CN110201170B - Erbin在制备结直肠癌肺转移的检测和治疗产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了Erbin在制备结直肠癌肺转移的检测和治疗产品中的应用。本发明阐明了Erbin在结直肠癌肺转移中调控肿瘤免疫微环境的作用，明确Erbin调控IgA+B细胞介导CD8+T细胞在结直肠癌肺转移中的作用及其机制，提供Erbin的拮抗物质在制备防治结直肠癌肺转移的药物中的应用。并证明B细胞中缺失Erbin基因可以调控IgA+CD138+细胞，通过在结直肠癌肺转移的B细胞中缺失Erbin转基因动物肺组织中检测到IgA+CD138+细胞显著高于对照组，且检测到该转基因小鼠的血清中IgA蛋白显著高于对照组中的。且发现该细胞低表达PD1。且该IgA+CD138+细胞能通过CD8+T细胞的细胞杀伤效应来杀伤结直肠癌细胞，进而抑制结直肠癌肺转移。

Description

Erbin在制备结直肠癌肺转移的检测和治疗产品中的应用
技术领域
本发明涉及Erbin在制备结直肠癌肺转移的检测和治疗产品中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
结直肠癌是全世界排名前三的恶性肿瘤，尽管现在诊断和治疗技术有了很大的提升，远端转移的结直肠癌病人预后仍然很差。近些年综合治疗在肝转移灶领域的成功应用明显改善了肝转移患者的生存。
与结直肠癌肝转移相比，对于结直肠癌肺转移的关注程度、综合治疗理念及相关的临床和基础研究都相对匮乏。另外，我国的直肠癌比例近50％，直肠癌患者更容易发生肺转移，北京大学肿瘤医院1996年至2017年的回顾性资料显示，我国肺转移病例占所有转移性结直肠癌的32.9％，而初发肺转移的患者达24.5％。因而，结直肠癌肺转移的诊断和治疗及其相关临床和基础研究是一个亟需重视的领域。
肺的微环境是高度动态的，常常会受到各种因素的影响。目前大多研究围绕探讨先天性免疫***如何快速清除病原，保持肺部内稳态。更多了解肺脏本身肿瘤微环境能帮助我们发现新的靶点，增强治疗的有效性，更好得找到靶向治疗及治疗时产生的细胞毒素的平衡点。
Erbin属于富含亮氨酸重复序列及PDZ结构域蛋白(leucine rich repeat andPDZ containing protein,LAP)家族的成员。它是一个重要的接头蛋白，该家族成员特征为N端有16个亮氨酸(LRRs)的重复序列，C端有1-4个PSD95-Dlg-Zol(PDZ)功能域。最早因为它能直接结合ErbB2而被命名为Erbb2-interacting-protein(Erbb2ip)。近几年来，我们课题组围绕着Erbin对肿瘤细胞本身的影响进行了系列工作。我们发现，Erbin能够直接和ERa作用，介导其泛素化降解，从而促进肝癌发生。在结直肠癌，我们发现Erbin可以通过与c-Cbl相互作用抑制EGFR泛素化降解，从而促进结直肠癌的发生。此外，梅林教授团队报道Erbin可通过调控ErbB2促进乳腺癌细胞的增殖。
肿瘤的侵袭转移不单与肿瘤细胞自身的改变有关还与其赖以生存的环境是分不开的，例如淋巴细胞的表型和功能特征，它们与肿瘤细胞或肿瘤间质的相互作用，浸润入肿瘤的淋巴细胞的细微差异都可能导致杀灭肿瘤细胞或促进它们生长两种不同的结局。大量肿瘤样本中的基因组和转录组数据已经被用于研究肿瘤微环境(tumormicroenvironment，TME)，并用于评价浸润在肿瘤中的免疫细胞亚群免疫基因的表达。通过分析T细胞受体(TCR)，B细胞受体(BCR)基因的表达可让我们更多的了解免疫微环境的特征。但是，Erbin在肿瘤免疫微环境中的作用并不清楚。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明应用条件性敲除Erbin小鼠，完全敲除Erbin小鼠，结直肠癌细胞系，及其临床结直肠癌肺/肝转移标本从整体动物模型，细胞模型及其临床标本阐明Erbin在结直肠癌肺转移中调控肿瘤免疫微环境的作用，明确Erbin调控IgA+B细胞介导CD8+T细胞在结直肠癌肺转移中的作用及其机制。
本发明的第一个目的是提供Erbin的拮抗物质在制备防治结直肠癌肺转移的药物中的应用，所述的药物降低B细胞中Erbin的表达。
