CN110198743B - 用于治疗肾脏疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

在一些方面，本公开涉及激活素和/或GDF拮抗剂以及使用激活素和/或GDF拮抗剂治疗、预防或降低肾脏疾病的进展速度和/或严重性的方法，特别是治疗、预防或降低一种或多种肾脏疾病相关并发症的进展速度和/或严重性的方法。

Description

用于治疗肾脏疾病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年10月5日提交的美国临时申请号62/404,603的权益，所述临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
肾脏疾病包括一定范围的病况，所述病况可以导致肾脏功能的丧失，并且在一些情况下可以是致命的。正常发挥机能的肾脏从血液中过滤出废物和过多的流体，然后将它们***在尿中。当慢性肾脏疾病达到晚期时，危险水平的流体、电解质和废物可以在血流中积累。如果不治疗，肾脏疾病会进展到终末期肾衰竭，如果没有人工过滤(透析)或肾移植则终末期肾衰竭是致命的。因此，对用于治疗肾脏疾病的有效疗法存在着高度的、尚未满足的需求。
发明内容
本公开部分地涉及治疗肾脏疾病或肾脏相关疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂(抑制剂)或激活素和/或GDF拮抗剂(抑制剂)的组合。在某些方面，本公开涉及降低肾脏疾病的进展速度的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂，或激活素和/或GDF拮抗剂的组合。在某些方面，本公开涉及降低肾脏疾病的严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂，或激活素和/或GDF拮抗剂的组合。在某些方面，本公开涉及降低肾脏相关疾病事件(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的频次的方法,包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂，或激活素和/或GDF拮抗剂的组合。在某些方面，本公开涉及治疗肾脏疾病的一种或多种并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂，或激活素和/或GDF拮抗剂的组合。在某些方面，本公开涉及预防肾脏疾病的一种或多种并发症的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂，或激活素和/或GDF拮抗剂的组合。在某些方面，本公开涉及降低肾脏疾病的一种或多种并发症的进展速度的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂，或激活素和/或GDF拮抗剂的组合。在某些方面，本公开涉及减少肾脏疾病的一种或多种并发症的严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂，或激活素和/或GDF拮抗剂的组合。在一些实施方案中，所述方法可以降低肾脏相关疾病事件的频次。在一些实施方案中，所述方法可以减少肾脏相关疾病事件的严重性。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及延缓肾脏疾病的临床进展(恶化)。在一些实施方案中，除了所述一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂以外，进一步向所述患者施用一种或多种用于治疗肾脏疾病的支持疗法或活性剂。例如，还可以向所述患者施用一种或多种支持疗法或活性剂，例如，血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，血管紧张素II受体阻滞剂，利尿药或利尿剂，任选地与低盐饮食结合，他汀类药物，激素红细胞生成素，任选地与铁补充剂、静脉内(IV)流体补充剂、钙和/或维生素D补充剂、磷酸盐粘结剂、钙、葡萄糖或聚苯乙烯磺酸钠(Kayexalate、Kionex)、血液透析、腹膜透析和/或肾移植结合。用于肾脏疾病的一些示例性药物为(呋塞米)、/>(托塞米)、/>(依他尼酸)和利尿酸钠。在某些优选的实施方案中，根据本文所述的方法使用的激活素和/或GDF拮抗剂是下列中的一种或多种的抑制剂(拮抗剂)，或抑制剂(拮抗剂)的组合：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制GDF11的作用剂(例如，GDF11拮抗剂)。对GDF11抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合GDF11。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合GDF11。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制GDF11的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(ligand trap)(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制GDF11的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制GDF8的作用剂(例如，GDF8拮抗剂)。对GDF8抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合GDF8。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合GDF8。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制GDF8的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制GDF8的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制GDF3的作用剂(例如，GDF3拮抗剂)。对GDF3抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合GDF3。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合GDF3。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制GDF3的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制GDF3的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制GDF1的作用剂(例如，GDF1拮抗剂)。对GDF1抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合GDF1。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合GDF1。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制BMP6的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制GDF1的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制Nodal的作用剂(例如，Nodal拮抗剂)。对Nodal抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合Nodal。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合Nodal。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制Nodal的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制Nodal的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制Cryptic的作用剂(例如，Cryptic拮抗剂)。对Cryptic抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合Cryptic。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10- 7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合Cryptic。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制Cryptic的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制Cryptic的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制Cryptic 1B的作用剂(例如，Cryptic1B拮抗剂)。对Cryptic 1B抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合Cryptic 1B。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10- 12M)的KD结合Cryptic 1B。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制Cryptic 1B的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制Cryptic 1B的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)的作用剂(例如，激活素拮抗剂)。对激活素抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合激活素。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合激活素。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制激活素的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制激活素的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic1B、Smad2和Smad3。在某些优选的实施方案中,根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制激活素B的作用剂。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ActRII(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)的作用剂(例如，ActRII拮抗剂)。对ActRII抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合ActRII。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10- 11M或至少1x10-12M)的KD结合ActRII。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制ActRII的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ActRII的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ALK4的作用剂(例如，ALK4拮抗剂)。对ALK4抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合ALK4。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合ALK4。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制ALK4的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ALK4的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ALK5的作用剂(例如，ALK5拮抗剂)。对ALK5抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合ALK5。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合ALK5。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制ALK5的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ALK5的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ALK7的作用剂(例如，ALK7拮抗剂)。对ALK7抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合ALK7。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合ALK7。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制ALK7的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ALK7的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK5、ALK4、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制Smad2的作用剂(例如，Smad2拮抗剂)。对Smad2抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合Smad2。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合Smad2。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制Smad2的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制Smad2的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B和Smad3。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制Smad3的作用剂(例如，Smad3拮抗剂)。对Smad3抑制的效应可以例如使用基于细胞的测定法来确定，包括本文所述的那些(例如，Smad信号传导报告基因测定法)。因此，在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合Smad3。配体结合活性可以例如使用结合亲和性测定法(包括本文所述的那些)来确定。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合至少以至少1x10-7M(例如，至少1x10-8M、至少1x10-9M、至少1x10-10M、至少1x10-11M或至少1x10-12M)的KD结合Smad3。如本文所述，可以根据本文所述的方法和用途使用多种抑制Smad3的激活素和/或GDF拮抗剂，包括例如，配体捕获物(例如，ActRII多肽、促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制Smad3的激活素和/或GDF拮抗剂或拮抗剂的组合可以进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B和Smad2。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂是ActRII多肽。术语“ActRII多肽”整体上是指天然存在的ActRIIA和ActR IIB多肽以及它们的截短形式和变体，诸如本文所述的那些。优选地，ActRII多肽包括，基本上由下列组成或由下列组成：ActRII多肽配体结合结构域或其修饰形式(变体)。例如，在一些实施方案中，ActRIIA多肽包括，基本上由下列组成或由下列组成：ActRIIA多肽的ActRIIA配体结合结构域，例如，ActRIIA细胞外结构域的一部分。相似地，ActRIIB多肽可以包括，基本上由下列组成或由下列组成：ActRIIB多肽的ActRIIB配体结合结构域，例如，ActRIIB细胞外结构域的一部分。优选地，根据本文所述的方法使用的ActRII多肽是可溶性多肽。
在某些方面，本公开涉及包含ActRIIA多肽的组合物及其用途。例如，在一些实施方案中，本公开的ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO:9或10的氨基酸30-110的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的ActRIIA多肽包含与在SEQ ID NO:9的氨基酸21-30中的任一个对应的残基处开始(例如，在氨基酸21、22、23、24、25、26、27、28、29或30中的任一个处开始)并在SEQ ID NO:9的氨基酸110-135中的任一个对应的位置处终止(例如，在氨基酸110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134或135中的任一个处终止)的一部分ActRIIA至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ IDNO:9的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在进一步另外的实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在还有的另外的实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO:177的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在还进一步的其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含，基本上由下列组成，或由下列组成：与SEQ ID NO:178的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在还进一步的其他实施方案中，ActRIIA多肽可以包含，基本上由下列组成，或由下列组成：与SEQ ID NO:179的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在其他方面中，本公开涉及包含ActRIIB多肽的组合物及其用途。例如，在一些实施方案中，本公开的ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸[天然存在的(E或D)或人工酸性氨基酸]。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与在SEQ ID NO:1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任一个对应的残基处开始并在SEQ ID NO:1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任一个对应的残基处终止的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与在SEQ ID NO:1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任一个对应的残基处开始并在SEQ ID NO:1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任一个对应的残基处终止的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列,其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ IDNO:2的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的另外的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ IDNO:3的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ IDNO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的另外的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的另外的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的另外的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的另外的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:181的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在其他的实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:181的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:182的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:182的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:184的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:184的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:188的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:189的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:190的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:192的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:192的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:193的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ IDNO:193的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:196的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:196的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:197的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:198的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:199的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在还有的进一步的其他实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:201的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以包含与SEQ ID NO:201的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述ActRIIB多肽在关于SEQ ID NO:1的位置79处包含酸性氨基酸。
如本文所述，ActRII多肽及其变体可以是同型多聚体，例如，同型二聚体、同型三聚体、同型四聚体、同型五聚体和更高阶的同型多聚体复合物。在某些优选的实施方案中，ActRII多肽及其变体是同型二聚体。在某些实施方案中，本文所述的ActRII多肽二聚体包括与第二ActRII多肽共价或非共价缔合的第一ActRII多肽，其中所述第一多肽包含ActRII结构域和相互作用对的第一成员(或第二成员)(例如，免疫球蛋白的恒定结构域)的氨基酸序列，且所述第二多肽包含ActRII多肽和所述相互作用对的第二成员(或第一成员)的氨基酸序列。
在某些方面，ActRII多肽(包括其变体)可以是融合蛋白。例如，在一些实施方案中，ActRII多肽可以是融合蛋白，所述融合蛋白包含ActRII多肽结构域和一个或多个异源(非-ActRII)多肽结构域。在一些实施方案中，ActRII多肽可以是融合蛋白，所述融合蛋白具有来源于ActRII多肽的氨基酸序列(例如，ActRII受体或其变体的配体结合结构域)作为一个结构域以及一个或多个异源结构域，所述异源结构域提供所需的特性，诸如改善的药代动力学、更容易的纯化、对特定组织的靶向，等等。例如，融合蛋白的结构域可以增强体内稳定性、体内半衰期、摄取/给药、组织定位或分布、蛋白复合物的形成、融合蛋白的多聚化和/或纯化中的一种或多种。任选地，融合蛋白的ActRII多肽结构域与一个或多个异源多肽结构域直接连接(融合)，或***序列诸如接头可以定位在ActRII多肽的氨基酸序列和一个或多个异源结构域的氨基酸序列之间。在某些实施方案中，ActRII融合蛋白包含定位在异源结构域和ActRII结构域之间的相对无结构化的接头。这种无结构化的接头可以对应于ActRII的细胞外结构域的C-末端(“尾”)处的大致15个氨基酸无结构化区，或其可以是相对地不具有二级结构的3至15、20、30、50或更多个氨基酸之间的人工序列。接头可以富含甘氨酸和/或脯氨酸残基，并且例如，可以含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列。接头的实例包括，但不限于，序列TGGG(SEQ ID NO:217)、GGG(SEQ ID NO:223)、GGGG(SEQ ID NO:222)、TGGGG(SEQ ID NO:219)、SGGGG(SEQ ID NO:220)、GGGS和SGGG(SEQ ID NO:218)。在一些实施方案中，ActRII融合蛋白可以包含免疫球蛋白的恒定结构域，包括，例如，免疫球蛋白的Fc部分。例如，衍生自IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(IgA1或IgA2)、IgE或IgM免疫球蛋白的Fc结构域的氨基酸序列。例如，免疫球蛋白结构域的Fc部分可以包含，基本上由下列组成，或由下列组成：与SEQ ID NO:135-149中的任一个至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。这样的免疫球蛋白结构域可以包含一个或多个氨基酸修饰(例如，缺失、添加和/或置换)，所述氨基酸修饰赋予改变的Fc活性，例如，减少一个或多个Fc效应器功能。在一些实施方案中，ActRII融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列。例如，B部分是N-和C-末端截短的ActRII多肽，例如，如本文所述的那样。A和C部分可以单独地为0、1或多于一个氨基酸，并且A和C部分两者与B是异源的。A和/或C部分可以经由接头序列与B部分连接。在某些实施方案中，ActRII融合蛋白包含前导序列。前导序列可以是天然的ActRII前导序列或异源的前导序列。在某些实施方案中，前导序列是组织纤溶酶原激活剂(TPA)前导序列(例如，SEQ IDNO:215)。
ActRII多肽(包括其变体)可以包含纯化子序列,诸如表位标签、FLAG标签、多组氨酸序列和GST融合体。任选地，ActRII多肽包含一个或多个修饰的氨基酸残基，所述修饰的氨基酸残基选自：糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸和/或与脂质部分缀合的氨基酸。ActRII多肽可以包含至少一个N-连接糖，并且可以包含两个、三个或更多个N-连接糖。这样的多肽还可以包含O-连接糖。通常，优选ActRII多肽表达在适宜地介导多肽的天然糖基化的哺乳动物细胞系中以便消除在患者内的有害免疫应答的可能性。ActRII多肽可以在多种糖基化所述蛋白的细胞系中以适合于患者使用的方式生产，所述细胞系包括工程化昆虫或酵母细胞和哺乳动物细胞，诸如COS细胞、CHO细胞、HEK细胞和NSO细胞。在一些实施方案中，ActRII多肽被糖基化并且具有可获自中国仓鼠卵巢细胞系的糖基化模式。在一些实施方案中，本公开的ActRII多肽表现出在哺乳动物(例如，小鼠或人)中至少4、6、12、24、36、48或72小时的血清半衰期。任选地,ActRII可以表现出在哺乳动物(例如，小鼠或人)中至少6、8、10、12、14、20、25或30天的血清半衰期。
在某些方面，本公开提供了药物制剂，所述药物制剂包含本公开的一种或多种ActRII拮抗剂和药学上可接受的载体。药物制剂还可以包含一种或多种附加的活性剂诸如用来治疗肾脏疾病的化合物，特别是治疗或预防肾脏疾病的一种或多种并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的化合物。通常，药物制剂将优选地是无热原的(意指含有的热原程度达到监管用于治疗用途的产品质量的法规所要求的程度)。
在某些情况下，当将本公开的ActRII拮抗剂或拮抗剂的组合施用于本文所述的病症或病况时，在施用ActRII拮抗剂期间监测对血液红细胞的效应，或确定或调整ActRII拮抗剂的施用剂量以便减少对血液红细胞的不期望的效应可以是合乎需要的。例如，血液红细胞水平、血红蛋白水平或红细胞比容水平的升高可以导致血压的不期望的升高。
在某些方面，根据本公开的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂是抗体或抗体的组合。在一些实施方案中，所述抗体至少结合ActRII(ActRIIA和/或ActRIIB)。在某些实施方案中，与ActRII结合的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，与ActRII结合的抗体抑制一种或多种GDF配体、I型受体或辅助受体与ActRII的结合。在某些实施方案中，与ActRII结合的抗体抑制一种或多种GDF配体与ActRII的结合，所述GDF配体选自：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF1、Nodal、GDF3、Cryptic、Cryptic 1B、ALK4、ALK5、ALK7、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，所述抗体至少结合ALK4。在某些实施方案中，与ALK4结合的抗体抑制ALK4信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，与ALK4结合的抗体抑制一种或多种GDF配体、II型受体或辅助受体与ALK4的结合。在某些实施方案中，与ALK4结合的抗体抑制一种或多种GDF配体与ALK4的结合，所述GDF配体选自：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF1、Nodal、GDF3、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，所述抗体至少结合ALK5。在某些实施方案中，与ALK5结合的抗体抑制ALK5信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，与ALK5结合的抗体抑制一种或多种GDF配体、II型受体或辅助受体与ALK5的结合。在某些实施方案中，与ALK5结合的抗体抑制一种或多种GDF配体与ALK5的结合，所述GDF配体选自：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF1、Nodal、GDF3、ALK4、ALK7、Cryptic、Cryptic1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，所述抗体至少结合ALK7。在某些实施方案中，与ALK7结合的抗体抑制ALK7信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，与ALK7结合的抗体抑制一种或多种GDF配体、II型受体或辅助受体与ALK7的结合。在某些实施方案中，与ALK7结合的抗体抑制一种或多种GDF配体与ALK7的结合，所述GDF配体选自：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF1、Nodal、GDF3、ALK4、ALK5、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，所述抗体至少结合GDF11。在某些实施方案中，与GDF11结合的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，与GDF11结合的抗体抑制GDF11-ActRII结合和/或GDF11-ALK结合(例如，GDF11-ALK4、GDF11-ALK5和/或GDF11-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体至少结合GDF8。在某些实施方案中，与GDF8结合的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，与GDF8结合的抗体抑制GDF8-ActRII结合和/或GDF8-ALK结合(例如，GDF8-ALK4、GDF8-ALK5和/或GDF8-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体至少结合GDF3。在某些实施方案中，与GDF3结合的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，与GDF3结合的抗体抑制GDF3-ActRII结合和/或GDF3-ALK结合(例如，GDF3-ALK4、GDF3-ALK5和/或GDF3-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)。在某些实施方案中，结合激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，结合激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)的抗体抑制激活素-ActRII结合和/或激活素-ALK结合(例如，激活素-ALK4、激活素-ALK5和/或激活素-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体结合激活素B。在某些实施方案中，结合激活素B的抗体抑制ActRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定法(诸如本文所述的那些)中测量的。在某些实施方案中，结合激活素B的抗体抑制激活素B-ActRII结合和/或激活素B-ALK结合(例如，激活素B-ALK4、激活素B-ALK5和/或激活素B-ALK7结合)。在一些实施方案中，所述抗体是与ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK5、ALK7、GDF11、GDF8、激活素、GDF1、Nodal、GDF3、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3中的一种或多种结合的多特异性抗体，或多特异性抗体的组合。在某些方面中，所述多特异性抗体或多特异性抗体的组合在基于细胞的测定法中抑制下列中的一种或多种的信号传导：ActRIIB、GDF11、GDF8、激活素、GDF3、GDF1、Nodal、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体、F(ab’)2片段、单链双抗体、串联单链Fv片段、串联单链双抗体或包含单链双抗体和免疫球蛋白重链恒定区的至少一部分的融合蛋白。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是小分子抑制剂或小分子抑制剂的组合。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少ActRII(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少ALK4的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少ALK5的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少ALK7的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少GDF11的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少GDF8的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少GDF1的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Nodal的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Cryptic的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Cryptic 1B的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Smad2的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Smad3的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少GDF3的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少激活素B的抑制剂。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是核酸抑制剂或核酸抑制剂的组合。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少ActRII(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少ALK4的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少ALK5的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少ALK7的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少GDF11的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少GDF8的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少GDF1的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Nodal的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Cryptic的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Cryptic 1B的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Smad2的抑制剂。在一些实施方案中，所述小分子抑制剂是至少Smad3的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少GDF3的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和激活素BE)的抑制剂。在一些实施方案中，所述核酸抑制剂是至少激活素B的抑制剂。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是促滤泡素抑制素多肽。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO:150的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO:151的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO:152的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO:153的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述促滤泡素抑制素多肽包含与SEQ ID NO:154-160的氨基酸序列中的至少一个至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是FLRG多肽。在一些实施方案中，所述FLRG多肽包含与SEQ ID NO:161-164的氨基酸序列中的至少一个至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是WFIKKN1多肽。在一些实施方案中，所述WFIKKN1多肽包含与SEQ ID NO:165-167的氨基酸序列中的至少一个至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是WFIKKN2多肽。在一些实施方案中，所述WFIKKN1多肽包含与SEQ ID NO:168-172的氨基酸序列中的至少一个至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是Lefty多肽。在一些实施方案中，所述WFIKKN1多肽包含与SEQ ID NO:173-174的氨基酸序列中的至少一个至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是Cerbrus多肽。在一些实施方案中，所述WFIKKN1多肽包含与SEQ ID NO:175的氨基酸序列中的至少一个至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面，所述激活素和/或GDF拮抗剂是Coco多肽。在一些实施方案中，所述WFIKKN1多肽包含与SEQ ID NO:176的氨基酸序列中的至少一个至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面，本公开涉及一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂，任选地与一种或多种其他用于治疗肾脏疾病的支持疗法或活性剂组合，在制备用于治疗、预防或降低如本文所述的肾脏疾病或肾脏疾病的一种或多种并发症的进展速度和/或严重性的药物中的用途。在某些方面，本公开涉及一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂，任选地与一种或多种其他用于治疗肾脏疾病的支持疗法或活性剂组合，用于治疗、预防或降低如本文所述的肾脏疾病或肾脏疾病的一种或多种并发症的进展速度和/或严重性。
本公开至少提供了用于治疗性用途的作用剂(例如细胞信号传导的拮抗剂)的组合。此类拮抗剂可以包括激活素和/或生长分化因子(GDF)拮抗剂中的至少一种，包括，例如，激活素、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、激活素受体IIA型(ActRIIA)、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto-1、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。所述作用剂可以通过至少一个共价键或非共价键彼此形成多聚体复合物。这些多聚体复合物的一些示例性结构显示于图5和6中。此类作用剂的可能的二聚体的示例列表如下：
可能的异源二聚体：
I.I型-II型异源二聚体:ALK4:ActRIIB；ALK4:ActRIIA；ALK4:BMPRII；ALK4:MISRII；ALK5:ActRIIB；ALK5:ActRIIA；ALK5:BMPRII；ALK5:MISRII；ALK7:ActRIIB；ALK7:ActRIIA；ALK7:BMPRII；ALK7:MISRII；ALK1:ActRIIB；ALK1:ActRIIA
II.1型-1型异源二聚体:ALK1:ALK4；ALK1:ALK5；ALK1:ALK7；ALK4:ALK5；ALK4:ALK7；ALK5:ALK7
III.II型-II型异源二聚体:ActRIIA:ActRIIB；；ActRIIA:BMPRII；ActRIIA:MISRII；ActRIIB:BMPRII；ActRIIB:MISRII
IV.辅助受体异源二聚体:Cryptic:Cripto；Cryptic:Cryptic 1B；Cripto:Cryptic 1B；ALK1:Cryptic；ALK1:Cryptic 1B；ALK1:Cripto；ALK4:Cryptic；ALK4:Cryptic1B；ALK4:Cripto；ALK5:Cryptic；ALK5:Cryptic 1B；ALK5:Cripto；ALK7:Cryptic；ALK7:Cryptic 1B；ALK7:Cripto；ActRIIA:Cryptic；ActRIIA:Cryptic 1B；ActRIIA:Cripto；ActRIIB:Cryptic；ActRIIB:Cryptic1B；ActRIIB:Cripto；BMPRII:Cryptic；BMPRII:Cryptic1B；BMPRII:Cripto；MISRII:Cryptic；MISRII:Cryptic 1B；MISRII:Cripto
可能的同型二聚体:
ALK4:ALK4；ALK5:ALK5；ALK7:ALK7；ActRIIA:ActRIIA；ActRIIB:ActRIIB；Cripto:Cripto；Cryptic 1B:Cryptic 1B；Cryptic-Cryptic
作为单二聚体用于二聚作用的其他拮抗剂：
配体(例如，激活素A、B、C和E；GDF8；GDF11；GDF3；GDF1；和Nodal)的抑制剂(例如，抗体、小分子、RNA干扰等)
I型受体(例如，ALK4、ALK5和ALK7)的抑制剂(例如，抗体、小分子、RNA干扰等)
II型受体(例如，ActRIIA和ActRIIB)的抑制剂(例如，抗体、小分子、RNA干扰等)
辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和Cryptic-1B)的抑制剂(例如，抗体、小分子、RNA干扰等)
Smad蛋白(例如，Smad2和Smad3)的抑制剂(例如，抗体、小分子、RNA干扰等)
天然配体捕获物(天然存在的与一种或多种激活素/GDF蛋白结合的蛋白)(例如，WFIKKN1、WFIKKN2、FST、FLRG、Dan-相关蛋白Cerberus和Coco、Lefty A、Lefty B、WFIKKN1和WFIKKN2)。
低聚体和聚合物可以使用如本文以及至少在图5和6中所示的策略来形成。例如，四聚体可以利用两个相同的或不同的异源二聚体或同型二聚体来形成。单体可以是列举的拮抗剂本身，或可以包含含有所列举的拮抗剂的融合蛋白。例如，单体可以包含ALK4和Fc结构域的融合蛋白，产生ALK4-Fc:ALK4-Fc的同型二聚体或ALK4-Fc和另一作用剂(例如，ActBRIIA-Fc)的异源二聚体。另外，ALK4可以与其自身或作为单二聚体的另一作用剂(例如，ALK5)融合，产生ALK4-ALK4:ALK4-ALK4或ALK4-ALK5:ALK4-ALK5的同型二聚体，或包含ALK4-ALK4或ALK4-ALK5的异源二聚体。因此，可能的二聚体还包括包含以不同的取向融合的相同作用剂的那些。例如，ALK4-ALK5:ActRIIA-ActRIIB和ALK5-ALK4:ActRIIA:ActRIIB可以形成不同的异源二聚体结构。
附图说明
图1显示了利用基于对多个ActRIIB和ActRIIA晶体结构的综合分析在本文中推断出与用方框指示的配体直接接触的残基对人ActRIIA(SEQ ID NO:11)和人ActRIIB(SEQ IDNO:3)的细胞外结构域的比对。
图2显示了多个不具有其细胞内结构域的脊椎动物ActRIIB前体蛋白(包括不具有其细胞内结构域的人ActRIIB前体蛋白(SEQ ID NO:16)和不具有其细胞内结构域的人ActRIIA前体蛋白(SEQ ID NO:15)，以及不具有其细胞内结构域的共有ActRII前体蛋白(SEQ ID NO:17))的多序列比对。
图3显示了多种脊椎动物ActRIIA蛋白和人ActRIIA(SEQ ID NO:11)的细胞外结构域的多序列比对。
图4显示了使用Clustal 2.1对来自人IgG同种型的Fc结构域的多序列比对。铰链区由点下划线来指示。双下划线指示在IgG1 Fc中被改造以促进不对称链配对的位置以及关于其他同种型IgG2、IgG3和IgG4的相应位置的实例。
图5A-5D显示了包含I型受体多肽(表示为“I”)(例如，与来自人或其他物种(诸如本文中所描述的那些)的ALK1、ALK4、ALK5或ALK7蛋白的细胞外结构域至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽)和II型受体多肽(表示为“II”)(例如，与来自人或其他物种(诸如本文中所描述的那些)的ActRIIA、ActRIIB、MISRII或BMPRII蛋白的细胞外结构域至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽)的异源聚体蛋白复合物的示意性实例。
在图示的实施方案中，I型受体多肽是包含相互作用对的第一成员(“C1”)的融合多肽的一部分，并且II型受体多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)的融合多肽的一部分。适宜的相互作用对包括，例如，重链和/或轻链免疫球蛋白相互作用对、其截短形式及其变体，诸如本文中所述的那些(例如，Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106)。在每种融合多肽中，接头可以被定位在I型受体多肽或II型受体多肽和相互作用对的对应成员之间。相互作用对的第一和第二成员可以是非引导的，意指所述对的成员可以没有实质偏好性地彼此缔合或自缔合，并且它们可以具有相同的或不同的氨基酸序列。参见图5A。可选地，相互作用对可以是引导的(不对称)对，意指所述对的成员优先地彼此缔合，而非自缔合。参见图5B。可以想到更高阶的复合物。参见图5C和5D。
图6A-6G显示了包含两个I型受体多肽(表示为“I”)(例如，与来自人或其他物种(诸如本文中所描述的那些)的ALK1、ALK4、ALK5或ALK7蛋白的细胞外结构域至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽)和两个II型受体多肽(表示为“II”)(例如，与来自人或其他物种(诸如本文中所描述的那些)的ActRIIA、ActRIIB、MISRII或BMPRII蛋白的细胞外结构域至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽)的异源聚体蛋白复合物的示意性实例。
在图示的实施方案6A中，第一个I型受体多肽(从左到右)是包含相互作用对的第一成员(“C1”)且进一步包含相互作用对的附加的第一成员(“A1”)的融合多肽的一部分；并且第二个I型受体多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)且进一步包含相互作用对的第一成员(“A2”)的融合多肽的一部分。第一个II型受体多肽(从左到右)是包含相互作用对的第二成员(“B1”)的融合多肽的一部分；并且第二个II型受体多肽是包含相互作用对的第二成员(“B2”)的融合多肽的一部分。A1和A2可以相同或不同；B1和B2可以相同或不同，且C1和C2可以相同或不同。在每个融合多肽中，接头可以被定位在I型受体多肽或II型受体多肽和相互作用对的对应成员之间以及相互作用对之间。图6A是非引导的相互作用对的缔合的实例，意指所述对的成员可以没有实质偏好性地彼此缔合或自缔合并且可以具有相同或不同的氨基酸序列。
在图示的实施方案6B中，第一个II型受体多肽(从左到右)是包含相互作用对的第一成员(“C1”)且进一步包含相互作用对的附加的第一成员(“A1”)的融合多肽的一部分；并且第二个II型受体ActRIIB多肽是包含相互作用对的第二成员(“B2”)的融合多肽的一部分。第一个I型受体多肽(从左到右)是包含相互作用对的第二成员(“B1”)的融合多肽的一部分；并且第二个I型受体多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)且进一步包含相互作用对的第一成员(“A2”)的融合多肽的一部分。在每个融合多肽中，接头可以被定位在I型受体或II型受体多肽和相互作用对的对应成员之间以及相互作用对之间。图6B是引导的(不对称)相互作用对的缔合的实例，意指所述对的成员优先地彼此缔合，而非自缔合。
适宜的相互作用对包括，例如，重链和/或轻链免疫球蛋白相互作用对、其截短形式及其变体，如本文中所述(例如，Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106)。可以想到更高阶的复合物。参见图6C-6F。使用类似的方法，特别是采用轻链和/或重链免疫球蛋白、其截短形式或其变体的那些方法，相互作用对可以用来产生类似抗体Fab和F(ab’)2复合物的异源二聚体(例如，Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106)。参见图6G。
图7显示了在CHO细胞中表达的ActRIIA-hFc的纯化，通过分级柱(图7A)以及考马斯染色的SDS-PAGE(图7B,左泳道:分子量标准品；右泳道:ActRIIA-hFc)显现。
图8显示了ActRIIA-hFc与激活素(图8A)和GDF-11(图8B)的结合，这通过BiacoreTM测定法测量。
图9A和9B显示了异源聚体蛋白复合物的示意性实例，所述异源聚体蛋白包含ALK4多肽(例如，与来自人或如本文所述的其他物种的ALK4蛋白的细胞外结构域至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽)、ActRIIB多肽(例如，与来自人或如本文所述的其他物种的ActRIIB蛋白的细胞外结构域至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽)和抗体的配体结合结构域(例如，来源于与一个或多个ALK4:ActRIIB-结合配体结合的抗体的配体结合结构域)。在图示的实施方案中，ALK4多肽是包含相互作用对的第一成员(“C1”)且进一步包含相互作用对的附加的第一成员(“A1”)的融合多肽的一部分。ActRIIB多肽是包含相互作用对的第二成员(“B1”)的融合多肽的一部分。可变重链(VH)多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)且进一步包含相互作用对的第一成员(“A2”)的融合多肽的一部分。可变重链(VL)多肽是包含相互作用对的第二成员(“B2”)的融合多肽的一部分。在每个融合多肽中，接头可以被定位在ALK4或ActRIIB多肽和相互作用对的对应成员之间，在相互作用对之间，以及在VH和VL多肽与相互作用的成员之间。A1和A2可以相同或不同；B1和B2可以相同或不同，并且C1和C2可以相同或不同。适宜的相互作用对包括，例如，恒定区重链和/或轻链免疫球蛋白相互作用对、其截短形式、及其变体，如本文中所述(例如，Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106)。图9A是引导的(不对称)的相互作用对的缔合的实例，意指所述对的成员优先地彼此缔合，而非自缔合。图9B是非引导的相互作用对的缔合的实例，意指所述对的成员可以没有实质偏好性地彼此缔合或自缔合并且可以具有相同或不同的氨基酸序列。
这样的抗体-ALK4:ActRIIB复合物可以用于需要进一步结合/拮抗不是ALK4:ActRIIB配体的作用剂的情况。可选地是，这样的抗体-ALK4:ActRIIB复合物可以用于需要进一步增强ALK4:ActRIIB配体结合/拮抗作用的情况。例如，如本文中的实施例所证明，激活素B、激活素A、GDF11和GDF8都与ALK4:ActRIIB异源二聚体以强亲和力结合。另外，BMP6结合ALK4:ActRIIB异源二聚体，但是亲和力较弱。在除了高亲和力结合配体(例如，激活素B、激活素A、GDF11和GDF8)中的一种或多种以外需要拮抗BMP6活性的特定情况下，BMP6可以更胜任于与ALK4:ActRIIB异源二聚体的结合。在这样的情况下，将抗体的BMP6-结合结构域添加到ALK4:ActRIIB异源多聚体复合物将提高此类蛋白复合物除拮抗激活素B、激活素A、GDF11和GDF8中的一种或多种之外拮抗BMP6的能力。
图10显示了ALK4:ActRIIB单捕获多肽的示意性实施例。ALK4:ActRIIB单捕获多肽可以含有多个具有相同或不同序列的ALK4结构域(例如，1、2、3、4、5、6、7、9、10或更多个结构域)，以及多个具有相同或不同序列的ActRIIB结构域(例如，1、2、3、4、5、6、7、9、10或更多个结构域)。这些ALK4和ActRIIB结构域可以以任何次序排列并且可以包含被定位在ALK4和ActRIIB结构域中的一个或多个之间的一个或多个接头结构域。这样的配体捕获物可以用作治疗剂来治疗或预防本文中所述的疾病或病况。
