CN110204586A - 一种新的甾体化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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CN110204586A CN201910642626.5A CN201910642626A CN110204586A CN 110204586 A CN110204586 A CN 110204586A CN 201910642626 A CN201910642626 A CN 201910642626A CN 110204586 A CN110204586 A CN 110204586A
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彭成
熊亮
刘菲
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Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
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Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Abstract

本发明为一种新的甾体化合物及其制备方法与应用，公开了式Ⅰ所示化合物、或其晶型、或其盐。本发明还提供了该化合物的制备方法和应用。实验证明，本发明化合物、或其晶型、盐，对肿瘤细胞，特别是乳腺癌及胃癌细胞具有明显的增殖抑制作用，能够诱导肿瘤细胞的凋亡，为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物提供了一种新的选择。

Description

一种新的甾体化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种新的甾体化合物及其制备方法与应用。
背景技术
甾体是一类重要的天然产物，易穿透细胞且对细胞核和膜受体有很高的结合力。甾体化合物具有耐多药性(MDR)的低易感性和高生物利用度，因此作为抗炎剂，利尿剂，合成代谢剂，避孕剂和抗癌剂的应用受到广泛关注。来自植物的甾醇类化合物对肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、肠癌等的发生和发展有一定抑制作用。该类化合物抗肿瘤机制复杂多样，涵盖阻遏肿瘤的启动、抑制肿瘤细胞的生成、增强机体免疫功能、阻滞肿瘤细胞有丝***、诱导肿瘤细胞调亡、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞的转移及协同其他治疗手段提高疗效等多个方面。
中药雷丸(Omphalia lapidescens Schroet.)始载于《神农本草经》，为白蘑科真菌雷丸的干燥菌核，性寒，味苦，有小毒，主产于四川、云南、贵州、甘肃等地。雷丸是我国常用传统驱虫中药，功效主杀三虫(蛔虫、绦虫和钩虫)，《本草经疏》中对于明朝时期雷丸使用状况进行了记载，形容该药“除杀虫外，它用甚稀”。由于环境的改善，现代生活中寄生虫病已越来越少，雷丸的临床使用也随之减少。但新的研究发现雷丸还具有良好的抗肿瘤效果，以雷丸为主要原料的雷丸片和雷丸胶囊在临床均作为抗肿瘤药物被使用。临床实验结果表明，雷丸胶囊在肺癌患者中具有增效减毒的作用。雷丸胶囊作为辅助药物，不仅对广泛期小细胞肺癌具有一定的抗肿瘤作用，同时还具有减轻血液学毒性、刺激骨髓造血等功能。在与吉西他滨联合治疗晚期肺癌时，雷丸胶囊具有良好的临床疗效且安全性较好，可改善患者的生存情况与生活质量，具有一定的临床推广应用价值。体内实验表明，皮下注射雷丸注射液对小鼠S180具有显著的抗肿瘤活性，抑制率达85.2～86％；腹腔注射雷丸提取液对小鼠腹水癌U14抗肿瘤效果显著，可将小鼠生命延长率达82％。雷丸入药历史悠久，临床使用毒性较小，作为一种抗肿瘤药物具有进一步开发的潜力。
中药雷丸物质基础复杂，除含有大量蛋白酶外，还有甾体、萜类、多糖等多种类型的化学成分。近年来对雷丸抗肿瘤活性的研究主要集中在多糖及蛋白类成分，但对于其它类型如甾体、三萜类的报道较少，有必要对这些类型的化合物进行深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的具有药用价值的甾体化合物及其制备方法与应用，以及包含该甾体化合物的药物组合物，以便为抗乳腺癌或胃癌提供更多的药物选择途径。
