CN110196272A - 检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法 - Google Patents

检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110196272A
CN110196272A CN201910582347.4A CN201910582347A CN110196272A CN 110196272 A CN110196272 A CN 110196272A CN 201910582347 A CN201910582347 A CN 201910582347A CN 110196272 A CN110196272 A CN 110196272A
Authority
CN
China
Prior art keywords
decorative layer
ratio sensor
electrode
solution
metal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910582347.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110196272B (zh
Inventor
陈时洪
李芹
谭兴容
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing ninth people's hospital
CHONGQING SHAPINGBA DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL
Southwest University
Original Assignee
Chongqing ninth people's hospital
CHONGQING SHAPINGBA DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing ninth people's hospital, CHONGQING SHAPINGBA DISTRICT PEOPLE'S HOSPITAL, Southwest University filed Critical Chongqing ninth people's hospital
Priority to CN201910582347.4A priority Critical patent/CN110196272B/zh
Publication of CN110196272A publication Critical patent/CN110196272A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110196272B publication Critical patent/CN110196272B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/305—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells optically transparent or photoresponsive electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/308—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells at least partially made of carbon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本申请提供一种检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法，属于电化学发光传感器技术领域。构建方法包括：在电极的表面修饰第一修饰层后得到第一修饰电极，其中，第一修饰层包括金属‑g‑C3N4。在第一修饰电极的表面修饰蛋白液后得到第二修饰电极。在第二修饰电极的表面修饰第三修饰层后得到电化学比率传感器，其中，第三修饰层包括异鲁米诺、金属‑猝灭剂。将电化学比率传感器置于含有溶解氧的过硫酸根溶液中，以所述电化学比率传感器作为工作电极进行电化学检测，得到阴极信号值和阳极信号值。通过所述阴极信号值和所述阳极信号值计算所述蛋白液的蛋白浓度。通过上述比率传感器检测得到的蛋白浓度的值更加准确。

Description