图11A-11D显示了多聚蛋白复合物的示意性实例，所述多聚蛋白复合物包含至少一个ALK4:ActRIIB单链捕获多肽。在图示的实施方案11A和11B中，第一ALK4:ActRIIB单链捕获多肽(从左到右)是包含相互作用对的第一成员(“C1”)的融合多肽的一部分；并且第二ALK4:ActRIIB单链捕获多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)的融合多肽的一部分。C1和C2可以相同或不同。第一和第二ALK4:ActRIIB单链捕获多肽可以相同或不同。在每个融合多肽中，接头可以被定位在ALK4:ActRIIB单链捕获多肽和相互作用对的对应成员之间。适宜的相互作用对包括，例如，重链和/或轻链免疫球蛋白相互作用对、其截短形式及其变体，如本文中所述[例如，Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106]。图11A是非引导的相互作用对的缔合的实例，意指所述对的成员可以没有实质偏好性地彼此缔合或自缔合并且可以具有相同或不同的氨基酸序列。图11B是引导的(不对称)的相互作用对的缔合的实例，意指所述对的成员优先地彼此缔合，而非自缔合。可以想到更高阶的复合物。另外，这样的ALK4:ActRIIB单链捕获多肽可以同样地与一个或多个ALK4多肽和/或一个或多个ActRIIB多肽共价或非公价地缔合。参见图11C。此外，这样的ALK4:ActRIIB单链捕获多肽可以类似地与抗体的一个或多个配体结合结构域(例如，与一个或多个ALK4:ActRIIB结合配体结合的抗体的配体结合结构域)共价或非共价地缔合。参见图11D。
图12显示了ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚蛋白复合物与ActRIIB-Fc同型二聚体和ALK4-Fc同型二聚体比较的比较性配体结合数据。对于每个蛋白复合物，配体通过Koff(与配体信号传导抑制良好相关的动力学常数)排序，并以结合亲和力的降序列出(最紧密结合的配体列在顶部)。在左边，黄线、红线、绿线和蓝线指示解离速率常数的量级。黑实线指示与同型二聚体相比与异源二聚体的结合被增强或没有改变的配体，而红短划线指示与同型二聚体相比明显减少的结合。如所示的那样，与任一个同型二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体表现出与激活素B的结合增强，保留了与激活素A、GDF8和GDF11的强结合，如利用ActRIIB-Fc同型二聚体所观察到的那样，并且表现出与BMP9、BMP10和GDF3明显减少的结合。像ActRIIB-Fc同型二聚体一样，异源二聚体保留了与BMP6中等水平的结合。
图13显示了通过如本文所述的A-204报告基因测定法测定的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体/ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体IC50比较数据。类似于ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体抑制激活素A、激活素B、GDF8和GDF11信号传导通路。然而，与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体对BMP9和BMP10信号传导通路的抑制明显降低。这些数据表明与对应的ActRIIB:ActRIIB同型二聚体相比，ALK4:ActRIIB异源二聚体是激活素A、激活素B、GDF8和GDF11的选择性更高的拮抗剂。
图14A-14C显示了来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、纤连蛋白、PAI-1、CTGF和a-SMA)、炎症基因(TNF-α和MCP1)、细胞因子基因(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和激活素A)、肾损伤基因(NGAL)、缺氧诱导因子1-α(HIF1a)和激活素A受体(Acvr2A)的基因表达谱。来自对侧未手术肾脏的样品用作对照(Ctrl)。在手术后17天时获得基因表达谱。在手术后第3、7、10和14天时向小鼠施用PBS或ALK4-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体。($)表示仅施用PBS的小鼠第17天时的UUO肾脏与施用ALK7-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体的小鼠第17天时的UUO肾脏之间的统计学差异。(@)表示没有检测到转录物。
图15显示了ALK7-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚蛋白复合物与ActRIIB-Fc同型二聚体和ALK7-Fc同型二聚体相比的比较性配体结合数据。对于每个蛋白复合物，配体通过Koff(与配体信号传导抑制良好相关的动力学常数)排序，并以结合亲和力的降序列出(最紧密结合的配体列在顶部)。在左边，黄线、红线、绿线和蓝线指示解离速率常数的量级。黑实线指示与同型二聚体相比与异源二聚体的结合被增强或没有改变的配体，而红短划线指示与同型二聚体相比明显减少的结合。如所示的那样，5个配体中与ActRIIB-Fc同型二聚体强结合的四个(激活素A、BMP10、GDF8和GDF11)表现出与ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体的结合减少，例外是激活素B，激活素B保留了与所述异源二聚体的紧密结合。类似地，四个配体中与ActRIIB-Fc同型二聚体中等结合的三个(GDF3、BMP6和特别是BMP9)表现出与ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体的结合减少，而与激活素AC的结合增加成为总体上第二强的与所述异源二聚体的配体相互作用。最后，激活素C和BMP5出人意料地以中等强度结合ActRIIB-Fc:ALK7异源二聚体，尽管与ActRIIB-Fc同型二聚体不结合(激活素C)或弱结合(BMP5)。没有检测到与ALK7-Fc同型二聚体结合的配体。
图16A-16C显示了来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、纤连蛋白、PAI-1、CTGF和a-SMA)、炎症基因(TNF-α和MCP1)、细胞因子基因(Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3和激活素A)、肾损伤基因(NGAL)、缺氧诱导因子1-α(HIF1a)和激活素A受体(Acvr2A)的基因表达谱。来自对侧未手术肾脏的样品用作对照(Ctrl)。在手术后第3天和第17天时获得基因表达谱。在手术后第3、7、10和14天时向小鼠施用PBS或ALK7-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体。使用单因素方差分析，然后使用Tukey分析进行统计学分析。(*)表示比较i)对照样品与施用ALK7-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体的小鼠第3天时的UUO肾脏之间或比较ii)对照样品与施用ALK7-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体的小鼠第17天时的UUO肾脏之间的统计学差异。($)表示仅施用PBS的小鼠第17天时的UUO肾脏与施用ALK7-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体的小鼠第17天时的UUO肾脏之间的统计学差异。(@)表示没有检测到转录物。
图17显示了在用ActRIIa-Fc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图18显示了在用ActRIIa-Fc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(IL-1B和TNF-α)的基因表达谱。
图19显示了在用ActRIIa-Fc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图20显示了在用ActRIIB(20-134)-Fc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图21显示了在用ActRIIB(20-134)-Fc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(IL-1B和TNF-α)的基因表达谱。
图22显示了在用ActRIIB(20-134)-Fc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图23显示了在用抗-TGF-β1/2/3pan抗体(即，结合TGF-β的同种型1、2和3)治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图24显示了在用抗-TGF-β1/2/3pan抗体(即，结合TGF-β的同种型1、2和3)治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(TNF-α)的基因表达谱。
图25显示了在用抗-TGF-β1/2/3pan抗体(即，结合TGF-β的同种型1、2和3)治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1/2/3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图26显示了在用抗-激活素A抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图27显示了在用抗-激活素A抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(IL-1B和TNF-α)的基因表达谱。
图28显示了在用抗-激活素A抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1/2/3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图29显示了在用抗-激活素A/B抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图30显示了在用抗-激活素A/B抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(IL-1B和TNF-α)的基因表达谱。
图31显示了在用抗-激活素A/B抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1/2/3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图32显示了在用抗-激活素B抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图33显示了在用抗-激活素B抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(IL-1B和TNF-α)的基因表达谱。
图34显示了在用抗-激活素B抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1/2/3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图35显示了在用抗-ActRIIA抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图36显示了在用抗-ActRIIA抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(TNF-α)的基因表达谱。
图37显示了在用抗-ActRIIA抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1/2/3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图38显示了在用抗-ActRIIA/IIB抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图39显示了在用抗-ActRIIA/IIB抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(TNF-α)的基因表达谱。
图40显示了在用抗-ActRIIA/IIB抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1/2/3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图41显示了在用抗-ActRIIB抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图42显示了在用抗-ActRIIB抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(TNF-α)的基因表达谱。
图43显示了在用抗-ActRIIB抗体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1/2/3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图44显示了在用ActRIIB(L79D,25-131)-hFc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图45显示了在用ActRIIB(L79D,25-131)-hFc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(IL-1B和TNF-α)的基因表达谱。
图46显示了在用ActRIIB(L79D,25-131)-hFc同型二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图47显示了ActRIIA-Fc:ALK4-Fc异源二聚蛋白复合物与ActRIIA-Fc同型二聚体和ALK4-Fc同型二聚体比较的配体结合数据。如所示的那样，与ActRIIA-Fc同型二聚体相比，ActRIIA-Fc:ALK4-Fc异源二聚体表现出与激活素A结合增强，并且特别是与激活素AC的结合增强，同时保留了与激活素AB和GDF11的强结合。另外，对ActRIIA-Fc同型二聚体具有最高亲和力的配体，即激活素B，表现出对ActRIIA-Fc:ALK4-Fc异源二聚体的亲和力减小(尽管仍然在高亲和力范围内)。与ActRIIA-Fc同型二聚体相比，ActRIIA-Fc:ALK4-Fc异源二聚体还表现出与BMP10的结合显著减小。
图48显示了在用ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的纤维化基因(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA)的基因表达谱。
图49显示了在用ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的炎症基因(TNF-α)的基因表达谱。
图50显示了在用ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体治疗后来自经受单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾脏的细胞因子基因(Tgfb1/2/3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的基因表达谱。
图51显示了BMPRII-Fc:ALK4-Fc异源二聚蛋白复合物与BMPRII-Fc同型二聚体和ALK4-Fc同型二聚体比较的配体结合数据。BMPRII-Fc:ALK4-Fc异源二聚体通过以高或中等强度结合几种激活素配体从而不同于两种同型二聚体，并且通过仅与BMP15弱结合而不同于BMPRII-Fc同型二聚体。最值得注意的是，BMPRII-Fc:ALK4-Fc异源二聚体与异源二聚配体激活素AB强力结合并具有高度选择性。
具体实施方式
1.概述
TGF-β超家族包括超过30种分泌因子，包括TGF-β、激活素、nodal、骨形成蛋白(BMP)、生长分化因子(GDF)和抗-缪勒管激素(AMH)(Weiss等人(2013)DevelopmentalBiology,2(1):47-63)。所述超家族的成员存在于脊椎动物和无脊椎动物中，广泛地表达于各种各样的组织中并且在动物寿命中最早的发育阶段期间发挥作用。实际上，TGF-β超家族蛋白是干细胞自我更新、原肠胚形成、分化、器官形态发生和成体组织稳态的关键介导物。与此广泛活性相一致，异常的TGF-β超家族信号传导与大范围的人体病理状态相关。
TGF-β超家族的配体共有相同的二聚结构，在所述二聚体结构中一个单体的中央3-1/2圈螺旋紧靠由另一单体的β链形成的凹面堆积。大多数TGF-β家族成员进一步通过分子间二硫键稳定。这种二硫键贯穿由两个其他的二硫键形成的环，产生被称作‘半胱氨酸结’基序的结构(Lin等人(2006)Reproduction 132:179-190；和Hinck等人(2012)FEBSLetters586:1860-1870)。
TGF-β超家族信号传导由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异源聚体复合物介导，该异源聚体复合物在配体刺激后磷酸化并激活下游SMAD蛋白(例如，SMAD蛋白1、2、3、5和8)[Massagué(2000)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1:169-178]。这些I型和II型受体是由下列构成的跨膜蛋白：具有富含半胱氨酸区的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶特异性的细胞质结构域。通常，I型受体介导细胞内信号传导，而II型受体则是结合TGF-β超家族配体所需要的。在配体结合后I型和II受体形成稳定的复合物，导致I型受体被II型受体磷酸化。
TGF-β家族可以基于它们结合的I型受体和它们活化的Smad蛋白分为两个***发生分支。一个是较近进化的分支，其包括例如，TGF-β、激活素、GDF8、GDF9、GDF11、BMP3和nodal，它们通过活化Smads2和3的I型受体进行信号传导(Hinck(2012)FEBS Letters586:1860-1870)。另一分支包括较远相关的超家族蛋白，且包括例如，BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF1、GDF5、GDF6和GDF7，其通过Smads 1、5和8进行信号传导。
激活素是TGF-β超家族的成员，并且最初作为促卵泡激素分泌的调节物发现，但随后表征了多种生殖和非生殖作用。有三种主要的激活素形式(A、B和AB)，它们是两个紧密相关的β亚基的同型/异源二聚体(分别为βAβA、βBβB和βAβB)。人基因组还编码激活素C和激活素E，它们主要在肝脏中表达，且包含βC或βE的异源二聚体形式也是已知的。在TGF-β超家族中，激活素是独特和多功能的因子，其可在卵巢和胎盘细胞中刺激激素产生，支持神经元细胞存活，根据细胞类型正面或负面影响细胞周期进展，且至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层分化(DePaolo等人(1991)Proc Soc Ep Biol Med.198:500-512；Dyson等人(1997)CurrBiol.7:81-84；和Woodruff(1998)Biochem Pharmacol.55:953-963)。在数种组织中，激活素信号传导被其相关的异源二聚体抑制素拮抗。例如，在从脑垂体的促卵泡激素(FSH)分泌的调节中，激活素促进FSH合成和分泌，而抑制素减少FSH合成和分泌。可调节激活素生物活性和/或结合激活素的其它蛋白包括促滤泡素抑制素(FS)、促滤泡素抑制素-相关蛋白(FSRP，也称为FLRG或FSTL3)和α2-巨球蛋白。
如本文所述，结合“激活素A”的作用剂是特异性结合βA亚基的作用剂，无论是在分离的βA亚基还是作为二聚体复合物(例如，βAβA同型二聚体或βAβB异源二聚体)的情况下。在异源二聚体复合物(例如，βAβB异源二聚体)的情况下，结合“激活素A”的作用剂对βA亚基内存在的表位是特异性的，但不结合所述复合物的非βA亚基(例如，所述复合物的βB亚基)内存在的表位。类似地，本文公开的拮抗(抑制)“激活素A”的作用剂是抑制由βA亚基介导的一种或多种活性的作用剂，无论是在分离的βA亚基还是作为二聚体复合物(例如，βAβA同二聚体或βAβB异源二聚体)的情况下。在βAβB异源二聚体的情况下，抑制“激活素A”的作用剂是特异性抑制βA亚基的一种或多种活性，但不抑制所述复合物的非βA亚基(例如，所述复合物的βB亚基)的活性的作用剂。该原理也适用于结合和/或抑制“激活素B”、“激活素C”和“激活素E”的作用剂。本文公开的拮抗“激活素AB”的作用剂是抑制由βA亚基介导的一种或多种活性和由βB亚基介导的一种或多种活性的作用剂。
BMP和GDF一起形成半胱氨酸结细胞因子的家族，其共有TGF-β超家族的特征性折叠(Rider等人(2010)Biochem J.，429(1):1-12)。该家族包括例如，BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP2a、BMP3、BMP3b(也称为GDF10)、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP8a、BMP8b、BMP9(也称为GDF2)、BMP10、BMP11(也称为GDF11)、BMP12(也称为GDF7)、BMP13(也称为GDF6)、BMP14(也称为GDF5)、BMP15、GDF1、GDF3(也称为VGR2)、GDF8(也称为肌生成抑制蛋白)、GDF9、GDF15和decapentaplegic。除了诱导骨形成的能力(这给予BMP其名称)之外，BMP/GDF还显示在大量组织的发育中的形态发生活性。BMP/GDF同型和异源二聚体与I型和II型受体二聚体的组合相互作用，以产生多种可能的信号传导复合物，导致两个竞争性的SMAD转录因子组之一的活化。BMP/GDF具有高度特异性和局部化的功能。这些以许多方式受到调节，包括BMP/GDF表达的发育限制，和通过数种特异性BMP拮抗剂蛋白的分泌，所述BMP拮抗剂蛋白以高亲和力结合所述细胞因子。奇特的是，这些拮抗剂中许多类似于TGF-β超家族配体。
生长和分化因子-8(GDF8)也称为肌生成抑制蛋白。GDF8是骨骼肌质量的负调节剂，且在发育和成年骨骼肌中高度表达。在转基因小鼠中GDF8无效突变特征在于骨骼肌的显著肥大和增生[McPherron等人，Nature(1997)387:83-90]。在牛中以及出人意料地在人中，在天然存在的GDF8突变中骨骼肌质量的类似增加是明显的(Ashmore等人(1974)Growth，38:501-507；Swatland和Kieffer，J.Anim.Sci.(1994)38:752-757；McPherron和Lee，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:12457-12461；Kambadur等人，Genome Res.(1997)7:910-915；和Schuelke等人(2004)N Engl J Med，350:2682-8)。研究已经显示，在人中与HIV-感染相关的肌肉萎缩(muscle wasting)伴随有GDF8蛋白表达的增加(Gonzalez-Cadavid等人，PNAS(1998)95:14938-43)。此外，GDF8可以调节肌肉-特异性的酶(例如，肌酸激酶)的产生和调节成肌细胞的细胞增殖[国际专利申请公开号WO 00/43781]。GDF8前肽可非共价结合加工的GDF8结构域二聚体，使其生物学活性失活[Miyazono等人(1988)J.Biol.Chem.，263:6407-6415；Wakefield等人(1988)J.Biol.Chem.，263；7646-7654；和Brown等人(1990)Growth Factors，3:35-43]。结合GDF8或结构相关蛋白且抑制它们的生物学活性的其它蛋白包括促滤泡素抑制素，和潜在地，促滤泡素抑制素-相关蛋白[Gamer等人(1999)Dev.Biol.，208:222-232]。
GDF11，也称为BMP11，是一种在小鼠发育期间在尾芽、肢芽、上颌和下颌弓和背根神经节中表达的分泌蛋白[McPherron等人(1999)Nat.Genet.，22:260-264；和Nakashima等人(1999)Mech.Dev.，80:185-189]。GDF11在中胚层和神经组织二者的图式发育(patterning)中起独特的作用[Gamer等人(1999)Dev Biol.，208:222-32]。GDF11已显示是鸡翼发育中软骨发生和肌生成的负调节剂[Gamer等人(2001)Dev Biol.，229:407-20]。GDF11在肌肉中的表达也表明其以类似于GDF8的方式在调节肌肉生长中的作用。此外，GDF11在脑中的表达表明GDF11还可具有与神经***的功能相关的活性。感兴趣的是，发现GDF11在嗅上皮中抑制神经发生[Wu等人(2003)Neuron.，37:197-207]。因此，GDF11可具有在治疗诸如肌肉疾病和神经退行性疾病(例如，肌萎缩侧索硬化)的疾病中的体外和体内应用。
部分地，本公开涉及下列的发现：激活素和/或GDF拮抗剂(抑制剂)治疗或降低肾脏疾病的进展速度和/或严重性，特别是治疗、预防或降低一种或多种肾脏疾病相关的并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的进展速度和/或严重性。在一些实施方案中，本公开涉及抑制激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF8、GDF3、GDF1、Nodal、ALK4、ALK5、ALK7、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad 2和Smad 3等中的一种或多种的激活素和/或GDF拮抗剂用于治疗、预防或降低肾脏疾病的进展速度和/或严重性或治疗、预防或降低一种或多种肾脏疾病相关的并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的进展速度、频次和/或严重性的用途。
在本公开的上下文中和在使用每个术语的特定上下文中，本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中的普通含义。下文或说明书别处论述了某些术语，以在描述本公开的组合物和方法和如何制备和使用它们方面，向实施者提供另外的指导。术语的任何使用的范围或含义将根据使用其的具体上下文而显而易见。
“同源的”，以其所有的语法形式和拼写变化，是指两种蛋白之间的关系，所述蛋白具有“共同的进化来源”，包括来自相同的物种的生物体的超家族的蛋白，以及来自不同物种的生物体的同源蛋白。此类蛋白(和它们的编码核酸)具有序列同源性，如通过它们的序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比方面，还是通过特定残基或基序和保守位置的存在。然而，在通常使用中和在本申请中，术语“同源的”当被副词例如“高度地”修饰时，可以指序列相似性，且可能或可能不涉及共同的进化来源。
术语“序列相似性”，以其所有的语法形式，是指核酸或氨基酸序列之间同一性或一致性的程度，所述序列可能或可能不享有共同的进化来源。
相对于参照多肽(或核苷酸)序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在比对序列和如果需要，引入空位以实现最大百分比序列同一性，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分后，在候选序列中与在参照多肽(核苷酸)序列中氨基酸残基(或核酸)相同的氨基酸残基(或核酸)的百分数。为确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以在本领域的技能范围内的各种方式实现，例如，使用公开可得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定合适的参数以比对序列，包括在所比较的序列的整个长度上实现最大比对所需的任何算法。然而，为本文目的，％氨基酸(核酸)序列同一性值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.设计，且源代码已使用用户文档提交至美国版权局，华盛顿，20559，其中它注册为美国版权注册号TXU510087。ALIGN-2程序可公开获自Genentech，Inc.，南旧金山，加利福尼亚州，或可从源代码编译。ALIGN-2程序应经编译在UNIX操作***上使用，包括digital UNIX V4.0D。所有的序列比较参数通过ALIGN-2程序设定，并且不改变。
“激动”，以其所有语法形式，是指活化蛋白和/或基因(例如，通过活化或放大所述蛋白的基因表达或通过诱导失活的蛋白进入活性状态)或增加蛋白和/或基因的活性的过程。
“拮抗”，以其所有语法形式，是指抑制蛋白和/或基因(例如，通过抑制或降低所述蛋白的基因表达或通过诱导活性蛋白进入失活状态)或降低蛋白和/或基因的活性的过程。
说明书和权利要求书全文中结合数值使用的术语“约”和“大约”表示准确度的区间，其为本领域技术人员熟悉和可接受的。通常，此类准确度区间是±10％。可选地，和特别是在生物学***中，术语“约”和“大约”可意指在给定值的一个数量级内的值，优选地≤5倍，和更优选地≤2倍。
本文公开的数值范围包括定义该范围的数字。
术语“一个”和“一种”包括复数指代物，除非使用该术语的上下文明确地另外指明。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。此外，本文使用的“和/或”应视为具体公开了两个或更多个指定的特征或组分的每一个，含或不含其它特征或组分。因此，在本文的词语诸如"A和/或B"中使用的术语“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在词语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”意在包括以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
在整个说明书中，词语“包括”或变型诸如“包含”或“含有”应理解为暗示包括所述的整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。
2.TGF-β超家族I型受体、II型受体和辅助受体多肽，其变体和蛋白复合物
在某些方面，根据本文公开的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂是ActRII多肽(例如，ActRIIA或ActRIIB多肽),其变体，包含至少一个ActRII多肽的蛋白复合物(例如，包含两个ActRII多肽的同型二聚体或包含一个ActRII多肽和一个异源多肽(例如，ALK4)的异源二聚体)。如本文所用，术语“ActRII”是指II型激活素受体的家族。此家族包括激活素受体IIA型(ActRIIA)和激活素受体IIB型(ActRIIB)。ActRII多肽，或包含ActRII多肽的蛋白复合物可以抑制，例如，一种或多种ActRII-结合配体(例如，激活素、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1和Nodal)、ActRII受体(例如，ActRIIA和ActRIIB)、ActRII-相关的I型受体(例如，ALK4、ALK5、ALK7等)和/或ActRII-相关的辅助受体(例如，Cripto、Cryptic、Cryptic 1B等)。在一些实施方案中，ActRII多肽或包含ActRII多肽的蛋白复合物抑制信号传导(例如，Smad信号传导)的能力在基于细胞的测定法中测定，所述测定法包括例如，本文中所述的那些。ActRII多肽或包含ActRII多肽的蛋白复合物可以单独使用或与一种或多种附加的支持疗法或活性剂组合使用以治疗、预防或降低肾脏疾病或肾脏疾病的一种或多种并发症的进展速度和/或严重性。
如本文所用，术语“ActRIIB”是指来自任何物种的激活素受体IIB型(ActRIIB)蛋白家族，和通过诱变或其它修饰衍生自此类ActRIIB蛋白的变体。本文提及ActRIIB应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ActRIIB家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ActRIIB多肽”包括包含ActRIIB家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。此类变体ActRIIB多肽的实例在本公开全文以及国际专利申请公开号WO 2006/012627、WO 2008/097541、WO2010/151426和WO 2011/020045(其通过引用以其整体并入本文)中提供。本文所述的所有ActRIIB-相关多肽的氨基酸编号基于人ActRIIB前体蛋白序列(SEQ ID NO:1；NCBI数据库登录号NP_001097.2)的编号，除非另外特别指出。含有在位置64处的精氨酸被丙氨酸置换的另一ActRIIB突变体显示在SEQ ID NO:2中。
经加工的细胞外ActRIIB多肽序列在SEQ ID NO:3中给出。选择性A64形式的经加工的细胞外ActRIIB多肽序列在SEQ ID NO:4中给出。细胞外结构域的C-端“尾部”通过两个 序列中的单下划线指示。
在一些实施方案中，可以产生在N-末端具有“SGR…”序列的蛋白。“尾部”缺失的序列(Δ15序列)在SEQ ID NO:5和6中给出，SEQ ID NO:5和6分别代表野生型和R64A突变体。
编码人ActRIIB前体蛋白的核酸序列显示为SEQ ID NO:7,代表Genbank参考序列NM_001106.3的核苷酸25-1560，其编码ActRIIB前体的氨基酸1-513。所示的序列提供了在位置64处的精氨酸并且可以被修饰以提供代替的丙氨酸。信号序列加下划线。
编码经加工的细胞外人ActRIIB多肽(SEQ ID NO:3)的核酸序列在SEQ ID NO:8中给出。此序列的位置64处的精氨酸的密码子可以被代替的丙氨酸的密码子置换。
人ActRIIB细胞外结构域和人ActRIIA细胞外结构域的氨基酸序列比对示于图1。该比对指示两种受体内被认为直接接触ActRII配体的氨基酸残基。例如，该复合ActRII结构指示ActRIIB-配体结合袋部分地由残基Y31、N33、N35、L38至T41、E47、E50、Q53至K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78至N83、Y85、R87、A92和E94至F101定义。在这些位置，预期保守突变将是耐受的。
另外，ActRIIB在脊椎动物中是充分保守的，其中一大段细胞外结构域完全保守。例如，图2描绘人ActRIIB细胞外结构域与各种ActRIIB直向同源物相比的多序列比对。许多结合ActRIIB的配体也是高度保守的。因此，根据这些比对，可能预测配体-结合结构域内对于正常的ActRIIB-配体结合活性是重要的关键氨基酸位置以及预测可能耐受置换而不显著改变正常的ActRIIB-配体结合活性的氨基酸位置。因此，可根据本文公开的方法使用的活性的人ActRIIB变体多肽可以包括来自另一种脊椎动物ActRIIB的序列的相应位置的一个或多个氨基酸，或可以包括类似于人或其它脊椎动物序列中的残基的残基。不意图限制，以下实例说明这种定义活性ActRIIB变体的方法。人细胞外结构域中的L46在非洲爪蟾(Xenopus)ActRIIB中是缬氨酸，因此该位置可被改变和任选地可被改变为另一疏水残基，诸如V、I或F，或非极性残基诸如A。在人细胞外结构域中的E52在非洲爪蟾中是K，表明该位点可耐受各种变化，包括极性残基诸如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y和可能的A。在人细胞外结构域中的T93在非洲爪蟾中是K，表明在该位置处广泛的结构变异是耐受的，其中极性残基是有利的，诸如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y。在人细胞外结构域中的F108在非洲爪蟾中是Y，因此Y或其它疏水基团，诸如I、V或L应是耐受的。在人细胞外结构域中的E111在非洲爪蟾中是K，指示带电荷残基在该位置处是耐受的，包括D、R、K和H，以及Q和N。在人细胞外结构域中的R112在非洲爪蟾中是K，表明碱性残基在该位置处是耐受的，包括R和H。人细胞外结构域的位置119处的A相对地保守性差，在啮齿动物中作为P和在非洲爪蟾中作为V出现，因此基本上任何氨基酸在该位置处应该是耐受的。
此外，在本领域中ActRII蛋白已在结构和功能特征方面，特别是关于配体结合被表征[Attisano等人(1992)Cell 68(1):97-108；Greenwald等人(1999)Nature StructuralBiology 6(1):18-22；Allendorph等人(2006)PNAS 103(20:7643-7648；Thompson等人(2003)The EMBO Journal22(7):1555-1566；以及美国专利号:7,709,605、7,612,041和7,842,663]。除了本文的教导之外，这些参考文献对于如何生成保留一种或多种正常活性(例如，配体-结合活性)的ActRIIB变体提供了充分指导。
例如，称为三指毒素折叠的定义结构基序对于通过I型和II型受体的配体结合是重要的且通过位于各单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成(Greenwald等人(1999)Nat Struct Biol6:18-22；和Hinck(2012)FEBS Lett 586:1860-1870)。因此，由这些保守半胱氨酸的最外端所划界的人ActRIIB的核心配体-结合结构域对应于SEQ ID NO:1(ActRIIB前体)的位置29-109。侧接这些半胱氨酸-划界的核心序列的结构上更加无序的氨基酸可以在N-末端处截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个残基和/或在C-末端处截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个残基，而不必然改变配体结合。N-末端和/或C-末端截短的示例性ActRIIB细胞外结构域包括SEQ ID NO:3、4、5和6。
Attisano等人证明ActRIIB的细胞外结构域的C-末端处的脯氨酸结的缺失减少受体对激活素的亲和力。相对于包含脯氨酸结区域和完整的近膜结构域的ActRIIB(20-134)-Fc(参见例如，美国专利号7,842,663)，包含本发明的SEQ ID NO:1的氨基酸20-119的ActRIIB-Fc融合蛋白，“ActRIIB(20-119)-Fc”，具有减少的对GDF11和激活素的结合。然而，相对于野生型，即使脯氨酸结区域被破坏，ActRIIB(20-129)-Fc蛋白也保留类似的但略微减少的活性。
因此，在氨基酸134、133、132、131、130和129处(相对于SEQ ID NO:1)终止的ActRIIB细胞外结构域全部预期是有活性的，但在134或133处终止的构建体可最具有活性。类似地，残基129-134(相对于SEQ ID NO:1)中的任一个处的突变在很大程度上预期不改变配体-结合亲和力。为支持此观点，本领域已知P129和P130的突变(相对于SEQ ID NO:1)基本上不降低配体结合。因此，本公开的ActRIIB多肽可早在氨基酸109(最后一个半胱氨酸)终止，然而，在109和119或其之间(例如，109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119)终止的形式预期具有减少的配体结合。氨基酸119(相对于本发明的SEQ ID NO:1)保守性差，因此容易改变或截短。在128(相对于SEQ ID NO:1)或更后终止的ActRIIB多肽应保留配体-结合活性。相对于SEQ ID NO:1在119和127或其之间(例如，119、120、121、122、123、124、125、126或127)终止的ActRIIB多肽将具有中等结合能力。任何这些形式可能对于应用是合乎需要的，这取决于临床或实验设置。
在ActRIIB的N-末端，预期在氨基酸29或之前(相对于SEQ ID NO:1)开始的蛋白将保留配体-结合活性。氨基酸29表示最开始的半胱氨酸。位置24(相对于SEQ ID NO:1)处的丙氨酸至天冬酰胺突变引入N-连接的糖基化序列，基本上不影响配体结合(美国专利号7,842,663)。这证实了信号裂解肽和半胱氨酸交联区之间的区域(对应于氨基酸20-29)中的突变是良好耐受的。具体而言，在位置20、21、22、23和24(相对于SEQ ID NO:1)开始的ActRIIB多肽应保留大致的配体-结合活性，且在位置25、26、27、28和29(相对于SEQ ID NO:1)开始的ActRIIB多肽也被预期保留配体-结合活性。已经证实，例如，美国专利号7,842,663，令人惊讶地，在22、23、24或25开始的ActRIIB构建体将具有最大活性。
总之，ActRIIB的活性部分(例如，配体-结合部分)的通式包含SEQ ID NO:1的氨基酸29-109。因此，ActRIIB多肽可以例如包含下列，基本上由下列组成，或由下列组成：与ActRIIB的部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述ActRIIB的部分起始于对应于SEQ ID NO:1的氨基酸20-29中任一个的残基(例如，起始于氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个)且终止于对应于SEQ ID NO:1的氨基酸109-134中任一个的位置(例如，终止于氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)。其它实例包括这样的多肽，其起始于SEQ ID NO:1的20-29(例如，位置20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个)或21-29(例如，位置21、22、23、24、25、26、27、28或29中任一个)的位置且终止于SEQ IDNO:1的119-134(例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)、119-133(例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133中任一个)、129-134(例如，位置129、130、131、132、133或134中任一个)或129-133(例如，位置129、130、131、132或133中任一个)的位置。其它实例包括这样的构建体，其起始于SEQ ID NO:1的20-24(例如，位置20、21、22、23或24中任一个)、21-24(例如，位置21、22、23或24中任一个)或22-25(例如，位置22、22、23或25中任一个)的位置且终止于SEQ ID NO:1的109-134(例如，位置109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)、119-134(例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中任一个)或129-134(例如，位置129、130、131、132、133或134中任一个)的位置。还考虑在这些范围内的变体，特别是包含下列，基本上由下列组成或由下列组成的那些：与SEQID NO:1的相应部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
本文所述的变化可以各种方式组合。在一些实施方案中，ActRIIB变体包含在配体-结合袋中不超过1、2、5、6、7、8、9、10或15个保守氨基酸变化，任选地在配体-结合袋的位置40、53、55、74、79和/或82处的0、1或多个非保守改变。结合袋外的位点(其中变异性可特别良好耐受)包括细胞外结构域的氨基和羧基端(如上所述)，和位置42-46和65-73(就SEQID NO:1而言)。位置65的天冬酰胺至丙氨酸的改变(N65A)似乎不降低R64背景中的配体结合(美国专利号7,842,663)。这种改变可能消除A64背景中N65的糖基化，因此证实该区域中显著改变可能是耐受的。尽管R64A变化耐受性差，但R64K是良好耐受的，因此另一碱性残基诸如H可在位置64耐受(美国专利号7,842,663)。另外，本领域描述的诱变程序的结果表明，ActRIIB中的氨基酸位置通常对于保守是有益的。相对于SEQ ID NO:1，这些包括位置80(酸性或疏水氨基酸)、位置78(疏水的，特别是色氨酸)、位置37(酸性的，特别是天冬氨酸或谷氨酸)、位置56(碱性氨基酸)、位置60(疏水氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸)。因此，本公开提供了在ActRIIB多肽中可能是保守的氨基酸框架。可能需要保守的其它位置如下：位置52(酸性氨基酸)、位置55(碱性氨基酸)、位置81(酸性)、98(极性或带电荷，特别是E、D、R或K)，全部相对于SEQ ID NO:1。
先前已经证明，将另外的N-连接的糖基化位点(N-X-S/T)添加至ActRIIB细胞外结构域被良好耐受(参见，例如，美国专利号7,842,663)。因此，N-X-S/T序列通常可以在本公开的ActRIIB多肽中在图1中限定的配体结合口袋外部的位置引入。用于引入非内源性N-X-S/T序列的特别合适的位点包括氨基酸20-29、20-24、22-25、109-134、120-134或129-134(就SEQ ID NO:1而言)。还可以将N-X-S/T序列引入ActRIIB序列和Fc结构域或其它融合组分之间的接头中，以及任选地引入融合组分本身中。通过在关于预先存在的S或T的正确位置引入N，或者通过在对应于预先存在的N的位置处引入S或T，可以以最小的努力引入这种位点。因此，将产生N-连接的糖基化位点的期望的改变是：A24N、R64N、S67N(可能与N65A改变组合)、E105N、R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112S和R112T(就SEQ ID NO:1而言)。由于糖基化提供的保护作用，任何预测被糖基化的S可以改变为T而不产生免疫原性位点。同样地，任何预测被糖基化的T可以改变为S。因此，考虑改变S67T和S44T(就SEQ ID NO:1而言)。同样地，在A24N变体中，可以使用S26T改变。因此，本公开的ActRIIB多肽可以是具有一个或多个如上所述的额外的非内源性N-连接的糖基化共有序列的变体。
在某些方面，根据本文所公开的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂是ActRIIB多肽(其包括其片段和功能变体)以及包含至少一个ActRIIB多肽的蛋白复合物(例如，包含两个ActRIIB多肽的同型二聚体或包含一个ActRIIB多肽和一个异源多肽(例如，ALK4)的异源二聚体)。优选地，ActRIIB多肽是可溶性的(例如，包含ActRIIB的细胞外结构域)。在一些实施方案中，ActRIIB多肽拮抗一种或多种激活素和/或GDF配体[例如，GDF11、GDF8、激活素(激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E)、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad 2和Smad 3]的活性(例如，Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，ActRIIB多肽结合一种或多种激活素和/或GDF配体[例如，GDF11、GDF8、激活素(激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad 2和Smad 3等]。在一些实施方案中，本公开的ActRIIB多肽包含与ActRIIB的部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述ActRIIB的部分起始于对应于SEQ ID NO:1的氨基酸20-29的残基并终止于对应于SEQ ID NO:1的氨基酸109-134的位置。在一些实施方案中，ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、181、182、184、187、188、189、190、192、193、196、197、198、199、201、205和206中的任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开的ActRIIB多肽包含ActRIIB多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的L79的位置不是酸性氨基酸(即，不是天然存在的酸性氨基酸D或E或人工酸性氨基酸残基)。
在某些实施方案中，本公开涉及ActRIIA多肽。如本文所用，术语“ActRIIA”是指来自任何物种的激活素受体IIA型(ActRIIA)蛋白家族，和通过诱变或其它修饰衍生自此类ActRIIA蛋白的变体。本文提及ActRIIA应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ActRIIA家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ActRIIA多肽”包括包含ActRIIA家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。此类变体ActRIIA多肽的实例在本公开全文以及国际专利申请公开号WO 2006/012627和WO 2007/062188(其通过引用以其整体并入本文)中提供。
人ActRIIA前体蛋白序列在SEQ ID NO:9或10中给出。
经加工的细胞外人ActRIIA多肽序列在SEQ ID NO:11中给出。编码所述经加工的细胞外ActRIIA多肽的核酸序列具有SEQ ID NO:14的序列。
其中细胞外结构域的C-末端“尾部”缺失的序列(Δ15序列)在SEQ ID NO:12中给出。
编码人ActRIIA前体蛋白(SEQ ID NO:9)的核酸序列显示在下面(SEQ ID NO:13),对应于Genbank参考序列NM_001616.4的核苷酸159-1700。信号序列加下划线。
ActRIIA在脊椎动物中是充分保守的，其中一大段细胞外结构域完全保守。例如，图3描绘人ActRIIA细胞外结构域与多种ActRIIA直向同源物相比的多序列比对。许多结合ActRIIA的配体也是高度保守的。因此，根据这些比对，可能预测配体-结合结构域内对于正常的ActRIIA-配体结合活性是重要的关键氨基酸位置以及预测可能耐受置换而不显著改变正常的ActRIIA-配体结合活性的氨基酸位置。因此，可根据本文公开的方法使用的活性的人ActRIIA变体多肽可以包括来自另一种脊椎动物ActRIIA的序列的相应位置的一个或多个氨基酸，或可以包括类似于人或其它脊椎动物序列中的残基。
不意图限制，以下实施例说明这种定义活性ActRIIA变体的方法。如图3中所示，人细胞外结构域中的F13在绵羊(Ovis aries)(SEQ ID NO:18)、原鸡(Gallus gallus)(SEQID NO:21)、家牛(Bos Taurus)(SEQ ID NO:22)、仓鸮(Tyto alba)(SEQ ID NO:23)和大卫鼠耳蝠(Myotis davidii)(SEQ ID NO:24)ActRIIA中是Y，表明在该位置的芳香族残基是耐受的，包括F、W和Y。人细胞外结构域中的Q24在家牛ActRIIA中是R，表明在该位置处带电残基是耐受的，包括D、R、K、H和E。人细胞外结构域中的S95在原鸡和仓鸮ActRIIA中是F，表明该位点可耐受各种变化，包括极性残基，诸如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y以及可能是疏水残基诸如L、I或F。人细胞外结构域中的E52在绵羊ActRIIA中是D，表明在该位置处酸性残基是耐受的，包括D和E。人细胞外结构域中的P29相对保守性较差，在绵羊ActRIIA中呈现为S且在大卫鼠耳蝠ActRIIA中呈现为L，因此在该位置的基本上任何氨基酸都被耐受。
此外，如上所讨论，在结构/功能特征方面，特别是关于配体结合，ActRII蛋白已在本领域中被表征[Attisano等人.(1992)Cell 68(1):97-108；Greenwald等人.(1999)Nature Structural Biology 6(1):18-22；Allendorph等人.(2006)PNAS 103(20:7643-7648；Thompson等人.(2003)The EMBO Journal 22(7):1555-1566；以及美国专利号：7,709,605、7,612,041和7,842,663]。除了本文的教导之外，这些参考文献对于如何生成保留一种或多种期望活性(例如，配体-结合活性)的ActRII变体提供了充分指导。
例如，称为三指毒素折叠的定义结构基序对于通过I型和II型受体的配体结合是重要的且通过位于各单体受体的细胞外结构域内的不同位置的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人(1999)Nat Struct Biol6:18-22；和Hinck(2012)FEBS Lett 586:1860-1870]。因此，由这些保守半胱氨酸的最外端所划界的人ActRIIA的核心配体-结合结构域对应于SEQ ID NO:9(ActRIIA前体)的位置30-110。因此，侧接这些半胱氨酸-划界的核心序列的结构上更加无序的氨基酸可以在N-末端截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个残基和在C-末端截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基，而不必然改变配体结合。示例性ActRIIA细胞外结构域截短物包括SEQ ID NO:12。
因此，ActRIIA的活性部分(例如，配体结合)的通式是包含下列，基本上由下列组成，或由下列组成的多肽：SEQ ID NO:9的氨基酸30-110。因此，ActRIIA多肽可以例如包含与ActRIIA的部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述ActRIIA的部分起始于对应于SEQ ID NO:9的氨基酸21-30中任一个的残基且终止于对应于SEQ ID NO:9的氨基酸110-135中任一个的位置。其它实例包括这样的构建体，其起始于选自SEQ ID NO:9的21-30、22-30、23-30、24-30的位置，且终止于选自SEQ ID NO:9的111-135、112-135、113-135、120-135、130-135、111-134、111-133、111-132或111-131的位置。还考虑在这些范围内的变体，特别是包含与SEQ ID NO:9的相应部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的那些。因此，在一些实施方案中，ActRIIA多肽可以包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。任选地，ActRIIA多肽包含与SEQ IDNO:9的氨基酸30-110至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同且在配体结合口袋中包含不超过1、2、5、10或15个保守氨基酸变化的多肽。
