CN110199854A

CN110199854A - 一种幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法

Info

Publication number: CN110199854A
Application number: CN201910638978.3A
Authority: CN
Inventors: 徐红卫; 刘成洪; 陆瑞菊; 黄剑华; 梁乔伟; 黄赛华
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2019-09-06

Abstract

一种幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，将待鉴定的大麦材料进行催芽，待种子出芽后转苗，再进行盐处理，测定幼苗的叶绿素含量及地上部干物重，经过数据处理，结合相对叶绿素含量和相对地上部干物重的乘积指标，能快速初步鉴定耐盐材料，利用本发明，可大批量多重复筛选大麦材料，占用空间极小，能有效保证实验的可重复性和准确性，简单、快速、便捷地测定材料的叶绿素含量及地上部干物重，对于群体材料大规模的筛选具有重要意义。

Description

一种幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法

技术领域

本发明属于作物种质资源鉴定领域，具体涉及一种幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法。

背景技术

土壤盐碱化是制约全球农作物产量和威胁粮食安全最为严重的非生物胁迫因子之一，盐碱地的改造与开发利用已成为农业可持续发展中亟待解决的重要问题。

通过筛选和遗传改良途径培育耐盐农作物新品种，是高效利用盐碱地、提高土地综合生产力的最根本途径。大麦是全球第四大禾谷类作物，广泛应用于饲料、啤酒、食品、医药领域等。由于其生育期短、适应性广和耐逆性强等优点，一直受到科学家们的广泛关注，也被作为遗传学研究的模式植物之一。大麦在禾谷类作物中耐盐性最强，是盐碱地改良的先锋作物，研究大麦耐盐机制，不仅对我国大麦耐逆育种的进一步发展具有重要的理论意义和应用价值，还对于提升其它禾本科作物的耐盐性具有重要的应用价值。

植物的耐盐性是一种复杂的数量性状，真实反映和衡量植物的耐盐性十分困难，一套行之有效的耐盐筛选指标也是必不可少的。多年来，研究者进行了大量筛选试验，探索植物耐盐性的评价方法；如在芽期主要通过发芽率、主根长度和胚芽鞘长度作为指标来反映材料之间的耐盐性差异；在苗期，主要通过土培或者溶液培养进行材料的耐盐性筛选，并以植株生物量和离子积累量等指标反映材料的差异；在全生育期，主要通过大田试验以产量作为指标评价材料的耐盐性，尽管这些筛选方法可以鉴定出某几种或者某一类物种之间的耐盐性差异，但它们均存在一定的局限性。

不同品种的遗传背景不同，在芽期鉴定的方法中，出芽率本身存在显著性差异，无法判定是盐胁迫还是本身发芽率低的问题；在苗期土培或者水培耐盐性筛选试验中，有采用人工模拟盐分环境，通过测定不同处理的苗高、根长和整株鲜重，调查待测样品在盐胁迫条件下相对于空白对照条件所受到的盐害程度，但是条件需要强调植物生长的空间和环境，若需要保证足够的样本重复进行统计分析，则占用空间大；而大田试验由于其受到外界众多因素的影响，对盐浓度控制的难度大，所以导致试验重复性差，同时大田试验周期长，耗时耗力，尤其大规模地进行耐盐品种筛选时工程艰巨；其他的生理指标中测定较多的钠钾离子含量，有报道表明，在大麦中并不能正确反映材料之间的耐盐性差异，因此，也亟需一套有效简便的筛选方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，以叶绿素含量和干物重为筛查指标结合判断，准确反映大麦材料的耐盐能力，提高鉴定大麦对盐环境耐受程度的准确性，在早期即能够大批量、多重复快速筛选大麦耐盐材料，节省时间和成本。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，包括如下步骤：

