CN110201099A - 戊糖片球菌纯种发酵六神曲的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种六神曲纯种发酵方法,它是接种戊糖片球菌到传统六神曲发酵所需原料中,进行发酵;所述传统六神曲发酵所需原料需经100℃以上高温灭菌。本发明还提供了该方法所得到的六神曲产品。本发明的六神曲具有优秀的促进胃排空的能力。其效果好高于自然发酵得到的六神曲,也高于枯草芽孢杆菌、伞枝犁头霉、黄曲霉及黑曲霉纯种发酵所得六神曲。
Description
技术领域
本发明涉及中药六神曲炮制领域。
背景技术
六神曲是一种传统中药,由辣蓼、青蒿、苍耳草、赤小豆、苦杏仁、麦麸、面粉发酵制备而成。六神曲具有健脾和胃,消食调中的作用;用于脾胃虚弱,饮食停滞,胸痞腹胀,小儿食积。
目前,六神曲发酵为传统自然发酵,发酵样品中杂菌较多,不同的环境也会对六神曲质量造成较大影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种六神曲的纯种发酵方法。
本发明的技术方案包括:
一种六神曲纯种发酵方法,它是接种戊糖片球菌到六神曲发酵所需原料中,进行发酵;所述传统六神曲发酵所需原料需经100℃以上高温灭菌;
所述六神曲发酵所需原料包括:苍耳草、青蒿、辣蓼、赤小豆、苦杏仁、麦麸和面粉。
如前述的六神曲纯种发酵方法,所述高温灭菌为121℃灭菌20min。
如前述的六神曲纯种发酵方法,所述传统六神曲发酵所需原料为:苍耳草4~6重量份,青蒿4~6重量份,辣蓼4~6重量份,赤小豆0.5~1.5重量份,苦杏仁0.5~1.5重量份,麦麸45~55重量份,面粉20~30重量份;
所述苦杏仁、赤小豆是能够过2号筛的粗粉;
所述苍耳草、青蒿、辣蓼是以水提物的方式与赤小豆、苦杏仁、麦麸、面粉混合;
如前述的六神曲纯种发酵方法,所述水提物的重量为原生药量的6.5倍。
如前述的六神曲纯种发酵方法,每g原料对应的戊糖片球菌的接种量是(1~3)×105个菌体;
优选地,每g原料对应的戊糖片球菌的接种量是2×105个菌体。
如前述的六神曲纯种发酵方法,它是加棉花塞于无菌环境发酵;
其发酵条件是:
温度35~38℃;
和/或,湿度70~80%;
和/或,4~7天。
如前述的六神曲纯种发酵方法,其发酵条件是:
温度37℃;
和/或,湿度75%;
和/或,4天。
前述六神曲纯种发酵方法所得的六神曲。
如前述的六神曲,其部分区域存在棉絮状白色菌落,有酒香。
本发明具有如下有益效果:
1)本发明所得产品气味较好。六神曲香气成分主要是亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯,而在这2种成分的含量上,本发明比自然发酵的六神曲含量要高。
2)本发明所得产品具有优秀的促进胃排空的能力。其效果好高于自然发酵得到的六神曲,也高于枯草芽孢杆菌、伞枝犁头霉、黄曲霉及黑曲霉纯种发酵所得六神曲。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1:自然发酵所得六神曲的外观图。
图2:戊糖片球菌纯种发酵所得六神曲的外观图。
图3:枯草芽孢杆菌纯种发酵所得六神曲的外观图。
图4:伞枝犁头霉纯种发酵所得六神曲的外观图。
图5:黄曲霉纯种发酵所得六神曲的外观图。
图6:黑曲霉纯种发酵所得六神曲的外观图。
图7:不同发酵方式所得六神曲中成分的韦恩图。
具体实施方式
本部分所涉及部分材料来源如下:
1仪器
2试药
实施例1本发明的六神曲纯种发酵方法
1.软材(曲料)制备
1.5g苦杏仁、1.5g赤小豆混合,过2号筛粉碎成粗粉,与30g面粉、55g麦麸混匀,再分装于250mL广口瓶中,加塞,用牛皮纸封口,121℃灭菌20min。
取苍耳草4g、青蒿4g、辣蓼4g,加12倍量水,浸泡30分钟,煎煮1小时,用200目滤布板框滤过,滤液浓缩成清膏(原生药6.5倍量水),121℃灭菌20min。