在某些方面，根据本文所公开的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂是ActRIIA多肽(其包括其片段和功能变体)或包含至少一个ActRIIA多肽的蛋白复合物(例如，包含两个ActRIIA多肽的同型二聚体或包含一个ActRIIA多肽和一个异源多肽(例如，ALK4)的异源二聚体)。优选地，ActRIIA多肽是可溶性的(例如，ActRIIA的细胞外结构域)。在一些实施方案中，ActRIIA多肽抑制一种或多种激活素和/或GDF配体[例如，GDF11、GDF8、激活素(激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad 2和Smad 3等]的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，ActRIIA多肽结合一种或多种激活素和/或GDF配体[例如，GDF11、GDF8、激活素(激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad 2和Smad 3等]。在一些实施方案中，本公开的ActRIIA多肽包含与ActRIIA的部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述ActRIIA的部分起始于对应于SEQ ID NO:9的氨基酸21-30的残基并终止于对应于SEQIDNO:9的任一氨基酸110-135的位置。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO:9的氨基酸21-135至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ActRIIA多肽包含与SEQ ID NO:9、10、11、12、15、18-24、177、178和180中任一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些方面，本公开涉及包含BMPRII多肽的异源多聚体。如本文所用，术语“BMPRII”是指来自任何物种的骨形成蛋白受体II型(BMPRII)蛋白家族以及通过诱变或其它修饰衍生自此类BMPRII蛋白的变体。本文提及BMPRII应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。BMPRII家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“BMPRII多肽”包括包含BMPRII家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有BMPRII-相关多肽的氨基酸编号基于人BMPRII前体蛋白序列(SEQ ID NO:34,NCBI Ref SeqNP_001195.2)的编号，除非另外特别指出。在SEQ ID NO:34中，信号肽由单下划线指示并且细胞外结构域以粗体字指示。编码BMPRII前体蛋白的核酸序列显示在SEQ ID NO:35中，作为Genbank参考序列NM_001204.6的核苷酸1149-4262。经加工的细胞外BMPRII多肽序列在SEQ ID NO:36中给出，其可由SEQ ID NO:37的核酸序列编码。BMPRII的可选同种型，同种型2(GenBank:AAA86519.1)在SEQ ID NO:38(信号肽由单下划线指示，且细胞外结构域以粗体字指示)中给出，其可由SEQ ID NO:39的核酸序列(对应于Genbank参考序列U25110.1的核苷酸163-1752,信号序列加下划线)编码。经加工的细胞外BMPRII多肽序列(同种型2)在SEQID NO:40中给出，其可由SEQ ID NO:41的核酸序列编码。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种BMPRII多肽的异源多聚体，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的BMPRII多肽(例如，包含BMPRII多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，BMPRII的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的BMPRII多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:34、36、38或40的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与起始于SEQ ID NO:34的27-34的氨基酸(例如，氨基酸残基27、28、29、30、31、32、33或34)中的任一个且终止于SEQ ID NO:34的氨基酸123-150(例如，氨基酸残基123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:34的27-123的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:34的27-150的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:34的34-123的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:34的34-150的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与起始于SEQ ID NO:38的27-34的氨基酸(例如，氨基酸残基27、28、29、30、31、32、33或34)中的任一个且终止于SEQ ID NO:38的氨基酸123-150(例如，氨基酸残基123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:38的27-123的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:38的27-150的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:38的34-123的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个BMPRII多肽，所述BMPRII多肽与SEQ ID NO:38的34-150的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些方面，本公开涉及包含MISRII多肽的异源多聚体。如本文所用，术语“MISRII”是指来自任何物种的缪勒管抑制物质受体II型(MISRII)蛋白家族，和通过诱变或其它修饰衍生自此类MISRII蛋白的变体。本文提及MISRII应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。MISRII家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“MISRII多肽”包括包含MISRII家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有MISRII-相关多肽的氨基酸编号基于人MISRII前体蛋白序列(SEQ ID NO:42,NCBI Ref SeqNP_065434.1)的编号，除非另外特别指出。在SEQ ID NO:42中，信号肽由单下划线指示并且细胞外结构域以粗体字指示。编码MISRII前体蛋白的核酸序列显示在SEQ ID NO:43中，对应于Genbank参考序列NM_020547.2的核苷酸81-1799。经加工的细胞外MISRII多肽序列(同种型1)在SEQ ID NO:44中给出，其可由SEQ ID NO:45的核酸序列编码。人MISRII前体蛋白序列的可选同种型，即同种型2(NCBI Ref Seq NP_001158162.1)，在SEQ ID NO:46(信号肽由单下划线指示，且细胞外结构域以粗体字指示)中给出，其可由SEQ ID NO:47的核酸序列(对应于Genbank参考序列NM_001164690.1的核苷酸81-1514)编码。经加工的细胞外MISRII多肽序列(同种型2)与相应的经加工的细胞外MISRII多肽序列(同种型1)(即，具有SEQ IDNO:44的氨基酸序列，其可由SEQ ID NO:45的核酸序列编码)100％相同。人MISRII前体蛋白序列的可选同种型,即同种型3(NCBI Ref Seq NP_001158163.1)，在SEQ ID NO:48(信号肽由单下划线指示，且细胞外结构域以粗体字指示)中给出，其可由SEQ ID NO:49的核酸序列(对应于Genbank参考序列NM_001164691.1的核苷酸81-1514)编码。信号序列加下划线。经加工的细胞外MISRII多肽序列(同种型3)与相应的经加工的细胞外MISRII多肽序列(同种型1)(即，具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列，其可由SEQ ID NO:45的核酸序列编码)100％相同。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种MISRII多肽的异源多聚体，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的MISRII多肽(例如，包含MISRII多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，MISRII的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的MISRII多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:42、44、46或48的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与起始于SEQ ID NO:42的17-24的氨基酸(例如，氨基酸残基17、18、19、20、21、22、23或24)中的任一个且终止于SEQ ID NO:42的氨基酸116-149(例如，氨基酸残基116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:42的17-116的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:42的17-149的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:42的24-116的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:42的24-149的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与起始于SEQ ID NO:46的17-24的氨基酸(例如，氨基酸残基17、18、19、20、21、22、23或24)中的任一个且终止于SEQ ID NO:46的氨基酸116-149(例如，氨基酸残基116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:46的17-116的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:46的17-149的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQID NO:46的24-116的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:46的24-149的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与起始于SEQID NO:42的17-24的氨基酸(例如，氨基酸残基17、18、19、20、21、22、23或24)中的任一个且终止于SEQ ID NO:48的氨基酸116-149(例如，氨基酸残基116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148或149)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:48的17-116的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:48的17-149的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:48的24-116的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个MISRII多肽，所述MISRII多肽与SEQ ID NO:48的24-149的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些方面，本公开涉及包含ALK1多肽的异源多聚体。如本文所用，术语“ALK1”是指来自任何物种的激活素受体样激酶-1蛋白家族，和通过诱变或其它修饰衍生自此类ALK1蛋白的变体。本文提及ALK1应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ALK1家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ALK1多肽”包括包含ALK1家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有ALK1-相关多肽的氨基酸编号基于人ALK1前体蛋白序列(SEQ ID NO:52,NCBI Ref Seq NP_000011.2)的编号，除非另外特别指出。在SEQ ID NO:52中，信号肽由单下划线指示并且细胞外结构域以粗体字指示。编码人ALK1前体蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:53中给出，对应于Genbank参考序列NM_000020.2的核苷酸284-1792。经加工的细胞外ALK1多肽序列在SEQID NO:54中给出，其可由SEQ ID NO:55的核酸序列编码。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种ALK1多肽的异源多聚体，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的ALK1多肽(例如，包含ALK1多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，ALK1的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的ALK1多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK1多肽，所述ALK1多肽与SEQ ID NO:52或54的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK1多肽，所述ALK1多肽与起始于SEQ IDNO:52的22-34的氨基酸(例如，氨基酸残基22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34)中的任一个且终止于SEQ ID NO:52的氨基酸95-118(例如，氨基酸残基95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK1多肽，所述ALK1多肽与SEQ ID NO:52的22-95的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK1多肽，所述ALK1多肽与SEQ ID NO:52的22-118的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK1多肽，所述ALK1多肽与SEQ ID NO:52的34-95的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK1多肽，所述ALK1多肽与SEQ ID NO:52的34-118的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些方面，本公开涉及包含ALK4多肽的异源多聚体。如本文所用，术语“ALK4”是指来自任何物种的激活素受体样激酶-4蛋白家族，和通过诱变或其它修饰衍生自此类ALK4蛋白的变体。本文提及ALK4应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ALK4家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ALK4多肽”包括包含ALK4家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有ALK4-相关多肽的氨基酸编号基于人ALK4前体蛋白序列(SEQ ID NO:56,NCBI Ref Seq NP_004293)的编号，除非另外特别指出。在SEQ ID NO:56中，信号肽由单下划线指示并且细胞外结构域以粗体字指示。编码ALK4前体蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:57中给出，对应于Genbank参考序列NM_004302.4的核苷酸78-1592。信号序列加下划线并且细胞外结构域以粗体字指示。经加工的细胞外ALK4多肽序列在SEQ ID NO:58中给出，其可由SEQ ID NO:59的核酸序列编码。人ALK4前体蛋白序列的可选同种型，即同种型C(NCBI Ref Seq NP_064733.3)，在SEQ ID NO:60中给出，其中信号肽由单下划线指示，且细胞外结构域以粗体字指示。编码ALK4前体蛋白(同种型C)的核酸序列在SEQ ID NO:61中给出，对应于Genbank参考序列NM_020328.3的核苷酸78-1715。经加工的细胞外ALK4多肽序列(同种型C)与相应的经加工的细胞外ALK4多肽序列(即，具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列，其可由SEQ ID NO:59的核酸序列编码)100％相同。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种ALK4多肽的异源多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的ALK4多肽(例如，包含ALK4多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，ALK4的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的ALK4多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:56、58或60的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与起始于SEQ ID NO:56的24-34的氨基酸(例如，氨基酸残基24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34)中的任一个且终止于SEQ ID NO:56的氨基酸101-126(例如，氨基酸残基101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:56的24-101的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:56的24-126的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:56的34-101的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:56的34-126的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与起始于SEQ ID NO:83的24-34的氨基酸(例如，氨基酸残基24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34)中的任一个且终止于SEQ ID NO:60的氨基酸101-126(例如，氨基酸残基101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:60的24-101的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:60的24-126的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:60的34-101的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:60的34-126的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些方面，本公开涉及包含ALK5多肽的异源多聚体。如本文所用，术语“ALK5”是指来自任何物种的激活素受体样激酶-5蛋白家族，和通过诱变或其它修饰衍生自此类ALK5蛋白的变体。本文提及ALK5应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ALK5家族的成员通常是跨膜蛋白，其具有包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域。
术语“ALK5多肽”包括包含ALK5家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有ALK5-相关多肽的氨基酸编号基于人ALK5前体蛋白序列(SEQ ID NO:62,NCBI Ref Seq NP_004603.1)的编号，除非另外特别指出。在SEQ ID NO:62中，信号肽由单下划线指示并且细胞外结构域以粗体字指示。编码ALK5前体蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:63中给出，对应于Genbank参考序列NM_004612.2的核苷酸77-1585。经加工的细胞外ALK5多肽序列在SEQ IDNO:64中给出，其可由SEQ ID NO:65的核酸序列编码。人ALK5前体蛋白序列的可选同种型，即同种型2(NCBI RefSeq XP_005252207.1)，在SEQ ID NO:66(信号肽由单下划线指示，且细胞外结构域以粗体字指示)中给出。编码人ALK5前体蛋白(同种型2)的核酸序列在SEQ IDNO:67(信号肽由单下划线指示，且细胞外结构域以粗体字指示)中给出，对应于Genbank参考序列XM_005252150.1的核苷酸77-1597。经加工的细胞外ALK5多肽序列(同种型2)在SEQID NO:68中给出，其可由SEQ ID NO:69的核酸序列编码。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种ALK5多肽的异源多聚体，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的ALK5多肽(例如，包含ALK5多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，ALK5的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的ALK5多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ ID NO:62、64、66或68的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与起始于SEQ ID NO:62的25-36的氨基酸(例如，氨基酸残基25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36)中的任一个且终止于SEQ ID NO:62的氨基酸101-126(例如，氨基酸残基101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112,113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ ID NO:62的25-101的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ IDNO:62的25-126的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ ID NO:62的36-101的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ ID NO:62的36-126的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一种ALK5多肽，所述ALK5多肽与起始于SEQ ID NO:66的25-36的氨基酸(例如，氨基酸残基25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36)中的任一个且终止于SEQ ID NO:66的氨基酸101-130(例如，氨基酸残基101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112,113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％.92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ IDNO:66的25-101的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ ID NO:66的25-130的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ ID NO:66的36-101的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK5多肽，所述ALK5多肽与SEQ ID NO:66的36-130的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些方面，本公开涉及包含ALK7多肽的异源多聚体。如本文所用，术语“ALK7”是指来自任何物种的激活素受体样激酶-7蛋白家族，和通过诱变或其它修饰衍生自此类ALK7蛋白的变体。本文提及ALK7应理解为提及任何一种目前鉴定的形式。ALK7家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富含半胱氨酸的区域的配体-结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ALK7多肽”包括包含ALK7家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有ALK7-相关多肽的氨基酸编号基于人ALK7前体蛋白序列(SEQ ID NO:70,NCBI Ref Seq NP_660302.2)的编号，除非另外特别指出。在SEQ ID NO:70中，信号肽由单下划线指示并且细胞外结构域以粗体字指示。编码人ALK7同种型1前体蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:71中给出，对应于Genbank参考序列NM_145259.2的核苷酸244-1722。经加工的细胞外ALK7同种型1多肽序列在SEQ ID NO:72中给出，其可由SEQ ID NO:73的核酸序列编码。人ALK7的可选同种型，即同种型2(NCBI Ref Seq NP_001104501.1)的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:74，其中细胞外结构域以粗体字指示。编码所述经加工的ALK7多肽(同种型2)的核酸序列在SEQID NO:75中给出，对应于NCBI参考序列NM_001111031.1的核苷酸279-1607。细胞外ALK7多肽(同种型2)的氨基酸序列在SEQ ID NO:76中给出，其可由SEQ ID NO:77的核酸序列编码。可选的人ALK7前体蛋白，即同种型3(NCBI Ref Seq NP_001104502.1)的氨基酸序列在SEQID NO:78中给出，其中信号肽以单下划线指示。编码未加工的ALK7多肽前体蛋白(同种型3)的核酸序列在SEQ ID NO:79中给出，对应于NCBI参考序列NM_001111032.1的核苷酸244-1482。信号序列由实下划线指示。经加工的ALK7多肽(同种型3)的氨基酸序列在SEQ ID NO:80中给出。此同种型缺少跨膜结构域并且因此被认为其整体是可溶性的(Roberts等人,2003,Biol Reprod 68:1719-1726)。SEQ ID NO:80的N-末端变体预测如下。编码经加工的ALK7多肽(同种型3)的核酸序列在SEQ ID NO:81中给出。可选的人ALK7前体蛋白,即同种型4(NCBI Ref Seq NP_001104503.1)的氨基酸序列在SEQ ID NO:82中给出，其中信号肽由单 下划线指示。编码未加工的ALK7多肽前体蛋白(同种型4)的核酸序列在SEQ ID NO:83中给出，对应于NCBI参考序列NM_001111033.1的核苷酸244-1244。信号序列由实下划线指示。经加工的ALK7多肽(同种型4)的氨基酸序列在SEQ ID NO:84中给出。如ALK7同种型3一样，同种型4缺少跨膜结构域并且因此被认为其整体是可溶性的(Roberts等人,2003,BiolReprod 68:1719-1726)。编码经加工的ALK7多肽(同种型4)的核酸序列在SEQ ID NO:85中给出。
基于大鼠全长ALK7(同种型1)的信号序列(参见NCBI参考序列NP_620790.1)以及人和大鼠ALK7之间的高度序列同一性，预测人ALK7同种型1的经加工形式在SEQ ID NO:86中给出。
预测经加工的ALK7同种型1的有活性变体，其中SEQ ID NO:72在N-末端被截短1、2、3、4、5、6或7个氨基酸，且SEQ ID NO:86在N-末端被截短1或2个氨基酸。与SEQ ID NO:86一致,进一步预期在人ALK7同种型3(SEQ ID NO:80)和人ALK7同种型4(SEQ ID NO:84)的经加工形式中亮氨酸是N-末端氨基酸。在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一个ALK7多肽的异源多聚体，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的ALK7多肽(例如，包含ALK7多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，ALK7的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的ALK7多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:70、72、74、76、78、80、82、84或86的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与起始于SEQ ID NO:70的21-28的氨基酸(例如，氨基酸残基21、22、23、24、25、26、27或28)中的任一个且终止于SEQ ID NO:70的氨基酸92-113(例如，氨基酸残基92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或113)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％.92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:70的21-92的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ IDNO:70的21-113的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:70的28-92的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:70的28-113的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与起始于SEQ ID NO:74的1-13的氨基酸(例如，氨基酸残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13)中的任一个且终止于SEQ ID NO:74的氨基酸42-63(例如，氨基酸残基42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％.92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:74的1-42的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:74的1-63的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:74的13-42的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:74的13-63的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与起始于SEQ ID NO:78的21-28的氨基酸(例如，氨基酸残基21、22、23、24、25、26、27或28)中的任一个且终止于SEQ ID NO:78的氨基酸411-413(例如，氨基酸残基411、412或413)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％.92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:78的21-411的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:78的21-413的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:78的28-411的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:78的28-413的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与起始于SEQ ID NO:82的21-28的氨基酸(例如，氨基酸残基21、22、23、24、25、26、27或28)中的任一个且终止于SEQ ID NO:82的氨基酸334-336(例如，氨基酸残基334、335或336)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％.92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:82的21-334的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:82的21-336的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:82的28-334的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个ALK7多肽，所述ALK7多肽与SEQ ID NO:82的28-336的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
术语“Cripto-1多肽”包括包含任何天然存在的Cripto-1蛋白(由TDGF1或其非人直系同源物中之一编码)以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有Cripto-1多肽的氨基酸编号基于人Cripto-1前体蛋白序列(SEQ ID NO:87,NCBI RefSeq NP_003203.1)的编号，除非另外特别指出。信号肽由单 下划线指示。编码未加工的人Cripto-1同种型1前体蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:88中给出，对应于NCBI参考序列NM_003212.3的核苷酸385-948。信号序列加下划线。经加工的Cripto-1同种型1多肽序列在SEQ ID NO:89中给出，其可由SEQ ID NO:90的核酸序列编码。人Cripto-1同种型2蛋白序列(NCBI RefSeq NP_001167607.1)在SEQ ID NO:91中给出，其可由SEQ ID NO:92的核酸序列编码，对应于NCBI参考序列NM_001174136.1的核苷酸43-558。经加工的Cripto-1多肽序列(同种型2)在SEQ ID NO:93中给出，其可由SEQ ID NO:94的核酸序列编码。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种Cripto-1多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的Cripto-1多肽(例如，包含Cripto-1多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，Cripto-1的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的Cripto-1多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:87、89、91或93的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与起始于SEQ ID NO:87的31-82的氨基酸(例如，氨基酸残基31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81或82)中的任一个且终止于SEQ ID NO:87的氨基酸172-188(例如，氨基酸残基172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187或188)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:87的31-188的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQID NO:87的63-172的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:87的82-172的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:87的82-188的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:87的31-172的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:87的63-188的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与起始于SEQ ID NO:91的15-66的氨基酸(例如，氨基酸残基15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66)中的任一个且终止于SEQ ID NO:91的氨基酸156-172(例如，氨基酸残基156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171或172)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:91的15-172的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQID NO:91的47-172的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:91的47-156的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:91的66-165的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:91的15-156的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cripto-1多肽，所述Cripto-1多肽与SEQ ID NO:91的66-172的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
术语“Cryptic多肽”包括包含任何天然存在的Cryptic蛋白(由CFC1或其非人直系同源物中之一编码)以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有Cryptic多肽的氨基酸编号基于人Cryptic同种型1前体蛋白序列(SEQ ID NO:95,NCBI RefSeq NP_115934.1)的编号，除非另外特别指出。信号肽由单 下划线指示。编码未加工的人Cryptic同种型1前体蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:96中给出，对应于NCBI参考序列NM_032545.3的核苷酸289-957。信号序列加下划线。经加工的Cryptic同种型1多肽序列在SEQ ID NO:97中给出，其可由SEQ ID NO:98的核酸序列编码。人Cryptic同种型2前体蛋白序列(NCBI RefSeq NP_001257349.1)在SEQ ID NO:99中给出。信号肽由单下划线指示。编码未加工的人Cryptic同种型2前体蛋白的核酸序列在SEQ IDNO:100中给出，对应于NCBI参考序列NM_001270420.1的核苷酸289-861。信号序列加下划 线。经加工的Cryptic同种型2多肽序列在SEQ ID NO:101中给出，其可由SEQ ID NO:102的核酸序列编码。人Cryptic同种型3前体蛋白序列(NCBI Ref Seq NP_001257350.1)在SEQID NO:103中给出。信号肽由单下划线指示。编码未加工的人Cryptic同种型3前体蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:104中给出，对应于NCBI参考序列NM_001270421.1的核苷酸289-732。信号序列加下划线。经加工的Cryptic同种型3多肽序列在SEQ ID NO:105中给出，其可由SEQ ID NO:106的核酸序列编码。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种Cryptic多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的Cryptic多肽(例如，包含Cryptic多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，Cryptic的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的Cryptic多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:95、97、99、101、103或105的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与起始于SEQ ID NO:95的26-90的氨基酸(例如，氨基酸残基26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90)中的任一个且终止于SEQ IDNO:95的氨基酸157-233(例如，氨基酸残基157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、126、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232或233)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:95的26-233的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:95的26-157的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:95的90-157的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:95的26-169的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:95的90-169的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:95的90-233的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:95的26-82的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与起始于SEQ ID NO:99的26-30的氨基酸(例如，氨基酸残基26、27、28、29或30)中的任一个且终止于SEQ ID NO:99的氨基酸82-191(例如，氨基酸残基82、83、84、85、86、57、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190或191)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:99的26-82的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:99的26-191的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:99的30-82的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:99的30-191的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与起始于SEQ ID NO:103的26-30的氨基酸(例如，氨基酸残基26、27、28、29或30)中的任一个且终止于SEQ ID NO:103的氨基酸82-148(例如，氨基酸残基82、83、84、85、86、57、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147或148)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:103的26-148的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:103的26-82的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:103的30-148的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic多肽，所述Cryptic多肽与SEQ ID NO:103的30-82的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
术语“Cryptic家族蛋白1B多肽”(Cryptic 1B)包括包含任何天然存在的Cryptic家族蛋白1B蛋白(由CFC1B或其非人直系同源物中之一编码)以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。本文所述的所有Cryptic家族蛋白1B多肽的氨基酸编号基于人Cryptic家族蛋白1B前体蛋白序列(SEQ ID NO:107,NCBI RefSeq NP_001072998.1,信号肽由单下划线指示)的编号，除非另外特别指出。编码未加工的人Cryptic家族蛋白1B前体蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:108中给出，对应于NCBI参考序列NM_001079530.1的核苷酸392-1060。信号序列加下划线。经加工的Cryptic家族蛋白1B多肽序列在SEQ ID NO:109中给出，其可由SEQ ID NO:110的核酸序列编码。
在某些实施方案中，本公开涉及包含至少一种Cryptic家族蛋白1B多肽的异源多聚体，所述Cryptic家族蛋白1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开的发明使用的Cryptic家族蛋白1B多肽(例如，包含Cryptic家族蛋白1B多肽的异源多聚体及其用途)是可溶性的(例如，Cryptic家族蛋白1B的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开的发明使用的Cryptic家族蛋白1B多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic家族蛋白1B多肽，所述Cryptic家族蛋白1B多肽与SEQ ID NO:107或109的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic家族蛋白1B多肽，所述Cryptic家族蛋白1B多肽与起始于SEQ ID NO:107的26-30的氨基酸(例如，氨基酸残基26、27、28、29或30)中的任一个且终止于SEQ ID NO:107的氨基酸82-223(例如，氨基酸残基82、83、84、85、86、57、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、126、217、218、219、220、221、222或223)中的任一个的多肽至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic家族蛋白1B多肽，所述Cryptic家族蛋白1B多肽与SEQ ID NO:107的26-223的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic家族蛋白1B多肽，所述Cryptic家族蛋白1B多肽与SEQ ID NO:107的26-82的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic家族蛋白1B多肽，所述Cryptic家族蛋白1B多肽与SEQ ID NO:107的30-82的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic家族蛋白1B多肽，所述Cryptic家族蛋白1B多肽与SEQ ID NO:107的30-223的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic家族蛋白1B多肽，所述Cryptic家族蛋白1B多肽与SEQ ID NO:107的26-169的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体包含至少一个Cryptic家族蛋白1B多肽，所述Cryptic家族蛋白1B多肽与SEQ IDNO:107的30-169的氨基酸至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些方面，本公开涉及包含至少两个ALK4多肽的同型多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种ALK4多肽)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK4同型多聚体是同型二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少两个ALK5多肽的同型多聚体，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种ALK5多肽)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK5同型多聚体是同型二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少两个ALK7多肽的同型多聚体，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种ALK7多肽)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK7同型多聚体是同型二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少两个ActRIIA多肽的同型多聚体，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种ActRIIA多肽)。在某些优选的实施方案中,本公开的ActRIIA同型多聚体是同型二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少两个ActRIIB多肽的同型多聚体，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种ActRIIB多肽)。在某些优选的实施方案中,本公开的ActRIIB同型多聚体是同型二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少两个Cripto-1多肽的同型多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种Cripto-1多肽)。在某些优选的实施方案中,本公开的Cripto-1同型多聚体是同型二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少两个Cryptic多肽的同型多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种Cryptic多肽)。在某些优选的实施方案中,本公开的Cryptic同型多聚体是同型二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少两个Cryptic 1B多肽的同型多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种Cryptic 1B多肽)。