1)催芽

取待鉴定的大麦种子，清水冲洗干净，18-22℃浸种6-8个小时，然后催芽过夜，待种子露白后，放到湿润的滤纸上发芽；

2)转苗

种子出芽后5-7天，芽长为4-5cm时，取长势整齐的大麦幼芽，转苗至培养盒中，根部浸入水中，置于温室中培养6-24小时，培养温度为18-22℃；

3)盐处理

将培养盒中的水换为盐溶液，进行盐处理，以清水中生长的大麦幼苗作为对照处理，每种处理各设5-20次重复，处理时间为6-8天，处理3-4天后更换新的盐溶液，其中，所述盐溶液的浓度为300-600mmol/L；

4)测定数据

盐处理完成后，测定最先展开叶片的叶绿素含量，取5株以上经过盐处理的大麦幼苗叶片叶绿素含量的平均值，作为盐处理幼苗的叶绿素含量；取5株以上对照幼苗的叶片叶绿素含量平均值，作为对照幼苗的叶绿素含量；

叶绿素含量测定完成后，分别取盐处理幼苗和对照幼苗的地上部，于100-110℃杀青30-60min，65-80℃烘干至恒重，测定对应幼苗的地上部干物重，分别获得盐处理幼苗的地上部干物重和对照幼苗的地上部干物重；

5)数据处理

根据测定的盐处理幼苗和对照幼苗的叶绿素含量、地上部干物重分别计算出对应的相对叶绿素含量以及相对地上部干物重；

相对叶绿素含量＝盐处理幼苗的叶绿素含量/对照幼苗的叶绿素含量；

相对地上部干物重＝盐处理幼苗的地上部干物重/对照幼苗的地上部干物重；

再将相对叶绿素含量和相对地上部干物重相乘，所得乘积作为判定指标：若所述乘积＞0.7，则所鉴定的大麦品种或者基因型为耐盐材料；若所述乘积＜0.5，则所鉴定的大麦品种或者基因型为盐敏感材料。

优选地，步骤2)中，所述培养盒为移液枪的枪头盒。

又，步骤3)中，所述盐溶液的浓度为400-450mmol/L。

进一步，步骤4)中，分别测定每叶片的叶尖、叶中和叶基处叶绿素的含量，并取三者的平均值作为每叶的叶绿素含量，对于待鉴定大麦幼苗和对照幼苗，分别取20个以上叶片的叶绿素含量平均值，作为对应的盐处理幼苗的叶绿素含量和对照幼苗的叶绿素含量。

优选地，步骤4)中，计算盐处理大麦幼苗和对照幼苗的叶绿素含量时，分别取5-20株幼苗最先展开叶片的叶绿素含量平均值。

又，步骤4)中，通过直接测定每个叶片叶中部叶绿素含量，作为耐盐处理大麦幼苗和对照幼苗的叶绿素含量。

植物对盐的吸收利用是非常复杂的生理生化过程，干物重是反映植物综合抗盐能力的指标，发明人通过研究发现，盐胁迫下，大麦幼苗盐敏感材料和耐盐材料的地上部干物重与正常对照相比有显著差异，大麦中地上部干物质积累量受盐胁迫的影响显著大于其对根部的影响。

除了生长指标外，光合作用也是植物体内极为重要的代谢过程，与产量密切相关，植物叶片叶绿素的含量不仅是直接反映植物光合能力的一个重要指标，也是衡量植物耐盐性的重要生理指标之一，现有技术中对耐盐材料叶绿素的鉴定主要集中在苗期的二叶一心期以及生长发育后期，周期较长，在材料的培养过程中需要提供外源营养，同时，在盐胁迫鉴定过程中增加了其他复杂因素，影响后续实验筛选结果的准确性；发明人通过研究发现，大麦第一片真叶完全展开的一叶一心时期，盐胁迫下叶绿素含量与正常处理相比，不同基因型之间的叶绿素含量具有显著性差异。

本发明结合光合生理指标与生长指标同时进行考虑，大麦材料出芽后，芽长为4-5cm时，取整齐一致的幼苗，利用简易装置进行盐胁迫处理，在大麦第一片真叶完全展开的一叶一心时期，进行大批量多重复筛选，不仅占用空间极小，而且从多角度去综合考虑其耐性，克服了单指标的片面性，有效保证实验的可重复性和准确性。