具体地说，本发明提供了式Ⅰ所示化合物、或其晶型、或其盐：
其中，
R1～R3各自独立地选自H、氘、卤素、羟基、氨基、被0～6个Ra取代的C1～C6烷氧基、被0～6个Ra取代的C1～C6烷基，；
R4～R9各自独立地选自H、氘、卤素、羟基、醛基、羧基、氨基、被0～6个Ra取代的C1～C6烷氧基、被0～6个Ra取代的C1～C6烷基；
Ra选自H、卤素、羟基、甲氧基、乙氧基、氨基、C1～C6烷基。
进一步地，R1～R3同时为羟基；和/或，R4～R9同时为H。
进一步地，所述化合物如式I-2所示：
进一步地，所述化合物如式I-3所示：
其中，R1～R9如上所述。
进一步地，所述化合物如式Ⅱ所示：
本发明还提供了上述式I-2或式II所述化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、取雷丸药材，加乙醇提取后，取提取液，除去乙醇，得到乙醇浸膏；
b、将步骤a所得乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取1～6次，合并乙酸乙酯部分，除去溶剂，得到乙酸乙酯浸膏；
c、取步骤b所得乙酸乙酯浸膏，采用硅胶柱色谱，依次以二氯甲烷：甲醇体积比＝100:1～0:1的液体为洗脱剂进行梯度洗脱，得到二氯甲烷：甲醇体积比＝5:1时的洗脱液H；
d、取步骤c所得洗脱液H，采用反相中压色谱柱，依次以甲醇：水体积比＝30：70～100：0的液体为洗脱剂进行梯度洗脱，得到甲醇：水体积比＝75：25时的洗脱液H8；
e、取步骤d所得洗脱液H8，采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇体积比＝5：5：1为洗脱剂进行洗脱得到洗脱液H8-3，去除溶剂，得到剩余物1；
f、将步骤e所得剩余物1再次经过Sephadex LH-20凝胶色谱柱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇体积比＝5：5：1为洗脱剂进行洗脱得到洗脱液H8-3-3，去除溶剂，得到剩余物2，将剩余物2再通过反相液相制备色谱，分离，纯化，即得。
进一步地，步骤a中，所述雷丸药材与乙醇的重量体积比为1:(8～24)kg/L，提取时间为48h～96h，优选为72h；
步骤b中，所述乙醇浸膏与水的重量体积比为0.12:(0.8～2.4)kg/L，乙醇浸膏与乙酸乙酯的重量体积比为0.12:(0.8～2.4)kg/L，乙醇浸膏与正丁醇的重量体积比为0.12:(0.8～2.4)kg/L；所述萃取次数为6次；
步骤c中，所述梯度洗脱的条件如下：
步骤d中，所述梯度洗脱的条件如下：
步骤e中，所述洗脱的条件如下：
步骤f中，反相液相制备色谱的洗脱剂为甲醇：水体积比＝90:10。
本发明还提供了上述化合物、或其晶型、或其盐在制备预防和/或***药物中的应用；优选地，所述肿瘤为乳腺癌或胃癌。
进一步地，所述药物能够下调Procaspase-3酶原表达水平，增加Bax/Bcl-2表达比例。
本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，它是以上述的化合物、或其晶型、或其盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备得到的制剂。
本发明从雷丸药材中提取分离出了一种结构新颖的化合物，该化合物对肿瘤细胞，特别是乳腺癌及胃癌细胞具有明显的增殖抑制作用，能够诱导肿瘤细胞的凋亡，为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物提供了一种新的选择。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
“取代”是指分子中的氢原子被1个或多个其它不同的原子或基团所替换。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～Cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～C6烷基是指包含1～6个碳原子的烷基。