进一步地，所述的拮抗物质为抗体、siRNA、shRNA或慢病毒包裹的序列。
进一步地，所述的应用还包括将Erbin的拮抗物质与PD1联合使用。
进一步地，所述的Erbin的拮抗物质通过降低B细胞中Erbin的表达，促进CD8+T细胞的杀伤效应抑制直肠癌肺转移。
进一步地，所述的防治结直肠癌肺转移的药物的剂型为注射剂或口服靶向药。
本发明的第二个目的是提供Erbin在制备结直肠癌肺转移的检测试剂盒中的应用，所述应用是用于监测使用Erbin靶向药后的效果。
进一步地，所述的检测试剂盒中含有检测IgA表达量的试剂。
进一步地，所述的检测试剂盒中含有采用流式分析检测表面表达IgA+CD138+细胞比例的试剂。
进一步地，通过所述的试剂盒检测使用Erbin靶向药的结直肠癌病人外周血中IgA表达量或者表面表达IgA的浆细胞，如果外周血中IgA表达量升高或者表面表达IgA的浆细胞比例升高，预测结直肠癌肺转移得到抑制。
进一步地，所述的检测IgA表达量的试剂为酶联免疫检测IgA表达量的试剂。
本发明的有益效果是：
本发明应用条件性敲除Erbin小鼠，完全敲除Erbin小鼠，结直肠癌细胞系，及其临床结直肠癌肺/肝转移标本从整体动物模型，细胞模型及其临床标本阐明Erbin在结直肠癌肺转移中调控肿瘤免疫微环境的作用，明确Erbin调控IgA+B细胞介导CD8+T细胞在结直肠癌肺转移中的作用及其机制。
本发明直接证明B细胞中缺失Erbin基因可以调控IgA+CD138+细胞(IgA+浆细胞)，我们通过在结直肠癌肺转移的B细胞中缺失Erbin转基因动物肺组织中检测到IgA+CD138+细胞显著高于对照组，且通过Elisa试剂盒检测到该转基因小鼠的血清中IgA蛋白显著高于对照组中的。且通过流式分析技术(Facs)，发现该细胞低表达PD1。且该IgA+CD138+细胞能通过CD8+T细胞的CTL(细胞杀伤效应)效应来杀伤结直肠癌细胞，进而抑制结直肠癌肺转移。
附图说明
图1为Erbin-/-和Erbinloxp/loxp；CD19-cre的鉴定；
图2为Erbin-/-和Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠结直肠癌肺转移模型及过继Erbin-/-小鼠B细胞给野生型小鼠后结直肠癌肺转移情；A)Erbin-/-小鼠及其对照小鼠(野生型小鼠)结直肠癌肺转移大体观及HE；B)Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠及其对照小鼠Erbinloxp/loxp结直肠癌肺转移大体观及HE；C)野生型小鼠，Erbin-/-小鼠及其接受Erbin-/-小鼠B细胞的野生型小鼠结直肠癌肺转移大体观及HE；D)C图中根据三组小鼠肺部HE计数显微镜40倍视野下肺转移灶数目；
图3为完全缺失Erbin的小鼠、野生型小鼠、B细胞条件性缺失Erbin的小鼠和对照负瘤小鼠Erbinloxp/loxp的肺组织中IgA，IgG，IgM浆细胞的比例；
图4为Elisa检测B细胞条件性缺失Erbin的小鼠Erbinloxp/loxp；CD19-cre和对照负瘤小鼠Erbinloxp/loxp的外周血中IgA，IgG以及IgM的表达；
图5为Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠肺转移灶中IgA+CD138+，IgG+CD138+以及IgM+CD138+细胞上表达PD1的细胞的比例；
图6为Erbin-/-和Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠肺转移灶中CD4+T细胞，CD8+T细胞，及其CD8+perforin+细胞比例；
图7为多种抗体治疗小鼠结直肠癌肺转移模型的方案及其治疗效果；其中，A)治疗方案；B)大体观多种方案治疗效果；C)肺组织染色(HE)；D)40倍显微镜下对每一个组别肺转移灶计数。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
动物模型：(1)Erbin完全缺失的小鼠Erbin-/-模型；(2)野生型为Erbin-/-转基因小鼠的背景鼠C57；(3)B细胞特异性缺失Erbin基因的条件型缺失Erbin的小鼠Erbin-loxp/loxp；CD19-cre；(4)Erbin-loxp/loxp；CD19-cre的对照鼠为Erbin-loxp/loxp，与C57相比，染色体中有loxp/loxp修饰位点。