检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检 测方法
技术领域
本申请涉及电化学发光传感器技术领域，具体而言，涉及一种检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法。
背景技术
电致化学发光(ECL，Electrochemiluminescence)比率法能有效避免仪器或环境因素干扰，提高分析的可靠性和灵敏度，在免疫、蛋白质、癌细胞、RNA、DNA等传感分析中显示出良好的应用前景。现有的ECL比率传感器通常使用CdS或CdTe等量子点作为阴极发光体，且阴极和阳极ECL发光体常借助同一种共反应试剂以同时增强两ECL信号。CdS和CdTe等量子点的毒性限制了他们在生物分析中的应用，同时，两发光体分享同一共反应试剂，不可避免的会对共反应试剂产生竞争消耗，从而影响检测结果的准确性。
发明内容
本申请提供了一种检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法，其能够提高蛋白浓度检测的准确性。
第一方面，本申请实施例提供了一种检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，包括如下步骤：在电极的表面修饰第一修饰层后得到第一修饰电极，其中，第一修饰层包括金属-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂。在第一修饰电极的表面修饰第二修饰层后得到第二修饰电极，其中，第二修饰层为蛋白液。在第二修饰电极的表面修饰第三修饰层后得到电化学比率传感器，其中，第三修饰层包括异鲁米诺、蛋白抗体、金属-猝灭剂和封闭剂。
第一修饰层中包括有金属-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂，在g-C3N4上生长金属，使蛋白抗体能够与金属进行键合作用，从而使蛋白抗体负载在g-C3N4上，并且通过封闭剂封闭非特异性结合位点，将金属中没有与蛋白抗体结合的部位覆盖掉，避免蛋白被金属吸附。相应地，第三修饰层中包括异鲁米诺、蛋白抗体、金属-猝灭剂和封闭剂，将金属与猝灭剂结合以后，使蛋白抗体能够与金属进行键合作用，从而使蛋白抗体负载在猝灭剂上，与异鲁米诺配合，实现异鲁米诺、金属、蛋白抗体和猝灭剂的结合，且通过封闭剂封闭非特异性结合位点。将蛋白液形成在第一修饰层和第三修饰层之间，与电极配合以后，形成电化学比率传感器，在进行电化学检测的时候，以g-C3N4作为阴极发光体，异鲁米诺作为阳极发光体，g-C3N4赋予电极一高的阴极信号，在将第三修饰层形成在第二修饰电极上以后，猝灭剂猝灭g-C3N4的信号，使阴极信号降低，而第三修饰层的异鲁米诺的阳极信号随着蛋白液的浓度增加而增大。通过阴极信号和阳极信号的同时改变，阴极信号下降，阳极信号的增加，从而使蛋白浓度的比率检测值更加准确。
结合第一方面，在另一实施例中，金属-g-C3N4的制备方法，包括：将g-C3N4分散液、金属盐溶液和还原剂混合，后加入稳定剂继续混合，固液分离得到金属-g-C3N4。
通过还原剂的作用，将金属盐溶液中的金属离子还原成金属单质颗粒，使金属单质颗粒均匀分布在g-C3N4的表面，且加入稳定剂以后，可以使金属颗粒更加稳定，以便得到稳定的金属-g-C3N4。
结合第一方面，在另一实施例中，在电极的表面修饰第一修饰层后得到第一修饰电极的步骤，包括：将金属-g-C3N4分散液、蛋白抗体溶液和封闭剂溶液依次滴涂在所述第一电极的表面孵育得到第一修饰电极。
通过分步进行各种溶液的滴涂，将金属-g-C3N4分散液、蛋白抗体溶液和封闭剂溶液依次滴涂在电极的表面上，使电极的表面修饰了第一修饰层，以便第一修饰层中含有金属-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂。
结合第一方面，在另一实施例中，金属-猝灭剂的制备方法，包括：将猝灭剂溶液、金属盐溶液和还原剂混合，后加入稳定剂继续混合，固液分离得到金属-猝灭剂。
通过还原剂的作用，将金属盐溶液中的金属离子还原成金属单质颗粒，使金属单质颗粒均匀地与猝灭剂结合，且加入稳定剂以后，可以使金属颗粒更加稳定，以便得到稳定的金属-猝灭剂，使猝灭剂的功能发挥效果更好。
结合第一方面，在另一实施例中，还原剂包括硼氢化钠和/或盐酸羟胺。以便将金属盐溶液还原成金属单质颗粒，使金属单质颗粒均匀地与猝灭剂结合。
结合第一方面，在另一实施例中，在第二修饰电极的表面修饰第三修饰层后得到电化学比率传感器的步骤，包括：将金属-猝灭剂分散液、蛋白抗体溶液、异鲁米诺溶液和封闭剂溶液混合后得到二抗复合物溶液，将二抗复合物溶液滴涂在第二修饰电极的表面。