上述灭菌后的原料,紫外灯下放冷后,充分混合,得软材。
2.发酵
在无菌条件下,取10ml浓度为3×106菌体/mL的戊糖片球菌悬浮液,与己经灭菌的软材均匀混合,用棉花塞住广口瓶瓶口,置35℃、湿度70%的恒温恒湿箱中发酵培养6d。发酵后,将曲料取出并于冷冻干燥机中冻干备用。
实施例2本发明的六神曲纯种发酵方法
1.软材(曲料)制备
1g苦杏仁、1g赤小豆混合,过2号筛粉碎成粗粉,与25g面粉、50g麦麸混匀,再分装于250mL广口瓶中,加塞,用牛皮纸封口,121℃灭菌20min。
取苍耳草5g、青蒿5g、辣蓼5g,加12倍量水,浸泡30分钟,煎煮1小时,用200目滤布板框滤过,滤液浓缩成清膏(原生药6.5倍量水),121℃灭菌20min。
上述灭菌后的原料,紫外灯下放冷后,充分混合,得软材。
2.发酵
在无菌条件下,取10ml浓度为2×106菌体/mL的戊糖片球菌悬浮液,与己经灭菌的软材均匀混合,用棉花塞住广口瓶瓶口,置37℃、湿度75%的恒温恒湿箱中发酵培养4d。发酵后,将曲料取出并于冷冻干燥机中冻干备用。
实施例3本发明的六神曲纯种发酵方法
1.软材(曲料)制备
0.5g苦杏仁、0.5g赤小豆混合,过2号筛粉碎成粗粉,与20g面粉、45g麦麸混匀,再分装于250mL广口瓶中,加塞,用牛皮纸封口,121℃灭菌20min。
取苍耳草6g、青蒿4g、辣蓼5g,加12倍量水,浸泡30分钟,煎煮1小时,用200目滤布板框滤过,滤液浓缩成清膏(原生药6.5倍量水),121℃灭菌20min。
上述灭菌后的原料,紫外灯下放冷后,充分混合,得软材。
2.发酵
在无菌条件下,取10ml浓度为0.82×106菌体/mL的戊糖片球菌悬浮液,与己经灭菌的软材均匀混合,用棉花塞住广口瓶瓶口,置38℃、湿度80%的恒温恒湿箱中发酵培养7d。发酵后,将曲料取出并于冷冻干燥机中冻干备用。
以下将以实验例的形式对本发明的有益效果进一步说明。
实验例1不同微生物纯种发酵六神曲以及传统发酵六神曲的对比
1.发酵方法
1.1传统发酵
苦杏仁、赤小豆混合,过2号筛粉碎成粗粉,与面粉、麦麸混匀;另取辣蓼、青蒿、苍耳草加12倍量水,浸泡30分钟,煎煮1小时,用200目滤布板框滤过,滤液浓缩成清膏(原生药6.5倍量水),趁热与上述药粉拌匀,制成握之成团触之即散的软材,在37℃、75%湿度的恒温恒湿箱中发酵四天,干燥,即得。处方:苍耳草5g,青蒿5g,辣蓼5g,赤小豆1g,苦杏仁1g,麦麸50g,面粉25g。
1.2纯种发酵软材(曲料)制备
苦杏仁、赤小豆混合,过2号筛粉碎成粗粉,与面粉、麦麸混匀,再分装于250mL广口瓶中,加塞,用牛皮纸封口;青蒿、辣廖、苍耳草同上煎煮浓缩后装于锥形瓶,加塞,以上原料一起置高压蒸汽灭菌锅中于121℃灭菌20min,紫外灯下放冷后,制成软材备用。原料处方与传统发酵相同。
1.3马铃薯培养基PDA
称取4.3g马铃薯葡萄糖琼脂溶于100mL纯水中,煮沸至溶解。分装后经121℃20min高压灭菌备用。该培养基用于培养伞枝犁头霉。
1.4牛肉膏蛋白胨培养基
称取牛肉膏0.3g,蛋白胨1g,NaC 1.5g,琼脂1.5g,水100mL,煮沸助溶解。分装后经121℃ 20min高压灭菌备用。该培养基用于培养枯草芽孢杆菌。
1.5麦芽汁琼脂培养基
称取麦芽汁琼脂粉4g,用水100mL,煮沸助溶解。分装后经121℃ 20min高压灭菌备用。该培养基用于培养黄曲霉、黑曲霉。
1.6 MRS肉汤培养基
取MRS培养基5g,加纯水100mL,搅拌至完全溶解。分装后经121℃ 20min高压灭菌备用。该培养基用于培养戊糖片球菌。
1.7纯种发酵
1.7.1孢子混悬液的制备