在某些优选的实施方案中,本公开的Cryptic 1B同型多聚体是同型二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK1多肽和至少一个ActRIIB多肽的异源多聚体，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK1:ActRIIB异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK4多肽和至少一个ActRIIB多肽的异源多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK4:ActRIIB异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK5多肽和至少一个ActRIIB多肽的异源多聚体，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK5:ActRIIB异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK7多肽和至少一个ActRIIB多肽的异源多聚体，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK7:ActRIIB异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK1多肽和至少一个ActRIIA多肽的异源多聚体，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK1:ActRIIA异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK4多肽和至少一个ActRIIA多肽的异源多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK4:ActRIIA异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK5多肽和至少一个ActRIIA多肽的异源多聚体，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK5:ActRIIA异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK7多肽和至少一个ActRIIA多肽的异源多聚体，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK7:ActRIIA异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK4多肽和至少一个BMPRII多肽的异源多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK4:BMPRII异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK5多肽和至少一个BMPRII多肽的异源多聚体，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK5:BMPRII异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK7多肽和至少一个BMPRII多肽的异源多聚体，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK7:BMPRII异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK4多肽和至少一个MISRII多肽的异源多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK4:MISRII异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK5多肽和至少一个MISRII多肽的异源多聚体，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK5:MISRII异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK7多肽和至少一个MISRII多肽的异源多聚体，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK7:MISRII异源多聚体复合物是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK1多肽和至少一个ALK4多肽的异源多聚体，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK1:ALK4异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK1多肽和至少一个ALK5多肽的异源多聚体，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK1:ALK5异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK1多肽和至少一个ALK7多肽的异源多聚体，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK1:ALK7异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK4多肽和至少一个ALK5多肽的异源多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK4:ALK5异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK4多肽和至少一个ALK7多肽的异源多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK4:ALK7异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ALK5多肽和至少一个ALK7多肽的异源多聚体，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ALK5:ALK7异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ActRIIA多肽和至少一个ActRIIB多肽的异源多聚体，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ActRIIA:ActRIIB异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ActRIIA多肽和至少一个BMPRII多肽的异源多聚体，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ActRIIA:BMPRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ActRIIA多肽和至少一个MISRII多肽的异源多聚体，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ActRIIA:MISRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ActRIIB多肽和至少一个BMPRII多肽的异源多聚体，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ActRIIB:BMPRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个ActRIIB多肽和至少一个MISRII多肽的异源多聚体，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,本公开的ActRIIB:MISRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个ALK1多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:ALK1异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个ALK4多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:ALK4异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个ALK5多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:ALK5异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个ALK7多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:ALK7异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个ALK1多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic:ALK1异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个ALK4多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic:ALK4异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个ALK5多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic:ALK5异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个ALK7多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic:ALK7异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic 1B多肽和至少一个ALK1多肽的异源多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic 1B:ALK1异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic 1B多肽和至少一个ALK4多肽的异源多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic 1B:ALK4异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic 1B多肽和至少一个ALK5多肽的异源多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK5多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic 1B:ALK5异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic 1B多肽和至少一个ALK7多肽的异源多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ALK7多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic 1B:ALK7异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个ActRIIA多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:ActRIIA异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个ActRIIB多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:ActRIIB异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个BMPRII多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:BMPRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个MISRII多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:MISRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个ActRIIA多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic多肽:ActRIIA异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个ActRIIB多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic多肽:ActRIIB异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个BMPRII多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic多肽:BMPRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个MISRII多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic多肽:MISRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic 1B多肽和至少一个ActRIIA多肽的异源多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIA多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic 1B:ActRIIA异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic 1B多肽和至少一个ActRIIB多肽的异源多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic 1B:ActRIIB异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic 1B多肽和至少一个BMPRII多肽的异源多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述BMPRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic 1B:BMPRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic 1B多肽和至少一个MISRII多肽的异源多聚体，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述MISRII多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cryptic 1B:MISRII异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个Cryptic多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:Cryptic异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cripto-1多肽和至少一个Cryptic 1B多肽的异源多聚体，所述Cripto-1多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在一些实施方案中,本公开的Cripto-1:Cryptic 1B异源多聚体是异源二聚体。
在某些方面，本公开涉及包含至少一个Cryptic多肽和至少一个Cryptic 1B多肽的异源多聚体，所述Cryptic多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)，所述Cryptic 1B多肽包括其片段、功能变体和修饰形式(例如，本文所述的任一种)。在某些优选的实施方案中,Cryptic多肽:Cryptic 1B异源多聚体是可溶性的。在一些实施方案中，本公开的Cryptic多肽:Cryptic 1B异源多聚体是异源二聚体。
在一些实施方案中，本公开考虑了为了例如增强治疗功效或稳定性(例如，保存期限和抵抗体内蛋白水解降解)的目的，通过修饰TGF-β超家族I型受体多肽(例如，ALK1、ALK4、ALK5和ALK7)、TGF-β超家族II型受体多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、BMPRII和MISRII)和/或TGF-β超家族辅助受体(例如，Cripto-1、Cryptic和Cryptic 1B)的结构来制备功能变体。变体可通过氨基酸置换、缺失、添加或其组合产生。例如，合理的是预期单独置换亮氨酸为异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸为谷氨酸、苏氨酸为丝氨酸或类似置换氨基酸为结构相关的氨基酸(例如，保守突变)对得到的分子的生物学活性将不具有显著影响。保守置换是在其侧链上相关的氨基酸家族内发生的那些。本公开的多肽的氨基酸序列的变化是否产生功能同源物可通过评价变体多肽在细胞中以类似于野生型多肽的方式产生反应，或结合一种或多种TGF-β超家族配体的能力来容易地确定，所述TGF-β超家族配体包括例如，GDF3、GDF5、GDF1、GDF8、GDF11、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素AE、激活素BC、激活素BE、Nodal。
在某些实施方案中，本公开考虑了本公开的TGF-β超家族I型受体多肽(例如，ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6和ALK7)、TGF-β超家族II型受体多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、BMPRII和MISRII)和/或TGF-β超家族辅助受体多肽(例如，内皮糖蛋白、β聚糖、Cripto-1、Cryptic、Cryptic 1B、CRIM1、CRIM2、BAMBI、BMPER、RGM-A、RGM-B和铁调素调节蛋白(hemojuvelin))的特定突变以改变多肽的糖基化。此类突变可经选择，以引入或消除一个或多个糖基化位点，例如O-连接或N-连接的糖基化位点。天冬酰胺-连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列，天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬酰胺-X-丝氨酸(其中“X”是任何氨基酸)，其被合适的细胞糖基化酶特异性识别。还可通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至多肽的序列或通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基置换多肽的序列进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置中的一个或两个处的各种氨基酸置换或缺失(和/或第二位置处的氨基酸缺失)，导致在修饰的三肽序列处非糖基化。增加多肽上的糖部分的数量的另一方法是通过糖苷化学或酶促偶联至多肽。根据使用的偶联模式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离的羧基；(c)游离的巯基，例如半胱氨酸的那些；(d)游离的羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些；(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。除去多肽上存在的一个或多个糖部分可经化学和/或酶促实现。化学去糖基化可包括例如，将多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效的化合物。这种处理导致大部分或所有的糖裂解(除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)之外)，同时保留氨基酸序列完整。多肽上糖部分的酶促裂解可通过使用各种内切和外切糖苷酶实现，如Thotakura等人[Meth.Enzymol.(1987)138:350]所述。在合适时，多肽的序列可根据使用的表达***的类型调整，原因在于，哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞都可能引入可受所述肽的氨基酸序列影响的不同糖基化模式。通常，在人中使用的本公开的异源多聚体可在提供合适糖基化的哺乳动物细胞系中表达，所述哺乳动物细胞系诸如HEK293或CHO细胞系，尽管预期也可使用其它哺乳动物表达细胞系。
本公开进一步考虑了产生本公开的TGF-β超家族I型受体多肽(例如，ALK1、ALK2、ALK3、ALK4、ALK5、ALK6和ALK7)、TGF-β超家族II型受体多肽(例如，ActRIIA、ActRIIB、BMPRII和MISRII)和/或TGF-β超家族辅助受体多肽(例如，内皮糖蛋白、β聚糖、Cripto-1、Cryptic、Cryptic 1B、CRIM1、CRIM2、BAMBI、BMPER、RGM-A、RGM-B和铁调素调节蛋白)的突变体(特别是组合突变体组，以及截短突变体)的方法。组合突变体的库可特别用于鉴定功能活性的(例如，配体结合)TGF-β超家族I型受体、TGF-β超家族II型受体和/或TGF-β超家族辅助受体序列。筛选此类组合文库的目的可以是产生例如，具有改变的性质(例如改变的药代动力学或改变的配体结合)的多肽变体。各种筛选测定法在下文提供，且此类测定法可用于评价变体。例如，可筛选TGF-β辅助受体变体结合TGF-β超家族配体(例如，BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素AE、激活素BC、激活素BE、nodal、胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(neurturin)、artemin、persephin、MIS和Lefty)、阻止TGF-β超家族配体与TGF-β超家族辅助受体结合和/或干扰由TGF-β超家族配体引起的信号传导的能力。
本公开的TGF-β超家族受体多肽(包括其异源多聚体和同型多聚体)的活性也可以在例如基于细胞的测定法中或体内测定法中测试。例如，可评价TGF-β超家族受体多肽对参与肌细胞中的肌肉生产的基因的表达或蛋白的活性的影响。按需要，这可在一种或多种重组TGF-β超家族配体蛋白(例如，BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素AE、激活素BC、激活素BE、nodal、胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、神经生长因子、artemin、persephin、MIS和Lefty)的存在下进行，且细胞可经转染，以产生TGF-β超家族受体多肽，和任选地，TGF-β超家族配体。同样地，本公开的TGF-β超家族受体多肽可施用于小鼠或其它动物，可使用本领域公认的方法评价一种或多种度量例如肌肉形成和强度。类似地，异源多聚体或其变体的活性可在成骨细胞、脂肪细胞和/或神经元细胞中测试对这些细胞的生长的任何影响，例如，通过本文所述的测定法和本领域常识的那些。SMAD-响应报告基因可在此类细胞系中用于监测对下游信号传导的效应。
可产生组合来源的变体，相对于参照TGF-β超家族受体多肽，其具有增加的选择性或普遍增加的效力。此类变体，当从重组DNA构建体表达时，可用于基因治疗方案。同样地，诱变可产生变体，其具有显著不同于相应的未修饰的TGF-β超家族受体多肽的细胞内半衰期。例如，可以使得改变的蛋白对蛋白水解降解或导致未修饰多肽的破坏或以其它方式失活的其它细胞过程更稳定或更不稳定。此类变体和编码它们的基因，可通过调节多肽的半衰期，用于改变多肽复合物水平。例如，短的半衰期可产生更短暂的生物学效应，并且当作为诱导型表达***的一部分时，可允许更紧密控制细胞内的重组多肽复合物水平。在Fc融合蛋白中，可在接头(如果有的话)和/或Fc部分中进行突变以改变TGF-β超家族受体多肽的一种或多种活性，例如，免疫原性、半衰期和溶解度。
组合文库可通过编码多肽文库的简并基因文库产生，所述多肽各自至少包括潜在的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽序列的一部分。例如，合成的寡核苷酸的混合物可经酶促连接至基因序列，使得潜在的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体编码核苷酸序列的简并组可作为个体多肽表达，或者，可选地，作为较大的融合蛋白组表达(例如，对于噬菌体展示)。
存在许多可从简并寡核苷酸序列产生潜在的同源物的文库的方法。简并基因序列的化学合成可在自动DNA合成仪中进行，且合成的基因然后可连接至合适的载体用于表达。简并寡核苷酸的合成是本领域众所周知的。参见，例如，Narang，SA(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等人(1981)Recombinant DNA，Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，ed.AG Walton，Amsterdam:Elsevier pp273-289；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura等人(1984)Science 198:1056；和Ike等人(1983)Nucleic Acid Res.11:477。此类技术已经用于其它蛋白的定向进化。参见，例如，Scott等人，(1990)Science249:386-390；Roberts等人(1992)PNAS USA 89:2429-2433；Devlin等人(1990)Science 249:404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS USA 87:6378-6382；以及美国专利号:5,223,409、5,198,346和5,096,815。
可选地，其它形式的诱变可用于产生组合文库。例如，本公开的异源多聚体可通过下述进行筛选而从文库产生和分离：所述筛选使用例如，丙氨酸扫描诱变[参见，例如，Ruf等人(1994)Biochemistry33:1565-1572；Wang等人(1994)J.Biol.Chem.269:3095-3099；Balint等人(1993)Gene 137:109-118；Grodberg等人(1993)Eur.J.Biochem.218:597-601；Nagashima等人(1993)J.Biol.Chem.268:2888-2892；Lowman等人(1991)Biochemistry 30:10832-10838；和Cunningham等人(1989)Science 244:1081-1085]，通过接头扫描诱变[参见，例如，Gustin等人(1993)Virology 193:653-660；和Brown等人(1992)Mol.CellBiol.12:2644-2652；McKnight等人(1982)Science 232:316]，通过饱和诱变[参见，例如，Meyers等人，(1986)Science 232:613]；通过PCR诱变[参见，例如，Leung等人(1989)MethodCell Mol Biol 1:11-19]；或通过随机诱变，包括化学诱变[参见，例如，Miller等人(1992)A Short Course in Bacterial Genetics，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY；和Greener等人(1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34]。接头扫描诱变，特别是在组合的设置下，是一种用于鉴定截短(生物活性)形式的TGF-β超家族I型受体、II型受体和/或辅助受体多肽的有吸引力的方法。
本领域已知用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物的大量技术，且在这方面，用于筛选cDNA文库获得具有特定性质的基因产物的大量技术。此类技术一般可适用于快速筛选通过对本公开的异源多聚体的组合诱变产生的基因文库。用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆至可复制表达载体中，用得到的载体文库转化合适的细胞，且在下述条件下表达组合基因：其中所需活性的检测促进编码其产物被检测到的基因的载体的相对容易的分离。优选的测定法包括TGF-β超家族配体(例如，BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素AE、激活素BC、激活素BE、nodal、胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、神经生长因子、artemin、persephin、MIS和Lefty)结合测定法和/或TGF-β超家族配体介导的细胞信号传导测定法。
在某些实施方案中，除了在TGF-β超家族I型受体、II型受体或辅助受体多肽中天然存在的任何修饰之外，本公开的TGF-β超家族受体多肽异源多聚体(包括其异源多聚体和同型多聚体)可进一步包含翻译后修饰。此类修饰包括但不限于，乙酰基化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰基化。结果，TGF-β超家族受体多肽可包含非氨基酸元件，诸如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸酯。此类非氨基酸元件对TGF-β超家族受体多肽的功能性的效应可按本文对于其它TGF-β超家族受体多肽变体描述的那样进行测试。当本公开的多肽在细胞中通过裂解新生形式的多肽产生时，翻译后加工对于蛋白的正确折叠和/或功能也可能是重要的。不同的细胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有用于此类翻译后活性的特定细胞机器和特征性机制，且可被选择以确保TGF-β超家族I型受体、II型受体和/或辅助受体多肽以及包含它们的异源多聚体的正确修饰和加工。
在一些实施方案中，TGF-β超家族I型受体、II型受体多肽和/或辅助受体多肽进一步包含一个或多个异源部分(例如，包含TGF-β超家族I型受体多肽结构域和与所述TGF-β超家族I型受体多肽结构域异源的第二多肽结构域的多肽)以便赋予所需的特性。例如，一些融合结构域特别适用于通过亲和层析分离融合蛋白。此类融合结构域的众所周知的实例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。为了亲和纯化的目的，使用用于亲和层析的相关基质，例如谷胱甘肽-、淀粉酶-和镍-或钴-缀合的树脂。许多此类基质可以“试剂盒”的形式获得，诸如Pharmacia GST纯化***和与(HIS6)融合配偶体一起使用的QIAexpressTM***(Qiagen)。作为另一实例，融合结构域可经选择，以促进多肽的检测。此类检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如，GFP)以及“表位标签”，其通常是特异性抗体可利用的短肽序列。特异性单克隆抗体可容易利用的众所周知的表位标签包括FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶裂解位点，例如对于因子Xa或凝血酶，其允许相关的蛋白酶部分地消化融合蛋白，从而从其中释放重组蛋白。释放的蛋白然后可通过随后的层析分离从融合结构域分离。
在一些实施方案中，本公开的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽包含一个或多个能够稳定多肽的修饰。例如，这样的修饰增强多肽的体外半衰期，增强多肽的循环半衰期和/或减少多肽的蛋白水解降解。此类稳定化修饰包括，但不限于，融合蛋白(包括例如，包含I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽结构域和稳定剂结构域的融合蛋白)，糖基化位点的修饰(包括例如，向本公开的多肽添加糖基化位点)和糖部分的修饰(包括例如，从本公开的多肽除去糖部分)。如本文所用，术语“稳定剂结构域”不仅是指在融合蛋白的情况下的融合结构域(例如，免疫球蛋白Fc结构域)，而且包括非蛋白性修饰，诸如糖部分，或非蛋白性部分，诸如聚乙二醇。
应理解，融合蛋白(例如，免疫球蛋白Fc融合蛋白)的不同的元件可以与所需功能性一致的任何方式排列。例如，TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽结构域可位于异源结构域的C-末端，或者可选地，异源结构域可位于TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽结构域的C-末端。TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽结构域和异源结构域在融合蛋白中不需要相邻，且另外的结构域或氨基酸序列可包含在任一结构域的C-或N-末端或在结构域之间。
例如，TGF-β超家族I型受体、II型受体或辅助受体融合蛋白可以包含式A-B-C所示的氨基酸序列。B部分对应于TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽结构域。A和C部分可独立地是零、一个或超过一个氨基酸，且A和C部分二者当存在时对B是异源的。A和/或C部分可通过接头序列连接至B部分。接头可以富含甘氨酸残基(例如，2-10、2-5、2-4、2-3个甘氨酸残基)或富含甘氨酸和脯氨酸残基，且可例如包含苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列，或苏氨酸/丝氨酸和/或甘氨酸的重复序列(例如，GGG(SEQ ID NO:223)、GGGG(SEQ ID NO:222)、TGGGG(SEQ ID NO:219)、SGGGG(SEQ ID NO:220)、TGGG(SEQ ID NO:217)、GGGS或SGGG(SEQ ID NO:218))，单一态或重复。在某些实施方案中，TGF-β超家族I型受体、II型受体或辅助受体融合蛋白包含式A-B-C所示的氨基酸序列，其中A是前导(信号)序列，B由TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽结构域组成，且C是增强体内稳定性、体内半衰期、摄取/给药、组织定位或分布、蛋白复合物形成和/或纯化中的一项或多项的多肽部分。在某些实施方案中，TGF-β超家族I型受体、II型受体或辅助受体融合蛋白包含式A-B-C所示的氨基酸序列，其中A是TPA前导序列，B由TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽结构域组成，且C是免疫球蛋白Fc结构域。
作为具体实例，本公开提供了融合蛋白，其包含与包含免疫球蛋白的恒定结构域(诸如免疫球蛋白或Fc结构域的CH1、CH2或CH3结构域)的多肽融合的TGF-β超家族I型受体、II型受体或辅助受体多肽。本文提供了衍生自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc结构域。已知有减少CDC或ADCC活性的任一种的其他突变，并且总体上，这些变体中的任一个包括在本公开中并且可以用作本公开的异源多聚体的有利组分。任选地，SEQ ID NO:135的IgG1 Fc结构域在残基诸如Asp-265、Lys-322和Asn-434(根据相应的全长IgG1编号)处具有一个或多个突变。在某些情况下，相对于野生型Fc结构域，具有这些突变中的一个或多个(例如，Asp-265突变)的突变体Fc结构域具有减少的结合Fcγ受体的能力。在其它情况下，相对于野生型Fc结构域，具有这些突变中的一个或多个(例如，Asn-434突变)的突变体Fc结构域具有增加的结合MHC I类相关Fc-受体(FcRN)的能力。
可用于人IgG1的Fc部分(G1Fc)的天然氨基酸序列的实例在下文显示(SEQ ID NO:135)。点下划线表示铰链区，且实下划线表示具有天然存在的变体的位置。部分地，本公开提供了包含与SEQ ID NO:135具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。根据SEQ ID NO:135中使用的编号***(参见Uniprot P01857)，G1Fc中的天然存在的变异包括E134D和M136L。
可用于人IgG2的Fc部分(G2Fc)的天然氨基酸序列的实例在下文显示(SEQ ID NO:136)。点下划线表示铰链区，且双下划线表示其中在序列中存在数据库冲突(根据UniProtP01859)的位置。部分地，本公开提供了包含与SEQ ID NO:136具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
可用于人IgG3的Fc部分(G3Fc)的氨基酸序列的两个实例在下文显示。G3Fc中的铰链区的长度可最多为其它Fc链的4倍，且含有三个相同的15-残基区段，该15-残基区段前面是类似的17-残基区段。在下文显示的第一G3Fc序列(SEQ ID NO:137)含有由单一15-残基区段组成的短铰链区，而第二G3Fc序列(SEQ ID NO:138)含有全长铰链区。在每种情况下，点下划线表示铰链区，且实下划线表示根据UniProt P01859具有天然存在的变异的位置。部分地，本公开提供了包含与SEQ ID NO:137或138具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
当转化为SEQ ID NO:137中使用的编号***时，G3Fc(例如，参见UniprotP01860)中的天然存在的变异包括E68Q、P76L、E79Q、Y81F、D97N、N100D、T124A、S169N、S169del、F221Y，且本公开提供了包含G3Fc结构域的融合蛋白，所述G3Fc结构域含有这些变异中的一种或多种。此外，人免疫球蛋白IgG3基因(IGHG3)显示特征在于不同的铰链长度的结构多态性(参见Uniprot P01859)。具体地，变体WIS缺乏大部分V区和所有的CH1区。除了铰链区中正常存在的位置11的链间二硫键之外，其在位置7处具有额外的链间二硫键。变体ZUC缺乏大部分V区、所有的CH1区和部分的铰链。变体OMM可以代表等位基因形式或另一种γ链亚类。本公开提供了包含G3Fc结构域的额外融合蛋白，所述G3Fc结构域含有这些变异中的一种或多种。
可用于人IgG4的Fc部分(G4Fc)的天然氨基酸序列的实例在下文显示(SEQ ID NO:139)。点下划线表示铰链区。部分地，本公开提供了包含与SEQ ID NO:139具有70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的多肽。
关于G1Fc序列(SEQ ID NO:135)，本文提供了Fc结构域中的各种工程改造的突变，且G2Fc、G3Fc和G4Fc中的类似突变可衍生自在图4中它们与G1Fc的比对。由于不等的铰链长度，基于同种型比对(图4)的类似的Fc位置在SEQ ID NO:135、136、137和139中具有不同的氨基酸编号。还可理解，在由铰链、CH2和CH3区组成的免疫球蛋白序列(例如，SEQ ID NO:135、136、137、138或139)中给定的氨基酸位置将通过与当编号涵盖Uniprot数据库中整个IgG1重链恒定结构域(由CH1、铰链、CH2和CH3区组成)时的相同位置不同的编号来鉴定。例如，在人G1Fc序列(SEQ ID NO:135)、人IgG1重链恒定结构域(Uniprot P01857)和人IgG1重链中所选择的CH3位置之间的对应关系如下。
表1
在某些方面，TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽(例如，本文所述的那些)可以与至少一个另外的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽共价地或非公价地形成异源多聚体。本领域已知的许多方法可用于产生异源多聚体。例如，可通过下述构建非天然存在的二硫键：将第一多肽(例如，TGF-β超家族I型受体多肽)上的天然存在的氨基酸替换为游离的含硫醇残基(例如半胱氨酸)而构建，使得游离的硫醇与第二多肽(例如，TGF-β超家族II型受体多肽)上的另一游离的含硫醇残基相互作用，以致在第一和第二多肽之间形成二硫键。促进异源多聚体形成的相互作用的另外的实例包括，但不限于，离子相互作用，诸如描述于Kjaergaard等人，WO2007147901；静电转向作用，诸如描述于Kannan等人，U.S.8,592,562；卷曲螺旋相互作用，诸如描述于Christensen等人，U.S.20120302737；亮氨酸拉链，诸如描述于Pack&Plueckthun,(1992)Biochemistry31:1579-1584；和螺旋-转角-螺旋基序，诸如描述于Pack等人，(1993)Bio/Technology 11:1271-1277。各个区段的连接可通过下述技术获得：例如共价结合，诸如通过化学交联、肽接头、二硫桥等，或亲和相互作用，诸如通过抗生物素蛋白-生物素或亮氨酸拉链技术。优选地，本文公开的多肽形成异源二聚体，尽管还包括更高阶的异源多聚体，诸如,但不限于，异源三聚体、异源四聚体、以及进一步的寡聚体结构(参见，例如，图5和6)。
在一些实施方案中，本公开的TGF-β超家族I型受体、II型受体和/或辅助受体多肽包含至少一个多聚化结构域。如本文所公开，术语“多聚化结构域”是指促进至少第一多肽和至少第二多肽之间的共价或非共价相互作用的氨基酸或氨基酸序列。本文公开的多肽可共价或非共价连接至多聚化结构域。在一些实施方案中，多聚化结构域促进在第一多肽和第二多肽之间的相互作用以促进异源多聚体形成(例如，异源二聚体形成)，且任选地妨碍或以其它方式不利于同型多聚体形成(例如，同型二聚体形成)，从而增加所需的异源多聚体的收率(参见例如，图5和6)。
在某些方面，多聚化结构域可包含相互作用对的一个组件。在一些实施方案中，本文公开的多肽可形成蛋白复合物，其包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽，其中第一多肽包含第一TGF-β超家族受体多肽的氨基酸序列和相互作用对的第一成员的氨基酸序列；且第二多肽包含第二TGF-β超家族受体多肽的氨基酸序列和相互作用对的第二成员的氨基酸序列。相互作用对可以是相互作用以形成复合物、特别是异源二聚体复合物的任何两个多肽序列，尽管有效的实施方案也可采用可以形成同型二聚体复合物的相互作用对。相互作用对可经选择以赋予改善的性质/活性，诸如增加的血清半衰期，或作为衔接子起作用，另一部分与该衔接子连接以提供改善的性质/活性。例如，聚乙二醇部分可连接至相互作用对的一个或两个组件以提供改善的性质/活性，诸如改善的血清半衰期。
相互作用对的第一和第二成员可以是不对称的对，意味着该对的成员优先与彼此缔合，而非自缔合。因此，不对称的相互作用对的第一和第二成员可以缔合以形成例如异源二聚体复合物(参见例如，图5A和5B)。可选地，相互作用对可以是非引导的，意味着该对的成员可以与彼此缔合或自缔合，而没有实质性的偏好性，因此可以具有相同或不同的氨基酸序列。因此，非引导的相互作用对的第一和第二成员可以缔合以形成同型二聚体复合物或异源二聚体复合物。任选地，相互作用对(例如，不对称对或非引导的相互作用对)的第一成员与相互作用对的第二成员共价缔合。任选地，相互作用对(例如，不对称对或非引导的相互作用对)的第一成员与相互作用对的第二成员非共价缔合。
从单一细胞系大规模生产不对称的基于免疫球蛋白的蛋白产生的问题被称为“链缔合问题”。如在产生双特异性抗体中所主要面临的，链缔合问题涉及从当不同的重链和/或轻链在单一细胞系中产生时固有产生的多个组合中有效产生需要的多链蛋白的挑战(参见，例如，Klein等人(2012)mAbs 4:653-663)。当两种不同的重链和两种不同的轻链在相同的细胞中产生时，该问题是极其明显的，在该情况下存在总共16种可能的链组合(尽管这些中的一些是相同的)，此时通常仅一种是合乎需要的。然而，该原理解释了掺有仅两种不同的(不对称的)重链的所需多链融合蛋白的低收率。
在单一细胞系中增加含Fc融合多肽链的所需配对以可接受的收率产生优选的不对称的融合蛋白的各种方法是本领域已知的(参见，例如，Klein等人(2012)mAbs 4:653-663；和Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106)。获得需要的含Fc链的配对的方法包括但不限于，基于电荷的配对(静电转向)、“杵臼”空间配对、SEED体配对和基于亮氨酸拉链的配对。参见，例如，Ridgway等人(1996)Protein Eng9:617-621；Merchant等人(1998)Nat Biotech 16:677-681；Davis等人(2010)Protein Eng Des Sel 23:195-202；Gunasekaran等人(2010)；285:19637-19646；Wranik等人(2012)J Biol Chem 287:43331-43339；US5932448；WO 1993/011162；WO 2009/089004和WO 2011/034605。如本文所述，这些方法可用于产生包含两个或多个TGF-β超家族受体多肽的异源多聚体，参见图5和6。
例如，可促进特定多肽之间的相互作用的一种方法是通过改造突起进孔洞(protuberance-into-cavity)(杵进臼)互补区，诸如描述于Arathoon等人，U.S.7,183,076和Carter等人，U.S.5,731,168。“突起”通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽(例如，第一相互作用对)的界面的小的氨基酸侧链构建。与突起相同或类似大小的互补“孔洞”在第二多肽(例如，第二相互作用对)的界面上任选地通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链产生。在合适定位和尺寸的突起或孔洞存在于第一或第二多肽的界面处时，只需要在邻近界面处各自改造相应的孔洞或突起。
在中性pH(7.0)时，天冬氨酸和谷氨酸带负电荷，赖氨酸、精氨酸和组氨酸带正电荷。这些带电荷残基可用于促进异源二聚体形成，同时妨碍同型二聚体形成。吸引相互作用在相反电荷之间发生，和排斥相互作用在相同电荷之间发生。部分地，通过进行带电荷界面残基的定点诱变，本文公开的蛋白复合物利用吸引相互作用以促进异源多聚体形成(例如，异源二聚体形成)，和任选地利用排斥相互作用以妨碍同型二聚体形成(例如，同型二聚体形成)。
例如，IgG1 CH3结构域界面包含四个独特的带电荷残基对，其参与结构域-结构域相互作用：Asp356-Lys439’、Glu357-Lys370’、Lys392-Asp399’和Asp399-Lys409’[第二链中的残基编号通过(’)表示]。应注意，此处用于指定IgG1 CH3结构域中的残基的编号方案符合Kabat的EU编号方案。由于CH3-CH3结构域相互作用中存在的二重对称，每个独特的相互作用在结构中将出现两次(例如，Asp-399-Lys409’和Lys409-Asp399’)。在野生型序列中，K409-D399’有利于异源二聚体和同型二聚体二者形成。第一链中转换电荷极性的单一突变(例如，K409E；正电荷至负电荷)导致对形成第一链同型二聚体不利的相互作用。该不利的相互作用由于在相同电荷之间发生的排斥相互作用(负-负；K409E-D399’和D399-K409E’)而产生。第二链中转换电荷极性的类似的突变(D399K’；负电荷至正电荷)导致对于第二链同型二聚体形成不利的相互作用(K409’-D399K’和D399K-K409’)。但同时，这两个突变(K409E和D399K’)导致对于异源二聚体形成有利的相互作用(K409E-D399K’和D399-K409’)。
对异源二聚体形成和同型二聚体阻碍的静电转向效应可进一步通过另外的带电荷残基的突变来增强，所述残基可以与或可以不与第二链中的带相反电荷的残基(包括例如，Arg355和Lys360)配对。下表2列出了可使用的可能的电荷改变突变(单独或组合)，以增强本文公开的异源多聚体的异源多聚体形成。
表2
在一些实施方案中，构成本申请的融合蛋白中的CH3-CH3界面的一个或多个残基被带电荷氨基酸替换，使得相互作用成为静电上不利的。例如，界面中的带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)被带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)替换。可选地，或与前述置换组合，界面中的带负电荷的氨基酸被带正电荷的氨基酸替换。在某些实施方案中，氨基酸被具有所需的电荷性质的非天然存在的氨基酸替换。应注意，将带负电荷残基(Asp或Glu)突变为His导致侧链体积增加，这可引起空间问题。此外，His质子供体-和接受体-形式取决于局部环境。设计策略应考虑这些问题。因为界面残基在人和小鼠IgG亚类中高度保守，本文公开的静电转向效应可适用于人和小鼠IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。该策略还可扩展至将CH3结构域界面处的不带电荷的残基修饰为带电荷的残基。
部分地，使用经工程改造以根据电荷配对(静电转向)互补的Fc序列，本公开提供了所需的不对称的含Fc多肽链的配对。具有静电互补性的一对Fc序列中的一个可任意地融合至构建体的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽，含或不含任选的接头，以产生TGF-β超家族I型、II型或辅助受体融合蛋白。该条单一链可在选择的细胞中和与第一Fc互补的Fc序列一起共表达，以帮助产生所需的多链构建体(例如，TGF-β超家族异源多聚体)。在基于静电转向的该实例中，SEQ ID NO：140(人G1Fc(E134K/D177K))和SEQ IDNO：141(人G1Fc(K170D/K187D))是互补Fc序列的实例，其中工程改造的氨基酸置换用双下划线表示，构建体的TGF-β超家族I型、II型受体或辅助受体多肽可融合至SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：141，但非二者中。鉴于在天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高程度的氨基酸序列同一性，可以理解，在hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc的相应位置处的氨基酸置换(参见图4)将产生互补Fc对，其可用于代替下文的互补hG1Fc对(SEQ ID NO：140和141)。
部分地，使用经工程改造用于立体互补性的Fc序列，本公开提供了所需的不对称的含Fc多肽链的配对。部分地，本公开提供了杵臼配对作为立体互补性的实例。具有立体互补性的一对Fc序列中的一个可任意地融合至构建体的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽，含或不含任选的接头，以产生TGF-β超家族I型、II型或辅助受体融合多肽。该条单一链可在选择的细胞中和与第一Fc互补的Fc序列一起共表达，以帮助产生所需的多链构建体。在基于杵臼配对的该实例中，SEQ ID NO:142(人G1Fc(T144Y))和SEQ IDNO:143(人G1Fc(Y185T))是互补Fc序列的实例，其中工程改造的氨基酸置换用双下划线表示，且构建体的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽可融合至SEQ IDNO：142或SEQ ID NO：143，但非二者中。鉴于在天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高程度的氨基酸序列同一性，可以理解，在hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc的相应位置处的氨基酸置换(参见图4)将产生互补Fc对，其可用于代替下文的互补hG1Fc对(SEQ ID NO：142和143)。
基于杵臼配对组合以工程改造的二硫键的Fc互补性的实例公开于SEQ ID NO:144(hG1Fc(S132C/T144W))和SEQ ID NO:145(hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V))。这些序列中的工程改造的氨基酸置换用双下划线表示，构建体的TGF-β超家族I型、II型或辅助受体可融合至SEQ ID NO：144或SEQ ID NO：145，但非二者。鉴于在天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高程度的氨基酸序列同一性，可以理解，在hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中的相应位置处的氨基酸置换(参见图4)将产生互补Fc对，其可用于代替下文的互补hG1Fc对(SEQ ID NO：144和145)。
部分地，使用经工程改造以产生人IgG和IgA CH3结构域的互相交叉β-链区段的Fc序列，本公开提供了所需的不对称的含Fc多肽链的配对。这样的方法包括使用链交换工程改造的结构域(SEED)CH3异源二聚体，其允许形成SEED体融合蛋白(参见，例如，Davis等(2010)Protein Eng Design Sel 23：195-202)。具有SEED体互补性的一对Fc序列中的一个可任意地融合至构建体的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽，含或不含任选的接头，以产生TGF-β超家族融合多肽。该条单一链可在选择的细胞中和与第一Fc互补的Fc序列一起共表达以帮助产生所需的多链构建体。在基于SEED体(Sb)配对的该实例中，SEQ ID NO:146(hG1Fc(SbAG))和SEQ ID NO:147(hG1Fc(SbGA))是互补IgG Fc序列的实例，其中来自IgA Fc的工程改造的氨基酸置换用双下划线表示，构建体的TGF-β超家族I型、II型或辅助受体多肽可融合至SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：147，但非二者。鉴于在天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高程度的氨基酸序列同一性，可以理解，在hG1Fc、hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc中的相应位置处的氨基酸置换(见图4)将产生Fc单体，其可用于下文的互补IgG-IgA对(SEQ ID NO：146和147)。
部分地，本公开提供了所需的不对称的含Fc多肽链的配对，其中可裂解的亮氨酸拉链结构域连接至Fc CH3结构域的C-末端。亮氨酸拉链的连接足以引起异源二聚体抗体重链的优先装配。参见，例如，Wranik等(2012)J Biol Chem 287：43331-43339。如本文公开的，连接至亮氨酸拉链-形成链的一对Fc序列中的一个可任意地融合至构建体的TGF-β超家族I型受体多肽、II型受体多肽或辅助受体多肽，含或不含任选的接头，以产生TGF-β超家族融合多肽。该条单一链可在选择的细胞中和连接至互补亮氨酸拉链-形成链的Fc序列一起共表达，以帮助产生所需的多链构建体。纯化后构建体用细菌内切蛋白酶Lys-C进行蛋白水解消化可释放亮氨酸拉链结构域，产生Fc构建体，其结构与天然Fc相同。在基于亮氨酸拉链配对的该实例中，SEQ ID NO:148(hG1Fc-Ap1(酸性))和SEQ ID NO:149(hG1Fc-Bp1(碱性))是互补IgG Fc序列的实例，其中工程改造的互补亮氨酸拉链序列用下划线表示，且构建体的TGF-β超家族I型、II型或辅助受体多肽可融合至SEQ ID NO：148或SEQ IDNO：149，但非二者中。鉴于在天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间高程度的氨基酸序列同一性，可以理解，连接至hG1Fc、hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc的亮氨酸拉链-形成序列(含或不含任选的接头)(参见图4)将产生Fc单体，其可用于下文的互补亮氨酸拉链-形成对(SEQ ID NO：148和149)中。
在优选的实施方案中，根据本文所述的方法使用的TGF-β超家族受体多肽(包括其异源多聚体和同型多聚体)是分离的多肽复合物。如本文所用，分离的蛋白(或蛋白复合物)或多肽(或多肽复合物)是已经与其天然环境的组分分离的蛋白或多肽。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体复合物被纯化至大于95％、96％、97％、98％或99％的纯度，如通过例如，电泳(例如，SDS-PAGE、等电点聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)所测定的。用于评估抗体纯度的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Flatman等人，(2007)J.Chromatogr.B848:79-87)。在一些实施方案中，本公开的异源多聚体制剂基本上不含有TGF-β超家族I型受体多肽同型多聚体、TGF-β超家族II型受体多肽同型多聚体和/或TGF-β超家族辅助受体多肽同型多聚体。例如，在一些实施方案中，异源多聚体制剂包含少于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或少于1％的TGF-β超家族I型受体多肽同型多聚体。在一些实施方案中，所述异源多聚体制剂包含少于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或少于1％的TGF-β超家族II型受体多肽同型多聚体。在一些实施方案中，所述异源多聚体制剂包含少于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或少于1％TGF-β超家族辅助受体多肽同型多聚体。在一些实施方案中，所述异源多聚体制剂包含少于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或少于1％TGF-β超家族I型受体多肽同型多聚体和少于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或少于1％的TGF-β超家族辅助受体多肽同型多聚体。在一些实施方案中，所述异源多聚体制剂包含少于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或少于1％的TGF-β超家族II型受体多肽同型多聚体和少于约10％、9％、8％、7％、5％、4％、3％、2％或少于1％的TGF-β超家族辅助受体多肽同型多聚体。
在某些实施方案中，本公开的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和辅助受体多肽以及其异源多聚体复合物可通过各种本领域已知的技术产生。例如，本公开的多肽可使用标准蛋白化学技术合成，诸如描述于Bodansky，M.Principles of PeptideSynthesis，Springer Verlag，Berlin(1993)和Grant G.A.(编)，Synthetic Peptides:AUser's Guide，W.H.Freemanand Company，New York(1992)的那些。此外，自动肽合成仪可市售获得(参见，例如，Advanced Chem Tech Model 396；Milligen/Biosearch 9600)。可选地，本公开的多肽和复合物，包括其片段或变体，可使用各种表达***(例如，大肠杆菌(E.coli)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、杆状病毒)经重组产生，这是本领域众所周知的。在进一步的实施方案中，本公开的修饰或未修饰的多肽可通过使用例如，蛋白酶，例如，胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶或配对的碱性氨基酸转换酶(PACE)，消化重组产生的全长TGFβ超家族I型受体、II型受体和/或辅助受体多肽产生。计算机分析(使用市售可得的软件，例如，MacVector，Omega，PCGene，Molecular Simulation，Inc.)可用于鉴定蛋白水解裂解位点。
3.编码TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和辅助受体多肽的核酸
在某些实施方案中，本公开提供了编码本文公开的TGFβ超家族I型受体、II型受体和辅助受体(包括其片段、功能变体和融合蛋白)的分离和/或重组的核酸。例如，SEQ IDNO:13编码天然存在的人ActRIIA前体多肽，SEQ ID NO:14编码ActRIIA的经加工的细胞外结构域。本发明的核酸可以是单链的或双链的。此类核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可用于例如，制备本公开的TGF-β超家族异源多聚体的方法。
如本文所用，分离的核酸是指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括在正常包含核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或不同于其天然的染色***置的染色***置。
在某些实施方案中，编码本公开的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的核酸应理解为包括SEQ ID NO:7、8、13、14、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、179、183、185、186、191、194、195、200、203和210中的任一个的核酸以及其变体。变体核苷酸序列包括差异一个或多个核苷酸置换、添加或缺失的序列，包括等位基因变体，并且因此，将包括与SEQID NO:7、8、13、14、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、179、183、185、186、191、194、195、200、203和210中任一个指定的核苷酸序列不同的编码序列。
在某些实施方案中，本公开的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽由分离或重组的核酸序列编码，所述分离或重组的核酸序列与SEQ ID NO:7、8、13、14、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、179、183、185、186、191、194、195、200、203和210至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。本领域普通技术人员将理解和与SEQ ID NO:7、8、13、14、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、179、183、185、186、191、194、195、200、203和210互补的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列也在本公开的范围内。在进一步的实施方案中，本公开的核酸序列可以是分离的、重组的和/或与异源的核苷酸序列融合或在DNA文库中。
在其它实施方案中，本公开的核酸还包括在高度严格性条件下与SEQ ID NO:7、8、13、14、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、179、183、185、186、191、194、195、200、203和210中指定的核苷酸序列，SEQ ID NO:7、8、13、14、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、179、183、185、186、191、194、195、200、203和210的互补序列或其片段杂交的核苷酸序列。本领域普通技术人员将容易理解，促进DNA杂交的合适的严格性条件可以改变。例如，可在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃进行杂交，接着在50℃下用2.0xSSC洗涤。例如，在洗涤步骤中盐浓度可选自在50℃约2.0xSSC的低严格性至在50℃约0.2xSSC的高严格性。此外，在洗涤步骤中温度可从在室温约22℃的低严格性条件增加至在约65℃的高严格性条件。温度和盐二者可以改变，或温度或盐浓度可以保持恒定，而改变其它变量。在一个实施方案中，本发明提供了核酸，其在室温6xSSC的低严格性条件下杂交，接着在室温下2xSSC洗涤。