大麦从早期种子萌发到第一片真叶伸出胚芽鞘的期间，主要靠胚乳供应营养物质，直到3叶期时，整个胚乳中的养分耗尽，幼苗才开始自养，本发明中，盐溶液浓度为300-600mmol/L，盐胁迫浓度较高，在幼苗自身营养提供的条件下进行高浓度筛选，可在早期快速检测到其盐胁迫后不同材料的表型变化，尤其是叶片叶绿素的变化，本发明测定时期较早，快速简便，对于群体材料大规模的筛选具有重要意义。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明中，催芽时无需消毒，大麦材料出芽后，不需要像普通水培一样加入营养液，取长势整齐的幼苗，在大麦第一片真叶完全展开的一叶一心时期，利用简易装置，进行清水培养及盐胁迫处理，无需营养液，可大批量多重复筛选，不仅节省培养空间，节约人力物力，而且有效避免了后期生长盐处理筛选的其他因素影响，可以实现高通量多重复快速检测，节省筛选的时间与成本。

2)本发明提出的在大麦作物耐盐育种中，在苗期根据地上部干重和叶绿素含量指标筛选耐盐材料的方法，结果稳定可靠，有效避免了单一指标的不准确性，可快速、简捷的筛选品种，为植物的耐逆性研究和品质改良提供有用线索。

附图说明

图1为本发明实施例中转苗至大枪头盒的大麦幼苗。

图2为本发明实施例中正常生长对照图，其中，1为花30，2为A7-20，3为Numar，4为苏啤3号，5为扬农啤5号，6为C2118。

图3为本发明实施例中的盐环境生长培育图，其中，1为花30，2为A7-20，3为Numar，4为苏啤3号，5为扬农啤5号，6为C2118。

图4为本发明实施例中花30和A7-20在盐处理下的表型比较。

图5为本发明实施例中花30和A7-20的在盐处理下的相对株高生长速率。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例

1.选取20份大麦材料作为供试材料，具体见表1，其中，Numar、CM72、C2118为国际公认的耐盐品种，Franklin、Gairdner为公认的盐敏感品种(参考文献Zhou etal.2012.Angessa etal.2016)，A7-20为花30的干种子⁶⁰Co 500GY的辐射诱变后经过500mg/LNaCl盐胁迫处理获得突变体材料，SP花01-3，SP花03-2分别为品种花01-3和花03-2的空间辐射诱变的材料，其他材料均为地方品种。

表1

2.挑选籽粒饱满的供试材料大麦种子，用纱网袋装好，于37℃烘干30分钟后，自来水清洗3次，置于20±2℃温室，浸种6小时后，用纱布包好，保证适量水分，置于500ml烧杯中，烧杯顶部封保险膜，用皮筋扎好，继续20±2℃催芽过夜，待种子露白后，置于湿润滤纸上发芽。

出芽6天后，取生长一致的大麦幼苗，转苗至枪头盒(参见图1，枪头盒规格为12cm×10cm×6.5cm)，培养的温度为20±2℃，24小时后进行盐处理，3-4天换一次盐溶液，以在正常水溶液中进行培养的大麦幼苗作对照，设20次重复，其中，盐溶液中氯化钠的浓度为450mmol/L。

盐胁迫7天后，分别测定每叶片的叶尖、叶中和叶基处叶绿素的含量，并取三者的平均值作为每叶的叶绿素含量，对于待鉴定大麦幼苗和对照幼苗分别取20个叶片的叶绿素含量平均值，分别作为盐处理幼苗的叶绿素含量和对照幼苗的叶绿素含量，收样后，105℃杀青30分钟，然后70℃烘干至恒重，测定地上部干重。