先形成二抗复合物溶液，可以使金属-猝灭剂、蛋白抗体和异鲁米诺进行很好的结合，以便蛋白浓度的检测。
结合第一方面，在另一实施例中，金属-g-C3N4和金属-猝灭剂中的金属均为金属纳米粒子。可选地，金属包括金、银和铂中的一种或多种。
金属纳米粒子的形成，可以使g-C3N4与蛋白抗体的结合更好，以便蛋白抗体负载在金属-g-C3N4上。猝灭剂的表面原位生长金属纳米粒子，结合牢固，与异鲁米诺和蛋白抗体结合以后，使得到的第三修饰层的各成分的结合更加牢固，蛋白浓度的检测更加准确。
结合第一方面，在另一实施例中，封闭剂溶液包括己六醇溶液和BSA溶液中的一种或两种。
使用上述封闭剂溶液以封闭非特异性结合位点，防止蛋白液的非特异性吸附。
结合第一方面，在另一实施例中，猝灭剂为聚苯胺。
使用上述猝灭剂，可以对阴极信号起到高效的猝灭作用，使阴极信号降低，阳极信号随着蛋白液的浓度的增加而增强，阴极信号的减弱，阳极信号的增强，实现蛋白液的高灵敏度的比率检测。
第二方面，本申请实施例提供一种检测蛋白的电化学比率传感器，包括：电极、第一修饰层、第二修饰层和第三修饰层。第一修饰层修饰在电极的表面，其中，第一修饰层包括金属-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂。第二修饰层修饰在第一修饰层的表面，其中，第二修饰层为蛋白液。第三修饰层修饰在第二修饰层表面，其中，第三修饰层包括异鲁米诺、蛋白抗体、金属-猝灭剂和封闭剂。
第一修饰层中包括有金属-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂，在g-C3N4上生长金属，使蛋白抗体能够与金属进行键合作用，从而使蛋白抗体负载在g-C3N4上，并且通过封闭剂封闭非特异性结合位点，将金属中没有与蛋白抗体结合的部位覆盖掉，避免蛋白被金属吸附。相应地，第三修饰层中包括异鲁米诺、蛋白抗体、金属-猝灭剂和封闭剂，将金属与猝灭剂结合以后，使蛋白抗体能够与金属进行键合作用，从而使蛋白抗体负载在猝灭剂上，与异鲁米诺配合，实现异鲁米诺、金属、蛋白抗体和猝灭剂的结合，且通过封闭剂封闭非特异性结合位点。将蛋白液形成在第一修饰层和第三修饰层之间，与电极配合以后，形成电化学比率传感器，在进行电化学检测的时候，以g-C3N4作为阴极发光体，异鲁米诺作为阳极发光体，g-C3N4赋予电极一高的阴极信号，在将第三修饰层修饰在第二修饰电极上以后，猝灭剂猝灭g-C3N4的信号，使阴极信号降低，而第三修饰层的异鲁米诺的阳极信号随着蛋白液的浓度增加而增强。通过阴极信号和阳极信号的同时改变，阴极信号下降，阳极信号的增加，从而使蛋白浓度的比率检测值更加准确。
第三方面，本申请实施例提供一种蛋白浓度的检测方法，包括如下步骤：将上述电化学比率传感器置于含有溶解氧的过硫酸根溶液中，以电化学比率传感器作为工作电极进行电化学检测，得到阴极信号值和阳极信号值，其中，蛋白液为待检测蛋白液。通过阴极信号值和阳极信号值计算所述待检测蛋白液的浓度。
使用过硫酸根和溶解氧作为电化学比率传感器的共反应试剂，g-C3N4发光体以过硫酸根作为共反应试剂，异鲁米诺发光体以溶解氧作为共反应试剂，g-C3N4发光体和异鲁米诺发光体的发光电位能够很好分辨且不相互干扰，而且两发光体不共用同一共反应试剂，避免共反应试剂的竞争，使蛋白浓度的比率检测更加精确。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例1提供的二抗复合物以及电化学比率传感器的构建方法图；
图2为本申请实施例1提供的PANI和Au@PANI的特征图；
图3为本申请实施例1提供的g-C3N4和Au-g-C3N4的特征图；
图4为本申请实施例1提供的电化学比率传感器的表征图；
图5为本申请实施例1提供的降钙素液的浓度的检测图；
图6为本申请实施例1提供的电化学比率传感器的稳定性和选择性检测图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，包括如下步骤：
S110、制备g-C3N4：
使用高温煅烧聚合的方法合成g-C3N4。首先将称量好的10-20g三聚氰胺放置于瓷坩埚中，再将坩埚置于马弗炉中在500-700℃的条件下加热2-3h，其中，马弗炉中的升温速率为4-6℃/min。冷却后，所得的黄色块状固体即为块状g-C3N4，研磨成粉末备用。称取g-C3N4粉末100-200mg，将其分散在100-200mL水中，连续超声10h以上，将超声后的分散液于5000rpm下离心，收集上层悬浮液并将其干燥处理。悬浮液干燥后得到的固体即为g-C3N4纳米片。
S120、制备金属-g-C3N4：