使用多种动物模型，评价Erbin在免疫微环境中的作用：分别构建上述动物模型的结直肠癌肺转移模型，诱导一个月后观察小鼠结直肠癌肺转移的程度，来判断B细胞中Erbin对结直肠癌肺转移的作用。
用流式分析技术检测上述B细胞缺失Erbin的负瘤小鼠与对照小鼠，B细胞缺失Erbin的负瘤小鼠的肺组织中浆细胞(B220-CD138+)显著增多，其中IgA浆细胞(IgA+CD138+)数目较IgM(IgM+CD138+)，IgG(IgG+CD138+)浆细胞比增多的最为显著。同时Elisa检测了B细胞缺失Erbin的负瘤小鼠与对照小鼠外周血中IgA，IgG，以及IgM的表达量。此外，通过流式分析技术，同时也发现B细胞缺失Erbin的小鼠负瘤模型肺组织中CD8+T细胞的增殖，及其T细胞分泌杀伤因子的表达情况都强于对照小鼠。以此确定了Erbin缺失的B细胞是通过CD8+T细胞的杀伤效应发挥功能。
同时，用细胞回输的技术，通过将肺转移程度较轻的B细胞缺失Erbin的小鼠的脾脏B细胞回输给野生型小鼠，发现与未接受B细胞的野生型相比，受体野生型肺转移情况显著好转。进一步证实了Erbin缺失的B细胞对结直肠癌肺转移的作用。
最后，为了验证B细胞中缺失Erbin会抑制结直肠癌肺转移，构建了平行6组C57小鼠(均为野生型小鼠)的结直肠癌肺转移模型，通过注射拮抗PD1抗体，拮抗Erbin的siRNA，拮抗B细胞，以及联合拮抗Erbin和PD1，联合拮抗B细胞和PD1与未接受任何抗体的对照组相比，经过1个月的时间，比较以上6组小鼠的肺转移灶的数目。判断拮抗Erbin及其联合拮抗Erbin和PD1对结直肠癌肺转移的作用。该实验模拟临床结直肠癌肺转移病人的情况，通过抗体靶向治疗小鼠的方式，确定Erbin对治疗结直肠癌肺转移的作用，及其确定最优的治疗方案。
实施例1：Erbin对小鼠不同浆细胞类群的影响与小鼠结直肠癌肺转移的关系
首先通过尾静脉注射小鼠结直肠癌细胞MCA-38或CMT-93的方式，构建Erbin-/-小鼠的结直肠癌肺转移模型。注射后一个月，观察肺转移的情况，称肺重和体重，HE染色，镜下记录转移灶的数目，以此判断肺转移的轻重。随后，我们应用Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠构建其结直肠癌肺转移模型，进一步确定B细胞中Erbin对结直肠癌肺转移的影响。
接着，在给Erbin-/-小鼠尾静脉注射MCA-38细胞1周后，分选出Erbin-/-小鼠脾脏B细胞，将其过继给野生型小鼠。一个月后，与未接受B细胞的野生型比较，观察接受Erbin-/-小鼠B细胞的小鼠结直肠癌肺转移情况，以此确定Erbin调控的B细胞是否在结直肠癌肺转移中的起到主导作用。
此外，通过RT-PCR的方法，在Erbin-/-小鼠肺转移灶中检测细胞因子，和趋化因子的表达。通过比较组间具有明显差异性的细胞因子和趋化因子的变化，判断Erbin可能在肺转移灶中影响的细胞类群。
最后，我们通过FACS和IHC检测Erbin-/-，Erbinloxp/loxp；CD19-cre结直肠癌转移的肺组织，外周器官血液和脾脏中IgA+，IgG+，IgM+细胞数目；Elisa检测小鼠外周血中IgA，IgM，IgG的蛋白含量，以此确定Erbin对小鼠不同浆细胞的影响及其与结直肠癌肺转移的关系。
1、Erbin完全缺失小鼠及其B细胞特异性缺失Erbin的小鼠背景的鉴定
提取小鼠DNA，PCR，看产物条带大小；完全缺失的小鼠需要送测PCR产物，对照峰图判断基因型。WB进一步验证。结果如图1所示。
2、小鼠结直肠癌肺转移模型的构建
培养MCA-38小鼠结直肠癌细胞，对数期时消化，计数，通过尾静脉注射的方式，每只小鼠接种1×106MCA-38，或CMT-93小鼠结直肠癌细胞。
3、HE染色
将制作好的石蜡切片经过二甲苯3次各5分钟和由高到低浓度的酒精各1分钟，再浸入水中水化5-10分钟。切片浸入苏木精中3分钟，流水冲去浮色，再至于温水中1分钟返蓝。切片浸入伊红20-30秒，经过95％，100％的酒精脱色，用中性树胶封片。待树脂干后可长期保存，数字病理切片扫描仪(d-metrix)扫描。