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
术语“盐”和“药学上可接受的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
硅胶柱色谱：是利用混合物中的各组分对固体吸附剂(也就是硅胶)的吸附能力不同而达到分离的层析方法。酶原：有些酶在细胞内合成或初级释放时只是酶的无活性前体，必须在一定的条件下，这些酶的前体水解开一个或几个特定的肽键，致使构象发生改变，表现出酶的活性。这种无活性酶的前体称作酶原。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明化合物的HRESIMS图。
图2为本发明化合物的红外光谱图(IR)。
图3为本发明化合物的1H-NMR图(C5D5N)。
图4为本发明化合物的13C-NMR图(C5D5N)。
图5为本发明化合物对相关凋亡蛋白表达的影响，compound 4是指本发明化合物。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明化合物的制备
(1)实验材料：
①药材
雷丸药材购于成都荷花池中药材专业市场。经成都中医药大学药学院龙飞老师鉴定，确定药材为白蘑科真菌雷丸的干燥菌核Omphalia lapidescens Schroet.。
②试剂和填料
柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
薄层层析硅胶G、GF254和H(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
Ultimate(250×10mm2)半制备型柱，以Rp C18(5μ)填装，Welch公司生产；
十八烷基硅烷键合硅胶(RPC18，43～60μm)，月旭科技(上海)股份公司；
Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，购于瑞典Amersham公司；
GF254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；
色谱甲醇，4L/瓶，购于美国Fisher公司；
石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。
③实验仪器
Cometro 6000高效液相色谱仪(美国Cometro)；
Búchi Gradient Former B-687中压液相色谱仪；
Waters Synapt G2HDMS高分辨飞行时间质谱(美国Waters)；
Bruker-600核磁共振仪(瑞士Bruker)；
Vector 22FT-IR红外光谱仪(瑞士Bruker)；
Shimadzu UV-260紫外-可见分光光度仪(日本Shimadzu)；
Perkin-Elmer 341旋光测定仪(美国PerkinElmer)；
BP211D十万分之一电子天平(瑞士Sartorius)；
R-210旋转蒸发器(瑞士BUCHI)；
DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)。
(2)本发明化合物的制备：
①、药材的提取：称取雷丸药材20Kg，粉碎，加95％乙醇(3×160L)提取72小时，提取3次，提取液合并后，减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏120g；
②、将乙醇浸膏(120g)用水(0.8L)分散，依次用乙酸乙酯(0.8L)、正丁醇(0.8L)萃取，萃取6次，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏(50g)；
③、采用硅胶柱(硅胶H)色谱对乙酸乙酯浸膏(50g)进行分离，按照表1进行梯度洗脱；取二氯甲烷：甲醇＝5:1洗脱部分(H)上反相中压色谱柱，按照表2进行梯度洗脱；收集75％甲醇洗脱部分(H8)，再通过Sephadex LH-20凝胶色谱柱以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝5：5：1为洗脱剂进行洗脱得到洗脱液H8-3，回收溶剂，剩余物再次经Sephadex LH-20凝胶色谱柱以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝5：5：1为洗脱剂进行洗脱得到洗脱液H8-3-3后，再通过反相液相制备色谱(Ultimate色谱柱，90％甲醇-水洗脱，保留时间tR＝98min)分离，纯化，即得本发明化合物。