由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:7、8、13、14、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、179、183、185、186、191、194、195、200、203和210所示的核酸的分离的核酸也在本公开的范围内。例如，许多氨基酸由超过一个三联体指定。规定相同的氨基酸的密码子，或同物异名(synonyms)(例如，CAU和CAC是组氨酸的同物异名)可导致“沉默”突变，所述沉默突变不影响蛋白的氨基酸序列。然而，预期确实导致本发明的蛋白的氨基酸序列变化的DNA序列多态性将存在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员将理解，由于天然等位基因变异，编码特定蛋白的核酸的一个或多个核苷酸(至多约3-5％的核苷酸)中的这些变化可存在于给定物种的个体中。任何和所有此类核苷酸变化和产生的氨基酸多态性在本公开的范围内。
在某些实施方案中，本公开的重组核酸可以与在表达构建体中的一种或多种调节性核苷酸序列可操作连接。调节性核苷酸序列通常适合于用于表达的宿主细胞。对于各种宿主细胞，许多类型的合适表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，所述一种或多种调节性核苷酸序列可包括但不限于，启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活物序列。本公开设想了本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或合并了超过一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞中的附加体上，诸如质粒，或表达构建体可***染色体中。在一些实施方案中，表达载体包含可选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。可选择标记基因是本领域众所周知的并且随使用的宿主细胞而改变。
在本公开的某些方面，在表达载体中提供本发明的核酸，所述载体包含编码TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽并可操作连接至至少一种调控序列的核苷酸序列。调控序列是本领域公认的并且经选择以指导TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的表达。因此，术语调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件。示例性调控序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology:Methods inEnzymology，Academic Press，San Diego，CA(1990)。例如，当与其可操作连接时控制DNA序列表达的大量表达控制序列中的任何一种可用于这些载体以表达编码TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的DNA序列。此类可用的表达控制序列包括例如，SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac***、trp***、TAC或TRC***、其表达受T7 RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、用于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解的酶的启动子、酸性磷酸酶(例如，Pho5)的启动子、用于酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒***的多面体启动子和已知控制原核或真核细胞或它们的病毒的基因表达的其它序列，和其各种组合。应理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择和/或需要表达的蛋白类型等因素。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和由载体编码的任何其它蛋白的表达，诸如抗生素标记的表达。
本公开的重组核酸可通过将克隆的基因或其部分连接至适合于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽、昆虫或哺乳动物)或二者中表达的载体来产生。用于产生重组TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的表达载体包括质粒和其它载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：pBR322-衍生的质粒、pEMBL-衍生的质粒、pEX-衍生的质粒、pBTac-衍生的质粒和pUC-衍生的质粒，用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达。
一些哺乳动物表达载体同时包含促进载体在细菌中增殖的原核序列和在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单元。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒诸如pBR322的序列修饰，以促进在原核和真核细胞中的复制和耐药性选择。可选地，病毒诸如牛***瘤病毒(BPV-1)或EB病毒(pHEBo、pREP-衍生的和p205)的衍生株可用于在真核细胞中蛋白瞬时表达。其它病毒(包括逆转录病毒)表达***的实例可见于下文的基因疗法递送***的描述。用于制备质粒和转化宿主生物体的各种方法是本领域众所周知的。对于原核和真核细胞二者的其它合适的表达***，以及通用的重组程序，参见，例如，Molecular Cloning ALaboratory Manual，第3版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编(Cold SpringHarborLaboratory Press)，2001。在一些实例中，可能需要通过使用杆状病毒表达***来表达重组多肽。此类杆状病毒表达***的实例包括pVL-衍生的载体(诸如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW-衍生的载体(诸如pAcUW1)和pBlueBac-衍生的载体(诸如包含β-gal的pBlueBac III)。
在优选实施方案中，载体经设计以在CHO细胞中产生本发明的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽，诸如Pcmv-Script载体(Stratagene，La Jolla，Calif.)、pcDNA4载体(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)和pCI-neo载体(Promega，Madison，Wisc.)。如显而易见的，本发明的基因构建体可用于使本发明的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽在培养物中增殖的细胞中表达，例如，以产生蛋白(包括融合蛋白或变体蛋白)，用于纯化。
本公开还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包含本发明的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽中的一种或多种的编码序列。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本公开的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽可在细菌细胞(诸如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达***)、酵母或哺乳动物细胞[例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系]中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
因此，本公开进一步涉及产生本发明的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的方法。例如，用编码TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的表达载体转染的宿主细胞可在合适的条件下培养，以允许TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽表达发生。多肽可经分泌并从细胞和包含所述多肽的培养基的混合物分离。可选地，TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽可从获得自收获和裂解的细胞的胞质或膜级分分离。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其它副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。本发明的多肽可使用本领域已知用于纯化蛋白的技术从细胞培养基、宿主细胞或二者分离，所述技术包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳、用对TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的特定表位特异性的抗体的免疫亲和纯化和用结合于融合至TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的结构域的作用剂的亲和纯化(例如，蛋白A柱可用于纯化TGFβ超家族I型受体-Fc融合蛋白、II型受体-Fc融合蛋白和/或辅助受体-Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽是包含促进其纯化的结构域的融合蛋白。
在一些实施方案中，纯化通过一系列柱层析步骤实现，包括例如，以任何顺序的以下的三种或更多种：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。TGFβ超家族I型受体-Fc融合蛋白、II型受体-Fc融合蛋白和/或辅助受体-Fc融合蛋白可纯化至>90％、>95％、>96％、>98％或>99％的纯度，如通过尺寸排阻层析所测定的，和>90％、>95％、>96％、>98％或>99％的纯度，如通过SDS PAGE所测定的。目标水平的纯度应该是足以在哺乳动物***、特别是非-人灵长类动物、啮齿动物(小鼠)和人中实现需要的结果的纯度。
在另一个实施方案中，编码在重组TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽的所需部分的N-末端的纯化前导序列，诸如聚-(His)/肠激酶裂解位点序列的融合基因，可允许使用Ni2+金属树脂通过亲和层析纯化表达的融合蛋白。然后纯化前导序列可随后通过用肠激酶处理除去，以提供纯化的TGFβ超家族I型受体多肽、II型受体多肽和/或辅助受体多肽。参见，例如，Hochuli等人(1987)J.Chromatography411:177；和Janknecht等人(1991)PNAS USA 88:8972。
用于制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接根据常规技术进行，常规技术使用平端或交错端末端连接，限制性酶消化以提供合适的末端，合适时粘端填充，碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接，和酶连接。在另一个实施方案中，融合基因可通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪。可选地，基因片段的PCR扩增可使用锚定引物进行，其在两个相邻的基因片段之间产生互补的突出端，其可随后被退火以产生嵌合基因序列。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编，John Wiley&Sons:1992。
4.抗体拮抗剂
在某些方面，根据本文公开的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂是抗体(激活素和/或GDF拮抗剂抗体)或抗体的组合。激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合可以结合，例如，一种或多种ActRII配体(例如，激活素(诸如激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素AE、激活素BC,和/或激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF1、GDF11、Nodal和/或GDF3)、ActRII受体(ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或它们的辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。如本文所述，激活素和/或GDF拮抗剂抗体可以单独或与一种或多种支持疗法和/或活性剂组合使用以治疗或降低肾脏疾病的进展速度、频次和/或严重性，特别是治疗、预防或降低一种或多种肾脏疾病相关的并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的进展速度、频次和/或严重性。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合激活素。如本文所用，激活素抗体(或抗-激活素抗体)通常是指以足够的亲和性与激活素结合使得所述抗体可用作靶向激活素的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，激活素抗体与不相关的非激活素蛋白的结合程度小于所述抗体与激活素的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，激活素抗体结合在来自不同物种的激活素中保守的激活素的表位。在某些优选的实施方案中，抗-激活素抗体结合人激活素。在一些实施方案中，激活素抗体可以抑制激活素结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，并由此抑制激活素介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，激活素抗体可以抑制激活素结合ActRII辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)，并由此抑制激活素介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应注意，激活素A与激活素B具有相似的序列同源性，且因此结合激活素A的抗体在一些情况下还可结合和/或抑制激活素B，这也适用于抗-激活素B抗体。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述多特异性抗体结合激活素，并进一步结合，例如，一种或多种额外的GDF配体(例如，GDF11、GDF8、GDF3、GDF1和/或Nodal)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，结合激活素的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含激活素抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种额外的GDF超家族配体(例如，GDF8、GDF11、GDF3、GDF1和/或Nodal)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic1B)。在一些实施方案中，包含激活素A抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF8的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合GDF8。如本文所用，GDF8抗体(或抗-GDF8抗体)通常是指以足够的亲和性与GDF8结合使得所述抗体可用作靶向GDF8的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，GDF8抗体与不相关的非GDF8蛋白的结合程度小于所述抗体与GDF8的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，GDF8抗体结合在来自不同物种的GDF8中保守的GDF8的表位。在某些优选的实施方案中，抗-GDF8抗体结合人GDF8。在一些实施方案中，GDF8抗体可以抑制GDF8结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，并由此抑制GDF8介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF8抗体可以抑制GDF8结合辅助受体并由此抑制GDF8-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应注意，GDF8与GDF11具有高序列同源性，且因此结合GDF8的抗体在一些情况下还可结合和/或抑制GDF11。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述多特异性抗体结合GDF8，并进一步结合，例如，一种或多种额外的GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1和/或Nodal)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，结合GDF8的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含GDF8抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种额外的GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1和/或Nodal)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，包含GDF8抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF11的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合GDF11。如本文所用，GDF11抗体(或抗-GDF11抗体)通常是指以足够的亲和性与GDF11结合使得所述抗体可用作靶向GDF11的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，GDF11抗体与不相关的非GDF11蛋白的结合程度小于所述抗体与GDF11的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，GDF11抗体结合在来自不同物种的GDF11中保守的GDF11的表位。在某些优选的实施方案中，抗-GDF11抗体结合人GDF11。在一些实施方案中，GDF11抗体可以抑制GDF11结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，并由此抑制GDF11介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF11抗体可以抑制GDF11结合辅助受体并由此抑制GDF11-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。应注意，GDF11与GDF8具有高序列同源性，且因此结合GDF11的抗体在一些情况下还可结合和/或抑制GDF8。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述多特异性抗体结合GDF11，并进一步结合，例如，一种或多种额外的GDF配体[例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF1和/或Nodal)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto,Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，结合GDF11的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含GDF11抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种额外的GDF配体[例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF1和/或Nodal]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，包含GDF11抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF1的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合GDF1。如本文所用，GDF1抗体(或抗-GDF1抗体)通常是指以足够的亲和性与GDF1结合使得所述抗体可用作靶向GDF1的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，GDF1抗体与不相关的非GDF1蛋白的结合程度小于所述抗体与GDF1的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，GDF1抗体结合在来自不同物种的GDF1中保守的GDF1的表位。在某些优选的实施方案中，抗-GDF1抗体结合人GDF1。在一些实施方案中，GDF1抗体可以抑制GDF1结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，并由此抑制GDF1介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF1抗体可以抑制GDF1结合辅助受体并由此抑制GDF1-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述多特异性抗体结合GDF1并进一步结合，例如，一种或多种额外的GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF8、GDF3、Nodal和/或GDF11)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic1B)。在一些实施方案中，结合GDF1的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含GDF1抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种额外的GDF配体[例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3和/或Nodal]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，包含GDF1抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制GDF3的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合GDF3。如本文所用，GDF3抗体(或抗-GDF3抗体)通常是指以足够的亲和性与GDF3结合使得所述抗体可用作靶向GDF3的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，GDF3抗体与不相关的非GDF3蛋白的结合程度小于所述抗体与GDF3的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，GDF3抗体结合在来自不同物种的GDF3中保守的GDF3的表位。在某些优选的实施方案中，抗-GDF3抗体结合人GDF3。在一些实施方案中，GDF3抗体可以抑制GDF3结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，并由此抑制GDF3介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，GDF3抗体可以抑制GDF3结合辅助受体并由此抑制GDF3-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述多特异性抗体结合GDF3并进一步结合，例如，一种或多种额外的GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF8、GDF1、Nodal和/或GDF11)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic1B)。在一些实施方案中，结合GDF3的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含GDF3抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种额外的GDF配体[例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF1和/或Nodal]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，包含GDF3抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制Nodal的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合Nodal。如本文所用，Nodal抗体(或抗-Nodal抗体)通常是指以足够的亲和性与Nodal结合使得所述抗体可用作靶向Nodal的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，Nodal抗体与不相关的非Nodal蛋白的结合程度小于所述抗体与Nodal的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，Nodal抗体结合在来自不同物种的Nodal中保守的Nodal的表位。在某些优选的实施方案中，抗-Nodal抗体结合人Nodal。在一些实施方案中，Nodal抗体可以抑制Nodal结合I型和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)，并由此抑制Nodal介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，Nodal抗体可以抑制Nodal结合辅助受体并由此抑制Nodal-介导的信号传导(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开涉及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及其用途，所述多特异性抗体结合Nodal并进一步结合，例如，一种或多种额外的GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3和/或GDF1)、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，结合Nodal的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含Nodal抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种额外的GDF配体[例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE)、GDF8、GDF3、GDF1和/或GDF11]、一种或多种I型受体和/或II型受体(例如，ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，包含Nodal抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ActRIIB的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合ActRIIB。如本文所用，ActRIIB抗体(或抗-ActRIIB抗体)通常是指以足够的亲和性与ActRIIB结合使得所述抗体可用作靶向ActRIIB的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ActRIIB抗体与不相关的非ActRIIB蛋白的结合程度小于所述抗体与ActRIIB的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，抗-ActRIIB抗体结合在来自不同物种的ActRIIB中保守的ActRIIB的表位。在某些优选的实施方案中，抗-ActRIIB抗体结合人ActRIIB。在一些实施方案中，抗-ActRIIB抗体可以抑制一种或多种GDF配体(例如，GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF11、GDF8、GDF3、GDF1和/或Nodal)结合ActRIIB。在一些实施方案中，抗-ActRIIB是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，所述多特异性抗体结合ActRIIB和一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、一种或多种辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)和/或额外的II型受体(例如，ActRIIA)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗-ActRIIB抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF1、GDF3和/或Nodal)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或额外的II型受体(例如，ActRIIA)。应注意，ActRIIB与ActRIIA具有序列相似性，且因此结合ActRIIB的抗体在一些情况下还可结合和/或抑制ActRIIA。在一些实施方案中，结合ActRIIB的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，包含ActRIIB抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ActRIIA的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合ActRIIA。如本文所用，ActRIIA抗体(或抗-ActRIIA抗体)通常是指以足够的亲和性与ActRIIA结合使得所述抗体可用作靶向ActRIIA的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ActRIIA抗体与不相关的非ActRIIA蛋白的结合程度小于所述抗体与ActRIIA的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，抗-ActRIIA抗体结合在来自不同物种的ActRIIA中保守的ActRIIA的表位。在某些优选的实施方案中，抗-ActRIIA抗体结合人ActRIIA。在一些实施方案中，抗-ActRIIA抗体可以抑制一种或多种GDF配体(例如，GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF11、GDF1、GDF3和/或Nodal)结合ActRIIA。在一些实施方案中，抗-ActRIIA是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，所述多特异性抗体结合ActRIIA和一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)和/或额外的II型受体(例如，ActRIIB)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗-ActRIIA抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF1、GDF3和/或Nodal)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic1B)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)和/或额外的II型受体(例如，ActRIIB)。应注意，ActRIIA与ActRIIB具有序列相似性，且因此结合ActRIIA的抗体在一些情况下还可结合和/或抑制ActRIIB。在一些实施方案中，结合ActRIIA的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，包含ActRIIA抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ALK4的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合ALK4。如本文所用，ALK4抗体(或抗-ALK4抗体)通常是指以足够的亲和性与ALK4结合使得所述抗体可用作靶向ALK4的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ALK4抗体与不相关的非ALK4蛋白的结合程度小于所述抗体与ALK4的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，抗-ALK4抗体结合在来自不同物种的ALK4中保守的ALK4的表位。在某些优选的实施方案中，抗-ALK4抗体结合人ALK4。在一些实施方案中，抗-ALK4抗体可以抑制一种或多种GDF配体(例如，GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF11、GDF1、GDF3和/或Nodal)结合ALK4。在一些实施方案中，抗-ALK4是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，所述多特异性抗体结合ALK4和一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)和/或额外的I型受体(例如，ALK5和/或ALK7)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗-ALK4抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF1、GDF3和/或Nodal)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)和/或额外的I型受体(例如，ALK5和/或ALK7)。在一些实施方案中，结合ALK4的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，包含ALK4抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ALK5的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合ALK5。如本文所用，ALK5抗体(或抗-ALK5抗体)通常是指以足够的亲和性与ALK5结合使得所述抗体可用作靶向ALK5的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ALK5抗体与不相关的非ALK5蛋白的结合程度小于所述抗体与ALK5的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，抗-ALK5抗体结合在来自不同物种的ALK5中保守的ALK5的表位。在某些优选的实施方案中，抗-ALK5抗体结合人ALK5。在一些实施方案中，抗-ALK5抗体可以抑制一种或多种GDF配体(例如，GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF11、GDF1、GDF3和/或Nodal)结合ALK5。在一些实施方案中，抗-ALK5是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，所述多特异性抗体结合ALK5和一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)和/或额外的I型受体(例如，ALK4和/或ALK7)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗-ALK5抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)和/或额外的I型受体(例如，ALK4和/或ALK7)。在一些实施方案中，结合ALK5的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，包含ALK5抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制ALK7的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合ALK7。如本文所用，ALK7抗体(或抗-ALK7抗体)通常是指以足够的亲和性与ALK7结合使得所述抗体可用作靶向ALK7的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-ALK7抗体与不相关的非ALK7蛋白的结合程度小于所述抗体与ALK7的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，抗-ALK7抗体结合在来自不同物种的ALK7中保守的ALK7的表位。在某些优选的实施方案中，抗-ALK7抗体结合人ALK7。在一些实施方案中，抗-ALK7抗体可以抑制一种或多种GDF配体(例如，GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF11、GDF1、GDF3和/或Nodal)结合ALK7。在一些实施方案中，抗-ALK7是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，所述多特异性抗体结合ALK7和一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic1B)和/或额外的I型受体(例如，ALK4和/或ALK5)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗-ALK7抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)和/或额外的I型受体(例如，ALK4和/或ALK5)。在一些实施方案中，结合ALK7的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，包含ALK7抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制Cripto的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合Cripto。如本文所用，Cripto抗体(或抗-Cripto抗体)通常是指以足够的亲和性与Cripto结合使得所述抗体可用作靶向Cripto的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-Cripto抗体与不相关的非Cripto蛋白的结合程度小于所述抗体与Cripto的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，抗-Cripto抗体结合在来自不同物种的Cripto中保守的Cripto的表位。在某些优选的实施方案中，抗-Cripto抗体结合人Cripto。在一些实施方案中，抗-Cripto抗体可以抑制一种或多种GDF配体(例如，GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF11、GDF1、GDF3和/或Nodal)结合Cripto。在一些实施方案中，抗-Cripto是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，所述多特异性抗体结合Cripto和一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、一种或多种II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(例如，ALK4、ALK7和/或ALK5)和/或额外的辅助受体(例如，Cryptic和/或Cryptic1B)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗-Cripto抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(例如，ALK4、ALK7和/或ALK5)和/或额外的辅助受体(例如，Cryptic和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，结合Cripto的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，包含Cripto抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制Cryptic的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合Cryptic。如本文所用，Cryptic抗体(或抗-Cryptic抗体)通常是指以足够的亲和性与Cryptic结合使得所述抗体可用作靶向Cryptic的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-Cryptic抗体与不相关的非Cryptic蛋白的结合程度小于所述抗体与Cryptic的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，抗-Cryptic抗体结合在来自不同物种的Cryptic中保守的Cryptic的表位。在某些优选的实施方案中，抗-Cryptic抗体结合人Cryptic。在一些实施方案中，抗-Cryptic抗体可以抑制一种或多种GDF配体(例如，GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF11、GDF1、GDF3和/或Nodal)结合Cryptic。在一些实施方案中，抗-Cryptic是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，所述多特异性抗体结合Cryptic和一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(例如，ALK4、ALK7和/或ALK5)和/或额外的辅助受体(例如，Cripto和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗-Cryptic抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(例如，ALK4、ALK7和/或ALK5)和/或额外的辅助受体(例如，Cripto和/或Cryptic 1B)。在一些实施方案中，结合Cryptic的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，包含Cryptic抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
在某些方面，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合是至少抑制Cryptic 1B的抗体。因此，在一些实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂抗体或抗体的组合至少结合Cryptic 1B。如本文所用，Cryptic 1B抗体(或抗-Cryptic 1B抗体)通常是指以足够的亲和性与Cryptic 1B结合使得所述抗体可用作靶向Cryptic 1B的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，抗-Cryptic 1B抗体与不相关的非Cryptic 1B蛋白的结合程度小于所述抗体与Cryptic 1B的结合的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法所测量。在某些实施方案中，抗-Cryptic 1B抗体结合在来自不同物种的Cryptic 1B中保守的Cryptic 1B的表位。在某些优选的实施方案中，抗-Cryptic 1B抗体结合人Cryptic1B。在一些实施方案中，抗-Cryptic 1B抗体可以抑制一种或多种GDF配体(例如，GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF11、GDF1、GDF3和/或Nodal)结合Cryptic 1B。在一些实施方案中，抗-Cryptic 1B是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，所述多特异性抗体结合Cryptic 1B和一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(例如，ALK4、ALK7和/或ALK5)和/或额外的辅助受体(例如，Cripto和/或Cryptic)。在一些实施方案中，本公开涉及抗体的组合及其用途，其中所述抗体的组合包含抗-Cryptic 1B抗体和一种或多种额外的抗体，所述额外的抗体结合，例如，一种或多种GDF配体(例如，GDF11、GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF3、GDF1和/或Nodal)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、I型受体(例如，ALK4、ALK7和/或ALK5)和/或额外的辅助受体(例如，Cripto和/或Cryptic)。在一些实施方案中，结合Cryptic 1B的多特异性抗体不结合或基本上不结合激活素B(例如，以大于1x10-7M的KD结合激活素B或具有相对适度的结合，例如，约1x10-8M或约1x10-9M)。在一些实施方案中，包含Cryptic 1B抗体的抗体组合不包含激活素B抗体。
术语抗体在本文以最广含义使用，且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示需要的抗原-结合活性即可。抗体片段是指并非完整抗体的分子，其包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体[参见，例如，Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134；Plückthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibody，vol.113，Rosenburg和Moore编，(Springer-Verlag，New York)，pp.269-315(1994)；WO 93/16185；和美国专利号5,571,894；5,587,458；和5,869,046]。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的[参见，例如，EP 404,097；WO1993/01161；Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448]。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人(2003)Nat.Med.9:129-134。单结构域抗体是包含抗体的所有或一部分重链可变结构域或所有或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(参见，例如，美国专利号6,248,516)。本文公开的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在某些实施方案中，本公开的抗体包含与其连接并能够被检测的标记(例如，标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。在优选的实施方案中，本公开的抗体是分离的抗体。在某些优选的实施方案中，本公开的抗体是重组抗体。
本文的抗体可以使任何类别。抗体的类别是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在5个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，若干这些类别可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域被称为α、δ、ε、γ和μ。
通常，用于本文公开的方法的抗体特异性结合其靶标抗原，优选地具有高结合亲和力。亲和力可表示为KD值，反映了固有结合亲和力(例如，具有最小的抗体亲抗原性作用)。通常，结合亲和力经体外测量，无论是在无细胞还是细胞相关的设置下。本领域已知的许多测定法中的任一种，包括本文公开的那些，可用于获得结合亲和力度量，包括例如，Biacore、放射性标记的抗原-结合测定法(RIA)和ELISA。在一些实施方案中，本公开的抗体以至少1x10-7或更强、1x10-8或更强、1x10-9或更强、1x10-10或更强、1x10-11或更强、1x10-12或更强、1x10-13或更强或1x10-14或更强的KD结合它们的靶标抗原(例如，ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK5、ALK7、激活素、GDF11、GDF8、GDF3、GDF1、Nodal、Cryptic、Cryptic 1B和/或Cripto)。
在某些实施方案中，KD通过以Fab形式的目的抗体和其靶标抗原进行的RIA测量，如以下测定法所述的。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在滴定系列的未标记抗原的存在下用最小浓度的放射性标记(例如，125I-标记)的抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来测量[参见，例如，Chen等人(1999)J.Mol.Biol.293:865-881]。为了建立该测定的条件，多孔板(例如，来自Thermo Scientific)用捕获性抗-Fab抗体(例如，来自Cappel Labs)包被(例如，过夜)和随后用牛血清白蛋白封闭，优选地在室温(例如，约23℃)进行。在非吸附板中，放射性标记的抗原与系列稀释的目的Fab混合[例如，与抗-VEGF抗体Fab-12的评价一致，Presta等人，(1997)Cancer Res.57:4593-4599]。然后将目的Fab孵育，优选地过夜，但孵育可持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。之后，将混合物转移至捕获板以孵育，优选地在室温约1小时。然后除去溶液，且将板洗涤数次，优选地用聚山梨醇酯20和PBS混合物洗涤。当板已经干燥时，加入闪烁剂(例如，/>来自Packard)并将板在γ计数器(例如，/>来自Packard)上计数。
根据另一个实施方案，KD使用表面等离子体共振测定法，使用例如2000或/>3000(Biacore，Inc.，Piscataway，N.J.)用约10个响应单位(RU)的固定抗原CM5芯片测量。简言之，羧基甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)根据供应商的说明书活化。例如，抗原可用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入以实现约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。在注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，以约25μl/min的流速注入在含0.05％聚山梨醇酯表面活性剂的PBS(PBST)中的Fab的2倍系列稀释液(0.78nM至500nM)。缔合速率(kon)和解离速率(koff)使用例如，简单的一对一Langmuir结合模型(评价软件版本3.2)，通过同时拟合缔合和离解传感图谱计算。平衡离解常数(KD)计算为比率koff/kon[参见，例如，Chen等人，(1999)J.Mol.Biol.293:865-881]。如果通过上述表面等离子体共振测定法，缔合速率超过例如，106M-1s-1，则缔合速率可通过使用测量在增加浓度的抗原的存在下PBS中20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(例如，激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的荧光淬灭技术测定，如在分光计，诸如装有停流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌杯的8000-系列分光光度计(ThermoSpectronic)中测量的。
抗体片段可通过各种技术制备，包括但不限于蛋白水解消化完整抗体以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述的。人ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、激活素(激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AC、激活素AB、激活素BC、激活素BE和/或激活素AE)、GDF11、GDF8、GDF1、GDF3、Nodal、Cryptic、Cryptic 1B和Cripto的核酸序列和氨基酸序列在本领域中是已知的。另外，产生抗体的大量方法在本领域中是众所周知的，其中的一些描述于本文中。因此，根据本公开使用的抗体拮抗剂可以由本领域技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导来常规地制备。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。嵌合抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定的来源或物种而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种的抗体。某些嵌合抗体描述于例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类诸如猴的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是"类别转换"抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体改变。通常，嵌合抗体包括其抗原-结合片段。
在某些实施方案中，本文提供的嵌合抗体是人源化抗体。人源化抗体是指包含来自非人超变区(HVR)的氨基酸残基和来自人框架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体包含基本上所有或至少一个和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可至少包含源自人抗体的抗体恒定区的一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非-人抗体，是指已经过人源化的抗体。人源化抗体和制备它们的方法综述于例如，Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633和进一步描述于例如，Riechmann等人，(1988)Nature 332:323-329；Queen等人(1989)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA86:10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，(2005)Methods 36:25-34[描述了SDR(a-CDR)移接]；Padlan，Mol.Immunol.(1991)28:489-498(描述了“表面重建”)；Dall'Acqua等人(2005)Methods 36:43-60(描述了“FR改组”)；Osbourn等人(2005)Methods 36:61-68；和Klimka等Br.J.Cancer(2000)83:252-260(描述了FR改组的“引导选择”方法)。可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296)；源自特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285；和Presta等人(1993)J.Immunol.，151:2623)；人加工的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；和源自筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；和Rosok等人，(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可使用本领域已知的各种技术产生。人抗体总体描述于van Dijk和van de Winkel(2008)Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459。例如，人抗体可通过向转基因动物施用免疫原(例如，GDF11多肽、激活素B多肽、ActRIIA多肽或ActRIIB多肽)来制备，所述转基因动物已经被修饰以在响应抗原攻击时产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常包含所有或一部分的人免疫球蛋白基因座，其替换了内源免疫球蛋白基因座或其在染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因动物中，内源免疫球蛋白基因座总体上已被失活。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见，例如，Lonberg(2005)Nat.Biotech.23:1117-1125；美国专利号6,075,181和6,150,584(描述了XENOMOUSE技术)；美国专利号5,770,429(描述了技术)；美国专利号7,041,870(描述了K-M/>技术)；和美国专利申请公开号2007/0061900(描述了技术)。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可被进一步修饰，例如，通过与不同的人恒定区组合。