4、过继B细胞给野生型小鼠
我们将MCA-38细胞按照1×106个/只小鼠的剂量通过尾静脉注射的方式注入10对8周龄的Erbin-/-及野生型小鼠体内。一周后，将其中5只Erbin-/-小鼠处死，分别取每只小鼠骨髓，分离出1×106的B细胞，通过尾静脉注射的方式分别注入开始接受结直肠癌细胞诱导的5只野生型小鼠体内。2周后，同时处死最终三组动物模型。这三组模型分别为：接受结直肠癌细胞诱导但未接受B细胞的5只野生型小鼠；接受结直肠癌细胞并接受Erbin-/-B细胞的5只野生型小鼠；接受结直肠癌细胞诱导的5只Erbin-/-小鼠。分别取各组小鼠的肺组织，脾脏。将肺组织拍照，制备蜡块，HE染色，计数肺转移灶数目。
结果如图2所示，MCA-38细胞诱导的结果显示Erbin-/-小鼠肺转移灶数目显著少于野生型中。我们从Erbin-/-脾脏中分离出的B细胞回输给野生型，接受B细胞的野生型肺转移灶较未接受组野生型明显减少，接受供体的B细胞后，增强了受体杀伤肿瘤细胞的能力，抑制结直肠癌肺转移，与供体Erbin-/-肺转移情况相近。
如图2(B)所示，我们应用Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠，应用尾静脉注射MCA-38小鼠结直肠癌细胞的方式，构建结直肠癌肺转移模型，与对照小鼠相比，肺转移灶数目显著少于对照小鼠。
5、FACS
1)分离出小鼠脾脏单细胞
研磨脾脏，筛网过滤，离心1200rpm 6min，弃上清；裂红细胞：裂红液处理5分钟，加10ml培基终止裂红，离心1200rpm，5min，弃培基，含有血清的PBS重悬混匀，计数。
2)分离出小鼠肺中单细胞
将肺组织至于含有血清的RPMI 1640培养基中，肝脏至于无血清的RPMI1640培养基中，研磨，筛网过滤，离心1200rpm 6min，弃上清，将肝脏和肺分别置于40％Percoll溶液中，重悬，离心2000rpm，升速6，降速1，15min，25℃，将沉淀裂去红细胞：1～3ml裂红，1～5min，终止，离心1200rpm，5min，弃上清，用含血清的PBS重悬混匀，计数，铺板。
3)染色标记:
PC(CD45+B220-CD138+)；IgA+CD138+；IgG+CD138+；IgM+CD138+
6、Elisa检测
ICL Elisa试剂盒，方法参照说明书。
7、统计学检测
所有实验均重复三次以上，数据采用mean±SD表示，用软件GraphPad Prism5作图，统计学检验采用student-t-test，p<0.05为具有显著性差异。
结果如图3、图4所示，FACS检测Erbin-/-小鼠，Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠肺转移灶中IgA+CD138+，IgG+CD138+，IgM+CD138+的数目，结果显示以上两组小鼠肺转移灶中IgA+/IgG+/IgM+CD138+细胞数目显著多于对照；Elisa的结果显示B细胞缺失Erbin的小鼠外周血中的IgA蛋白显著高于对照，外周血中IgG和IgM差异并不显著。
实施例2：Erbin调控的新型IgA+B细胞亚群的分子特性及其与主要效应细胞的关系
首先，我们在Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠源性结直肠癌肺转移模型肺组织中，应用FACS检测CD4+T细胞及其亚群，CD8+T细胞，及其这些T细胞表达PD1的情况；同时应用IHC和IF方法检测IgA+B细胞，特别注意观察免疫共抑制分子如PD1、PDL1等的表达及其定位，检测CD8+T细胞，CD4+T细胞的表达及其定位，以此确定Erbin调控的IgA+B细胞在结直肠癌肺转移中所介导的效应细胞类型。
其次，基于Erbinloxp/loxp；CD19-cre结直肠癌肺转移模型，应用体内和体外实验分别检测效应细胞的分子特性。转基因动物肺转移灶中FACS检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖(Ki67)，杀伤效应标志物(Perforin等)，及其表达PD1的情况；体外实验中，在Erbinloxp /loxp；CD19-cre负瘤小鼠及其对照小鼠脾脏中分离出的B细胞，与野生型CD8+T细胞共培养，通过FACS检测共培养后IgA+B细胞的特性(比如表达PD1，PDL1的情况)。