表1、硅胶柱色谱的洗脱条件
表2、反相中压柱色谱的洗脱条件
(3)本发明化合物的鉴定：
白色粉末，易溶于二氯甲烷，难溶于石油醚，TLC检测254nm下有暗斑，碘蒸熏显黄色，10％硫酸乙醇溶液显紫色；由HRESIMS m/z 451.3193[M+Na]+可确定分子式为C28H40O3(见图1)，[α]25D+49.77(c 0.33,CHCl3)。
红外光谱中(见图2)可以看出具有明显的OH信号(3437和3327cm-1)。
化合物核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表3。
化合物核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-600spectrometer测定，数据见表3。
化合物1H-NMR(见图3)显示2个甲基单峰信号(δH:0.70,1.36)，4个与次甲基相连的甲基信号(δH:0.90,0.91,1.00,1.11)，2个低场连氧次甲基信号(δH:4.47,4.90)，4个低场烯氢质子信号(δH:5.25,5.32,5.71,5.74)。
化合物13C-NMR(见图4)和DEPT谱显示28个碳信号，DEPT谱显示这些碳信号分别归属于6个甲基、6个亚甲基、11个次甲基(包括2个连氧碳和4个烯碳)和5个季碳(包括1个连氧碳和2个烯碳)，结合以上信息和不饱和度可以推断出该化合物与已知化合物(22E,24R)-ergosta-7,22-diene-3β,5β,6α-triol的结构相似，均为C-9侧链上有两个共轭双键的Δ22-麦角甾衍生物。与之的不同主要在于该化合物的C-11上多了一个烯基[δH 5.71(s),5.74(d,J＝6.0Hz)；δC 122.1]。二维NMR数据分析结果与以上推断的平面结构相同，其相对构型同样可通过1H-1H耦合常数、NOESY数据和吡啶的去屏蔽效应确定。在NOESY谱中OH-5和H-6与H3-19的相关以及处于平伏键的H-1(J＝13.9,13.9,3.5Hz)与OH-3和OH-5的相关表明OH-3、OH-5、H-6和H3-19均为β构型，且A/B环顺式骈合。为了进一步验证其相对构型，采用经验方法吡啶诱导的去屏蔽效应，分别检测得到该化合物在CDCl3和C5D5N中的1H NMR数据。H-1β,H-6β和H3-19在C5D5N中均明显向低场位移(Δδ0.52,0.52,0.36)说明了OH-5为β构型。而22、23位上的氢耦合常数较大(15.0Hz)，此处双键的构型可以推测为E。根据之前的文献报道显示，真菌只生产有24α-甲基的甾体(侧链不饱和时为24S，侧链Δ22不饱和时为24R)，因此推断出C-24为R构型。因此，本发明化合物的化学结构确定为如式Ⅱ所示：
表3、本发明化合物的1H NMR(600MHz)、13C NMR(150MHz)核磁数据(测定溶剂b：CDCl3；测定溶剂c：C5D5N；δ：ppm；J：Hz)
为了说明本发明化合物的有益效果，本发明提供以下试验例。
试验例1细胞毒性试验
(1)实验材料：
①药物
受试化合物用DMSO配置成3.125,6.25,12.5,25,50μM的贮备液，-10℃保存。阳性药物(Paclitaxel)采用以上相同的方法配置贮备。
②细胞株
人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，购于中国科学院细胞库；
人胃癌细胞株HGC-27，购于ATCC。
③实验试剂
RPMI-1640,Gibico公司,批号1896994；
DMEM,Gibico公司,批号1812193；
胎牛血清,Gibico公司,批号1828728；
青霉素－链霉素溶液,碧云天公司,批号C0222；
甲基噻唑蓝(MTT),Sigma公司；
MTT配置方法：称取MTT 500mg，超声粉碎使其完全溶解于100ml磷酸缓冲液中，最终配成浓度5mg/ml的MTT液体，0.22μM滤膜滤过后锡箔纸包裹于4℃避光保存；