本文提供的人抗体还可通过基于杂交瘤的方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系已有描述(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,(1984)133:3001；Brodeur等人(1987)Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York；和Boerner等人(1991)J.Immunol.,147:86)。通过人B-细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人，(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562。额外的方法包括描述于例如，美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue(2006)26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)还描述于Vollmers和Brandlein(2005)Histol.Histopathol.，20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein(2005)Methods Find Exp.Clin.Pharmacol.，27(3):185-91。本文提供的人抗体还可通过分离选自人-衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变-结构域序列来产生。此类可变-结构域序列然后可与需要的人恒定结构域组合。从抗体文库选择人抗体的技术在本领域中是已知的，并在本文中描述。
例如，本公开的抗体可通过筛选组合文库中的具有所需的一种或多种活性的抗体来分离。产生噬菌体展示文库和筛选此类文库的具有所需结合特征的抗体的各种方法是本领域已知的。此类方法综述于例如，Hoogenboom等人(2001)的Methods in MolecularBiology 178:1-37，O'Brien等人编，Human Press，Totowa，N.J.且进一步描述于例如，McCafferty等人(1991)Nature 348:552-554；Clackson等人，(1991)Nature352:624-628；Marks等人(1992)J.Mol.Biol.222:581-597；Marks和Bradbury(2003)的Methods inMolecularBiology 248:161-175，Lo编，Human Press，Totowa，N.J.；Sidhu等人(2004)J.Mol.Biol.338(2):299-310；Lee等人(2004)J.Mol.Biol.340(5):1073-1093；Fellouse(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472；和Lee等人(2004)J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因库分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆和在噬菌体文库中随机重组，其然后可对于抗原-结合噬菌体进行筛选，如描述于Winter等人(1994)Ann.Rev.Immunol.，12:433-455。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自免疫来源的文库提供对免疫原(例如，激活素A)的高-亲和力抗体，不需要构建杂交瘤。可选地，天然库可被克隆(例如，从人)以提供针对各种非-自身以及自身抗原的单一来源的抗体，不需要任何免疫，如描述于Griffiths等人(1993)EMBO J，12:725-734。最后，天然文库还可通过从干细胞克隆未重排V-基因区段和使用包含随机序列的PCR引物合成制备，以编码高度可变的CDR3区和实现体外重排，如描述于Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227:381-388。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体(通常单克隆抗体)具有对一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种或更多种)抗原上的至少两个不同的表位(例如，两个、三个、四个、五个或六个或更多个)的结合特异性。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同的特异性的两个免疫球蛋白重链/轻链对的重组共表达[参见，例如，Milstein和Cuello(1983)Nature 305：537；国际专利公开号WO 93/08829；和Traunecker等人(1991)EMBO J.10：3655和美国专利号5,731,168(“杵臼”工程改造)]。多特异性抗体还可通过用于制备抗体Fc-异源二聚体分子的工程改造静电转向效应(参见，例如，WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段[参见，例如，美国专利号4,676,980；和Brennan等人(1985)Science，229：81]；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体[参见，例如，Kostelny等人(1992)J.Immunol.，148(5)：1547-1553]；使用“双抗体”技术以制备双特异性抗体片段[参见，例如，Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448]；使用单链Fv(sFv)二聚体[参见，例如，Gruber等人(1994)J.Immunol.，152：5368]；和制备三特异性抗体(参见，例如，Tutt等人(1991)J.Immunol.147：60)制备。多特异性抗体可作为全长抗体或抗体片段制备。具有三个或更多个功能抗原结合位点的工程改造的抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”，也包括在本文中[参见，例如，US 2006/0025576A1]。
在某些实施方案中，本文公开的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是指获得自一群基本上同质的抗体的抗体，即，组成该群的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外，例如，包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间产生，此类变体通常以较少量存在。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一表位。因此，修饰语“单克隆”表示获得自基本同质的抗体群的抗体的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的方法使用的单克隆抗体可通过各种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用包含所有或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法和制备单克隆抗体的其它示例性方法在本文中描述。
例如，通过使用源自激活素的免疫原，抗-蛋白/抗-肽抗血清或单克隆抗体可通过标准方案制备[参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual，由Harlow和Lane编(1988)Cold Spring Harbor Press:1988]。哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔，可用免疫原性形式的激活素多肽(一种能够引发抗体反应的抗原片段)或融合蛋白免疫。赋予蛋白或肽免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域熟知的其它技术。激活素多肽的免疫原性部分可在佐剂的存在下施用。免疫进展可通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测。标准ELISA或其它免疫测定法可利用作为抗原的免疫原用于评价抗体产生水平和/或结合亲和力水平。
用激活素的抗原制剂免疫动物后，可获得抗血清，并且如果需要，可从血清分离多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，产生抗体的细胞(淋巴细胞)可自免疫的动物收获，且通过标准体细胞融合程序与永生细胞诸如骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞。此类技术是本领域众所周知的且包括例如，杂交瘤技术[参见，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature，256:495-497]、人B细胞杂交瘤技术[参见，例如，Kozbar等人(1983)Immunology Today，4:72]和产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole等人(1985)Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96]。杂交瘤细胞可经免疫化学筛选以产生与激活素多肽特异性反应的抗体和从包含此类杂交瘤细胞的培养物分离单克隆抗体。
在某些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换、缺失和/或添加)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
例如，本公开考虑了具有一些但并非所有效应功能的抗体变体，这使得对于其中抗体体内半衰期是重要的但其某些效应功能[例如，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)]是不需要的或有害的应用，它成为理想的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，但单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于例如，Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9:457-492。评价目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom,I.等人(1986)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 83:7059-7063]；Hellstrom,I等人(1985)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 82:1499-1502；美国专利号5,821,337；和Bruggemann,M.等人(1987)J.Exp.Med.166:1351-1361。可选地，可使用非-放射性测定方法(例如，ACTITM，用于流式细胞术的非-放射性细胞毒性测定法；CellTechnology，Inc.MountainView，Calif.；和CytoTox非-放射性细胞毒性测定法，Promega，Madison，Wis.)。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选地，或另外地，目的分子的ADCC活性可体内评价，例如，在动物模型中，诸如公开于Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656。也可进行C1q结合测定法以证实抗体不能结合C1q和因此缺少CDC活性[参见，例如，WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA]。为了评价补体活化，可进行CDC测定法[参见，例如，Gazzano-Santoro等人(1996)J.Immunol.Methods 202:163；Cragg，M.S.等人(2003)Blood101:1045-1052；和Cragg，M.S和M.J.Glennie(2004)Blood103:2738-2743]。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可使用本领域已知的方法进行[参见，例如，Petkova，S.B.等人(2006)Int.Immunol.18(12):1759-1769]。具有减少的效应功能的本公开的抗体包括其中Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被置换的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸置换这些残基，反应性硫醇基团从而位于抗体的可接近位点处，并可用于使抗体与其它部分诸如药物部分或接头-药物部分缀合，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任一种或多种可被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程改造的抗体可按例如美国专利号7,521,541中所述产生。
此外，用于筛选抗体以鉴定需要的抗体的技术可影响获得的抗体的性质。例如，如果抗体用于在溶液中结合抗原，可能需要测试溶液结合。可获得各种不同的技术以测试抗体和抗原之间的相互作用，以鉴定特别需要的抗体。此类技术包括ELISA、表面等离子体共振结合测定法(例如，Biacore结合测定法，Biacore AB，Uppsala，Sweden)、夹心测定法(例如，IGEN International，Inc.，Gaithersburg，Maryland的顺磁珠***)、蛋白质印迹、免疫沉淀测定法和免疫组织化学。
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能需要改进抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其它生物学性质。抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体可通过向编码所述抗体和/或结合多肽的核苷酸序列中引入合适的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如，抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或***和/或置换。可进行缺失、***和置换的任何组合以实现最终的构建体，只要最终的构建体具有需要的特征，例如，靶标结合(例如，和激活素诸如激活素E和/或激活素C结合)。
可在HVR中进行改变(例如，置换)，例如以改进抗体亲和力。此类改变可在HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程中经过高频率突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury(2008)Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行，其中测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。本领域已描述通过构建二级文库和从中再选择的亲和力成熟[参见，例如，Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37，O'Brien等人编，Human Press，Totowa，N.J.，(2001)]。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过各种方法中的任一种将多样性引入经选择用于成熟的可变基因中(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸-定点诱变)。然后产生二级文库。然后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法包括HVR-定向方法，其中数个HVR残基(例如，一次4-6残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可被特别鉴定，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别是，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换、***或缺失可在一个或多个HVR内发生，只要此类改变基本上不减少抗体结合抗原的能力。例如，基本上不减少结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守置换)可在HVR中进行。此类改变可在HVR“热点”或SDR外。在上述提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
可用于鉴定抗体和/或结合多肽的可靶向诱变的残基或区域的方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如描述于Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085。在该方法中，一个残基或一组靶残基(例如，带电荷残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)被鉴定和被中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多聚丙氨酸)置换，以确定抗体-抗原相互作用是否受到影响。进一步的置换可在证实对初始置换有功能敏感性的氨基酸位置处引入。可选地，或另外地，确定抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可作为置换候选者被靶向或消除。变体可经筛选以确定它们是否包含需要的性质。
氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至包含一百或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它***变体包括抗体的N-或C-末端融合至酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽。
在某些实施方案中，本文提供的抗体和/或结合多肽可进一步修饰以包含本领域已知的和容易获得的另外的非蛋白性部分。适合于衍生抗体和/或结合多肽的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环已烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛由于其水稳定性可具有制造益处。聚合物可具有任何分子量且可以是分支的或未分支的。连接至抗体和/或结合多肽的聚合物的数量可改变，且如果连接超过一个聚合物，它们可以是相同的或不同的分子。通常，用于衍生的聚合物的数量和/或类型可根据以下考虑来确定，包括但不限于待改进的抗体和/或结合多肽的特定性质或功能，抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否将在限定的条件下用于疗法。
6.小分子拮抗剂
在其它方面，根据本文所述的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂是小分子(激活素和/或GDF小分子拮抗剂)或小分子拮抗剂的组合。GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以抑制，例如，一种或多种GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF8、GDF3、GDF1和/或Nodal)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、II型受体(例如，ActRIIB和/或ActRIIA)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)和/或Smad多肽(例如，Smad2和/或Smad3)。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合抑制由一种或多种GDF配体介导的信号传导，例如，如在基于细胞的测定法中所测定，所述基于细胞的测定法诸如本文所述的那些。如本文所述，GDF小分子拮抗剂可以单独使用或与一种或多种支持疗法和/或活性剂组合使用以治疗或降低肾脏疾病的进展速度、频次和/或严重性，特别是治疗、预防或降低一种或多种肾脏疾病相关的并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的进展速度、频次和/或严重性。
在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF11，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF8，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF11、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制激活素(激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制激活素B，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素A、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制激活素A，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：激活素(例如，激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF1，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF11、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制Nodal，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1、GDF11、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制GDF3，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制Cripto，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制Cryptic，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制Cryptic 1B，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ActRIIA，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic 1B、Cryptic、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ActRIIB，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic 1B、Cryptic、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ALK4，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic 1B、Cryptic、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ALK5，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK7、Cripto、Cryptic 1B、Cryptic、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制ALK7，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK5、ALK4、Cripto、Cryptic 1B、Cryptic、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制Smad2，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK5、ALK4、ALK7、Cripto、Cryptic 1B、Cryptic和Smad3。在一些实施方案中，GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合至少抑制Smad3，任选地进一步抑制下列中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK5、ALK4、ALK7、Cripto、Cryptic 1B、Cryptic和Smad2。在一些实施方案中，如本文所公开的GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制激活素B。一些实施方案中，如本文所公开的GDF小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制激活素A。GDF小分子拮抗剂可以是直接或间接抑制剂。例如，间接小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以抑制至少一种或多种GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE或激活素BE)、GDF11、GDF1、Nodal、GDF3和/或GDF8)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、辅助受体(例如，Cryptic、Cryptic 1B和/或Cripto)和/或一种或多种下游信号传导成分(例如，Smad，诸如Smad2和Smad3)的表达(例如，转录、翻译、细胞分泌或其组合)。可选地，直接小分子拮抗剂或小分子拮抗剂的组合可以直接结合并抑制，例如，一种或多种GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE或激活素BE)、GDF11、GDF1、Nodal、GDF3和/或GDF8)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、辅助受体(例如，Cryptic、Cryptic 1B和/或Cripto)和/或一种或多种下游信号传导成分(例如，Smad，诸如Smad2和Smad3)。一种或多种间接和一种或多种直接GDF小分子拮抗剂的组合可以根据本文公开的方法使用。
本公开的结合有机小分子可以是例如，醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、碳二酰肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫代缩酮、缩醛、硫代缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸酯、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯、炔、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮基化合物和酰基氯。
7.多核苷酸拮抗剂
在其它方面中，根据本文公开的方法和用途使用的激活素和/或GDF拮抗剂是多核苷酸(激活素和/或GDF多核苷酸拮抗剂)或多核苷酸的组合。GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合可以抑制，例如，一种或多种GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE或激活素BE)、GDF11、GDF8、GDF3、GDF1和/或Nodal)、I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)、II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、辅助受体(例如，Cryptic、Cryptic 1B和/或Cripto)和/或一种或多种下游信号传导成分(例如，Smad，诸如Smad2和Smad3)。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合抑制由一种或多种GDF配体介导的信号传导，例如，如在基于细胞的测定法中所测定，所述基于细胞的测定法诸如本文所述的那些。如本文所述，GDF多核苷酸拮抗剂可以单独使用或与一种或多种支持疗法和/或活性剂组合使用以治疗或降低肾脏疾病的进展速度、频次和/或严重性，特别是治疗、预防或降低一种或多种肾脏疾病相关的并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的进展速度、频次和/或严重性。
在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF11，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF8,任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF11、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制激活素(激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制激活素A、任选地进一步抑制以下中的一种或多种：额外的激活素(例如，激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制激活素B，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：额外的激活素(激活素A、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF1，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF11、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制Nodal，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF3、GDF11、GDF1、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制GDF3，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF1、GDF11、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制Cripto，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制Cryptic，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cripto、Cryptic 1B、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制Cryptic1B，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cripto、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ActRIIA，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Cripto、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ActRIIB，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Cripto、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ALK4，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ActRIIA、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Cripto、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ALK5，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ActRIIA、ALK4、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Cripto、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制ALK7，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ActRIIA、ALK5、ALK4、Cryptic、Cryptic1B、Cripto、Smad2和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制Smad2，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ActRIIA、ALK5、ALK4、ALK7、Cryptic、Cryptic1B、Cripto和Smad3。在一些实施方案中，GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合至少抑制Smad3，任选地进一步抑制以下中的一种或多种：GDF8、激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE和/或激活素BE)、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIB、ActRIIA、ALK5、ALK4、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Cripto和Smad2。在一些实施方案中，如本文所公开的GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制激活素B。一些实施方案中，如本文所公开的GDF多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制激活素A。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸拮抗剂可以是反义核酸、RNAi分子[例如，小干扰RNA(siRNA)、小-发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)]、适配体和/或核酶。人GDF11、GDF8、激活素(激活素A、激活素B、激活素C和激活素E)、GDF1、Nodal、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、Cryptic、Cryptic 1B、Cripto、ALK4、ALK5、ALK7、Smad2,和Smad3的核酸和氨基酸序列是本领域已知的。另外，产生多核苷酸拮抗剂的许多不同方法在本领域中是众所周知的。因此，根据本公开使用的多核苷酸拮抗剂可由本领域技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导常规制备。
反义技术可通过反义DNA或RNA或通过三股螺旋形成，用于控制基因表达。反义技术论述于例如，Okano(1991)J.Neurochem.56:560；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,Fla.(1988)。三股螺旋形成论述于例如，Cooney等人(1988)Science 241:456；和Dervan等人，(1991)Science 251:1300。该方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。在一些实施方案中，反义核酸包含单链的RNA或DNA序列，其与本文公开的基因的RNA转录物的至少一部分互补。然而，绝对互补性尽管是优选的，但不是必需的。
本文提及的“与RNA的至少一部分互补的”序列是指具有足够的互补性能够与RNA杂交，形成稳定的双链体的序列；在本文公开的基因的双链反义核酸的情况下，可因此测试双链体DNA的单链，或可测定三链体形成。杂交能力取决于互补性的程度和反义核酸的长度。通常，杂交核酸越长，其可包含越多的与RNA的碱基错配，且仍形成稳定的双链体(或根据情况，三链体)。本领域技术人员可通过使用确定杂交复合物的解链温度的标准程序来确定错配的耐受程度。
与信使的5'端、例如直至和包括AUG起始密码子的5'-非翻译序列互补的多核苷酸应在抑制翻译中最有效地起作用。然而，与mRNA的3'-非翻译序列互补的序列已表明也有效抑制mRNA的翻译[参见，例如，Wagner，R.，(1994)Nature 372:333-335]。因此，与本公开的基因的5'-或3'-非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法以抑制内源mRNA的翻译。与mRNA的5'-非翻译区互补的多核苷酸应包括AUG起始密码子的组分。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是较不有效的翻译抑制剂，但能够根据本公开的方法使用。无论设计为与本公开的mRNA的5'-、3'-或编码区杂交，反义核酸应为至少6个核苷酸长度和优选地范围为6-约50个核苷酸长度的寡核苷酸。在特别的方面，寡核苷酸为至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
在一个实施方案中，本公开的反义核酸通过自异源序列转录在细胞内产生。例如，载体或其部分经转录，产生本公开的基因的反义核酸(RNA)。此类载体包含编码需要的反义核酸的序列。此类载体可保持为附加体或成为染色体整合的，只要它可被转录以产生需要的反义RNA即可。此类载体可通过本领域标准的重组DNA技术方法构建。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的其它载体，用于在脊椎动物细胞中复制和表达。编码本公开的需要的基因或其片段的序列的表达可通过本领域已知的在脊椎动物、优选地人细胞中起作用的任何启动子进行。此类启动子可以是诱导型或组成型的。此类启动子包括但不限于SV40早期启动子区[参见，例如，Benoist和Chambon(1981)Nature 290:304-310]、在劳斯肉瘤病毒的3'长-末端重复区中包含的启动子[参见，例如，Yamamoto等人(1980)Cell 22:787-797]、疱疹胸腺嘧啶启动子[参见，例如，Wagner等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445]和金属硫蛋白基因的调节序列[参见，例如，Brinster,等人(1982)Nature 296:39-42]。
在一些实施方案中，多核苷酸拮抗剂是干扰RNA(RNAi)分子，其靶向以下中的一种或多种基因的表达：GDF11、GDF8、激活素(激活素A、激活素B、激活素C和激活素E)、GDF1、GDF3、ActRIIA、ActRIIB、Cryptic、Cryptic 1B、Cripto、ALK4、ALK5、ALK7、Smad2和Smad3。RNAi是指干扰靶标mRNA的表达的RNA的表达。具体而言，RNAi通过与特定的mRNA通过siRNA(小干扰RNA)相互作用来沉默靶标基因。ds RNA复合物然后被细胞靶向降解。siRNA分子是10-50个核苷酸长度的双链的RNA双链体，其干扰足够互补的靶基因(例如，与该基因具有至少80％同一性)的表达。在一些实施方案中，siRNA分子包含与靶基因的核苷酸序列具有至少85、90、95、96、97、98、99或100％同一性的核苷酸序列。
另外的RNAi分子包括短发夹RNA(shRNA)；以及短干扰发夹和微RNA(miRNA)。shRNA分子包含通过环连接的来自靶基因的有义和反义序列。shRNA从细胞核转运至细胞质并且其与mRNA一起降解。对于RNAi，Pol III或U6启动子可用于表达RNA。Paddison等[Genes&Dev.(2002)16:948-958，2002]已经使用折叠成发夹的小的RNA分子作为实现RNAi的手段。因此，此类短发夹RNA(shRNA)分子也可有利地用于本文所述的方法中。功能shRNA的茎和环的长度不同；茎长度范围可大概为约25-约30nt，且环大小范围可为4-约25nt而不影响沉默活性。尽管不希望受任何特定理论的束缚，认为这些shRNA类似于DICER RNase的双链RNA(dsRNA)产物，并且在任何情况下具有相同的抑制特定基因表达的能力。shRNA可从慢病毒载体表达。miRNA是约10-70个核苷酸长度的单链RNA，其初始转录为特征为“茎-环”结构的前-miRNA，且其在通过RISC进一步加工后，随后被加工成加工的miRNA。
介导RNAi的分子，包括但不限于siRNA，可通过化学合成(Hohjoh，FEBS Lett 521:195-199，2002)、dsRNA水解(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947，2002)，通过用T7 RNA聚合酶体外转录(Donzeet等人，Nucleic Acids Res 30:e46，2002；Yu等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052，2002)和使用核酸酶诸如大肠杆菌RNase III通过双链RNA水解(Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947，2002)体外产生。
根据另一方面，本公开提供了多核苷酸拮抗剂，其包括但不限于诱饵DNA、双链DNA、单链DNA、复合DNA、包封DNA、病毒DNA、质粒DNA、裸RNA、包封RNA、病毒RNA、双链RNA、能够产生RNA干扰的分子或其组合。
在一些实施方案中，本公开的多核苷酸拮抗剂是适配体。适配体是核酸分子，包括双链DNA和单链RNA分子，其结合并形成特异性结合靶分子的三级结构。适配体的产生和治疗用途是本领域充分确立的(参见,例如，美国专利号5,475,096)。关于适配体的另外信息可见于美国专利申请公开号20060148748。核酸适配体使用本领域已知的方法选择，例如通过Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment(SELEX)方法。SELEX是具有与靶分子高度特异性结合的核酸分子的体外进化的方法，如描述于例如，美国专利号5,475,096；5,580,737；5,567,588；5,707,796；5,763,177；6,011,577和6,699,843。鉴定适配体的另一筛选方法描述于美国专利号5,270,163。SELEX方法基于核酸形成各种二维和三维结构的能力，以及核苷酸单体内作为配体的可用化学多功能性(与基本上任何化学化合物(无论是单体或聚合物，包括其它核酸分子和多肽)形成特异性结合对)。任何大小或组成的分子可用作靶标。SELEX方法包括从候选寡核苷酸的混合物选择，以及结合、分隔和扩增的逐步重复，使用相同的通用选择方案，以实现需要的结合亲和力和选择性。从可包含随机化序列的区段的核酸的混合物开始，SELEX方法包括以下步骤：使混合物与靶标在有利于结合的条件下接触；分隔未结合的核酸与已经特异性结合至靶分子的那些核酸；离解核酸-靶标复合物；扩增从核酸-靶标复合物离解的核酸以得到富含配体的核酸混合物。结合、分隔、离解和扩增的步骤按需要重复许多循环，以得到以高亲和力结合并特异性针对靶标分子的核酸配体。
通常，此类结合分子单独施用于动物[参见，例如，O'Connor(1991)J.Neurochem.56:560]，但此类结合分子也可在体内从宿主细胞摄入的多核苷酸表达，和体内表达[参见，例如，Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression,CRC Press,Boca Raton,Fla.(1988)]。
8.促滤泡素抑制素和FLRG拮抗剂
在其他方面中，激活素和/或GDF拮抗剂是促滤泡素抑制素或FLRG多肽。如本文所述，促滤泡素抑制素和/或FLRG多肽可以用来治疗或降低肾脏疾病的进展速度、频次和/或严重性，特别是治疗、预防或降低一种或多种肾脏疾病相关的并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的进展速度、频次和/或严重性。
术语“促滤泡素抑制素多肽”包括包含促滤泡素抑制素的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽，且进一步包括促滤泡素抑制素的任何功能单体或多聚体。在某些优选实施方案中，本公开的促滤泡素抑制素多肽结合和/或抑制激活素活性、特别是激活素A。促滤泡素抑制素多肽的保留激活素结合特性的变体可以基于先前的涉及促滤泡素抑制素和激活素相互作用的研究鉴定。例如，WO2008/030367公开了特定的促滤泡素抑制素结构域(“FSD”)，其显示对于激活素结合是重要的。如在下文SEQ ID NO:150和151中所示，促滤泡素抑制素N-末端结构域FSD2和较少程度的FSD1代表促滤泡素抑制素内对于激活素结合是重要的示例性结构域。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文的ActRII多肽的上下文中进行描述，且此类方法还涉及制备和测试促滤泡素抑制素的变体。促滤泡素抑制素多肽包括衍生自任何已知促滤泡素抑制素的序列的多肽，其具有与促滤泡素抑制素多肽的序列具有至少约80％同一性和任选地至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的序列。促滤泡素抑制素多肽的实例包括经加工的促滤泡素抑制素多肽或人促滤泡素抑制素前体多肽的较短的同种型或其它变体，如描述于例如WO2005/025601。
促滤泡素抑制素是可以基于选择性mRNA剪接和蛋白的可变糖基化具有31-49kDa的分子量范围的单链多肽。来自促滤泡素抑制素基因的选择性剪接的mRNA编码288个氨基酸(即，FST288,SEQ ID NO:150)和315个氨基酸(即，FST315,SEQ ID NO:151)的同种型，且后者可以被蛋白水解加工以产生另一同种型，促滤泡素抑制素303(FST303)。对天然人促滤泡素抑制素多肽的氨基酸序列的分析已经揭示其包含5个结构域；信号序列(SEQ ID NO:150的氨基酸1-29)、N-末端结构域(FSTND)(SEQ ID NO:150的氨基酸30-94)、促滤泡素抑制素结构域-1(FSTFD1)(SEQ ID NO:150的氨基酸95-164)、促滤泡素抑制素结构域-2(FSTFD2)(SEQ ID NO:1的氨基酸168-239)和促滤泡素抑制素结构域-3(FSTFD3)(SEQ ID NO:150的氨基酸245-316)。参见Shimanski等人(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85:4218-4222。
人促滤泡素抑制素-288(FST288)前体具有SEQ ID NO:150(NCBI参考序列NP_006341；Uniprot P19883-2)的氨基酸序列，信号肽由点下划线表示，N-末端结构域(FSTND)由短下划线表示，且促滤泡素抑制素结构域1-3(FSTFD1、FSTFD2、FSTFD3)由实下划线表示。
经加工的人促滤泡素抑制素变体FST288具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列，N-末端结构域由短下划线表示，促滤泡素抑制素结构域1-3由实下划线表示。而且，要理解的是在第一个半胱氨酸之前的任一个初始氨基酸G或N可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何后果，并且进一步包括包含这样的稍小多肽的多肽。
人促滤泡素抑制素-315(FST315)前体具有SEQ ID NO:151(NCBI参考序列NP_037541.1；Uniprot P19883)的氨基酸序列，信号肽由点下划线表示，N-末端结构域(FSTND)由短下划线表示，且促滤泡素抑制素结构域1-3(FSTFD1、FSTFD2、FSTFD3)由实下划线表示。代表C-末端延伸部分的最后27个残基将此促滤泡素抑制素同种型与较短的促滤泡素抑制素同种型FST288区分开。
经加工的人FST315具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列，N-末端结构域由短下划线表示，且促滤泡素抑制素结构域1-3由实下划线表示。而且，要理解的是在第一个半胱氨酸之前的任一个初始氨基酸G或N可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何后果，并且进一步包括包含这样的稍短多肽的多肽。
本公开的促滤泡素抑制素-相关多肽可以包括包含促滤泡素抑制素蛋白的任何天然存在的结构域以及其保留有用活性的变体(包括突变体、片段和拟肽形式)的多肽。例如，众所周知FST315和FST288对肌抑素、激活素(激活素A和激活素B)和GDF11具有高亲和性，并且促滤泡素抑制素结构域(例如，FSTND、FSTFD1、FSTFD2和FSTFD3)被认为参与此类TGFβ配体的结合。然而，有证据表明这四个结构域中的每一种对这些TGF-β配体具有不同的亲和性。例如，最近的研究已经证明仅包含N-末端结构域和串联的两个FSTFD1结构域的多肽构建体保留了对肌抑素的高亲和性，证明了对激活素亲和性很小或没有亲和性，并且当通过基因表达引入到鼠中时促进全身肌肉生长(Nakatani等人(2008)FASEB 22:478-487)。因此，本公开部分地涵盖促滤泡素抑制素蛋白变体，所述变体证明相对于天然存在的FST蛋白选择性地结合和/或抑制给定的TGFβ配体(例如，保持了对肌抑素的高亲和性，同时具有对激活素显著减小的亲和性)。
通过表达为还包含FSTND结构域的多肽，FSTFD1序列可以在结构上被有利地保持。因此，本公开包括包含FSTND-FSTFD1序列，如SEQ ID NO:154所示，以及例如，一个或多个异源多肽的多肽，而且，要理解的是，在第一个半胱氨酸之前的任一个初始氨基酸G或N可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何后果，并且进一步包括包含这样的稍短多肽的多肽。
如Nakatani人所证明，FSTND-FSTFD1-FSTFD1构建体当在小鼠中基因表达时足以引起全身肌肉生长，并且因此本公开包括包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列以及例如，一个或多个异源多肽的多肽。
尽管FSTFD1序列赋予了肌抑素和GDF11结合，已经证明激活素，特别是激活素A以及激活素B还是肌肉的负调控物，并且因此抑制肌抑素/GDF11配体组和激活素A/激活素B配体组两者的促滤泡素抑制素多肽可以提供更强力的肌肉效应。鉴于FSTFD2赋予了激活素A和B结合，本公开提供了包含FSTFD1-FSTFD2(SEQ ID NO:156)和FSTFD1-FSTFD2-FSTFD3(SEQ ID NO:157)，和包含FSTND-FSTFD1-FSTFD2(SEQ ID NO:158)的构建体以及例如，一个或多个异源多肽的多肽。
在某些实施方案中，291个氨基酸的促滤泡素抑制素多肽(代表天然存在的FST315的截短物)可以具有有利的特性。因此，未加工的(SEQ ID NO:159)和经加工的FST291(SEQID NO:160)多肽包括在本公开内，并且可以与异源蛋白组合。此外，要理解的是在第一个半胱氨酸之前的任一个初始氨基酸G或N可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何后果，并且进一步包括包含这样的稍短多肽的多肽。
促滤泡素抑制素蛋白在本文中可称作FST。如果跟随有数字，诸如FST288，这表示该蛋白是促滤泡素抑制素的288-氨基酸同种型。如果表示为FST288-Fc，这表示Fc结构域融合到FST288的C-末端，其可以包含或不包含中间接头。在此例子中的Fc可以是任何免疫球蛋白Fc部分，如本文所定义的该术语。如果表示为FST288-G1Fc，这表示人IgG1的Fc部分在FST288的C-末端处融合。除非有相反说明，否则以此术语描述的蛋白均代表人促滤泡素抑制素蛋白。
在其它方面，根据本文公开的方法使用的作用剂是促滤泡素抑制素-样相关基因(FLRG)，也称为促滤泡素抑制素-相关蛋白3(FSTL3)。术语“FLRG多肽”包括包含FLRG的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。在某些优选实施方案中，本公开的FLRG多肽结合和/或抑制激活素活性、特别是激活素A。FLRG多肽的保留激活素结合特性的变体可以使用测定FLRG和激活素相互作用的常规方法鉴定(参见，例如，US 6,537,966)。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文的ActRII多肽的上下文中进行描述，且此类方法还涉及制备和测试FLRG的变体。FLRG多肽包括衍生自任何已知FLRG的序列的多肽，其具有与FLRG多肽的序列具有至少约80％同一性和任选地至少85％、90％、95％、97％、99％或更大同一性的序列。
由FSTN编码的与天然促滤泡素抑制素密切相关的同种型是由FSTL3基因编码的天然存在的蛋白，并且已知可选地称为促滤泡素抑制素相关基因(FLRG)、促滤泡素抑制素-样3(FSTL3)或促滤泡素抑制素-相关蛋白(FSRP)(Schneyer等人(2001)Mol Cell Endocrinol180:33-38)。类似于促滤泡素抑制素，FLRG以高亲和性结合肌抑素、激活素和GDF11，并且由此抑制它们的体内生物活性(Sidis等人(2006)Endocrinology 147:3586-3597)。不像促滤泡素抑制素，FLRG不具有肝素结合序列，不能结合细胞表面蛋白聚糖，并且因此在细胞表面附近是激活素的不如FST288强力的抑制剂。与促滤泡素抑制素相反，FLRG也在血液中循环，结合经加工的肌抑素，并且因此就此而言类似于肌抑素前肽(Hill等人(2002)J Biol Chem277:40735-40741)。不像促滤泡素抑制素，在小鼠中FLRG缺乏并不是致死性的，尽管其确实引起多种多样的代谢性显型(Mukherjee等人(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104:1348-1353)。
FLRG的总体结构非常类似于促滤泡素抑制素。天然的人FLRG前体是单链多肽，其包含4个结构域：信号序列(SEQ ID NO:161的氨基酸1-26)、N-末端结构域(FLRGND)(SEQ IDNO:161的氨基酸38-96，其与肌抑素的相互作用不同于激活素A(Cash等人(2012)J BiolChem287:1043-1053))，和称为FLRGFD1(SEQ ID NO:161的氨基酸99-167)和FLRGFD2(SEQ IDNO:161的氨基酸171-243)的两个促滤泡素抑制素结构域。
术语“FLRG多肽”用来指包含FLRG的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。在某些优选的实施方案中，本公开的FLRG多肽结合和/或抑制肌抑素、GDF11或激活素，特别是激活素A的活性(例如，ActRIIA和/或ActRIIB Smad2/3信号传导的配体介导的激活)。FLRG多肽的保留配体结合特性的变体可以使用测定FLRG和配体之间相互作用的常规方法鉴定(参见，例如，US 6,537,966)。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文中进行描述，且此类方法还涉及制备和测试FLRG的变体。
例如，FLRG多肽包括包含衍生自任何已知FLRG的序列的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有与FLRG多肽的序列(例如，SEQ ID NO:161-164)具有至少约80％同一性和任选地与SEQ ID NO:161-164中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、99％或更大同一性的序列。术语“FLRG融合多肽”可以指包含上面提到的任一种多肽以及异源(非-FLRG)的部分的融合蛋白。如果不是在人FLRG(由SEQ ID NO:161表示)中唯一存在的，则氨基酸序列要理解为与FLRG异源。本文提供了异源部分的许多实例，并且此类异源部分可以通过氨基酸序列紧邻融合蛋白的FLRG多肽部分，或被中间氨基酸序列(诸如接头或其他序列)隔开。