戊糖片球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、黄曲霉及伞枝犁头霉分别复活,接种到各自准备好的灭菌培养基平板上,置培养箱中培养,其中戊糖片球菌(30℃),枯草芽孢杆菌(28℃),黑曲霉、黄曲霉及伞枝犁头霉(37℃),待菌群生长茂盛时,用灭菌水将孢子/菌体冲洗下来,使用显微染色法计数(细菌以菌体计数,真菌以孢子计数),并制成浓度为2×106孢子(或菌体)·mL-1的孢子/菌体悬浮液备用。
1.7.2纯种发酵
在无菌条件下,分别取10ml上述孢子/菌体悬浮液,与己经灭菌的软材均匀混合,用棉花塞住广口瓶瓶口,置37℃、湿度75%的恒温恒湿箱中发酵培养4d。发酵后,将曲料取出并于冷冻干燥机中冻干备用。
2发酵样品的比较
2.1性味比较
六神曲性状描述为块状或粗颗粒状,表面黄色,有灰白色霉衣,略有酒香气或陈腐气,味微苦。常规发酵多以“表面遍生黄白色或灰白色霉衣”为发酵重点,而发酵样品多具有发酵后特有气味,所以可根据发酵后样品的表面性状和气味来比较发酵样品的优劣。
2.2消食功效比较
2.2.1药液的制备
分别将自然发酵(ZR)、戊糖片球菌发酵(WTPQ)、枯草芽孢杆菌发酵(KCYB)、伞枝犁头霉发酵(SZLT)、黄曲霉发酵(HQM)及黑曲霉发酵(HEI)的样品,分别取六神曲样品适量,与10倍量水混匀,浸泡30min,水浴回流提取两次,每次1h,200目纱布过滤,将两次滤液合并后,旋蒸浓缩至所需浓度。将健胃消食片研成粉末加水制成所需浓度。
2.2.2不同样品对正常小鼠肠胃功能的影响
将小鼠按体重,性别随机分为8组,每组10只。分别为空白组,ZR组、WTPQ组、KCYB组、SZLT组、HQW组、HEI组、健胃消食片组。取健康SPF级KM小鼠60只,称重,按体重、性别随机分为6组,每组10只。动物常规饲养3天后,其中模型对照组给予生理盐水,其余几组给予相应的药液,连续灌胃7天。
实验前禁食不禁水10小时,末次给药后0.5小时后各组给予0.05%的碳末0.3ml/只,20min后分别颈椎脱臼法处死,立即取贲门至直肠末端胃肠,自幽门***处取胃,将其放入8ml生理盐水溶液中切碎搅匀,室温下静置1h,3000r·min-1离心15min,上清液在546nm处测吸光度(A值)为胃内碳末的残留量,并另外取4只小鼠给予碳末混悬液后立即处死,取胃,测其吸光度为碳末的基准吸光度。胃排空率(Gastric emptying)%=(1-A胃内碳末/A基准碳末)×100%。取出小肠分离肠系膜,剪取幽门至回盲肠部的肠管,置于托盘上,轻轻将小肠拉成直线,测量碳末前进的距离以及小肠全长。小肠推进率(Intestinaltransit)%=碳末前进的距离/小肠的全长×100%
2.2.3统计学处理
实验数据统一表达方式为:采用平均值±标准差(x±s),数据分析软件为SPSS21.0软件。结果用t检验进行比较分析。分析结果均以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.3 GC-MS分析
2.3.1色谱条件
DB-5MS石英毛细管柱[30m×0.25mm×0.25μm]、进样口温度:280℃。进样的方法法:升温程序:最开始的柱温60℃,以20℃·min-1升温至200℃,再以10℃·min-1升温至280℃保持20min;载气:高纯氦,流速1mL·min-1;进样方式:分流进样;分流比:50∶1;进样量:1μL。
2.3.2质谱条件
色谱与质谱接口温度:280℃;电离方式:电子轰击源(EI);监测方式:全扫描;扫描范围:35~550aum;电离能量:70eV;溶剂延迟:2min;离子源温度:280℃;谱库:INST2005。
2.3.1样品制备
分别称取六神曲各样品粉末20.0g(80目),精密称取,用石油醚(60~90℃)200mL回流3h得到石油醚提取液,回收溶剂至干,用氯仿复溶,配成浓度为5mg·mL-1溶液,加少量无水硫酸钠脱水干燥,密封作为供试品溶液。
3实验结果
