,共载药物/基因的复合物由于其壳层富含羟基易于跨膜运输和内涵体逃逸,促进基因在细胞内的转录与表达。(4) 药物/基因复合物能够有效地在细胞内释放出药物和基因,从而克服药物的多药耐药性。下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述:
实施例一:4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯的合成
首先,在惰性气体气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸(4-CPDB)和二硫二乙醇为原料,以N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)为吸水剂和4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂,通过酯化反应得到4-CPDB-ss-OH双头试剂。
具体合成方法如下:在通气过程中,向支管瓶中分别加入二硫二乙醇(5.46 g,35.4 mmol)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC,0.88 g,7.0 mmol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP,0.214 g,1.75 mmol)以及10 mL干燥后的二氯甲烷(CH2Cl2);然后利用恒压漏斗将含有10mL CH2Cl2的4-CPDB(1.0 g,3.5 mmol)溶液逐滴加入到圆底烧瓶中。待完全密封后,将反应瓶和恒压漏斗转移至-5 ℃低温恒温反应浴中,缓慢滴加。待滴加完毕,转移至30 ℃油浴中反应24 h。
反应结束后,除去反应产生的白色固体,将溶液浓缩至10 mL后,然后,利用柱层析的方法进一步提纯粗产物,以二氯甲烷和乙酸乙酯(v/v=5/1)为洗脱剂,浓缩收集产物。将产物置于真空干燥箱中50 ℃条件下烘干24 h至恒重。得到红棕色粘稠状产物4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯(4-CPDB-ss-OH,0.95 g,产率为61.9%)。产物的核磁共振氢谱图见图1。
实施例二:聚酯链转移剂4-CPDB-ss-PCL的合成
将装有搅拌子的50 mL支管烧瓶放在120 ℃烘箱中干燥至少12 h,取出,将支管烧瓶连接到双排管上,用油泵抽真空至常温,重复抽充气三次,最后充满氮气。在通入氮气时,往支管瓶中加入4-CPDB-ss-OH(51.3 mg,0.122 mmol),利用甲苯共沸法去除引发剂中残留的水分;待甲苯蒸馏完毕后,依次加入ε-CL单体(698 mg,4.84 mmol)以及辛酸亚锡(Sn(Oct)2,24.6 mg,0.061 mmol)。充满氮气完全密封后,转移至110 ℃油浴中继续搅拌反应6 h。反应结束后,将反应瓶冷却至室温后,加入少量CH2Cl2溶解粗产物,加入2-3滴冰醋酸,搅拌30min后,在冷无水***中沉淀三次,目的是除去未反应ε-CL单体和Sn(Oct)2催化剂。最后,将终产物置于40 ℃真空干燥箱中烘干至恒重;即可得到聚酯链转移剂(4-CPDB-ss-PCL,453.5 mg,产率:65.9%),产物的核磁共振氢谱图见图2。
实施例三:聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物的合成
将放入搅拌子的50 mL圆底烧瓶及玻璃塞在120 ℃烘箱中干燥24 h,取出,塞上玻璃塞,通过乳胶管与油泵相连,将支管圆底烧瓶抽真空至室温后,再通入高纯氮气。在通气过程中,分别依次加入4-CPDB-ss-PCL(100 mg,0.020 mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN,3.2 mg,0.020 mmol)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA,136.6 mg,0.29 mmol)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA,282 mg,1.98 mmol);在氮气氛围中,向支管烧瓶中加入8 mL的N,N-二甲基甲酰胺,抽真空,如此反复三次后充满氮气。搅拌待完全溶解,转移至70 ℃油浴中反应12 h。迅速降温终止反应。选用截留分子量为12000~14000 Da的透析袋对聚合反应的溶液进行透析,透析时间为48 h,每6 h更换一次透析水,目的是除去未参加反应的单体。将透析液冷冻干燥,获得白色絮状的固体。即聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯),(PCL-ss-P(GMA-co-PEGMA,304 mg) 产率为58.6%)。产物的核磁共振氢谱图见图3和凝胶渗透色谱图如图4。