根据测定的盐处理幼苗的叶绿素含量和对照幼苗的叶绿素含量，分别计算出对应的相对叶绿素含量以及相对地上部干物重：

再将相对叶绿素含量和相对地上部干物重相乘，所得乘积作为判定指标；每种处理，每个品种设置20次生物学重复，利用SPSS21.0对数据进行统计学分析，如果P≥0.05，表示差异不显著，如果P<0.05，表示差异显著，结果参见表2-4，表2和表3中，均值和标准差后面的字母仅代表每个品种在两种盐处理下是否有显著差异，字母不同表示差异显著，反之则不显著，不涉及不同品种间的比较。

表2不同大麦品种在正常和盐胁迫下叶绿素含量的比较结果及其相对值

由表2可见，在盐胁迫下，国际公认耐盐品种的叶绿素含量显著高于盐敏感品种的含量，不同品种的遗传背景不同，通过比较试验品种在盐胁迫下叶绿素含量相对于正常对照的比值，发现几乎所有试验品种都存在显著性差异，耐盐品种的相对值≥0.65，盐敏感品种的相对值≤0.5，单纯从叶绿素含量指标，耐盐材料和盐敏感的材料之间区分度较低。

表3不同大麦品种在正常和盐胁迫下干物重的比较结果及其相对值

由表3可见，大部分的品种在正常对照和盐胁迫下的干物重不存在显著性差异，尽管耐盐品种Numar、CM72和C2118的相对干物重值显著高于盐敏感品种，但是盐敏感品种Franklin的相对干物重高达0.9440，所以在生长发育早期，仅从干物重生长指标无法判定耐盐品种其相对干物重就一定高，盐敏感品种的相对干物重就一定低。

表4不同品种的相对叶绿素含量和相对干物重的乘积

由表4可见，耐盐品种Numar、CM72、C2118、A7-20等的相对叶绿素含量和相对干物重乘积都大于0.7，而品种Franklin、Gairdner、苏啤3号、花22等的相对叶绿素含量和相对干物重乘积都小于0.5，为盐敏感材料，现有技术中，乔海龙等通过对大麦幼苗的盐分胁迫下可溶性糖、脯氨酸含量和K⁺/Na⁺比值进行分析后认为，苏啤3号和CM72的生理耐盐性相当，但在本发明中，苏啤3号为盐敏感品种；申玉香等认为C2118的耐盐性优于扬农啤5号，而本发明通过相对叶绿素含量和相对干物重两个指标同时考虑，发现扬农啤5号的耐盐性较C2118强，提高了耐盐材料鉴定的准确性。

3.苗期土培耐盐性试验验证材料鉴定的准确性

土培试验在上海市农业科学院植物细胞工程研究室的人工气候室中完成。首先选取耐盐性差异的材料花30、A7-20、Numar、苏啤3号、扬农啤5号和C2118籽粒大小均匀且饱满的种子，清水洗净，浸泡6-8h，置于25℃人工气候室发芽，待种子萌发2天后，选取整齐一致的芽苗，播于直径为6cm的塑料盆钵中，每个盆钵移栽1株，将盆钵置于长×宽为42×30厘米的周转箱中。

其中，营养土的主要成分为有机质478g/kg，氮磷钾6.75mg/kg，益生菌90μg/kg，微量元素为1.7μg/kg，养分含量为200g/kg，腐植酸为130μg/kg。大麦生长期间未施加其他肥料，病虫害防治同大田管理一致，并确保正常水分供应。待材料长至两叶一心期开始盐处理(450mmol/L NaCl)处理的周转箱中为2L盐水，正常(CK)的周装箱中添加2L水作为对照，参见图2-3，处理28d时，取材，测定其株高、叶绿素以及地上部干物质重量，利用软件SPSS.21进行数据统计分析，通过最小显著极差法进行P<0.05显著水平分析，其中，不同的字母代表同一测定指标在同一处理下不同品种之间具有显著性差异，相同的字母则反之，见表5。