人FLRG前体具有下列的氨基酸序列(SEQ ID NO:161)(NCBI参考序列NP_005851.1的氨基酸1-263),信号肽由点下划线表示，N-末端结构域(FLRGND)由短下划线表示，且两个促滤泡素抑制素结构域(FSTFD1、FSTFD2)由实下划线表示。
经加工的人FLRG包含下列的氨基酸序列(SEQ ID NO:162)(NCBI参考序列NP_005851.1的氨基酸38-263)，N-末端结构域由短下划线表示，且两个促滤泡素抑制素结构域由实下划线表示。而且，要理解的是，可以包括在第一个半胱氨酸(SEQ ID NO:161中的38位)之前的任一个氨基酸(SEQ ID NO:161的27-37位)可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何实质性后果，并且包括包含这样的稍长多肽的多肽。
通过表达为还包含FLRGND结构域的多肽，FLRGFD序列可以在结构上被有利地保持。因此，本公开包括包含FLRGND-FLRGFD1序列(SEQ ID NO:163)和FLRGND-FLRGFD1-FLRGFD2序列(SEQ ID NO:164)，如下所示，以及例如，一个或多个异源多肽的多肽。而且，要理解的是，在第一个半胱氨酸之前的任一个初始氨基酸G或N可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何后果，并且进一步包括包含这样的稍短多肽的多肽。
如果表示为FLRG-Fc，这表示Fc结构域融合到FLRG的C-末端，其可以包含或不包含中间接头。在此例子中的Fc可以是任何免疫球蛋白Fc部分，如本文所定义的该术语。如果表示为FLRG-G1Fc，这表示人IgG1的Fc部分在FLRG的C-末端处融合。除非有相反说明，否则以此术语描述的蛋白均代表人FLRG蛋白。
在某些实施方案中，促滤泡素抑制素多肽和FLRG多肽的功能变体或修饰形式包括具有促滤泡素抑制素多肽或FLRG多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域的融合蛋白，所述结构域诸如,例如，促进所述多肽的分离、检测、稳定或多聚化的结构域。合适的融合结构域在上面关于ActRII多肽详细讨论。在一些实施方案中，本公开的拮抗剂是包含融合到Fc结构域的促滤泡素抑制素多肽的激活素结合部分的融合蛋白。在另一个实施方案中，本公开的拮抗剂是包含融合到Fc结构域的FLRG多肽的激活素结合部分的融合蛋白。
9.WFIKKN1和WFIKKN2
除了FSTN和FSTL3以外，已经鉴定了两种其他基因，其蛋白产物含有促滤泡素抑制素结构域基序并且作为肌抑素和GDF11的细胞外抑制剂起作用。在人中，这些密切相关的基因基于它们共有的结构域结构被命名为WFIKKN1和WFIKKN2，所述共有的结构域结构包括乳清酸蛋白结构域、促滤泡素抑制素-Kazal结构域、免疫球蛋白结构域、两个与Kunitz-型蛋白酶抑制剂模块相关的串联结构和netrin结构域(Trexler等人(2001)Proc Natl AcadSci USA 98:3705-3709；Trexler等人(2002)Biol Chem 383:223-228)。基于其配体结合能力，WFIKKN2也称为WFIKKN-相关蛋白(WFIKKNRP)，并且这些蛋白的鼠源副本分别被命名为GDF-相关血清蛋白-2(Gasp2)和Gasp1(Hill等人(2003)Mol Endocrinol 17:1144-1154)。
天然的WFIKKN1(GASP2)和WFIKKN2(GASP1)蛋白具有重叠的活性谱，尽管如此它们彼此截然不同且与促滤泡素抑制素或FLRG也截然不同。WFIKKN以高亲和力结合肌抑素、GDF11，并且在一些情况下结合肌抑素前肽，与经加工的配体的结合主要由促滤泡素抑制素结构域(WFIKKN1FD、WFIKKN2FD)介导，与前肽的结合主要由netrin结构域(Hill等人，2003；Kondas等人(2008)J Biol Chem 283:23677-23684)介导。与促滤泡素抑制素和FLRG相反，WFIKKN1和WFIKKN2都不结合激活素(Szláma等人(2010)FEBS J 277:5040-5050)。WFIKKN蛋白通过阻断肌抑素和GDF11接触激活素II型受体来抑制它们的信号传导(Lee等人(2013)Proc Natl Acad Sci USA 110:E3713-E3722)。由于在两种WFIKKN中数种蛋白酶抑制性模块的存在，有可能它们也调节多种类型蛋白酶的作用。WFIKKN1的组织表达谱在出生前和出生后均不同于WFIKKN2，由此支持了下面的观点：两种蛋白充当截然不同的角色(Trexler等人(2002)Biol Chem 383:223-228)。
另外的证据线提示WFIKKN参与骨骼肌质量的调控。纯合缺失WFIKKN1或WFIKKN2的小鼠表现出与肌抑素和GDF11的过高活性一致的显型，包括肌肉重量减少，纤维类型从快速糖酵解IIb型纤维转换为快速氧化IIa型纤维，以及肌肉再生受损(Lee等人(2013)ProcNatl Acad Sci USA 110:E3713-E3722)。相反地，WFIKKN2在小鼠中的广泛过表达主要导致肌肉增多表型(Monestier等人(2012)BMC Genomics13:541-551)。尽管两种WFIKKN蛋白结合肌抑素，但WFIKKIN1和WFIKKN2可以与肌抑素前肽不同地相互作用，并且因此可以通过半潜肌抑素不同地阻断ActRIIA或ActRIIB的激活，所述半潜肌抑素是肌抑素和单一肌抑素前肽链之间的天然复合物(Szláma等人(2013)FEBS J280:3822-3839)。总起来，包含如本文公开的WFIKKN1或WFIKKN2多肽的促滤泡素抑制素-相关融合蛋白预期有助于体内治疗或缓解与肾脏疾病相关的一种或多种症状(诸如肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)而不会潜在地导致与抑制内源性激活素相关的不良效应。
术语“WFIKKN1多肽”用来指包含WFIKKN1的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。在某些优选的实施方案中，本公开的WFIKKN1多肽结合和/或抑制肌抑素、肌抑素前肽、肌抑素和其前肽之间的复合物、GDF11，以及潜在地激活素的活性(例如，ActRIIA和/或ActRIIB Smad2/3信号传导的配体介导的激活)。WFIKKN1多肽的保留配体结合特性的变体可以使用测定WFIKKN1和配体之间相互作用的常规方法鉴定(参见，例如，Kondas等人，2008；Szláma等人，2013)。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文中进行描述，且此类方法还涉及制备和测试WFIKKN1的变体。
例如，WFIKKN1多肽包括包含衍生自任何已知WFIKKN1多肽的序列的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有与WFIKKN1多肽的序列(例如，SEQ ID NO:165-167)具有至少约80％同一性和任选地与SEQ ID NO:165-167中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、99％或更大同一性的序列。术语“WFIKKN1融合多肽”可以指包含上面提到的任一种多肽以及异源(非-WFIKKN1)部分的融合蛋白。如果不是在人WFIKKN1(由SEQ ID NO:165表示)中唯一存在的，则氨基酸序列要理解为与WFIKKN1异源。本文提供了异源部分的许多实例，并且此类异源部分可以通过氨基酸序列紧邻融合蛋白的WFIKKN1多肽部分，或被中间氨基酸序列(诸如接头或其他序列)隔开。
人WFIKKN1前体具有SEQ ID NO:165(NCBI Ref Seq NP_444514.1)的氨基酸序列,信号肽由点下划线表示，且促滤泡素抑制素结构域(WFIKKN1FD)由实下划线表示。
经加工的人WFIKKN1具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列，其中促滤泡素抑制素结构域由实下划线表示。此外，要理解的是，在第一个半胱氨酸之前的13个氨基酸中的任一个可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何后果，并且进一步包括包含这样的稍小多肽的多肽。
在某些方面，本公开包括包含如下所示(SEQ ID NO:167)的WFIKKN1FD结构域和例如，一个或多个异源多肽的多肽。
如果表示为WFIKKN1-Fc，这表示Fc部分融合到WFIKKN1的C-末端，其可以包含或不包含中间接头。在此例子中的Fc可以是任何免疫球蛋白Fc部分，如本文所定义的该术语。如果表示为WFIKKN1-G1Fc，这表示人IgG1的Fc部分在WFIKKN1的C-末端处融合。除非有相反说明，否则以此术语描述的蛋白均代表人WFIKKN1蛋白。
术语“WFIKKN2多肽”用来指包含WFIKKN2的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽。在某些优选的实施方案中，本公开的WFIKKN2多肽结合和/或抑制肌抑素、肌抑素前肽、肌抑素和其前肽之间的复合物、GDF11，以及潜在地激活素的活性(例如，ActRIIA和/或ActRIIB Smad2/3信号传导的配体介导的激活)。WFIKKN2多肽的保留配体结合特性的变体可以使用测定WFIKKN2和配体之间相互作用的常规方法鉴定(参见，例如，Kondas等人(2008)J Biol Chem 283:23677-23684；Szláma等人(2013)FEBS J 280:3822-3839)。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文中进行描述，且此类方法还涉及制备和测试WFIKKN2的变体。
例如，WFIKKN2多肽包括包含衍生自任何已知WFIKKN2多肽的序列的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有与WFIKKN2多肽的序列(例如，SEQ ID NO:168-172)具有至少约80％同一性和任选地与SEQ ID NO:168-172中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、99％或更大同一性的序列。术语“WFIKKN2融合多肽”可以指包含上面提到的任一种多肽以及异源(非-WFIKKN2)部分的融合蛋白。如果不是在人WFIKKN2(由SEQ ID NO:168表示)中唯一存在的，则氨基酸序列要理解为与WFIKKN2异源。本文提供了异源部分的许多实例，并且此类异源部分可以通过氨基酸序列紧邻融合蛋白的WFIKKN2多肽部分，或被中间氨基酸序列(诸如接头或其他序列)隔开。
人WFIKKN2前体具有SEQ ID NO:168(NCBI Ref Seq NP_783165.1)的氨基酸序列，信号肽由点下划线表示且促滤泡素抑制素结构域(WFIKKN2FD)由实下划线表示。
经加工的人WFIKKN2具有SEQ ID NO:169的氨基酸序列，其中促滤泡素抑制素结构域由单下划线表示。此外，要理解的是，在第一个半胱氨酸之前的11个氨基酸中的任一个可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何后果，并且进一步包括包含这样的稍小多肽的多肽。
在某些方面，本公开包括包含如SEQ ID NO:170所示的WFIKKN2FD结构域和例如，一个或多个异源多肽的多肽。
鼠WFIKKN2(GASP1)前体具有下列的SEQ ID NO:171(NCBI Ref Seq NP_861540.2)的氨基酸序列，信号肽由点下划线表示且促滤泡素抑制素结构域(WFIKKN2FD)由实下划线表示。
经加工的鼠WFIKKN2具有下列的SEQ ID NO:172的氨基酸序列，其中促滤泡素抑制素结构域由单下划线表示。此外，要理解的是，在第一个半胱氨酸之前的11个氨基酸中的任一个可以通过加工去除或有意地消除，而不会有任何后果，并且进一步包括包含这样的稍小多肽的多肽。
如果表示为WFIKKN2-Fc，这表示Fc部分融合到WFIKKN2的C-末端，其可以包含或不包含中间接头。在此例子中的Fc可以是任何免疫球蛋白Fc部分，如本文所定义的该术语。如果表示为WFIKKN2-G1Fc，这表示人IgG1的Fc部分在WFIKKN2的C-末端处融合。除非有相反说明，否则以此术语描述的蛋白均代表人WFIKKN2蛋白。
10.Lefty A和B
已知Lefty A和B蛋白调控Nodal和通过ALK7通路传导信号的其他蛋白。因此，在其他方面中，ALK7拮抗剂是Lefty A或Lefty B多肽，其可以单独使用或与如本文所公开的一种或多种附加的支持疗法或活性剂组合使用以实现所需的效应(例如，治疗肾脏疾病和/或代谢性病况或病症)。
术语“Lefty A多肽”包括包含Lefty A的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽，并且进一步包括Lefty A的任何功能单体或多聚体。在某些优选的实施方案中，本公开的Lefty A多肽结合和/或抑制nodal活性。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文中在ActRII和ALK7多肽的上下文中进行了描述，且此类方法还涉及制备和测试Lefty A的变体。Lefty A多肽包括衍生自任何已知Lefty A的序列的多肽，所述多肽具有与Lefty A多肽的序列具有至少约80％同一性和任选地具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的序列。LeftyA多肽的实例包括经加工的Lefty A多肽或更短的同种型或人Lefty A前体多肽(SEQ IDNO:173,信号肽加下划线；GenBank Id:AAD48145.1)的其他变体。
术语“Lefty B多肽”包括包含Lefty B的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽，并且进一步包括Lefty B的任何功能单体或多聚体。在某些优选的实施方案中，本公开的Lefty B多肽抑制nodal活性。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文中在ActRII和ALK7多肽的上下文中进行了描述，且此类方法还涉及制备和测试Lefty B的变体。Lefty B多肽包括衍生自任何已知Lefty B的序列的多肽，所述多肽具有与Lefty B多肽的序列具有至少约80％同一性和任选地具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的序列。Lefty B多肽的实例包括经加工的Lefty B多肽或更短的同种型或人Lefty B前体多肽(SEQ ID NO:174,信号肽加下划线；GenBank Id:AAD48144.1)的其他变体。
在某些实施方案中，Lefty A多肽和Lefty B多肽的功能变体或修饰形式包括具有Lefty A多肽或Lefty多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域的融合蛋白，所述结构域诸如,例如，促进所述多肽的分离、检测、稳定或多聚化的结构域。合适的融合结构域在上面关于ActRII和ALK7多肽详细讨论。在一些实施方案中，本公开的拮抗剂是包含融合到Fc结构域的Lefty A和/或Lefty B多肽的nodal结合部分的融合蛋白。
11.DAN-相关蛋白
已知DAN家族蛋白成员调控通过ALK7通路传导信号的配体。因此，在其他方面中，ALK7拮抗剂是DAN-相关多肽(例如，Cerberus和Coco)，其可以单独使用或与如本文所公开的一种或多种附加的支持疗法或活性剂组合使用以实现所需的效应(例如，治疗具有肾脏疾病和/或代谢紊乱的患者)。
术语“Cerberus多肽”包括包含Cerberus的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽，并且进一步包括Cerberus的任何功能单体或多聚体。在某些优选的实施方案中，本公开的Cerberus多肽结合和/或抑制nodal活性。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文中在ActRII和ALK7多肽的上下文中进行了描述，且此类方法还涉及制备和测试Cerberus的变体。Cerberus多肽包括衍生自任何已知Cerberus的序列的多肽，所述多肽具有与Cerberus多肽的序列具有至少约80％同一性和任选地具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的序列。Cerberus多肽的实例包括经加工的Cerberus多肽或更短的同种型或人Cerberus前体多肽(SEQ ID NO:175,信号肽加下划线；GenBank Id:NP_005445.1)的其他变体。
术语“Coco多肽”，还已知是DAN结构域BMP拮抗剂家族成员5、SP1、CER2、CRL2、CERL2、DANTE、GREM3和CKTSF1B3，包括包含Coco的任何天然存在的多肽以及其保留了有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和拟肽形式)的多肽，并且进一步包括Coco的任何功能单体或多聚体。在某些优选的实施方案中，本公开的Coco多肽结合和/或抑制nodal活性。此外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文中在ActRII和ALK7多肽的上下文中进行了描述，且此类方法还涉及制备和测试Coco的变体。Coco多肽包括衍生自任何已知Coco的序列的多肽，所述多肽具有与Coco多肽的序列具有至少约80％同一性和任选地具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的序列。Coco多肽的实例包括经加工的Coco多肽或更短的同种型或人Coco前体多肽(SEQ ID NO:176,信号肽加下划线；GenBankId:NP_689867.1)的其他变体。
在某些实施方案中，Cerberus多肽和Coco多肽的功能变体或修饰形式包括具有Cerberus多肽和/或Coco多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域的融合蛋白，所述结构域例如是促进所述多肽的分离、检测、稳定或多聚化的结构域。合适的融合结构域在上面关于ActRII和ALK7多肽详细讨论。在一些实施方案中，本公开的拮抗剂是包含融合到Fc结构域的Cerberus和/或Coco多肽的nodal结合部分的融合蛋白。
12.筛选测定法
在某些方面，本公开涉及本发明的激活素和/或GDF拮抗剂(例如，下列中的一种或多种的抑制剂或抑制剂组合：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2,和Smad3)在鉴定可以用来治疗或降低肾脏疾病的进展速度、频次和/或严重性，特别是治疗、预防或降低一种或多种肾脏疾病相关的并发症(例如，肾脏组织损害、纤维化和/或炎症)的进展速度、频次和/或严重性的化合物(作用剂)中的用途。
存在许多筛选用于通过靶向一种或多种GDF配体的信号传导(例如，Smad信号传导)来治疗肾脏疾病的治疗剂的方法。在某些实施方案中，化合物的高通量筛选可在选择的细胞系上进行以鉴定干扰GDF配体-介导的作用的作用剂。在某些实施方案中，该测定进行以筛选和鉴定特异性抑制或减少GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal等)与其结合伴侣诸如诸如II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)或I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7)的结合的化合物。可选地，该测定可用于鉴定增强GDF配体与其结合伴侣诸如II型受体的结合的化合物。在进一步的实施方案中，化合物可通过其与II型受体相互作用的能力来鉴定。
各种测定法形式符合要求，并且根据本公开，本文未明确描述的那些将仍然被本领域普通技术人员所理解。如本文所述，本发明的测试化合物(作用剂)可通过任何组合化学方法产生。可选地，本发明的化合物可以是体内或体外合成的天然存在的生物分子。待测试作为组织生长的调节剂的能力的化合物(作用剂)可例如，通过细菌、酵母、植物或其它生物体产生(例如，天然产物)，通过化学产生(例如，小分子，包括拟肽)或通过重组产生。本发明考虑的测试化合物包括无肽基有机分子、肽、多肽、拟肽、糖、激素和核酸分子。在某些实施方案中，测试作用剂是具有小于约2,000道尔顿的分子量的小的有机分子。
本公开的测试化合物可作为单一的离散实体提供，或在较大复杂性的文库(诸如通过组合化学制备)中提供。这些文库可包含，例如，醇、烷基卤化物、胺、酰胺、酯、醛、醚和其它类型的有机化合物。测试化合物至试验***的呈递可以为分离的形式或作为化合物的混合物，尤其是在初始筛选步骤中。任选地，化合物可任选地用其它化合物衍生，和具有促进化合物的分离的衍生基团。衍生基团的非限制性实例包括生物素、荧光素、洋地黄毒苷、绿色荧光蛋白、同位素、多组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、光可激活交联剂或其任何组合。
在测试化合物的文库和天然提取物的许多药物-筛选程序中，需要高通量测定法以最大化在给定的时期内调查的化合物的数量。在无细胞***中进行的测定法(诸如可用纯化或半纯化的蛋白得到)，通常优选作为“初级”筛选，因为它们可经产生以允许对由测试化合物诱导的分子靶标改变的快速显影和相对容易检测。此外，测试化合物的细胞毒性或生物利用度的作用在体外***中一般可忽略，该测定法而是主要关注药物对分子靶标的作用，如可以在GDF配体(例如，激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、等)及其结合伴侣(诸如，II型受体(例如，ActRIIA和/或ActRIIB)、辅助受体(例如，Cripto、Cryptic和/或Cryptic 1B)或I型受体(例如，ALK4、ALK5和/或ALK7))之间的结合亲和力的改变所证明的。
仅为说明，在本公开的示例性筛选测定法中，按对于测定法的目的所需，将目的化合物与分离和纯化的通常能够结合ActRIIB配体的ActRIIB多肽接触。然后向化合物和ActRIIB多肽的混合物中加入含有ActRIIB配体(例如，GDF11)的组合物。对ActRIIB/ActRIIB-配体复合物的检测和定量提供了确定化合物抑制(或加强)ActRIIB多肽和其结合蛋白之间的复合物形成的功效的手段。化合物的功效可从使用各种浓度的测试化合物获得的数据通过产生剂量-反应曲线评价。此外，对照测定也可进行以提供基线用于比较。例如，在对照测定中，分离和纯化的ActRIIB配体被加入至包含ActRIIB多肽的组合物，并在缺少测试化合物的情况下定量ActRIIB/ActRIIB配体复合物的形成。要理解，通常，其中反应物可混合的顺序可改变，且可同时混合。此外，代替纯化蛋白，细胞提取物和裂解物可用于提供合适的无细胞测定***。
GDF配体与其结合蛋白之间的复合物形成可通过各种技术检测。例如，对复合物形成的调节可使用例如，可检测标记的蛋白诸如放射性标记的(例如，32P、35S、14C或3H)、荧光标记的(例如，FITC)或酶标记的ActRIIB多肽和/或其结合蛋白，通过免疫测定法或通过层析检测来量化。
在某些实施方案中，本公开考虑了荧光极化测定法和荧光共振能量转移(FRET)测定法在直接或间接测量GDF配体和其结合蛋白之间相互作用的程度中的用途。此外，其它检测模式，诸如基于光波导的那些(参见，例如，PCT公开号WO 96/26432和美国专利号5,677,196)、表面等离子体共振(SPR)、表面电荷传感器和表面力传感器，与本公开的许多实施方案相容。
此外，本公开考虑了相互作用捕获物测定法，也称为“双杂交测定法”用于鉴定破坏或增强GDF配体和其结合伴侣之间相互作用的作用剂的用途。参见，例如，美国专利号5,283,317；Zervos等人(1993)Cell72:223-232；Madura等人(1993)J Biol Chem 268:12046-12054；Bartel等人(1993)Biotechniques 14:920-924；和Iwabuchi等人(1993)Oncogene8:1693-1696)。在特定的实施方案中，本公开考虑了反转双杂交***鉴定离解GDF配体和其结合蛋白之间相互作用的化合物(例如，小分子或肽)的用途[参见，例如，Vidal和Legrain，(1999)Nucleic Acids Res 27:919-29；Vidal和Legrain，(1999)Trends Biotechnol 17:374-81；和美国专利号5,525,490；5,955,280；和5,965,368]。
在某些实施方案中，本发明的化合物通过其与GDF配体相互作用的能力来鉴定。在化合物和GDF配体之间的相互作用可以是共价或非共价的。例如，此类相互作用可在蛋白水平上使用体外生物化学方法，包括光交联、放射性标记的配体结合和亲和层析鉴定(参见，例如，Jakoby WB等人(1974)Methods in Enzymology 46:1)。在某些情况下，化合物可在基于机制的测定法中筛选，诸如检测结合GDFP配体的化合物的测定法。这可包括固相或液相结合事件。可选地，编码GDF配体的基因可用报告***(例如，β-半乳糖苷酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白)转染至细胞中并针对文库优选地通过高通量筛选或以文库的各个成员进行筛选。可使用其它基于机制的结合测定法；例如，检测自由能变化的结合测定法。结合测定法可用固定至孔、珠或芯片的，或通过固定的抗体捕获的，或通过毛细管电泳解析的靶标进行。结合的化合物可通常使用比色终点或荧光或表面等离子体共振检测。
13.治疗用途
部分地，本公开涉及治疗肾脏疾病的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂(例如，以下中的一种或多种的拮抗剂：激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素AC、激活素BC、激活素E、激活素AE和/或激活素BE)、GDF8、GDF11、GDF3、GDF1、Nodal、ActRIIA、ActRIIB、ALK4、ALK5、ALK7、Cryptic、Cryptic 1B、Smad2和Smad 3)。在一些实施方案中，本公开考虑治疗肾脏疾病的一种或多种并发症(例如，任何肾脏疾病-相关症状，诸如组织损害、纤维化和/或炎症)的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂。在一些实施方案中，本公开考虑预防肾脏疾病的一种或多种并发症的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂。在一些实施方案中，本公开考虑降低肾脏疾病的进展速度的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂。在一些实施方案中，本公开降低肾脏疾病的一种或多种并发症的进展速度的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂。在一些实施方案中，本公开考虑减降低肾脏疾病相关疾病事件的频次的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂。在一些实施方案中，本公开考虑降低肾脏疾病的一种或多种并发症的频次的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂。在一些实施方案中，本公开考虑降低肾脏疾病的严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂。在一些实施方案中，本公开考虑降低肾脏疾病的一种或多种并发症的严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂。任选地,本文公开的用于治疗或降低肾脏疾病和肾脏疾病相关疾病事件的进展速度、频次和/或严重性，特别是治疗、预防或降低肾脏疾病的一种或多种并发症的进展速度、频次和/或严重性的方法可以进一步包括向患者施用用于治疗肾脏疾病的一种或多种支持疗法或额外的活性剂。例如，还可以向患者施用一种或多种支持疗法或活性剂以治疗或缓解一种或多种症状，诸如高血压(例如，施用血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻滞剂或利尿药(利尿剂),任选地采用低盐饮食)，高胆固醇水平(例如，使用他汀类药物)，贫血(例如，使用激素红细胞生成素,任选地采用铁补充剂)，浮肿(例如，使用利尿剂),血液中体液缺乏(例如，采用静脉内(IV)流体补充剂)，缺钙或骨衰竭(例如，采用钙和/或维生素D补充剂，或磷酸盐粘结剂以降低血磷酸盐水平并保护以免血管钙化)，高血钾水平(例如，使用钙、葡萄糖或聚苯乙烯磺酸钠(Kayexalate,Kionex)以降低钾水平)，毒素累积(例如，通过血液透析和/或腹膜透析)，等。另外，还可使用肾移植作为额外的治疗。一些用于肾脏疾病的示例性药物是(呋塞米)、/>(托塞米)、/>(依他尼酸)和利尿酸钠。
如本文所用，“预防”病症或病况的治疗剂是指在统计学样品中，相对于未治疗的对照样品减少经治疗的样品中病症或病况的发生，或相对于未治疗的对照样品延迟病症相关事件的发作或减少其频次，或减少所述病症或病况的一种或多种症状的严重性的化合物。
如本文所用的术语“治疗”包括一旦已经确立，则改善或消除病况。在任一情况下，预防或治疗可在由医生或其它健康护理提供者提供的诊断和施用治疗剂的预期结果中辨别。
通常，本公开中描述的疾病或病况的治疗或预防通过施用有效量的激活素和/或GDF拮抗剂来实现。作用剂的有效量是指以必要的剂量和持续的时间段有效实现期望的治疗或预防结果的量。本公开的作用剂的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及作用剂在个体中引发需要的反应的能力等因素而改变。预防有效量是指以必要的剂量和持续的时间段有效实现需要的预防结果的量。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在整个说明书中是可互换的并且是指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养动物(例如，母牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物诸如猴)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
通常，本公开中描述的对肾脏相关疾病或病况的治疗或预防通过施用“有效量”的本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或此类拮抗剂的组合来实现。作用剂的有效量是指以必要的剂量和持续的时间段有效实现期望的治疗或预防结果的量。本公开的作用剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及作用剂在个体中引发需要的反应的能力等因素而改变。“预防有效量”是指以必要的剂量和持续的时间段有效实现需要的预防结果的量。
肾脏维持血液的许多特征，包括血容量、pH平衡、电解质浓度和血压，以及承担了毒素和废物过滤的责任。这些功能取决于肾脏肾单位的复杂结构，血液恒定地流动通过肾脏的各种毛细血管，以及通过来自身体其他部位的信号(包括内分泌激素)调控肾脏。肾脏功能的问题通过直接机制(例如，遗传缺陷、感染或暴露于毒素)表现，和通过间接机制表现，在长期应激源如肥大和超滤(它们本身是对肾脏功能的更多直接损害的结果)的作用下进行性进展。由于肾脏在血液维持和废物分泌中的关键作用，肾脏相关的疾病表现很多且会发生变化；它们的综述见Harrison’sPrinciples ofInternal Medicine,第18版，McGrawHill,N.Y.,Part 13,Chp 277-289。
如本文所述，激活素和/或GDF拮抗剂在肾脏疾病模型中具有多种有益作用。具体地，用ALK7:ActRIIB异源多聚体治疗减少患有单侧输尿管梗阻(UUO)的受试者中的肾脏组织损害、炎症和纤维化。这些数据表明激活素和/或GDF拮抗剂可以用来治疗或预防肾脏疾病，特别是治疗或预防肾脏疾病的各种并发症(表现)，包括，例如，肾脏组织损害、炎症和/或纤维化。
因此，本发明的方法可应用于多种肾脏相关疾病或病况。如本文所用，“肾脏相关疾病或病况”可以指影响肾脏或肾脏***的任意疾病、病症或病况。肾脏相关疾病或病况的实例包括，但不限于，慢性肾脏疾病(或衰竭)、急性肾脏疾病(或衰竭)、原发性肾脏疾病、非糖尿病性肾脏疾病、肾小球肾炎、间质性肾炎、糖尿病性肾脏疾病、糖尿病性慢性肾脏疾病、糖尿病性肾病变、肾小球硬化症、急进性肾小球肾炎、肾纤维化、Alport综合征、IDDM肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、肾间质纤维化、局灶节段性肾小球硬化症、膜性肾病、微小病变肾病、少免疫型急进性肾小球肾炎、IgA肾病、多囊性肾病、Dent病、肾胱氨酸贮积症(nephrocytinosis)、Heymann肾炎、多囊性肾病(例如，常染色体显性(成人)多囊性肾病和常染色体隐性(儿童)多囊性肾病)、急性肾损伤、肾病综合征、肾缺血、足细胞病或功能紊乱、蛋白尿症、肾小球疾病、膜性肾小球肾炎、局灶节段性肾小球肾炎、先兆子痫、子痫、肾损害、胶原血管病、良性***性(姿势性)蛋白尿症、IgM肾病、膜性肾病、结节病、糖尿病、药物引起的肾损害、法布里病、氨基酸尿症、范可尼综合征、高血压性肾硬化、间质性肾炎、急性间质性肾炎、镰刀细胞病、血红蛋白尿症、肌红蛋白尿症、韦格纳肉芽肿、1型糖原贮积病、慢性肾脏疾病、慢性肾衰竭、低肾小球滤过率(GFR)、肾血管硬化、狼疮性肾炎、ANCA-阳性少免疫性新月体性肾小球肾炎、慢性移植物肾病、肾毒性、肾脏毒性、肾坏死、肾脏损害、肾小球和肾小管损伤、肾功能障碍、肾炎综合征、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、近端肾小管功能障碍、急性肾移植排斥、慢性肾移植排斥、非IgA系膜增生性肾小球肾炎、感染后肾小球肾炎、任何类型的累及肾脏的血管炎、任何遗传性肾脏疾病、任何间质性肾炎、肾移植物衰竭、肾癌、与其他病况相关的肾脏疾病(例如，高血压、糖尿病,和自身免疫性疾病)、Dent病、肾胱氨酸贮积症、Heymann肾炎、原发性肾脏疾病、坍塌性肾小球病、致密物沉积病、冷球蛋白血症相关性肾小球肾炎、过敏性紫癜(Henoch-Schonleindisease)、感染后肾小球肾炎、细菌性心内膜炎、显微镜下多血管炎、Churg-Strauss综合征、抗-GBM-抗体介导的肾小球肾炎、淀粉样变性、单克隆免疫球蛋白沉积病、纤维丝样肾小球肾炎、免疫触须样肾小球病、缺血性肾小管损伤、药物诱发的小管-间质性肾炎、中毒性小管-间质性肾炎、感染性小管-间质性肾炎、细菌性肾盂肾炎、由多瘤病毒感染或HIV感染引起的病毒感染性小管-间质性肾炎、代谢引起的小管-间质性疾病、混合性***病、管型肾病、由尿酸盐或草酸盐或药物引起的晶体沉积引起的晶体性肾病、急性细胞性小管-间质同种异体移植排斥、由淋巴瘤或移植后淋巴增生性疾病引起的肿瘤浸润性疾病、肾脏的梗阻性疾病、血管病、血栓性微血管病、肾血管硬化、动脉粥样硬化性疾病、混合性***病、结节性多动脉炎、钙调磷酸酶抑制剂引起的血管病、急性细胞性血管同种异体移植排斥、急性体液同种异体移植排斥、早期肾功能下降(ERFD)、终末期肾病(ESRD)、肾静脉血栓形成、急性肾小管坏死、急性间质性肾炎、已明确的慢性肾脏疾病、肾动脉狭窄、缺血性肾病、***、药物和毒素引起的慢性小管间质性肾炎、反流性肾病、肾结石、肺出血肾炎综合征(Goodpasture's syndrome)、正常红细胞正常色素性贫血、肾性贫血、糖尿病性慢性肾脏疾病、IgG4-相关性疾病、希-林二氏综合征(von Hippel-Lindau syndrome)、结节性硬化症、肾消耗病、肾髓质囊性病、肾细胞癌、腺癌、肾母细胞瘤,淋巴瘤、白血病、低唾液酸化功能紊乱、慢性环孢素肾病、肾再灌注损伤、肾发育不全、氮血症、双侧动脉闭塞、急性尿酸肾病、血容量减少、急性双侧梗阻性尿路病、高钙血症肾病、溶血性***综合征、急性尿潴留、恶性肾硬化、产后肾小球硬化症、硬皮病、非Goodpasture抗GBM病(non-Goodpasture'santi-GBM disease)、显微镜下结节性多动脉炎、变应性肉芽肿病、急性放射性肾炎、链球菌感染后肾小球肾炎、Waldenstrom巨球蛋白血症、镇痛剂肾病、动静脉瘘、动静脉移植物、透析、异位肾、髓质海绵肾、肾性骨营养不良、孤立肾、肾盂积水、微白蛋白尿、***、血尿症、高脂血症、低白蛋白血症、脂肪尿、酸中毒、水肿、小管间质性肾纤维化、高血压硬化症、肾球旁细胞瘤、Fraser综合征、马蹄肾、肾小管发育不全、低钾血症、低镁血症、高钙血症、低磷酸盐血症、尿调节素相关性肾脏疾病、指甲-髌骨综合征、锂肾毒性、TNF-α肾毒性、蜜蜂树脂相关性肾功能衰竭(honeybee resin related renal failure)、收获甘蔗引起的急性肾衰竭(sugarcane harvesting acute renal failure)、完全LCAT缺陷、Fraley综合征、Page肾、反流性肾病、Bardet-Biedl综合征、胶原纤维性肾小球病、Dent病、Denys-Drash综合征、先天性肾病综合征、免疫触须样肾小球病、纤连蛋白肾小球肾病、Galloway Mowat综合征、脂蛋白肾小球病、中美洲肾病、beta-地中海贫血肾病、溶血性***综合征、过敏性紫癜病(Henoch-Schonlein-Purpura disease)、腹膜后纤维化、结节性多动脉炎、心肾综合征、肾髓质病、肾动脉狭窄、尿调节素肾脏疾病和高钾血症。
在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或此类拮抗剂的组合可以用来治疗或预防慢性肾脏疾病，任选地与一种或多种用于治疗慢性肾脏疾病的支持疗法组合。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或此类拮抗剂的组合可以用来治疗或预防慢性肾脏疾病的一种或多种并发症(症状或表现)(例如，组织损害、炎症和/或纤维化)，任选地与一种或多种用于治疗慢性肾脏疾病的支持疗法组合。在一些实施方案中，本公开的激活素和/或GDF拮抗剂或此类拮抗剂的组合可以用来治疗或预防终末期肾脏衰竭，任选地与一种或多种用于治疗终末期肾脏疾病的支持疗法组合。慢性肾脏疾病(CKD),也已知是慢性肾病，是在数月或数年的时期内肾脏功能进行性的丧失。肾功能恶化的症状可以包括通常感觉不适且经历饮食减退。慢性肾脏疾病经常是在筛选已知处于肾脏问题风险的人时而诊断的，诸如具有高血压或糖尿病的那些人，以及具有患有CKD的血缘亲属的那些人。此病还可在其引起其公认的并发症之一时被鉴定，诸如心血管疾病、贫血或心包炎。最近的职业指南将CKD的严重性分为5期，1期为最轻的，通常引起很少的症状，且5期为严重的疾病，如果不治疗则具有不佳寿命预期。5期CKD经常被称作终末期肾脏疾病、终末期肾病或终末期肾衰，且与和现已过时的术语慢性肾衰竭或慢性肾脏衰竭基本上同义；并且通常意指患者需要肾替代疗法，其可能涉及透析的形式，但理想地指定肾移植。CKD开始没有特异性的症状，并且通常仅检测有血清肌酐的增加或尿蛋白的增加。当肾功能减退时，可以表现出如下所述的各种症状。由于体液超载以及肾脏通过肾素-血管紧张素***所引起的血管活性激素产生可以导致血压升高，增加了发展成高血压和/或患有充血性心力衰竭的风险。尿素可以积累，引起氮血症并最终引起***(症状的范围从倦怠至心包炎和脑病)。由于其高体循环，尿素在小汗腺中以高浓度地分泌并在皮肤上作为汗液蒸发物结晶("***霜")。钾可以在血液中积累(高钾血症的症状范围包括不适和潜在致命性心律失常)。高钾血症在肾小球滤过率降至小于20-25ml/min/1.73m2之前通常不会发展，在该点时肾脏***钾的能力下降。CKD中的高钾血症可以被酸血症加重(其引起钾的细胞外迁移)以及由缺少胰岛素引起。红细胞生成素合成可以减少，导致贫血。体液容积超载症状可以发生，范围从轻度水肿至威胁生命的肺水肿。由于磷酸盐***减少引起的高磷血症可以通常在肾小球滤过减小后发生。高磷血症与增加的心血管风险有关，是血管钙化的直接刺激。可以表现低钙血症，其通常由纤维细胞生长因子-23的刺激导致。骨细胞负责增加FGF23的产生，FGF23是酶1-α-羟化酶(负责将25-羟胆钙化醇转化成1,25-双羟维生素D3)的有效抑制剂。更晚期，这进展成继发性甲状旁腺功能亢进、肾性骨病和血管钙化，血管钙化进一步损害心脏功能。代谢性酸中毒(由硫酸盐、磷酸盐、尿酸等引起)可以发生并通过过量酸作用于酶而导致酶活性改变；并由于过量酸(酸血症)通过促进高钾血症还导致心脏和神经元膜的兴奋性增加。酸中毒还由于从近端小管的细胞产生足够的氨的能力减少而引起。当肾功能下降时缺铁性贫血的发生率增加，在需要血透析的那些人中其发生率特别高。在病因上其是多因素的，但包括炎症增加，红细胞生成素减少和导致骨髓抑制的高尿酸血症。患有CKD的人患有加速性动脉粥样硬化，并且与一般人群相比更可能发展心血管病。患有CKD和心血管病的患者往往比仅患有后者的那些人具有显著更差的预后。
在另一个实施方案中，激活素和/或GDF拮抗剂或此类拮抗剂的组合可以在患有慢性肾脏疾病矿物质骨代谢紊乱(CKD-MBD)的患者中使用，CKD-MBD是一种由肾脏疾病引起的相互关联的骨骼、心血管和矿物质-代谢紊乱的广泛综合征。CKD-MBD涵盖经常称作肾性骨病(ROD)的多种骨骼病理变化，其是用激活素和/或GDF拮抗剂或此类拮抗剂的组合治疗的优选实施方案。取决于不同的致病因素的相对贡献度，ROD表现为骨骼重塑的各种各样的病理谱(Hruska等人，2008,Chronic kidney disease mineral bone disorder(CKD-MBD)；Rosen等人(编)Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of MineralMetabolism,第7版，American Society for Bone and Mineral Research,WashingtonD.C.,pp 343-349)。在谱的一端是具有***性骨营养不良和低骨转换的ROD，其特征是很少数量的活性重塑位点，极度受抑制的骨形成和低骨吸收。在另一极端是具有甲状旁腺功能亢进、高骨转换和纤维性骨炎的ROD。鉴于激活素和/或GDF拮抗剂或此类拮抗剂的组合可以发挥同化和抑制吸收效应两者，这些作用剂可以用于跨越整个ROD病理谱的患者。
在某些实施方案中，本公开提供了用于通过测量患者中的一种或多种血液学参数来管理已经用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂治疗或者是用其治疗的候选者的患者的方法。血液学参数可用于评估作为待用本公开的拮抗剂治疗的候选者的患者的适当用药剂量，监测治疗期间的血液学参数，评价在用本公开的一种或多种拮抗剂治疗期间是否调整剂量，和/或评价本公开的一种或多种拮抗剂的适当维持剂量。如果血液学参数中的一种或多种在正常水平之外，则可以减少、延迟或终止一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂的给药。
可以根据本文提供的方法测量的血液学参数包括，例如，使用本领域公认的方法，红细胞水平、血压、铁储备和在体液中发现的与增加的红细胞水平相关的其他作用因子。此类参数可以使用来自患者的血液样品来测定。红细胞水平、血红蛋白水平和/或血细胞比容水平的增加可以引起血压的增加。
在一个实施方案中，如果一种或多种血液学参数在作为用一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂治疗的候选者的患者的正常范围之外或在正常上限上，则可以延迟本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂的施用的开始，直至血液学参数自然或经由治疗干预恢复至正常或可接受的水平为止。例如，如果候选患者是高血压的或高血压前期的，则可以用降血压剂治疗患者以降低患者的血压。可以使用适合于个体患者的病况的任何降血压剂，包括例如利尿剂、肾上腺素能抑制剂(包括α阻滞剂和β阻滞剂)、血管扩张剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂或血管紧张素II受体阻滞剂。可选地可以使用膳食和锻炼方案来治疗血压。类似地，如果候选患者具有低于正常或在正常的下限上的铁储备，则患者可以用适当的膳食和/或铁补充剂的方案治疗，直至患者的铁储备已恢复至正常或可接受的水平为止。对于具有高于正常红细胞水平和/或血红蛋白水平的患者，则可以延迟施用本公开的一种或多种本发明的拮抗剂，直至所述水平已恢复至正常或可接受的水平为止。
在某些实施方案中，如果一种或多种血液学参数在作为用一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂治疗的候选者的患者的正常范围之外或正常上限上，则可以不延迟施用的开始。然而，本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂的剂量或给药频率可以设定为会降低施用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂后出现的血液学参数的不可接受的增加的风险的量。可选地，可以为患者开发治疗方案，其将一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂与治疗剂组合，所述治疗剂解决不期望的血液学参数水平。例如，如果患者具有升高的血压，则可以设计治疗方案，其涉及施用一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂和降血压剂。对于具有低于期望的铁储备的患者，可以开发治疗方案，其涉及一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂和铁补充剂。
在一个实施方案中，可以为作为待用一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂治疗的候选者的患者确立一种或多种血液学参数的基线参数，并且基于所述基线值为该患者确立适当的给药方案。可选地，基于患者的病史确立的基线参数可用于为患者告知适当的激活素和/或GDF拮抗剂给药方案。例如，如果健康患者的确立的基线血压读数高于定义的正常范围，则可能没有必要将患者的血压带入一般人群在用本公开的一种或多种拮抗剂治疗之前被认为是正常的范围中。在用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂治疗之前患者的一种或多种血液学参数的基线值也可以用作监测用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂治疗期间血液学参数的任何变化的相关比较值。
在某些实施方案中，在正在用一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂治疗的患者中测量一种或多种血液学参数。血液学参数可用于在治疗期间监测患者，并允许调节或终止用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂给药或额外用另一种治疗剂给药。例如，如果施用一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂导致血压、红细胞水平或血红蛋白水平的增加或铁储备的减少，则可以在量或频率方面减少本公开的一种或多种拮抗剂的剂量，以减少本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂对一种或多种血液学参数的作用。如果施用一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂导致一种或多种血液学参数的对患者不利的变化，则本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂的给药可以暂时终止(直到所述一种或多种血液学参数返回至可接受的水平)或永久终止。类似地，如果在减少本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂的剂量或施用频率后，一种或多种血液学参数未被带入可接受的范围内，则可以终止给药。作为替代或另外地，减少或终止用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂给药，患者可以用额外的治疗剂给药，所述治疗剂解决一种或多种血液学参数中的不希望的水平，诸如，例如，降血压剂或铁补充剂。例如，如果用一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂治疗的患者具有升高的血压，则用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂给药可以继续在相同水平并且将血压降低剂添加至治疗方案中，用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂的给药(例如，量和/或频率)可以减小，并将血压降低剂的给药添加至治疗方案中，或者可以终止用本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂的给药并且可以用降血压剂治疗患者。
14.药物组合物
本文所述的治疗剂(例如，激活素和/或GDF拮抗剂)可以配制成药物组合物。根据本公开使用的药物组合物可以以常规的方式使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂配制。
在某些实施方案中，本公开的治疗方法包括将组合物全身施用或将组合物作为植入物或装置局部施用。当施用时，用于本公开的治疗组合物可以是任何生理上可接受的形式，诸如以基本上无致热原，或无致热原，生理上可接受的形式。激活素和/或GDF拮抗剂以外的治疗上有用的作用剂也可以任选地包含在如上所述的组合物中，可以在本文公开的方法中与本发明的化合物同时或序贯地施用。
典型地，本文公开的蛋白治疗剂将胃肠外施用，特别是经静脉内或皮下。适合于胃肠外施用的药物组合物可包含本公开的一种或多种激活素和/或GDF拮抗剂与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、混悬液或乳液或可在临用前重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，可注射溶液或分散液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、赋予制剂与预期受体的血液等渗的溶质或助悬剂或增稠剂。可在本公开的药物制剂中采用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，和其合适的混合物。适当的流动性可例如，通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持需要的粒度，且通过使用表面活性剂来维持。
组合物和制剂如果需要，可以存放于包装或配药装置中，所述包装或配药装置可以含有一个或多个包含活性成分的单位剂型。所述包括可以例如包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。所述包装或配药装置可以配以施用说明书。
此外，药物组合物可以递送至靶组织部位的形式被包封或注射。在某些实施方案中，本发明的组合物可包括能够递送一种或多种治疗化合物(例如，激活素和/或GDF拮抗剂)至靶组织部位，为发育中的组织提供结构，且最好能够再吸收至体内的基质。例如，基质可提供激活素和/或GDF拮抗剂的缓慢释放。此类基质可由目前用于其它植入的医学应用的材料形成。
基质材料的选择可基于以下一项或多项进行：生物相容性、生物降解能力、机械性质、美容外观和界面性质。本发明的组合物的特定应用将定义合适的制剂。用于组合物的潜在基质可以是生物可降解的和化学上明确的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它潜在的材料是生物可降解的和生物学上充分确定的，诸如骨或皮肤胶原。其它基质包括纯的蛋白或细胞外基质组分。其它潜在的基质是非-生物可降解的和化学上确定的，诸如烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。基质可包含任何上述类型的材料的组合，诸如聚乳酸和羟基磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷可在组分上改变，诸如钙-铝酸盐-磷酸盐，和经加工以改变孔径、粒度、颗粒形状和生物降解能力。
在某些实施方案中，本发明的方法可口服施用，例如，以胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用矫味基质，通常是蔗糖和***胶或西黄蓍胶)、粉剂、颗粒剂或作为在水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂或作为水包油或油包水液体乳剂或作为酏剂或糖浆剂或作为软锭剂(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和***胶)和/或口腔洗剂等的形式，各自包含预定量的作用剂作为活性成分。作用剂还可以作为巨丸剂、药糖剂或糊剂施用。
在某些实施方案中，本发明的方法可以被配制用于鼻内施用。本发明的鼻施用可以包括使用鼻喷剂，鼻喷剂使用水或盐溶液作为液体载体，一种或多种治疗化合物(例如，激活素和/或GDF拮抗剂)以治疗有效量分散或溶解在水中。
在用于经口施用的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂和颗粒剂等)中，本发明的一种或多种治疗化合物可与一种或多种药学上可接受的载体混合，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或下列中的任一种：(1)填充剂或膨胀剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如，例如，羧基甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和/或***胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、特定的硅酸盐和碳酸钠；(5)溶解阻滞剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7)浸湿剂，诸如，例如，鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，和其混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充明胶胶囊的填充物，使用诸如乳糖(lactose)或奶糖(milk sugar)的赋形剂，以及高分子量聚乙二醇等。
用于经口施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域常用的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂、增溶剂和/或乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯，和其混合物]。除了惰性稀释剂外，口服组合物还可包括辅料，诸如浸湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
混悬剂，除了活性化合物外，可含有助悬剂诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和去水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和西黄蓍胶，及其组合。
本发明的组合物还可包含辅料，诸如防腐剂、浸湿剂、乳化剂和分散剂。对微生物的作用的预防可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚山梨酸，等等。还可能需要在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠，等等。此外，可通过包含延迟吸收的作用剂诸如单硬脂酸铝和明胶导致可注射药物形式的延长吸收。
应理解，剂量方案由主治医生考虑各种因素来确定，所述因素改变本公开的本发明化合物(例如，激活素和/或GDF拮抗剂)的作用。各种因素可包括但不限于，患者的年龄、性别和饮食、疾病的严重程度、施用时间和其它临床因素。任选地，剂量可以随着在重构中使用的基质类型和组合物中化合物的类型而变化。添加其它已知的生长因子至最终组合物中也可影响剂量。可通过定期评估ESS或血液学参数监测进展。
在某些实施方案中，本发明还提供了用于体内产生激活素和/或GDF拮抗剂的基因疗法。此类疗法通过将激活素和/或GDF拮抗剂多核苷酸序列引入至具有上文列出的病症的细胞或组织来实现其治疗效果。递送激活素和/或GDF拮抗剂多核苷酸序列可使用重组表达载体诸如嵌合病毒或胶体分散***来实现。优选用于激活素和/或GDF拮抗剂多核苷酸序列的治疗递送的是使用靶向脂质体。
本文教导的可用于基因疗法的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘或优选地，RNA病毒诸如逆转录病毒。优选地，逆转录病毒载体是鼠或禽逆转录病毒的衍生株。其中可***单一外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多另外的逆转录病毒载体可掺有多种基因。所有这些载体可传递或掺有用于可选择标记的基因，使得转导的细胞可鉴定和产生。通过连接例如，糖、糖脂或蛋白，可使得逆转录病毒载体为靶标特异性的。优选的靶向通过使用抗体实现。本领域技术人员将认识到，特定的多核苷酸序列可***逆转录病毒基因组或连接至病毒被膜以允许包含激活素和/或GDF拮抗剂的逆转录病毒载体的靶标特异性递送。
可选地，组织培养细胞可通过常规磷酸钙转染，用编码逆转录病毒结构基因(gag、pol和env)的质粒，直接转染。然后这些细胞用包含目的基因的载体质粒转染。得到的细胞释放逆转录病毒载体至培养基。