实施例四:共载药物和基因用阳离子聚合物PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)共聚物的合成
向50 mL的单口圆底瓶中依次加入PCL-ss-P(GMA-co-PEGMA(100 mg,5.17 mmol)和0.5mL的N-羟乙基乙二胺(HA);然后向单口圆底烧瓶加入8 mL干燥后的DMF;搅拌待完全溶解,转移至70 ℃油浴中反应10 h。待反应结束后。选用截留分子量为12000~14000 Da的透析袋对反应原液进行透析,透析时间为24 h,每6 h更换一次透析水,目的是除去未参加反应的N-羟乙基乙二胺(HA)。将透析液冷冻干燥,获得白色絮状粉末共载药物和基因用阳离子聚合物,简称为PGHAP,产率为91.5%。产物的核磁共振氢谱图见图5。
实施例五:PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)共聚物自组装行为的研究
实施例四PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)共聚物的临界聚集浓度(CAC)是通过芘荧光探针法检测的。具体步骤如下:在一系列小盐水瓶中使用微量注射器加入50 μL芘的丙酮溶液(6´10-6 mol L-1),在真空条件下抽除盐水瓶中的丙酮。将母液按照一定的浓度来进行稀释,用母液以及稀释后的母液来配置一系列5 mL不同浓度的PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)溶液并将它们逐一添加到上述的小盐水瓶中并使用超声进行分散20 min,以使溶液中纳米粒子被彻底破坏。随后将这一系列具有不同浓度样品的盐水瓶放置于25 ℃条件下搅拌48 h。利用荧光分光光度计(Cary Eclipse,Agilent Technologies)对芘的荧光强度进行检测。其中,激发波长为335 nm,发射波长的范围为350 nm~550 nm,狭缝宽度为2.5 nm。以第三峰(I 3,382 nm)和第一峰(I 1,371 nm)荧光强度的比值(I 3/I 1)对胶束浓度对数(Log C)作图,图中两条直线的交点对应的横坐标的值就是聚合物前药纳米粒子的CAC值。其临界聚集浓度曲线图附图6所示,CAC值为15.2 mg L-1。
聚合物胶束采用透析法制备得到。将25 mg PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)共聚物和2.5 mL DMSO加至装有搅拌子的25 mL圆底烧瓶中,搅拌2 h,使聚合物充分溶解。随后,在搅拌的条件下,利用微量进样泵(WZS-50F)逐滴加入15 mL 的超纯水,滴加速度为2 mL/h,待完全进样后,继续搅拌4 h。将聚合物混合溶液转移到透析袋(MWCO 3500 Da)内,置于去离子水中透析24 h,每隔6 h换一次水,将透析后的聚合物溶液用去离子水定容到25 mL容量瓶中,得到PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)聚合物胶束(浓度为1.0 mg mL-1)。
称取3 mg的阿霉素盐酸盐(DOXHCl)放于单口圆底烧瓶中,向圆底烧瓶中加入2 mL的DMSO和20 mL三乙胺(TEA),搅拌12 h后,吸出三乙胺溶液,完全脱去盐酸盐,得到DOX/DMSO溶液。称取25 mg的聚合物溶于2 mL DMSO中,待完全溶解后,将所得到的聚合物溶液加入到DOX/DMSO溶液中,继续搅拌2 h。随后,在搅拌的条件下,利用微量进样泵(WZS-50F)逐滴加入10 mL的超纯水,滴加速度为2 mL/h,待完全进样后,继续搅拌4 h。将聚合物与DOX的混合溶液转移到透析袋(MWCO 7000 Da)内,置于去离子水中透析24 h,每隔6 h换一次水,将透析后的聚合物纳米粒子用去离子水定容到25 mL容量瓶中,得到载DOX的聚合物胶束(DOX-PGHAP),其的浓度为1 mg mL-1。整个制备过程在避光条件下操作。如附图7所示,分别表示的是聚合物胶束和载药聚合物胶束的TEM和粒径分布曲线图);其中,通过TEM测试的聚合物胶束和载药聚合物胶束的粒径大小分别为100 nm和150 nm左右;通过DLS测试PGHAP和DOX-PGHAP聚合物纳米粒子的粒径大小分别为160 nm和186 nm。
实施例六:药物/基因阳离子复合物的Zeta电位和凝胶阻滞电泳实验
首先制备不同浓度的载药聚合物胶束,然后将其与基因复合,制备出一系列不同N/P比的载药聚合物胶束/基因络合物。利用DLS分别对络合物的Zeta电位进行表征,并观察不同N/P比络合物的Zeta电位变化趋势。
载药聚合物纳米粒子/基因络合物中不同的N/P是由公式(1)计算得到,其中,M1代表聚合物中阳离子载体的质量,M p53为p53基因的质量。