蛋白酶抑制剂，美国sigma公司生产；
二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，500ml/瓶，购于成都科龙化工试剂厂；
RIPA裂解液(强)，上海雅酶生物科技有限公司；
PMSF，碧云天生物技术有限公司；
PVDF膜，Millipore公司；
APS，Sigma公司；
ECL显影液，Abbkine公司；
抗体Procaspase-3，Abcam Inc.公司；
抗体Bax，Abcam Inc.公司；
抗体Bcl-2，Abcam Inc.公司；
抗体β-actin，GeneTex公司；
Omni-ECLTMFemtoLiqht化学发光试剂盒，购自上海EpiZyme生物技术有限公司。
④实验仪器
细胞培养板(96孔板)：Costar公司；
AL 104电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；
A99471离心机：Beckman Coulter公司；
TDZ5-W5台式低速离心机：Cence湘仪公司；
AE 2000电子显微镜：Motic公司；
Series II Water Jacket CO2孵箱：Thermo Scientific公司；
Sunrise酶标仪：TECAN公司；
SK-R1808-E摇床：SCILOGex公司；
MCV-13161FT超净工作台：Sanyo公司；
超声破碎仪：SCIENTZ公司；
F3CA69756Milli-Q纯水仪：Millipore公司。
(2)实验方法：
①MTT法测定细胞毒活性
首先，将MDA-MB-231和HGC-27细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基中。待细胞对数生长期进行收集，使用0.25％浓度的胰酶37℃消化4分钟，800r/min的转速下离心3分钟，弃去上清液，加入含10％FBS的完全培养基，反复吹打使细胞均匀分散，制成的悬液每毫升含有3.0×104个细胞，种于96孔板内，使得每孔接种细胞约3.0×103个。放入培养箱，24小时后观察细胞是否完全贴壁。确认细胞生长状态良好后，弃去上清培养基，加入含50,25,12.5,6.25,3.125μM药物的培养基，每个药物浓度设置3个复孔，每个药筛选重复3次，空白组为含有适量DMSO的培养基溶液，阳性对照药为紫杉醇，放入孵箱，在温度37℃、CO2浓度为5％的条件下培养48小时。取出，弃去上清液，向每个孔中加入事先配置好的MTT溶液(5mg/mL)20μL。放入孵箱相同条件下孵育4小时，取出后用针管小心吸去上清液，每孔加入150μL DMSO，置于水平摇床上震荡，使甲瓒完全溶解于DMSO。再将96孔板置于酶标仪内，在570nm处测定并记录OD值。最后以IC50值表示待测化合物对肿瘤细胞的抑制作用，IC50，半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)是指能达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。按照下列公式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率：抑制率＝1–A给药组/A空白组。各化合物的IC50值用spass软件进行计算。
②Hoechst 33342染色法检测细胞形态
取处于对数生长的MDA-MB-231细胞，设置转速为每分钟800转，开始离心，3分钟后取出，丢弃离心管上部液体，收集沉于底部的细胞，所得细胞加入培养基中，用移液枪小心反复吹打，配制为至3×105个/mL的混悬液，每孔100μL接种于96孔板内，加入含本发明化合物的RPMI-1640完全培养基，设置最高浓度为24μM，2倍稀释法稀释培养基中药物浓度，共设5个梯度，同时设置空白对照组。将这些细胞培养一天后，小心移去孔内培养基，使用PBS清洗两次，在清洗完成后将事先配制好浓度为0.01μg/mL的Hoechst染色剂，小心加入。在常温下避光染色5分钟，反应完全后，将染色剂移除并用PBS洗去残留染色剂，置于荧光显微镜(激发波长350nm，发射波长460nm)下观察并拍照。
③细胞凋亡相关蛋白表达
a)细胞裂解与蛋白提取