3.1外观性状结果
以发酵后六神曲的外观性状和气味评价,对不同菌株发酵和传统发酵工艺发酵后的样品进行比较,不同发酵样品均能长出白色菌落或白霉,只有细菌发酵和自然发酵才有酒香气,而霉菌发酵样品均为陈霉气味,详见表1。
表1不同发酵样品性状结果
3.2不同样品对正常小鼠肠胃功能影响结果
由表2可知,与空白组比较传统发酵和不同菌种发酵的六神曲均能促进正常小鼠的肠推进率和胃排空率,SZLT和HEI组可以明显的增加正常胃排空率(P<0.05),但对小肠推进无明显作用,不过有增加趋势,其他组别均有明显的增加胃排空、肠推进率的作用(P<0.01)。
表2肠推进率胃排空率结果
备注:与模型组相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01
3.3 GC-MS分析结果
检测结果见表3,六个样品中共检测出来76种化合物,其中ZR、WTPQ、KCYB、SZLT、HQM、HEI各检测到31、30、31、34、30、36种,它们共有成分有14种,分别是肉豆蔻酸、棕榈酸甲酯、棕榈油酸、棕榈酸、棕榈酸乙酯、十七烷酸、脱氧青蒿素、亚油酸乙酯、硬脂酸乙酯、Paullinic酸、棕榈酸己酯、BETA-扶桑甾醇氧化物、角鲨烯、γ-谷甾醇。而以下六种成分有四到五种发酵方式中存在:十五烷酸、反油酸、亚油酸甲酯、亚油酸、硬脂酸、菜油甾醇。反-9-十八碳烯酸甲酯、亚麻酸C18∶2、二十酸、(9Z)-十八碳9,17二烯醛、正十七烷、十六烷基十六烷酸酯七种成分在至少三种发酵方式中出现,它们之间的差异或是不同发酵方式引起的影响。各组成分重合情况见图7。
表3 GC-MS检测结果
综上,本发明的戊糖片球菌纯种发酵六神曲的方法,能够获得与其他微生物纯种发酵不同的发酵产物组合。本发明的发酵产品呈浓酒香,无明显陈霉味,气味易于被人接受。本发明的发酵产品还具有较高的胃排空作用。本发明的方法及该方法得到的产品具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.一种六神曲纯种发酵方法,其特征在于,它是接种戊糖片球菌到六神曲发酵所需原料中,进行发酵;所述传统六神曲发酵所需原料需经100℃以上高温灭菌;
所述六神曲发酵所需原料包括:苍耳草、青蒿、辣蓼、赤小豆、苦杏仁、麦麸和面粉。
2.如权利要求1所述的六神曲纯种发酵方法,其特征在于:所述高温灭菌为121℃灭菌20min。
3.如权利要求1所述的六神曲纯种发酵方法,其特征在于:
所述传统六神曲发酵所需原料为:苍耳草4~6重量份,青蒿4~6重量份,辣蓼4~6重量份,赤小豆0.5~1.5重量份,苦杏仁0.5~1.5重量份,麦麸45~55重量份,面粉20~30重量份;
所述苦杏仁、赤小豆是能够过2号筛的粗粉;
所述苍耳草、青蒿、辣蓼是以水提物的方式与赤小豆、苦杏仁、麦麸、面粉混合。
4.如权利要求3所述的六神曲纯种发酵方法,其特征在于:
所述水提物的重量为原生药量的6.5倍。
5.如权利要求3所述的六神曲纯种发酵方法,其特征在于:
每g原料对应的戊糖片球菌的接种量是(1~3)×105个菌体。
6.如权利要求5所述的六神曲纯种发酵方法,其特征在于:
每g原料对应的戊糖片球菌的接种量是2×105个菌体。
7.如权利要求1所述的六神曲纯种发酵方法,其特征在于:它是加棉花塞于无菌环境发酵;
其发酵条件是:
温度35~38℃;
和/或,湿度70~80%;
和/或,4~7天。
8.如权利要求7所述的六神曲纯种发酵方法,其特征在于,其发酵条件是:
温度37℃;
和/或,湿度75%;
和/或,4天。
9.由权利要求1~8任一所述六神曲纯种发酵方法所得的六神曲。
10.如权利要求9所述的六神曲,其特征在于,所述六神曲部分区域存在棉絮状白色菌落,有酒香。
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