(1)
将制备好的不同浓度载DOX的聚合物胶束溶液与一定质量的p53基因溶液混合,涡旋10秒后,静置30分钟后形成载药聚合物纳米粒子/p53络合物,即共载基因和药物的阳离子聚合物胶束。结果如附图8所示,裸DNA带有负电荷,随着氮磷比的增加,共载药物/基因络合物表面的Zeta电位值逐渐由负电荷变为正电荷。当氮磷比为3时,药物/基因络合物的Zeta电位值约为+25 mV。
设计不同N/P比值(分别为N/P=0,1,2,3,4,5,6)的共载基因和药物的阳离子聚合物胶束,在一定浓度的p53基因溶液中加入不同浓度的载DOX的聚合物胶束溶液,涡旋震荡使其完全混合均匀,阳离子聚合物纳米粒子是带正电荷,而DNA溶液是带负电荷,通过静电作用压缩DNA,形成载药聚合物纳米粒子/DNA络合物。将上述20 μL的载药聚合物纳米粒子/p53络合物和4 μL的缓冲溶液(6×DNA loading buffer)混合,点样到含有0.1 μL mL-1 GelRed的琼脂糖凝胶(1 wt%琼脂糖)中进行电泳测试。电泳电压为80 V,时间为30 min,缓冲溶液为0.5×TBE溶液。电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于化学发光成像仪(365 nm)中拍摄电泳结果,见图9A,其中泳道7至1分别对应N/P=0,1,2,3,4,5和6。
对于基因载体而言,要能够有效地将基因压缩住,并在体内遇到外源负电荷离子干扰时能够保持一定的稳定性。肝素钠是一种带有强负电荷的聚阴离子物质,利用肝素钠来模拟体内血液中带负电荷的大分子;当载药聚合物胶束/基因的络合物与肝素钠进行混合时,带负电荷的肝素钠会与带正电的载药聚阳离子载体发生电荷中和作用,与基因竞争阳离子聚合物,因此可以用来评价络合物的稳定性。将载DOX聚合物胶束溶液、p53基因溶液按一定的N/P(N/P = 6)混合,涡旋10秒后,静置30分钟后形成载药聚合物纳米粒子/p53络合物,然后向其中加入不同浓度的肝素钠溶液,与络合物混合均匀后形成一系列不同肝素钠浓度的溶液,静置30 min,然后进行琼脂糖凝胶电泳测试。同样的方法,利用化学发光成像仪对琼脂糖凝胶进行电泳照片的拍摄。其结果如附图9所示,其中,图9(A)表示的是不同氮磷比的药物/基因络合物的凝胶阻滞电泳图像;图9(B)所示,表示的是加入不同肝素钠溶液的药物/基因络合物凝胶阻滞电泳图像,其中第1列为DNA对照组,第2-7列对应肝素钠的浓度分别为0.1,0.3,0.5,0.7,0.9和1.0 mg mL-1。通过验证可知,药物/基因络合物具有较好的固定DNA的能力,以及能够在一定负电荷的环境下保持一定的稳定性。
实施例七:载药聚合物胶束的体外释放研究
将制备得到的载药聚合物胶束,对其在不同环境下体外释放行为的研究;取3 mL载药聚合物纳米粒子置于截留分子量为12000~14000 Da的透析袋中,分别用30 mL不同pH值的缓冲溶液加入到放有透析袋的大离心管中,缓冲溶液分为两种:(1)磷酸缓冲液(pH 7.4);(2)磷酸缓冲液(pH 7.4+10 mM GSH)。然后,将大离心管置于37.5 ℃的恒温振荡仪中,以160 r/min速度进行振荡。在设定的时间点,依次取出5 mL释放液并补加相应体积的缓冲溶液。每组实验进行3个平行实验,最后取平均值。取出的释放液用荧光分光光度计对DOX浓度进行测定。
为了测试载药纳米粒子中DOX的载药量和载药效率,具体步骤为:取1 mL载有DOX的聚合物纳米粒子,利用加入9 mL的DMF进行稀释(DMF/H2O= 9/1)。随后,利用超声和DMF使载药纳米粒子中包埋的DOX完全泄露出来。采用荧光分光光度计(FLS920,Edinburgh Co.)测定不同浓度载药纳米粒子的荧光光谱,激发波长为480 nm,扫描范围为500~700 nm,狭缝宽度为5 nm,取560 nm处的荧光强度,并根据标准曲线求出对应吸收值的DOX浓度。根据公式(2)进行计算载药胶束的载药量(DLC):
(2)
根据公式(3)进行计算载药胶束的载药效率(DLE):
(3)
通过公式(4)来计算聚合物前药纳米粒子在特定时间内DOX的累积释放量(E r)。
(4)
其中,Ve代表取出或者添加的释放液体积,Vo代表释放液的初始体积(30 mL),Ci代表第i次取出的释放液中药物的浓度,n代表取样次数,mdrug代表载药纳米粒子中计算所得DOX质量。结果如附图10所示,载药聚合物胶束能够在还原环境中促进药物的释放,在pH 7.4+10mM GSH缓冲溶液中DOX的累积释放量约为60%左右,这说明载药聚合物胶束具有还原响应性。
实施例八:聚合物胶束的生物相容性及DOX-PHGAP/p53基因复合细胞毒性的研究