由图2和表5可见，正常生长条件下，6份材料生长状况良好，株高、叶面积、叶绿素以及干物质重量皆无明显差异。

由图3和表5可见，450mmol/L的盐处理条件下，6份材料的生长受到不同程度的抑制，花30和苏啤3号较A7-20、Nuamr、扬农啤5号和C2118抑制明显，主要表现为植株变矮、叶面积减小和干物质积累下降。杨农啤5号较C2118在株高和干物质积累量方面表现较优。

4.苗期不同土培方式重复鉴定花30和A7-20的耐盐性

材料种植于直径为20cm的花盆中，每个花盆分别种植花30和A7-20两个材料，每个材料3个重复，参见图4，材料培育方式同上，待材料长至两叶一心期开始盐处理(450mmol/LNaCl)，处理的托盘中添加200ml盐水，正常(CK)的周装箱中添加200mL水作为对照，处理28d时，取材，测定其相对株高生长速率，计算公式为：相对株高生长速率＝(盐处理n天的株高-盐处理0天的株高)/盐处理0天的株高，其中1≤n≤28，参见图5，由图5可以看出，在盐处理第4天时，A7-20的株高已显著高于花30。

5.利用江苏盐城试验农场对花30和A7-20进行田间的耐盐性鉴定

试验于2018年-2019年在江苏沿海地区农科所试验农场进行。土壤为壤性脱盐潮土，土壤PH值为7.8，土壤有效N含量为73.5mg/kg、有效P含量为39.7mg/kg、有效K含量为76.4mg/kg，K⁺占0.005％，Na⁺占0.008％，Mg⁺占0.002％，Ca⁺占0.007％，Cl^-占0.013％，SO₄ ^2-占0.011％，HCO₃ ^-占0.006％，种植小区长6m、宽2.1m、行距30cm，重复3次。

试验点播种密度相同，均以基本苗270万·hm^-2为准，根据不同品种发芽率，取相应数量的种子播种。田间肥料施用以基肥60％、返青期追肥20％，拔节期追肥20％进行肥料管理。

花30和A7-20穗长分别是5.1567cm和5.7550cm，千粒重分别是37.9167g和40.3667g，综合土培和田间数据，表明A7-20的耐盐性优于花30。

本发明通过相对叶绿素含量和相对干物重两个指标的同时考虑，利用两者的乘积，能将耐盐品种和盐敏感品种进行准确区分。

Claims

1.一种幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，包括如下步骤：

1)催芽

2)转苗

3)盐处理

将培养盒中的水更换为盐溶液，进行盐处理，以清水中生长的大麦幼苗作为对照处理，每种处理各设5-20次重复，处理时间为6-8天，处理3-4天后更换新的盐溶液，其中，所述盐溶液的浓度为300-600mmol/L；

4)测定数据

盐处理完成后，测定第一个展开叶片的叶绿素含量，取5株以上经过盐处理的大麦幼苗叶片叶绿素含量的平均值，作为盐处理幼苗的叶绿素含量；取5株以上对照幼苗的叶片叶绿素含量平均值，作为对照幼苗的叶绿素含量；

5)数据处理

2.根据权利要求1所述幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中，所述培养盒为移液枪的枪头盒。

3.根据权利要求1所述幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，其特征在于，步骤3)中，所述盐溶液的浓度为400-450mmol/L。

4.根据权利要求1所述幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，分别测定每个叶片的叶尖、叶中和叶基处叶绿素的含量，并取三者的平均值作为每个叶片的叶绿素含量，对于待鉴定大麦幼苗和对照幼苗，分别取20个以上叶片的叶绿素含量平均值，作为对应的盐处理幼苗的叶绿素含量和对照幼苗的叶绿素含量。

5.根据权利要求1所述幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，计算盐处理大麦幼苗和对照幼苗的叶绿素含量时，分别取5-20株幼苗，测定其第一个展开叶片的叶绿素含量平均值。

6.根据权利要求1所述幼苗期大麦耐盐性的鉴定方法，其特征在于，步骤4)中，通过直接测定每个叶片叶中部叶绿素含量，作为盐处理大麦幼苗和对照幼苗的叶绿素含量。