将细胞接种于6孔板中，使用不同浓度的化合物(0,6.25,12.5,25μM)处理MDA-MB-231细胞24小时后，移去培养液，加入4℃PBS洗一次，加入细胞裂解液300μL后，置于冰上裂解30分钟。设置超声破碎仪，每破碎10秒后暂停10秒，然后继续破碎10秒，如此循环往复。将好的细胞转移至经湿法灭菌的1.5mL EP管中，放置于冰水浴中破碎，每管细胞破碎3分钟。提前设置离心机为参数，温度为4℃，转数为12000rpm。待离心机温度达到4℃后，将裂解液放入离心15分钟。用移液枪小心吸取离心后EP管中上清液，取少许稀释后用BCA方法对每个样本的蛋白浓度开始进行测定。根据标曲将所有蛋白配至同一浓度。按照4:1的比例加入配置好的5×Loding buffer，涡旋仪充分混匀后放入热循环仪100℃5分钟，蛋白充分变性后取出冷却。根据实验使用量进行分装，保存于-2℃的冰箱中。
b)SDS-PAGE凝胶电泳与显影
取出两块玻璃板，把它们用清洁剂浸泡一段时间后，清洗干净，自然晾干或者用吹风机吹干，然后紧密的将其固定在配套的制胶架上，即形成了制胶板。按序顺次加入去离子水、30％Acrylamide、1.5M Tris-HCl(PH 8.8)、10％SDS于烧杯中充分混匀，再加入10％AP和TEMED后立刻摇匀，并用1mL的移液枪加入到两层玻璃板之间，而后在胶上加一层去离子水液封，37℃搁置30min，待胶凝后倒出水，板中残余的水可用滤纸吸干。按上述方法配制5％的浓缩胶并加入制胶板中，排除气泡***梳子，常温放置待用。将制胶板放入电泳槽中固定，垂直拔出梳子，随即加入足够量的1×running buffer于槽中。向孔胶中加入每孔蛋白量为75μg的样本或预染蛋白marker。上样完成后盖好电泳槽盖，接通电源，先稳定电压为80V，持续半小时后，观察到蛋白样品位置，待跑至下层分离胶后调整电压至100V。根据marker确认目的蛋白位置，确定分离足够距离后断开电源。取出胶板小心撬开，注意不要损坏胶体，用切胶板将含有所需目的蛋白的分离胶切开。剪取合适的PVDF膜并使用甲醇活化1分钟。将放入转膜液中浸润备用的海绵，PVDF膜及滤纸按顺序铺好后夹紧转膜夹，注意每层之间不能有气泡。将转膜仪放入电泳槽中，加入适量转膜液，并在另一侧放入小冰袋，盖上盖子后将电泳仪放入装有碎冰的泡沫箱中，接通电源，200mA转膜1小时。加入适量的TBSTBuffer稀释的5％脱脂奶粉后放入PVDF膜，密封好，放入培养皿中置于摇床上，封闭2h后取出PVDF膜，用TBST洗膜，5min/次，共3次。取出PVDF膜，使用滤纸擦去多余液体后平放于抗体孵育袋中，各自加入适量提前配制好的一抗稀释液，并用封口机将孵育袋密封好，摇床上轻摇，4℃孵育过夜。重新收回孵育袋中的一抗溶液，并将膜取出放入早已清洗干净的培养皿中，培养皿中加入一些TBST溶液，将它们放到摇床上漂洗，15min/次，共3次。参照孵育一抗的过程开始实施二抗封闭，37℃孵育1h。实验完成后用TBST溶液洗膜，10min/次，共3次。避光取ECL发光液A和B各取900μL于2mL的EP管中，立刻混匀后倒入保鲜膜上，并将PVDF膜平铺其中反应1min，反应结束后去除残液用干净的保鲜膜包好，放入凝胶成像仪中成像。取出暗盒，将PVDF膜固定其中并加入ECL显影液，均匀涂抹于膜上，反应1min后去除残液用干净的保鲜膜包好，在黑暗环境下将胶片放入暗盒内进行曝光。曝光完成后扫描所得胶片。
(3)实验结果和评价：
使用MTT检测从雷丸乙酸乙酯部位分离得到的本发明化合物对乳腺癌细胞MDA-MB-231和胃癌细胞HGC-27活性的影响，实验结果表明，本发明化合物对乳腺癌细胞MDA-MB-231和胃癌细胞HGC-27的IC50值分别为11.33±2.18和12.28±3.64μM，阳性药物(Paclitaxel)的IC50值分别为4.2±0.35和23.81±4.56μM。说明本发明的化合物对乳腺癌细胞MDA-MB-231和胃癌细胞HGC-27均有增殖抑制作用，特别是对胃癌细胞HGC-27的抑制作用甚至优于阳性对照药物。
Hoechst荧光染色实验显示，使用本发明化合物处理24小时后，与空白组相比，细胞在3.125,6.25,12.5和50μM浓度下表现出具有凋亡特征性的形态学变化，由此说明本发明化合物对MDA-MB-231细胞具有诱导凋亡的作用。随后，通过蛋白免疫印迹法检测细胞中凋亡蛋白的变化发现，本发明化合物可使Procaspase-3酶原表达水平下调以及Bax/Bcl-2的比例增加，从而促进细胞凋亡(见图5)。