将正常细胞(L929细胞)以及两种肺癌细胞(A549和H1299细胞)的细胞培养在补充有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,置于37℃,5% CO2(相对湿度为90%)的培养箱中培养,定期更换培养液。选择处在生长活跃期的细胞接种于每孔含有100 μL DMEM培养基的96孔板中,培养24 h。利用透析法制备的聚合物胶束(胶束浓度为5 mg mL-1),将一系列不同浓度的聚合物纳米粒子分别加入到96孔板中,继续培养48 h。接着加入25 μL的MTT试剂,进一步培养4 h后,用酶标仪(Bio-Rad model 680)在570 nm下测量对应的吸光度。
细胞存活率的计算方法为:
其中,ODtreated为含有聚合物胶束所测得的吸光度,而ODcontrol为不含有聚合物胶束所测得 的吸光度。每个样品测试三次,取其平均值。利用同样的方法,将药物/基因络合物加入到 96孔板中,继续培养48h。接着加入25μL的MTT试剂,进一步培养4h后,将孔内液 体吸出,加入150μL DMSO,摇匀后测试。用酶标仪(Bio-Rad model 680)在570nm下 测量对应的吸光度。结果如图11所示,所制备的阳离子聚合物胶束具有较好的生物相容 性,其在浓度为125mg mL-1时,三种细胞的存活率均能达到80%,由此可以说明聚合物胶 束可以作为药物和基因载体。细胞毒性的结果如图12所示,图(A)和图(B)分别是不同 浓度的DOX-PGHAP/p53复合物分别与A549细胞和H1299细胞培养48h后的细胞存活率 的结果,以游离的DOX为对照组。其中图12(A和B)中所示,游离DOX、DOX-PGHAP 纳米粒子以及DOX-PGHAP/p53复合物对A549细胞的IC50值分别是1.262mg L-1,1.053mg L-1以及0.364mg L-1;而H1299细胞的IC50值分别是是1.037mg L-1,0.814mg L-1以及 0.576mg L-1。由此可知,DOX-PGHAP/p53复合物具有较小的IC50值,说明本发明DOX- PGHAP/p53复合物可以通过内吞作用进入肿瘤细胞并在细胞中累积,所得到药物/基因复合 物能够更有效地抑制肿瘤细胞的增殖。
实施例九:细胞内吞测试
为了验证载药聚合物胶束/基因络合物可以通过内吞作用进入肿瘤细胞并在细胞内实现药物的释放和基因的表达,利用配有倒置荧光显微镜和培养箱的活细胞工作站对载药聚合物胶束/基因络合物的内吞过程进行检测。具体步骤为:首先将制备好的载药聚合物胶束与基因按一定的N/P混合(N/P=6),涡旋10 s后静置待用。选取处于生长活跃期的A549细胞,接种到35 nm的玻璃底培养皿中,密度为15×104细胞/mL,置于培养箱中培养12 h使细胞贴壁生长。取出后移除培养基,用PBS缓冲溶液洗三次,随后加入1 mL配制好的染料H 33342,放入培养箱中培养30 min完成对细胞核的染色。取出后移除带有染料的培养基,用PBS溶液冲洗三次,确保将培养皿中残留的染料冲洗干净。然后在培养皿中加入1 mL配置好的含有载药聚合物胶束/基因络合物的培养液,放入活细胞工作站的培养箱中用倒置荧光显微镜观察细胞内荧光强度随时间的变化。
图13显示了A549细胞在游离DOX+p53-GFP混合溶液以及载药聚合物胶束/基因络合物的内吞效果:(A)是载药聚合物胶束/基因络合物在不同时间段内的内吞图;(B)是游离DOX+p53-GFP混合溶液中的内吞图。这些结果表明:与游离的基因和药物相比,载药聚合物胶束/基因络合物能够有效的将基因和药物递送到细胞内,并且提高基因在细胞内的转染效率和药物在细胞内的富集,从而可以有效地抑制癌细胞的增殖,起到杀死癌细胞的作用。
本发明利用开环聚合和可逆加成-断裂链转移相结合,制备出分布较为均一PCL-ss-P(GMA-co-PEGMA)共聚物;再利用N-羟乙基乙二胺对聚合物侧链的环氧基团进行开环反应,得到具有还原响应性的PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)阳离子聚合物。本发明中,所构建的阳离子PCL-ss-P(GHA-co-PEGMA)聚合物侧链富含羟基,不仅能够增加阳离子聚合物的水溶性,还能促进阳离子聚合物在细胞内吞过程中的跨膜运输,有效地提高基因的转染效率。此外,聚己内酯作为疏水内核,能够有效地包埋疏水性抗癌药物;亲水壳层带有正电荷,能够将带有负电的基因进行压缩和固定,并且具有一定的稳定性。共载药物和基因的络合物能够有效地进入细胞内,在较高谷胱甘肽的条件下,导致药物/基因络合物中的主链裂解,导致聚合物胶束中的药物释放出来。再者,由于侧链富含羟基可以导致基因从内涵体逃逸,提高基因在细胞内的转录和表达,从而达到克服多药耐药性的目的。
Claims (10)
1.一种共载药物和基因用阳离子聚合物,由下列化学结构式表达:
式中,x为30~70,y为60~85,z为5~20。
2.根据权利要求1所述共载药物和基因用阳离子聚合物,其特征在于:共载药物和基因用阳离子聚合物的数均分子量为1.5´104~2.5´104 g mol-1。