FACS检测
IgA+PD1+；CD8+PD1+；CD8+Perforin+；CD8+IFNγ+；CD8+GranzB+
如图5所示，Facs方法检测到Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠肺转移灶中IgA+CD138+中的PD1+细胞显著少于在野生型肺组织中的且表达量较高。IgG+CD138+PD1+在B细胞缺失Erbin组表达高于对照组，但这两组小鼠中IgG+CD138+PD1+表达量没有IgA+CD138+PD1+高。IgM+CD138+PD1+细胞在两组小鼠肺组织中更没有差异。
我们通过FACS方法检测了Erbin-/-和Erbinloxp/loxp；CD19-cre小鼠及其对照肺转移灶中CD8+T细胞，CD4+T细胞，及其CD8+Perforin+细胞数目。结果如图6所示，结果显示，两种转基因小鼠肺转移灶中CD4+T细胞数目与其对照相比，没有太大的差异。Erbin-/-肺转移灶中CD8+T细胞数目明显多于对照，Erbinloxp/loxp；CD19-cre中CD8+T细胞数目多于对照比，但不显著。CD8+Perforin+在两种转基因小鼠肺转移灶中的数目均显著高于对照组中。
实施例3：拮抗Erbin的分子治疗对结直肠癌肺转移的小鼠的作用
准备6组C57小鼠，尾静脉注射MC38结直肠癌细胞，诱导其为结直肠癌肺转移模型。按照附图7制定治疗方案。
从以上6组小鼠肺转移情况大体观及其结合对其肺转移灶计数结果看，没有任何治疗组别(untreated)转移灶最多，抗体治疗的其余的5个组别中肺转移灶大约是未治疗组的1/10，其中效果最优的是单独拮抗Erbin的治疗组siErbin(siRNA-Erbin)，siRNA分子能够进入细胞，siRNA-Erbin能进入细胞，敲低Erbin的表达。另外siErbin与拮抗PD1联合治疗的方案也较优，这两组方案平均每个肺组织中大约为1个转移灶，约是未治疗组转移灶数目的1/10-1/30。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.Erbin的拮抗物质在制备防治结直肠癌肺转移的药物中的应用，其特征在于，所述的药物降低B细胞中Erbin的表达，所述的拮抗物质为抗体、siRNA、shRNA或慢病毒包裹的序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括将Erbin的拮抗物质与PD1联合使用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的Erbin的拮抗物质通过降低B细胞中Erbin的表达，促进CD8+T细胞的杀伤效应抑制直肠癌肺转移。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的防治结直肠癌肺转移的药物的剂型为注射剂或口服靶向药。
5.Erbin在制备结直肠癌肺转移的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述应用是用于监测使用Erbin靶向药后的效果。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中含有检测IgA表达量的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的检测IgA表达量的试剂为酶联免疫检测IgA表达量的试剂。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的检测试剂盒中含有采用流式分析检测表面表达IgA+CD138+细胞比例的试剂。
9.根据权利要求6或8所述的应用，其特征在于，通过所述的试剂盒检测使用Erbin靶向药的结直肠癌病人外周血中IgA表达量或者表面表达IgA的浆细胞，如果外周血中IgA表达量升高或者表面表达IgA的浆细胞比例升高，预测结直肠癌肺转移得到抑制。
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