用于激活素和/或GDF拮抗剂多核苷酸的另一靶向递送***是胶体分散***。胶体分散***包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束、混合型胶束和脂质体。本发明的优选的胶体***是脂质体。脂质体是人造膜囊，其可体外和体内用作递送载体。RNA、DNA和完整的病毒体可包封在水性内芯内并以生物活性形式递送至细胞(参见，例如，Fraley等人，Trends Biochem.Sci.，6:77,1981)。使用脂质体载体的有效基因传递的方法是本领域中已知的，参见，例如，Mannino,等人，Biotechniques，6:682，1988。脂质体的组成通常是磷脂的组合，通常与甾族化合物，特别是胆固醇组合。其它磷脂或其它脂质也可使用。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
可用于脂质体制备中的脂质的实例包括磷脂酰基化合物，诸如磷脂酰基甘油、磷脂酰基胆碱、磷脂酰基丝氨酸、磷脂酰基乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。说明性的磷脂包括卵磷脂酰基胆碱、二棕榈酰基磷脂酰基胆碱和二硬脂酰基磷脂酰基胆碱。脂质体的靶向还可能基于例如，器官-特异性、细胞-特异性和细胞器-特异性，并且是本领域已知的。
本公开提供了制剂，所述制剂可以改变以包含酸和碱来调整pH；和缓冲剂以将pH保持在狭窄的范围内。
15.试剂盒
在某些实施方案中，本公开还提供了药物包装或试剂盒，所述药物包装或试剂盒包括一个或多个容器，所述容器填充以本公开的至少一种激活素和/或GDF拮抗剂。任选地与此类容器关联的可以是以由监管药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了(a)由用于人施用的制造、使用或销售的机构批准，(b)使用指导，或两者。
实施例
本发明现在已总体上进行了描述，参照以下实施例将更容易理解，实施例仅为说明本发明的某些实施方案的目的包括在内，且不意图限制本发明。
实施例1:ActRIIa-Fc融合蛋白
构建了可溶性ActRIIA融合蛋白，其具有与人或小鼠Fc结构域融合的人ActRIIa的细胞外结构域，它们之间具有最小的接头。所述构建体分别被称为ActRIIA-hFc(SEQ IDNO:177,Fc部分加下划线)和ActRIIA-mFc。
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc蛋白在CHO细胞系中表达。可以使用不同的前导序列(例如，蜜蜂蜂毒肽(mellitin)(HBML)前导序列(SEQ ID NO:214)，组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO:215)，或天然前导序列(SEQ ID NO:216))。示例性的ActRIIA-hFc构建体包含TPA前导序列并且具有如SEQ ID NO:178中所示的未加工的氨基酸序列，其可由具有SEQ ID NO:179的核酸序列的多核苷酸编码。
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc两者均显著适于重组表达。示例性的ActRIIA-hFc蛋白纯化为单一、明确定义的蛋白峰。N-末端测序揭示–ILGRSETQE(SEQ ID NO:50)的单一序列。纯化可以通过一系列柱层析步骤(包括例如，以任何顺序的以下中的三种或更多种)实现：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。ActRIIA-hFc蛋白被纯化至如通过尺寸排阻层析法所测定的>98％的纯度和如通过SDS PAGE所测定的>95％的纯度。如图7中所示，融合蛋白纯化为单一的明确定义的峰，如通过尺寸柱(图7A)和考马斯蓝染色的SDS-PAGE(图7B)显现。
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc显示对配体的高亲和力。使用标准胺偶联程序将GDF-11或激活素A固定在BiacoreTM CM5芯片上(图8)。将ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc蛋白加载至***上并测量结合。ActRIIA-hFc以5x10-12的解离常数(KD)与激活素结合，且以9.96x10-9的KD与GDF11结合。ActRIIA-mFc表现相似。
ActRIIA-hFc在药代动力学研究中非常稳定。向大鼠用1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的ActRIIA-hFc蛋白给药，且在24、48、72、144和168小时测量蛋白的血浆水平。在分开研究中，大鼠以1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg给药。在大鼠中，ActRIIA-hFc具有11-14天的血清半衰期，且药物的循环水平在两周后相当高(对于1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的初始施用，分别为11μg/ml、110μg/ml或304μg/ml)。在食蟹猴中，血浆半衰期显著大于14天，且对于1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的初始施用，药物的循环水平分别为25μg/ml、304μg/ml或1440μg/ml。
实施例2:可选的ActRIIA-Fc蛋白
可以根据本文所述的方法来构建Fc融合蛋白的各种ActRIIA变体描述于作为WO2006/012627公开的国际专利申请(参见，例如，第55-58页)，其通过引用以其整体并入本文。可选的构建体可以具有C-末端尾部(ActRIIA的细胞外结构域的最后15个氨基酸)的缺失。这种构建体的氨基酸序列显示为SEQ ID NO:180(Fc部分加下划线)。
实施例3.示例性ActRIIa-Fc同型二聚体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
ActRIIa-Fc同型二聚体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用与本说明书中前面实施例和本文中提到的那些相似的方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用ActRIIa-Fc同型二聚体治疗小鼠显著地抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图17)和炎性(IL-1B和TNF-α，示于图18)基因的表达，抑制TGFβ1和激活素A(图19,顶部两个图面)的上调，以及减少的肾损伤(NGAL的下调，示于图19,下部图面)。
实施例4:ActRIIB-Fc融合蛋白的生成
申请人构建了可溶性ActRIIB融合蛋白，其具有与人或小鼠Fc结构域融合的人ActRIIB的细胞外结构域，它们之间具有最小的接头。所述构建体分别被称为ActRIIB(20-134)-hFc(包含与人Fc结构域融合的人ActRIIB细胞外结构域(具有SEQ ID NO:1的序列的天然ActRIIB的残基20-134))和ActRIIB-mFc。
ActRIIB(20-134)-hFc(SEQ ID NO:181)和ActRIIB-mFc蛋白在CHO细胞系中表达。可以将三种不同的前导序列加入到这些序列中，诸如：(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)前导序列(SEQID NO:214)，ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO:215)，和(iii)天然前导序列(SEQ ID NO:216))。示例性的具有TPA前导序列的ActRIIB(20-134)-hFc融合蛋白具有SEQ ID NO:182的未加工的氨基酸序列，其可由具有SEQ ID NO:183的核酸序列的多核苷酸编码。
CHO细胞产生的材料的N-末端测序揭示–GRGEAE(SEQ ID NO:51)的主要序列。值得注意的是，文献中报道的其它构建体以–SGR…序列起始。此类报道的构建体也掺入在本文公开的ActRIIB及其融合蛋白中。
纯化可以通过一系列柱层析步骤(包括例如，以任何顺序的下列中的三种或更多种)实现：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。
申请人进一步生成ActRIIB(25-131)-hFc融合蛋白，其包含具有N-末端和C-末端截短的人ActRIIB细胞外结构域(具有SEQ ID NO:1的序列的天然ActRIIB的残基25-131)，其在N-末端与TPA前导序列融合以取代天然ActRIIB前导序列且在C-末端经由最小接头(三个甘氨酸残基)与人Fc结构域融合(SEQ ID NO:184)。编码该融合蛋白的多核苷酸显示于SEQ ID NO:185。申请人修饰了密码子并发现编码ActRIIB(25-131)-hFc蛋白的变体核酸(SEQ ID NO:186)，其提供了初始转化体的表达水平的显著改善。经加工的ActRIIB(25-131)-hFc蛋白具有SEQ ID NO:187的氨基酸序列(N-末端通过N-末端测序确认)。
表达的分子通过一系列柱层析步骤(包括例如，以任何顺序的下列中的三种或更多种)纯化：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。
用BiacoreTM仪器在体外评价几种配体对ActRIIB(25-131)-hFc及其全长对应物ActRIIB(20-134)-hFc的亲和力，且结果概述于下表3中。由于复合物的非常快速的缔合和解离，Kd值通过稳态亲和拟合获得，这防止了对kon和koff的准确测定。ActRIIB(25-131)-hFc以高亲和力结合例如，激活素A、激活素B和GDF11。
表3 ActRIIB-hFc变体的配体选择性
另一示例性ActRIIB-hFc融合蛋白具有SEQ ID NO:188的氨基酸序列，包含与人Fc结构域融合的ActRIIB-衍生部分(SEQ ID NO:189,含有对应ActRIIB细胞外结构域序列的L79D置换)。ActRIIB-衍生部分或ActRIIB-hFc融合蛋白的全长可以用作单体或非-Fc融合蛋白用作单体、二聚体或更高级的复合物。
ActRIIB(L79D,20-134)-hFc融合蛋白在CHO细胞系中表达。三种不同的前导序列可以用于表达：(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)前导序列(SEQ ID NO:214)，ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO:215)，和(iii)天然前导序列(SEQ ID NO:216)。示例性的ActRIIB(L79D,20-134)-hFc融合蛋白含有TPA前导序列并具有SEQ ID NO:190的未加工的氨基酸序列。编码此示例性融合蛋白的多核苷酸具有SEQ ID NO:191的核酸序列。
实施例5.示例性ActRIIB(20-134)-Fc同型二聚体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
ActRIIB(20-134)-Fc同型二聚体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用与本说明书中前面实施例和本文中提到的那些相似的方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用ActRIIB(20-134)-Fc同型二聚体治疗小鼠显著地抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图20)和炎性(IL-1B和TNF-α，示于图21)基因的表达，抑制TGFβ1和激活素A(图22,顶部两个图面)的上调，以及减少的肾损伤(NGAL的下调，示于图22，下部图面)。
实施例6:具有截短的ActRIIB细胞外结构域的融合蛋白的生成
如实施例4中所示，ActRIIB(L79D,20-134)-hFc融合蛋白(SEQ ID NO:190)通过向含有亮氨酸至天冬氨酸置换(在SEQ ID NO:1中的残基79处)的ActRIIB细胞外结构域(SEQID NO:1中的残基20-134)进行N-末端TPA前导序列融合和用最小的接头(三个甘氨酸残基)进行C-末端人Fc结构域融合而生成。此外，具有截短的ActRIIB细胞外结构域的相似融合蛋白称作ActRIIB(L79D,25-131)-hFc(SEQ ID NO:192)，其通过向含有亮氨酸至天冬氨酸置换(在SEQ ID NO:1中的残基79处)的截短的细胞外结构域(SEQ ID NO:1中的残基25-131)进行N-末端TPA前导序列融合和用最小的接头(三个甘氨酸残基)进行C-末端人Fc结构域融合而生成。ActRIIB(L79D,25-131)-hFc的细胞纯化形式的序列示于SEQ ID NO:193。编码此融合蛋白的一种核苷酸序列示于SEQ ID NO:194,而编码恰好相同的融合蛋白的可选多核苷酸序列示于SEQ ID NO:195。
用BiacoreTM仪器在体外评价这些和其他ActRIIB-hFc蛋白对几种配体的亲和力。结果概述于下表4中。由于复合物的非常快速的缔合和解离，Kd值通过稳态亲和拟合获得，这防止了对kon和koff的准确测定。
表4 ActRIIB-hFc变体的配体选择性
具有截短的细胞外结构域的融合蛋白ActRIIB(L79D,25-131)-hFc等同或超过由较长变体ActRIIB(L79D,20-134)-hFc所显示的对激活素B和GDF11的配体选择性，与缺少L79D置换的ActRIIB-hFc对应物相比具有激活素A结合的显著丧失，激活素B结合的部分丧失，和GDF11结合的几乎完全保留。值得注意的是，不含有L79D置换的不同截短变体(即，ActRIIB(25-131)-hFc vs.ActRIIB(20-134)-hFc)对在此显示的配体具有相似的结合选择性。ActRIIB(L79D,25-131)-hFc还保留了对Smad2/3信号传导配体GDF8和Smad1/5/8配体BMP6和BMP10的强至中等的结合。
实施例7.示例性ActRIIB(L79D,25-131)-hFc同型二聚体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
ActRIIB(L79D,25-131)-hFc同型二聚体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用与本说明书中前面实施例和本文中提到的那些相似的方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用ActRIIB(L79D,25-131)-hFc同型二聚体治疗小鼠不抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图44)和炎性(IL-1B和TNF-α，示于图45)基因的表达。该治疗不抑制TGFβ1和激活素A(图46)的上调，或不减少肾损伤(NGAL的下调，示于图46)。
实施例8.ALK4:ActRIIB异源二聚体的生成
申请人构建了可溶性ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源聚体复合物，其包含人ActRIIB和人ALK4的细胞外结构域，利用位于所述细胞外结构域和Fc结构域之间的接头将所述细胞外结构域各自分别融合至Fc结构域。各个构建体分别称作ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽，且各自的序列提供在下面。在此和其他实施例中，要注意用于形成二聚体的融合蛋白的ActRIIB部分可以包含天然或突变的ActRIIB序列的任何部分。例如，ActRIIB部分可以包含天然ActRIIB的全长细胞外结构域(例如，ActRIIB(20-134)序列)，具有截短(例如，ActRIIB(25-131)序列)、延伸或突变(例如，ActRIIB(L79D,25-131)或ActRIIB(L79D,20-134)序列)的细胞外结构域，除非另外地指定。
用于促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源聚体复合物形成的方法，与ActRIIB-Fc或ALK4-Fc同型二聚体复合物相反，是在Fc结构域的氨基酸序列中引入改变以引导非对称异源聚体复合物的形成。用于使用Fc结构域制备非对称相互作用对的许多不同方式描述于本公开中。
除了图5和6中所示的结构以外，ALK4:ActRIIB异源二聚体可以其他多聚体结构形成，诸如图9和11中的那些。用于多聚体复合物的可能单体包括图10中例举的各种融合蛋白。
在一种方式中，在ActRIIB-Fc(SEQ ID NO:199或201)和ALK4-Fc(SEQ ID NO:202或204)多肽序列中所示，改变一个Fc结构域以在相互作用面处引入阳离子氨基酸，而改变另一个Fc结构域以在相互作用面处引入阴离子氨基酸。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自采用了组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO:215)。
在SEQ ID NO:199中，前导(信号)序列和接头加下划线。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体而非ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc或ALK4-Fc:ALK4-Fc同型二聚体复合物形成,两个氨基酸置换(用赖氨酸替换酸性氨基酸)可以引入至ActRIIB融合蛋白的Fc结构域，如SEQ ID NO:199中由所指示。相应的经加工的蛋白(即，没有前导序列)具有SEQ ID NO:201的氨基酸序列。可以任选地提供SEQ ID NO:199或201的氨基酸序列，其中从C-末端移除赖氨酸(K)。编码SEQ ID NO:199的多核苷酸具有SEQ ID NO:200的核酸序列。
相应的ALK4-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:202的氨基酸序列,前导序列和接头加下 划线)。为了利用上面SEQ ID NO:199和201的ActRIIB-Fc融合多肽引导异源二聚体形成，两个氨基酸置换(用天冬氨酸替换赖氨酸)可以引入至ALK4-Fc融合蛋白的Fc结构域，如SEQID NO:202中由所指示。相应的经加工的蛋白(即，没有前导序列)具有SEQ IDNO:204的氨基酸序列。可以任选地提供SEQ ID NO:202或204的氨基酸序列，其中在C-末端处添加赖氨酸(K)。编码SEQ ID NO:202的一种多核苷酸具有SEQ ID NO:203的核酸序列。
ActRIIB-Fc(SEQ ID NO:199或201，或其中赖氨酸(K)从C末端移除的相应序列)和ALK4-Fc蛋白(SEQ ID NO:202或204，或其中赖氨酸(K)添加至C末端的相应序列)可以从CHO细胞系共表达并纯化，产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异源聚体复合物。
在使用非对称Fc融合蛋白促进异源多聚体复合物形成的另一种方式中，改变Fc结构域以引入互补的疏水相互作用和额外的分子间二硫键，分别如SEQ ID NO:205或206和207或208的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中所示。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自采用了组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO:215)。
在SEQ ID NO:205中所示的ActRIIB-Fc多肽序列中，前导(信号)序列和接头加下 划线。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体而非同型二聚体复合物形成,两个氨基酸置换(用半胱氨酸替换丝氨酸，和用色氨酸替换苏氨酸)可以引入至融合蛋白的Fc结构域，如上面由 所指示。相应的经加工的蛋白(即，没有前导序列)具有SEQ ID NO:206的氨基酸序列。可以任选地提供SEQ ID NO:205或206的氨基酸序列，其中从C-末端移除赖氨酸(K)。
在SEQ ID NO:207中所示的ALK4-Fc多肽序列中，前导序列和接头加下划线。为了利用上面SEQ ID NO:205或206的ActRIIB-Fc融合多肽引导异源二聚体形成，四个氨基酸置换可以引入至ALK4融合多肽的Fc结构域中，如SEQ ID NO:207中由所指示。相应的经加工的蛋白(即，没有前导序列)具有SEQ ID NO:208的氨基酸序列。可以任选地提供SEQ ID NO:207和208的氨基酸序列，其中在C-末端移除赖氨酸(K)。
ActRIIB-Fc(SEQ ID NO:205或206，或赖氨酸(K)从C末端移除的对应序列)和ALK4-Fc蛋白(SEQ ID NO:207或208，或赖氨酸(K)从C末端移除的对应序列)可以从CHO细胞系共表达和纯化，产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异源聚体复合物。
各种ALK4-Fc:ActRIIB-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱层析步骤(包括例如，以任何顺序的下列中的三种或更多种)实现：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。
实施例9.ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体与ActRIIB-Fc同型二聚体和ALK4-Fc同型二聚体相比较的配体结合谱
使用基于BiacoreTM的结合测定法比较上述示例性的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体复合物的配体结合选择性与ActRIIB-Fc和ALK4-Fc同型二聚体复合物的结合选择性。使用抗-Fc抗体将ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体、ActRIIB-Fc同型二聚体和ALK4-Fc同型二聚体独立地捕获至***上。注入配体且允许流经捕获的受体蛋白。结果概述于下表5中，其中表示最有效的配体捕获物的配体解离速率(kd)通过灰色阴影表示。
表5
这些比较结合数据证明ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体相对于ActRIIB-Fc或ALK4-Fc同型二聚体具有改变的结合谱/选择性。ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体与任一同二聚体相比显现与激活素B的结合增强，保留如利用ActRIIB-Fc同型二聚体所观察到的与激活素A、GDF8和GDF11的强结合，且表现出与BMP9、BMP10和GDF3的结合显著减少。具体而言，BMP9显现低或无可观察到的对ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体的亲和力，而该配体强烈结合ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体。像ActRIIB-Fc同型二聚体一样，异源二聚体保留与BMP6的中等水平结合。参见图12。
此外，使用A-204报告基因测定来评价ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体对通过激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、BMP10和BMP9的信号传导的影响。细胞系：人横纹肌肉瘤(衍生自肌肉)。报告载体：pGL3(CAGA)12(如Dennler等人,1998,EMBO 17:3091-3100中所述)。CAGA12基序存在于TGFβ响应基因(PAI-1基因)中，所以该载体通常用于通过Smad2和3信号传导的因子。以下概述示例性A-204报告基因测定。
第1天：将A-204细胞分至48孔板中。
第2天：用10ug pGL3(CAGA)12或pGL3(CAGA)12(10ug)+pRLCMV(1ug)和Fugene转染A-204细胞。
第3天：添加因子(稀释至培养基+0.1％ BSA中)。在添加至细胞之前，抑制剂需要与因子预孵育约1小时。约6小时后，将细胞用PBS冲洗且然后裂解。
遵循上述步骤，申请人进行荧光素酶测定。
在该测定中，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体两者均被确定为激活素A、激活素B、GDF11和GDF8的有效抑制剂。具体而言，如在图13中所示的比较同型二聚体/异源二聚体IC50数据中可见，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体类似地抑制激活素A、激活素B、GDF8和GDF11信号传导途径。然而，与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体对BMP9和BMP10信号传导途径的抑制显著降低。该数据与上面讨论的结合数据一致，其中观察到ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体展现与激活素A、激活素B、GDF8和GDF11的强结合，但与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同型二聚体相比，BMP 10和BMP9对ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体的亲和力显著降低。
因此，这些数据一起证明，与ActRIIB-Fc同型二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体是激活素B、激活素A、GDF8和GDF11的更有选择性的拮抗剂。因此，在其中此类选择性拮抗作用有利的某些应用中，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体将比ActRIIB-Fc同型二聚体更有用。实例包括治疗应用，其中期望保留激活素A、激活素B、激活素AB、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用，但使BMP9、BMP10、GDF3和BMP6中的一种或多种的拮抗作用最小化。
实施例10.示例性ALK4:ActRIIB异源多聚体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
实施例7中描述的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，参见，例如，Klahr和Morrissey(2002)Am J Physiol RenalPhysiol 283:F861-F875。
24只12周龄的C57BL/6雄性小鼠在肾的下极水平处进行左侧单侧输尿管结扎两次。3天后，将8只小鼠安乐死，从各只动物获取肾脏以评估肾损伤。剩余的小鼠随机分至两组中：i)在手术后第3天、第7天、第10天和第14天时以10mg/kg的剂量向8只小鼠皮下注射ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体，和ii)在手术后第3天、第7天、第10天和第14天时向8只小鼠皮下注射媒介物对照(vehicle control)磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在第17天时根据相关的动物看护指南将两组处死。从各只动物从UUO肾脏和对侧肾脏两者收集半个肾脏用于组织学分析(H&E和Masson’s Trichrome染色)，并使用1/4个肾脏用于RNA提取(RNeasy MidiKit,Qiagen,IL)。
对UUO肾脏样品进行基因表达分析以评估各个基因的水平。在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化(Col1a1、纤连蛋白、PAI-1、CTGF和a-SMA)、炎性基因(TNF-α和MCP1)、细胞因子(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的表达。参见图14。用ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体治疗小鼠显著抑制纤维化和炎性基因的表达，抑制TGFβ1/2/3的上调，并减少肾损伤。组织学数据确认在UUO模型中ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体治疗显著抑制肾纤维化并减少肾损伤。
总起来说，这些数据证明ALK4:ActRIIB异源多聚体治疗抑制肾纤维化和炎症并减少肾损伤。此外，这些数据表明其他ALK4:ActRIIB拮抗剂可用于治疗或预防肾脏疾病，包括，例如，ALK4和/或ActRIIB-结合配体的拮抗剂，ALK4和/或ActRIIB受体的拮抗剂，ALK4和/或ActRIIB下游信号传导介导物(例如，Smads)的拮抗剂，和与ALK4和/或ActRIIB相关的TGFβ超家族辅助受体的拮抗剂。
实施例11.ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体的生成
申请人构建了可溶性ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源聚体复合物，其包含人ActRIIB和人ALK7的细胞外结构域，利用位于所述细胞外结构域和Fc结构域之间的接头将所述细胞外结构域各自分别融合至Fc结构域。各个构建体分别称作ActRIIB-Fc和ALK7-Fc。
与ActRIIB-Fc或ALK7-Fc同型二聚体复合物相反，用于促进ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源聚体复合物形成的方法是在Fc结构域的氨基酸序列中引入改变以引导非对称异源聚体复合物的形成。用于使用Fc结构域制备非对称相互作用对的许多不同方式描述于本公开中。
在一种方式中，分别在下面公开的ActRIIB-Fc(SEQ ID NO:199)和ALK7-Fc多肽序列中所示，改变一个Fc结构域以在相互作用面处引入阳离子氨基酸，而改变另一个Fc结构域以在相互作用面处引入阴离子氨基酸。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK7-Fc融合多肽各自采用了组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列(SEQ ID NO:215)。
在SEQ ID NO:199中，前导(信号)序列和接头加下划线。为了促进ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体而非可能的同型二聚体复合物形成,两个氨基酸置换(用赖氨酸替换酸性氨基酸)可以引入至ActRIIB融合蛋白的Fc结构域，如上面由所指示。相应的经加工的(即，没有前导序列)ActRIIB-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:201的氨基酸序列。可以任选地提供SEQ ID NO:199和201两者，其中赖氨酸(K)从C-末端移除。编码SEQ ID NO:199的多核苷酸具有SEQ ID NO:200的核酸序列。
ALK7-Fc融合蛋白的示例性引导形式在SEQ ID NO:209中给出。在该序列中，信号序列和接头序列加下划线。为了促进ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体而非同型二聚体复合物形成,两个氨基酸置换(用天冬氨酸替换赖氨酸)可以引入至融合蛋白的Fc结构域，如上面由双下划线所指示。相应的经加工的(即，没有前导序列)ALK7-Fc融合多肽具有SEQ IDNO:211的氨基酸序列。可以任选地提供SEQ ID NO:209和211两者，其中在C-末端添加赖氨酸。编码SEQ ID NO:209的多核苷酸具有SEQ ID NO:210的核酸序列。
ActRIIB-Fc(SEQ ID NO:199或201，或从C末端移除赖氨酸(K)的对应序列)和ALK7-Fc(SEQ ID NO:209或211，或在C末端添加赖氨酸(K)的对应序列)蛋白可以从CHO细胞系共表达和纯化，产生包含ActRIIB-Fc:ALK7-Fc的异源聚体复合物。
在使用非对称Fc融合蛋白促进异源多聚体复合物形成的另一种方式中，改变Fc结构域以在ActRIIB-Fc和ALK7-Fc多肽的Fc结构域中引入互补的疏水相互作用和额外的分子间二硫键。例如，在突变的ActRIIB-Fc多肽(SEQ ID NO:205)中，前导序列和接头加下划线。为了促进ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体而非可能的同型二聚体复合物形成,两个氨基酸置换(用半胱氨酸替换丝氨酸和用色氨酸替换苏氨酸)可以引入至融合蛋白的Fc结构域，如上面由所指示。相应的经加工的(即，没有前导序列)ActRIIB-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:206的氨基酸序列。可以任选地提供SEQ ID NO:205和206两者，其中从C-末端去除赖氨酸。
示例性的ALK7-Fc融合蛋白突变形式(用于引导的二聚作用)在SEQ ID NO:212中给出。在该序列中，前导序列和接头加下划线。为了利用上面SEQ ID NO:205或206的ActRIIB-Fc融合多肽引导异源二聚体形成，四个氨基酸置换可以引入至ALK7融合多肽的Fc结构域中，如由所指示。相应的经加工的(即，没有前导序列)ALK7-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:213的氨基酸序列。可以任选地提供SEQ ID NO:212和213的氨基酸序列两者，其中从C-末端移除赖氨酸。
ActRIIB-Fc(SEQ ID NO:205或206，或从C末端移除赖氨酸(K)的对应序列)和ALK7-Fc(SEQ ID NO:212或213，或从C末端移除赖氨酸(K)的对应序列)蛋白可以从CHO细胞系共表达和纯化，产生包含ActRIIB-Fc:ALK7-Fc的异源聚体复合物。
各种ActRIIB-Fc:ALK7-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱层析步骤(包括例如，以任何顺序的下列中的三种或更多种)实现：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。
实施例12.ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体与ActRIIB-Fc同型二聚体和ALK7-Fc同型二聚体相比较的配体结合谱
使用基于BiacoreTM的结合测定法比较示例性ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体复合物与ActRIIB-Fc和ALK7-Fc同型二聚体复合物的配体结合选择性。使用抗-Fc抗体将示例性的二聚体诸如ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体、ActRIIB-Fc同型二聚体和ALK7-Fc同型二聚体独立地捕获至***上。注入配体且允许流经捕获的受体蛋白。结果概述于下表6中，其中表示最有效的配体捕获物的配体解离速率(kd)通过灰色阴影表示。
表6
这些比较结合数据证明ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体相对于ActRIIB-Fc同型二聚体或ALK7-Fc同型二聚体具有改变的结合谱/选择性。有趣的是，与ActRIIB-Fc同型二聚体最强结合的5个配体中的4个(激活素A、BMP10、GDF8和GDF11)显示出与ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体的结合减少，例外是激活素B，其保留了与异源二聚体的紧密结合。类似地，与ActRIIB-Fc同型二聚体中等结合的4个配体中的3个(GDF3、BMP6和特别是BMP9)显示出与ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体的结合减少，而与激活素AC的结合增加成为总体上与异源二聚体的第二强的配体相互作用。最后，激活素C和BMP5出人意料地以中等强度结合ActRIIB-Fc:ALK7异源二聚体，尽管与ActRIIB-Fc同型二聚体没有结合(激活素C)或弱结合(BMP5)。最终结果是ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体具有与ActRIIB-Fc同型二聚体或ALK7-Fc同型二聚体截然不同的配体结合谱，ALK7-Fc同型二聚体与前述配体中的每一个都不结合。参见图15。
因此这些结果证明与ActRIIB-Fc同型二聚体相比，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体是激活素B和激活素AC的更有选择性的拮抗剂。此外，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体表现出与激活素C稳固结合的独特特性。因此，在其中此类选择性拮抗作用有利的某些应用中，ActRIIB-Fc:ALK7-Fc异源二聚体将比ActRIIB-Fc同型二聚体更有用。实例包括治疗应用，其中期望保留激活素B或激活素AC的拮抗作用，但减小激活素A、GDF3、GDF8、GDF11、BMP9或BMP10中的一种或多种的拮抗作用。还包括治疗、诊断或分析应用，其中期望拮抗激活素C或基于激活素C和激活素E之间的相似性，拮抗激活素E。
实施例13.示例性ALK7:ActRIIB异源多聚体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
实施例11中描述的ALK7-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，参见，例如，Klahr和Morrissey(2002)Am J Physiol RenalPhysiol 283:F861-F875。
24只12周龄的C57BL/6雄性小鼠在肾的下极水平处进行左侧单侧输尿管结扎两次。3天后，将8只小鼠安乐死，从各只动物获取肾脏以评估肾损伤。剩余的小鼠随机分至两组中：i)在手术后第3天、第7天、第10天和第14天时以10mg/kg的剂量向8只小鼠皮下注射ALK7-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体，和ii)在手术后第3天、第7天、第10天和第14天时向8只小鼠皮下注射媒介物对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在第17天时根据相关的动物看护指南将两组处死。从各只动物从UUO肾脏和对侧肾脏两者收集半个肾脏用于组织学分析(H&E和Masson’sTrichrome染色)，并使用1/4个肾脏用于RNA提取(RNeasy Midi Kit,Qiagen,IL)。
对UUO肾脏样品进行基因表达分析以评估各个基因的水平。在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化基因(Col1a1、Col3a1、纤连蛋白、PAI-1、CTGF和a-SMA)、炎性基因(TNF-α和MCP1)、细胞因子(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3和激活素A)、肾损伤基因(NGAL)、缺氧诱导因子1-α(HIF1a)和激活素A受体(ActRIIA)的表达。参见图16。用ALK7-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体治疗小鼠显著抑制纤维化和炎性基因的表达，抑制TGFβ1/2/3、激活素A和ActRIIa的上调，并减少肾损伤。组织学数据确认在UUO模型中ALK7-Fc:ActRIIB-Fc异源二聚体治疗显著抑制肾纤维化并减少肾损伤。
总起来说，这些数据证明ALK7:ActRIIB异源多聚体治疗抑制肾纤维化和炎症并减少肾损伤。此外，这些数据表明其他ALK7:ActRIIB拮抗剂可用于治疗或预防肾脏疾病，包括，例如，ALK7和/或ActRIIB-结合配体的拮抗剂(例如，配体抗体和其他配体捕获物诸如促滤泡素抑制素、Cerberus和Lefty)，ALK7和/或ActRIIB受体的拮抗剂，ALK7和/或ActRIIB下游信号传导介导物(例如，Smads)的拮抗剂，和TGFβ超家族辅助受体的拮抗剂(例如，Crypto或Cryptic的拮抗剂)。
实施例14.示例性抗-TGFβpan抗体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
抗-TGF-β1/2/3pan抗体(即，结合TGF-β的同种型1、2和3)对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用pan抗体治疗小鼠显著抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图23)基因的表达，和稍稍减少炎性(TNF-α，示于图24)基因的表达，并抑制TGFβ1/2/3和激活素A的上调(图25)。然而，不同于ActRIIA-Fc同型二聚体和ActRIIB-Fc同型二聚体，pan抗体不减少肾损伤(无NGAL下调，示于图25)。
实施例15.示例性抗-激活素A抗体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
抗-激活素A抗体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用抗-激活素A抗体治疗小鼠显著抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图26)和炎性(IL-1B和TNF-α，示于图27)基因的表达，并抑制TGFβ1/2/3和激活素A的上调(图28)，和减少肾损伤(NGAL的下调，示于图28)。
实施例16.示例性抗-激活素A/B抗体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
抗-激活素A/B抗体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用抗-激活素A/B抗体治疗小鼠显著抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图29)和炎性(IL-1B和TNF-α，示于图30)基因的表达，并抑制TGFβ1/2/3和激活素A的上调(图31)，和减少肾损伤(NGAL的下调，示于图31)。
实施例17.示例性抗-激活素B抗体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
抗-激活素B抗体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用抗-激活素B抗体治疗小鼠不显著抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图32)或炎性(IL-1B和TNF-α，示于图33)基因的表达。该治疗不显著抑制TGFβ1/2/3和激活素A的上调(图34)或不减少肾损伤(NGAL的下调，示于图34)。
实施例18.示例性抗-ActRIIA抗体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
抗-ActRIIA抗体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用抗-ActRIIA抗体治疗小鼠显著抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图35)和炎性(TNF-α，示于图36)基因的表达，抑制TGFβ1/2/3和激活素A的上调(图37)，和减少肾损伤(NGAL的下调，示于图37)。
实施例19.示例性抗-ActRIIA/IIB抗体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
抗-ActRIIA/IIB抗体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用与这些实施例和本说明书中提到的那些相同的方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用抗-ActRIIA/IIB抗体治疗小鼠显著抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图38)和炎性(TNF-α，示于图39)基因的表达，抑制TGFβ1/2/3和激活素A的上调(图40)，和减少肾损伤(NGAL的下调，示于图40)。
实施例20.示例性抗-ActRIIB抗体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
抗-ActRIIB抗体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
在CFX ConnectTM实时PCR检测***(Bio-Rad,CA)上进行QRT-PCR以评价各种纤维化和炎性基因和肾损伤基因(NGAL)的表达。用抗-ActRIIB抗体治疗小鼠不抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图41)或炎性(TNF-α，示于图42)基因的表达。该治疗不抑制TGFβ1/2/3和激活素A的上调(图43)或不减少肾损伤(NGAL的下调，示于图43)。
实施例21.ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体与ActRIIA-Fc同型二聚体和ALK4-Fc同型二聚体相比较的配体结合谱
类似地，ActRIIA多肽(例如，其细胞外结构域)可以融合至，例如，人IgG Fc结构域用于与其自身(即，同型二聚体)或其他多肽(即，异源二聚体)的进一步二聚作用。在此实施例和其他实施例中，要注意的是用于形成二聚体的融合蛋白的ActRIIA部分可以包含本文公开的或本领域中已知的天然或突变的ActRIIA序列的任何部分。例如，所述ActRIIA部分可以包含天然ActRIIA的全长细胞外结构域，具有截短、延伸或突变的细胞外结构域，除非另外指明。
使用基于BiacoreTM的结合测定法比较示例性的ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体复合物与ActRIIA-Fc和ALK4-Fc同型二聚体复合物的配体结合选择性，比较使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
如图47中所示，这些比较结合数据证明ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体相对于ActRIIA-Fc或ALK4-Fc同型二聚体具有改变的结合谱/选择性。ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体与任一同型二聚体相比显现与激活素AC和激活素A的结合增强，保留如利用ActRIIA-Fc同型二聚体所观察到的与激活素AB的强结合，且表现出与激活素B、BMP10和BMP7明显减少的结合。
实施例22.示例性ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体对肾纤维化、炎症和肾损伤的作用
ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体对肾脏疾病的作用在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估，评估使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
用ALK4-Fc:ActRIIA-Fc异源二聚体治疗小鼠显著抑制纤维化(Col1a1、Col3a1、PAI-1、纤连蛋白、CTGF和a-SMA,示于图48)和炎性(TNF-α，示于图49)基因的表达，抑制TGFβ1/2/3和激活素A的上调(图50)，和减少肾损伤(NGAL的下调，示于图50)。
实施例23.ALK4-Fc:BMPRII-Fc异源二聚体与BMPRII-Fc同型二聚体和ALK4-Fc同型二聚体相比较的配体结合谱
使用基于BiacoreTM的结合测定法比较示例性的ALK4-Fc:BMPRII-Fc异源二聚体复合物与BMPRII-Fc和ALK4-Fc同型二聚体复合物的配体结合选择性，比较使用这些实施例和本说明书中的相同方法进行。
如图51中所示，这些比较结合数据证明ALK4-Fc:BMPRII-Fc异源二聚体相对于BMPRII-Fc或ALK4-Fc同型二聚体具有改变的结合谱/选择性。ALK4-Fc:BMPRII-Fc异源二聚体与任一同型二聚体相比显现与激活素A、激活素B和激活素AB的结合增强，保留如利用BMPRII-Fc同型二聚体所观察到的与BMP10的中等结合，且表现出与BMP9和BMP15明显减少的结合。
实施例24.通用方法
除非另外指明，否则上述实施例中所使用的材料和方法举例如下：人融合蛋白的产生
构建的融合蛋白通过在COS细胞中瞬时转染而初始表达。简言之，COS细胞用编码靶标融合蛋白的质粒使用/>6转染试剂(Promega)转染过夜。第二天，细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤并加入无血清培养基。孵育72h后，收获COS-条件培养基、过滤并加载到MabSelect SuRe柱(GE Healthcare,UK)上。融合蛋白用0.1M甘氨酸(pH3.0)稀释，且稀释的级分立即通过以1:10比率添加1M Tris(pH 8.0)中和。使用NanoDropTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)量化蛋白。
CHO细胞通过标准方法利用编码靶标融合蛋白并含有促进蛋白表达的遍在染色质开放元件(UCOE)的质粒转染。参见，例如，Cytotechnology(2002)38:43-46。在10nM、20nM和50nM浓度的甲氨蝶呤(MTX)中选择多个汇合物。50nM MTX汇合物产生最高的表达水平，因此从此汇合物中获得稀释克隆，并使该稀释克隆适应无血清悬浮生长以产生用于纯化的条件培养基。
衍生自CHO细胞的融合蛋白的纯化
在CHO细胞中表达的人融合蛋白如下纯化用于随后的通过表面等离子体共振和报告基因测定的表征。将含有靶标融合蛋白的条件培养基浓缩、过滤并加载在之前用PBS平衡的MAb SelectSuRe柱上。然后用PBS洗涤树脂，并用0.1M甘氨酸pH 3.5洗脱蛋白。含有蛋白的级分用5％(v/v)1M Tris pH 8.0中和。将洗脱汇合物加载在之前用缓冲液A(50mM TrispH 8.0)和B(50mM Tris,1M NaCl pH 8.0)平衡的Q Sepharose FF 10mL柱(GEHealthcare)上。以10％ B(100mM NaCl)进行洗涤，接着以20％ B(200mM NaCl)洗脱。将蛋白在经含有50mM精氨酸(pH 7.22)的PBS平衡的HiLoadTM 26/60Superdex(GE Healthcare)上进一步加工。通过分析性尺寸排阻层析评价级分，并将含有超过90％单体的那些汇合、浓缩并表征。样品的纯度通过分析性尺寸排阻层析和利用考马斯蓝染色的SDS-PAGE评价。
融合蛋白的配体结合谱
使用表面等离子体共振来研究和表征融合蛋白和它们的结合伴侣之间的结合。在初始的定性筛选中，重组融合蛋白被共价固定在BIACORETM CM5芯片上，并将超过30种的内部产生或获自R&DSystems的配体各自注射到俘获的融合蛋白以表征它们在室温下的结合度。基于此筛选的结果，申请人将所选择的配体进行与人融合蛋白在生理温度下的结合的定量表征。对于一种条件，融合蛋白如实施例1中所述在CHO细胞中表达、纯化，在BIACORETM芯片上用抗-Fc抗体俘获，并利用下面的配体在37℃通过表面等离子体共振测试。
通过基于细胞的测定法测定与融合蛋白的配体结合的抑制作用
使用报告基因测定法来确定人融合蛋白抑制细胞信号传导(例如，TGF-β/Smad信号传导)的能力。这些测定法基于用pGL3 BRE(包含TGF-β/Smad反应元件)报告质粒以及用来控制转染效率的Renilla报告质粒(pRLCMV)转染的人细胞系。TGF-β反应元件与启动子一起存在于pGL3 BRE报告质粒的启动子中，因此该载体通常用于通过Smad蛋白传导信号的因子。
在测定的第一天，将细胞以8.5x104细胞/孔或12.5x104细胞/孔分别分配在48孔板中。在第二天，含有10μg pGL3 BRE、100ng pRLCMV、30μl Fugene HD(Roche AppliedScience,DE)和970μl OptiMEMTM(Invitrogen)的溶液预孵育30min,然后添加到由补充了0.1％BSA的Eagle极限必需培养基或McCoy’s 5A培养基组成的测定缓冲液中。将该混合物施加到接种的细胞(500μl/孔)在37℃孵育过夜。
在第三天，移除培养基，细胞与如下所述制备的配体和抑制剂的混合物在37℃孵育过夜。使用48孔板将融合蛋白在200μl体积的测定缓冲液中连续稀释。加入等体积的含有测试配体的测定缓冲液以获得与之前确定的EC50相等的最终配体浓度。测试溶液在37℃孵育30分钟，然后向所有孔加入250μl所述混合物。一式两份地确定每个浓度的测试物品。在与测试溶液孵育过夜后，细胞用磷酸盐缓冲盐水漂洗，然后用被动裂解缓冲液(PromegaE1941)裂解并在–70℃保存过夜。在第4天和最后一天，将板升温至室温并轻轻震摇。将细胞裂解液一式两份地转移到化学发光板(96-孔)并利用来自双萤光素酶报告基因测试***(Promega E1980)的试剂在光度计中分析以确定归一化的萤光素酶活性。
使用这些测定来评价融合蛋白抑制由TGF-β/Smad介导的细胞信号传导的能力，申请人通过表面等离子体共振鉴定TGF-β/Smad是高亲和力结合剂。在这些测定中使用的融合蛋白如上所述在CHO细胞中表达和纯化。
通过引用并入
本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其整体并入本文，就像每个独立出版物或专利具体而单独指明通过引用并入一样。
尽管已经论述了主题的具体实施方案，但上述说明书是说明性的而非限制性的。在回顾了本说明书和随附权利要求书后，许多变化对本领域技术人员将变得显而易见。应参照权利要求连同其等同内容的整个范围和说明书连同此类变化来确定本发明的整个范围。

Claims (21)

1.靶向激活素和生长分化因子GDF的拮抗剂在制备用于治疗或预防受试者的肾脏疾病的药物中的用途，其中所述肾脏疾病是肾纤维化、肾脏炎症或肾损伤，其中所述拮抗剂是包含ActRIIA-Fc多肽和ALK4-Fc多肽的异源多聚体，其中ActRIIA多肽包含SEQ ID No:12的氨基酸序列，其中ALK4多肽包含SEQ ID No:58的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述拮抗剂包含一个或多个接头序列。
3.根据权利要求1中所述的用途，其中所述异源多聚体是异源二聚体。
4.根据权利要求3所述的用途，其中Fc结构域来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.根据权利要求3所述的用途，其中Fc结构域包含选自SEQ ID NO:135-149的氨基酸序列。
6.根据权利要求3所述的用途，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸修饰促进所述Fc结构域与具有相同的氨基酸修饰或至少一个不同的氨基酸修饰的另一Fc结构域的特异性结合。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述拮抗剂是ActRIIA-Fc-ALK4-Fc异源二聚体，所述ActRIIA-Fc-ALK4-Fc异源二聚体包含ActRIIA-Fc多肽和ALK4-Fc多肽，其中所述ActRIIA-Fc-ALK4-Fc异源二聚体相对于ActRIIA-Fc同型二聚体对激活素A、GDF11和BMP6中的一种或多种具有增加的结合活性，和/或相对于ALK4-Fc同型二聚体对GDF8、GDF11和激活素A中的一种或多种具有增加的结合活性。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述ActRIIA多肽包含SEQ IDNo:11的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者患有单侧输尿管梗阻UUO。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述拮抗剂抑制Col1a1、纤连蛋白、Col3a1、PAI-1、CTGF、a-SMA和TNF-α中的一种或多种的mRNA表达。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述抑制通过基于细胞的测定法测量。
12.根据权利要求2所述的用途，其中所述一个或多个接头序列包含TGGG、SGGG、TGGGG、SGGGG、GGGGS、GGGG或GGG。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述ALK4-Fc多肽包含选自SEQ ID NO:204、SEQID NO:208和不具有末端赖氨酸的SEQ ID NO:208的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述ActRIIA-Fc多肽包含选自SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:180、不具有末端赖氨酸的SEQ ID NO:177和不具有末端赖氨酸的SEQ ID NO:180的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述ALK4-Fc多肽包含选自SEQ ID NO:204、SEQID NO:208和不具有末端赖氨酸的SEQ ID NO:208的氨基酸序列。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述肾脏疾病是肾纤维化。
17.根据权利要求1所述的用途，其中所述肾脏疾病是局灶节段性肾小球硬化症。
18.根据权利要求1所述的用途，其中所述肾脏疾病是局灶节段性肾小球肾炎。
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述肾脏疾病是肾纤维化。
20.根据权利要求15所述的用途，其中所述肾脏疾病是局灶节段性肾小球硬化症。
21.根据权利要求15所述的用途，其中所述肾脏疾病是局灶节段性肾小球肾炎。
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