3.根据权利要求1所述共载药物和基因用阳离子聚合物,其特征在于,所述共载药物和基因用阳离子聚合物的制备方法包括以下步骤:
(1)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸和二硫代二乙二醇为原料,在吸水剂、催化剂存在下,通过酯化反应得到4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯;
(2)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯为引发剂,己内酯为反应单体,在催化剂存在下,通过开环聚合反应,制备得到聚酯链转移剂;
(3)惰性气氛条件下,以甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯为反应单体,在聚酯链转移剂和引发剂存在下,通过可逆加成-断裂链转移反应制备聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物;
(4)利用氨基化合物对聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行开环反应,制备得到共载药物和基因用阳离子聚合物。
4.根据权利要求3所述共载药物和基因用阳离子聚合物,其特征在于:
步骤(1)中,惰性气氛为氮气气氛;吸水剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺;催化剂为4-二甲氨基吡啶;4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸、二硫代二乙二醇、N,N’-二异丙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(8~15)∶(1~5)∶0.5;
步骤(2)中,惰性气氛为氮气气氛;催化剂为辛酸亚锡;4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯、己内酯、辛酸亚锡的摩尔比为1∶(30~90)∶0.5;
步骤(3)中,惰性气氛为氮气气氛;引发剂为偶氮二异丁腈;聚酯链转移剂、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯的摩尔比为1∶1∶(60~90)∶(8~15);
步骤(4)中,氨基化合物为N-羟乙基乙二胺;聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)、N-羟乙基乙二胺的摩尔比为1∶(10~20)。
5.根据权利要求3所述共载药物和基因用阳离子聚合物,其特征在于:步骤(1)中,酯化反应时,反应温度为20 ℃~40 ℃,反应时间为30 h~60 h;步骤(2)中,开环聚合反应的温度为80 ℃~110 ℃,时间为5 h~15 h;步骤(3)中,可逆加成-断裂链转移反应时,反应温度为60 ℃~80 ℃,反应时间为5 h~15 h;步骤(4)中,侧链开环反应时,反应温度为60 ℃~80 ℃,反应时间为5 h~15 h。
6.一种共载药物和基因用阳离子聚合物胶束,其特征在于,所述共载药物和基因用阳离子聚合物胶束的制备方法包括以下步骤:
(1)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸和二硫代二乙二醇为原料,在吸水剂、催化剂存在下,通过酯化反应得到4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯;
(2)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯为引发剂,己内酯为反应单体,在催化剂存在下,通过开环聚合反应,制备得到聚酯链转移剂;
(3)惰性气氛条件下,以甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯为反应单体,在聚酯链转移剂和引发剂存在下,通过可逆加成-断裂链转移反应制备聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物;
(4)利用氨基化合物对聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行开环反应,制备得到共载药物和基因用阳离子聚合物;
(5)将共载药物和基因用阳离子聚合物在溶液中通过自组装形成共载药物和基因用阳离子聚合物胶束。
7.根据权利要求6所述共载药物和基因用阳离子聚合物胶束,其特征在于,包括以下步骤:
步骤(1)中,惰性气氛为氮气气氛;吸水剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺;催化剂为4-二甲氨基吡啶;4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸、二硫代二乙二醇、N,N’-二异丙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(8~15)∶(1~5)∶0.5;
步骤(2)中,惰性气氛为氮气气氛;催化剂为辛酸亚锡;4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯、己内酯、辛酸亚锡的摩尔比为1∶(30~90)∶0.5;
步骤(3)中,惰性气氛为氮气气氛;引发剂为偶氮二异丁腈;聚酯链转移剂、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯的摩尔比为1∶1∶(60~90)∶(8~15);
步骤(4)中,氨基化合物为N-羟乙基乙二胺;聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)、N-羟乙基乙二胺的摩尔比为1∶(10~20)。
8.一种共载药物和基因的阳离子聚合物胶束,其特征在于,所述共载药物和基因的阳离子聚合物胶束的制备方法包括以下步骤:
(1)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸和二硫代二乙二醇为原料,在吸水剂、催化剂存在下,通过酯化反应得到4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯;
(2)惰性气氛条件下,以4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯为引发剂,己内酯为反应单体,在催化剂存在下,通过开环聚合反应,制备得到聚酯链转移剂;
(3)惰性气氛条件下,以甲基丙烯酸缩水甘油酯和聚乙二醇甲基丙烯酸酯为反应单体,在聚酯链转移剂和引发剂存在下,通过可逆加成-断裂链转移反应制备聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)共聚物;
(4)利用氨基化合物对聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行开环反应,制备得到共载药物和基因用阳离子聚合物;
(5)将共载药物和基因用阳离子聚合物与药物混合,在溶液中通过自组装形成载药胶束;然后将载药胶束与基因复合,制备共载药物和基因的阳离子聚合物胶束。
9.根据权利要求8所述共载药物和基因的阳离子聚合物胶束,其特征在于,步骤(1)中,惰性气氛为氮气气氛;吸水剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺;催化剂为4-二甲氨基吡啶;4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸、二硫代二乙二醇、N,N’-二异丙基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1∶(8~15)∶(1~5)∶0.5;
步骤(2)中,惰性气氛为氮气气氛;催化剂为辛酸亚锡;4-氰基-4-(二硫代苯甲酰氧基)戊酸-二硫代二乙醇酯、己内酯、辛酸亚锡的摩尔比为1∶(30~90)∶0.5;
步骤(3)中,惰性气氛为氮气气氛;引发剂为偶氮二异丁腈;聚酯链转移剂、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯的摩尔比为1∶1∶(60~90)∶(8~15);
步骤(4)中,氨基化合物为N-羟乙基乙二胺;聚己内酯-ss-聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-聚乙二醇甲基丙烯酸酯)、N-羟乙基乙二胺的摩尔比为1∶(10~20);
步骤(5)中,将共载药物和基因用阳离子聚合物与药物在溶液中通过自组装形成载药阳离子聚合物胶束;然后将基因溶液与载药阳离子聚合物胶束溶液混合,涡旋,然后静置,得到共载药物和基因的阳离子聚合物胶束。
10.权利要求1所述共载药物和基因用阳离子聚合物或者权利要求6所述共载药物和基因用阳离子聚合物胶束作为药物和/或基因的载体中的应用;或者权利要求1所述共载药物和基因用阳离子聚合物或者权利要求6所述共载药物和基因用阳离子聚合物胶束或者权利要求8所述共载药物和基因的阳离子聚合物胶束在制备***的药物中的应用。
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Cited By (2)
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CN111154002A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-05-15 | 上海海洋大学 | 双功能肽k14、基因载体和共载药*** |