综上，本发明从雷丸药材中提取分离出了一种新的化合物，该化合物对肿瘤细胞，特别是乳腺癌及胃癌细胞具有明显的增殖抑制作用，能够诱导肿瘤细胞的凋亡，为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物提供了一种新的选择。

Claims (10)

1.式Ⅰ所示化合物、或其晶型、或其盐：
其中，
R1～R3各自独立地选自H、氘、卤素、羟基、氨基、被0～6个Ra取代的C1～C6烷氧基、被0～6个Ra取代的C1～C6烷基，；
R4～R9各自独立地选自H、氘、卤素、羟基、醛基、羧基、氨基、被0～6个Ra取代的C1～C6烷氧基、被0～6个Ra取代的C1～C6烷基；
Ra选自H、卤素、羟基、甲氧基、乙氧基、氨基、C1～C6烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物、或其晶型、或其盐，其特征在于：
R1～R3同时为羟基；和/或，R4～R9同时为H。
3.根据权利要求2所述的化合物、或其晶型、或其盐，其特征在于：
所述化合物如式I-2所示：
4.根据权利要求1～3任意一项所述的化合物、或其晶型、或其盐，其特征在于：所述化合物如式I-3所示：
其中，R1～R9如权利要求1～3任意一项所述。
5.根据权利要求4所述的化合物、或其晶型、或其盐，其特征在于：所述化合物如式Ⅱ所示：
6.一种制备权利要求3或5所述化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、取雷丸药材，加乙醇提取后，取提取液，除去乙醇，得到乙醇浸膏；
b、将步骤a所得乙醇浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取1～6次，合并乙酸乙酯部分，除去溶剂，得到乙酸乙酯浸膏；
c、取步骤b所得乙酸乙酯浸膏，采用硅胶柱色谱，依次以二氯甲烷：甲醇体积比＝100:1～0:1的液体为洗脱剂进行梯度洗脱，得到二氯甲烷：甲醇体积比＝5:1时的洗脱液H；
d、取步骤c所得洗脱液H，采用反相中压色谱柱，依次以甲醇：水体积比＝30：70～100：0的液体为洗脱剂进行梯度洗脱，得到甲醇：水体积比＝75：25时的洗脱液H8；
e、取步骤d所得洗脱液H8，采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇体积比＝5：5：1为洗脱剂进行洗脱得到洗脱液H8-3，去除溶剂，得到剩余物1；
f、将步骤e所得剩余物1再次经过Sephadex LH-20凝胶色谱柱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇体积比＝5：5：1为洗脱剂进行洗脱得到洗脱液H8-3-3，去除溶剂，得到剩余物2，将剩余物2再通过反相液相制备色谱，分离，纯化，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
步骤a中，所述雷丸药材与乙醇的重量体积比为1:(8～24)kg/L，提取时间为48h～96h，优选为72h；
步骤b中，所述乙醇浸膏与水的重量体积比为0.12:(0.8～2.4)kg/L，乙醇浸膏与乙酸乙酯的重量体积比为0.12:(0.8～2.4)kg/L，乙醇浸膏与正丁醇的重量体积比为0.12:(0.8～2.4)kg/L；所述萃取次数为6次；
步骤c中，所述梯度洗脱的条件如下：
步骤d中，所述梯度洗脱的条件如下：
步骤e中，所述洗脱的条件如下：
步骤f中，反相液相制备色谱的洗脱剂为甲醇：水体积比＝90:10。
8.权利要求1～5任意一项所述的化合物、或其晶型、或其盐在制备预防和/或***药物中的应用；优选地，所述肿瘤为乳腺癌或胃癌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述药物能够下调Procaspase-3酶原表达水平，增加Bax/Bcl-2表达比例。
10.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于：它是以权利要求1～5任意一项所述的化合物、或其晶型、或其盐为活性成分，加上辅料或辅助性成分制备得到的制剂。
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