CN115010913A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-09-06 | 广东工业大学 | 一种pH/还原双重响应聚合物胶束及其制备方法与应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102432745A (zh) * | 2011-11-28 | 2012-05-02 | 苏州大学 | 一种含有环氧和叔胺双官能团的活性共聚物的制备方法 |
CN102643374A (zh) * | 2012-04-26 | 2012-08-22 | 北京化工大学 | Atrp法构建以pgma为骨架的高性能阳离子基因载体 |
CN102702407A (zh) * | 2012-06-21 | 2012-10-03 | 萨恩化学技术(上海)有限公司 | Atrp法构建以pgma为骨架的阳离子基因载体 |
CN103524687A (zh) * | 2013-09-11 | 2014-01-22 | 江南大学 | 一种表面形貌和性能可控的光敏性可降解梳状共聚物膜 |
US9285508B2 (en) * | 2009-06-16 | 2016-03-15 | Bausch & Lomb Incorporated | Biomedical devices |
-
2019
- 2019-06-17 CN CN201910523368.9A patent/CN110204664B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9285508B2 (en) * | 2009-06-16 | 2016-03-15 | Bausch & Lomb Incorporated | Biomedical devices |
CN102432745A (zh) * | 2011-11-28 | 2012-05-02 | 苏州大学 | 一种含有环氧和叔胺双官能团的活性共聚物的制备方法 |
CN102643374A (zh) * | 2012-04-26 | 2012-08-22 | 北京化工大学 | Atrp法构建以pgma为骨架的高性能阳离子基因载体 |
CN102702407A (zh) * | 2012-06-21 | 2012-10-03 | 萨恩化学技术(上海)有限公司 | Atrp法构建以pgma为骨架的阳离子基因载体 |
CN103524687A (zh) * | 2013-09-11 | 2014-01-22 | 江南大学 | 一种表面形貌和性能可控的光敏性可降解梳状共聚物膜 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JIUCUN CHEN,等: "Amphiphilic block copolymer micelles with fluorescence as nano-carriers for doxorubicin delivery", 《RSC ADVANCE》 * |
张骥,等: "基于环氧开环的聚合物类非病毒基因载体", 《中国化学会第29届学术年会摘要集——第35分会:纳米生物医学中的化学问题》 * |
陈久存: "环境响应型多嵌段共聚物的合成、自组装及应用研究", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 * |
陈枫,等: "RAFT法可控聚合合成聚电解质", 《科技通报》 * |
黄平升: "pH与氧化还原响应型聚两性离子纳米药物载体的构建与肿瘤靶向药物递送", 《万方数据库》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111154002A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-05-15 | 上海海洋大学 | 双功能肽k14、基因载体和共载药*** |
CN111154002B (zh) * | 2020-01-10 | 2022-11-22 | 上海海洋大学 | 双功能肽k14、基因载体和共载药*** |
CN115010913A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-09-06 | 广东工业大学 | 一种pH/还原双重响应聚合物胶束及其制备方法与应用 |
CN115010913B (zh) * | 2022-06-17 | 2023-05-26 | 广东工业大学 | 一种pH/还原双重响应聚合物胶束及其制备方法与应用 |
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