将g-C3N4分散液、金属盐溶液和还原剂混合，后加入稳定剂继续混合，固液分离得到金属-g-C3N4。其中g-C3N4分散液中的g-C3N4为薄片结构，通过还原剂的作用将金离子还原，使在g-C3N4薄片上生长金属颗粒，并通过稳定剂的作用使金属颗粒的负载更加稳定，以便后续与蛋白抗体的结合。
可选地，金属为纳米金属离子，金属包括金、银和铂中的一种或多种。例如：金属为金纳米粒子；金属为银纳米粒子；金属为铂纳米粒子，金属为金纳米粒子和银纳米粒子；金属为金纳米粒子和铂纳米粒子；金属为银纳米粒子和铂纳米粒子；金属为金纳米粒子、银纳米粒子和铂纳米粒子。下面以金属为金纳米粒子为例进行说明。
还原剂包括硼氢化钠和/或盐酸羟胺。下面以还原剂为硼氢化钠为例进行说明。稳定剂包括柠檬酸钾和/或柠檬酸钠。下面以稳定剂为柠檬酸钠为例进行说明。
详细地，称取2-4mg的g-C3N4纳米片分散在2-4mL水中，搅拌下加入20-40μL质量浓度为1-4％的HAuCl4溶液，保持搅拌6-8h。然后将50-100μL现配的浓度为10-20mmol/L硼氢化钠(NaBH4)溶液加入至上述混合溶液中，搅拌20-40min以还原AuCl4 —。继续加入20-40μL浓度为10-20mmol/L的柠檬酸钠溶液，搅拌30-60min后将混合溶液离心分离并洗涤数次，将所得到的固体Au-g-C3N4分散在2mL水中备用，得到Au-g-C3N4分散液。
S130、制备猝灭剂，猝灭剂为聚苯胺(PANI)。
聚苯胺(PANI)的合成方法是：分别将0.8-1g过硫酸铵和150-200μL的苯胺单体溶解于4-10mL浓度为0.8-1.5mol/L的盐酸溶液中。两溶液均超声10-15min后，在搅拌条件下将过硫酸铵盐酸溶液滴加到苯胺溶液中，然后再加入250-300μL的无水乙醇得到混合物。将混合物在冰浴下搅拌12h以上，将最后得到的混合物离心分离并洗涤数次后，分散在8-10mL水中得到PANI溶液。
S140、制备金属-猝灭剂：
将猝灭剂溶液、金属盐溶液和还原剂混合，后加入稳定剂继续混合，固液分离得到金属-猝灭剂。可以使金属颗粒原位生长在猝灭剂上，使金属颗粒生长在聚苯胺表面，金属颗粒与聚苯胺的结合较为牢固，使最终得到的二抗复合物溶液中的各成分具有稳定的结合力。
可选地，金属为纳米金属离子，金属包括金、银和铂中的一种或多种。例如：金属为金纳米粒子；金属为银纳米粒子；金属为铂纳米粒子，金属为金纳米粒子和银纳米粒子；金属为金纳米粒子和铂纳米粒子；金属为银纳米粒子和铂纳米粒子；金属为金纳米粒子、银纳米粒子和铂纳米粒子。下面以金属为金纳米粒子为例进行说明。
还原剂包括硼氢化钠和/或盐酸羟胺。下面以还原剂为硼氢化钠为例进行说明。稳定剂包括柠檬酸钾和/或柠檬酸钠。下面以稳定剂为柠檬酸钠为例进行说明。猝灭剂为聚苯胺(PANI)为例进行说明。
详细地，将50-100μL的上述步骤S130中的PANI溶液加入到2-4mL水中，搅拌下加入20-40μL质量浓度为1-4％的HAuCl4溶液，保持搅拌6-8h。然后将50-100μL现配的浓度为10-20mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)溶液加入至上述混合溶液中，搅拌20-40min以还原AuCl4 —。继续加入20-40μL浓度为10-20mmol/L的柠檬酸钠溶液，搅拌30-60min后将混合溶液离心分离并洗涤数次得到Au-PANI，分散于2-4mL水中得到Au-PANI分散液备用。
S150、电极预处理：
电极可以是玻碳电极或铂电极，下面以电极为玻碳电极为例进行说明。将直径为4mm的玻碳电极(GCE)分别用粒径为3μm和粒径为0.05μm的氧化铝粉进行打磨，打磨后分别用水和无水乙醇超声处理三次，得到洁净的玻碳电极表面。其中，电极的表面是指电极被打磨的那个面。
S160、制备第一修饰电极：
在玻碳电极的表面修饰第一修饰层后得到第一修饰电极，其中，第一修饰层包括金属-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂。其中，封闭剂溶液包括己六醇溶液和BSA溶液中的一种或两种，下面以封闭剂溶液为己六醇溶液、金属-g-C3N4为Au-g-C3N4分散液为例进行说明。
第一修饰层中，在g-C3N4上生长金纳米粒子，使蛋白抗体能够与金纳米粒子进行键合作用，从而使蛋白抗体负载在g-C3N4上，并且通过己六醇封闭非特异性结合位点，将金纳米粒子中没有与蛋白抗体结合的部位覆盖掉，避免蛋白液被金纳米粒子吸附，使蛋白浓度的检测值更加准确。
本实施例中，可以分多次滴涂得到第一修饰电极，具体地，将Au-g-C3N4分散液、蛋白抗体溶液和己六醇依次滴涂在电极的表面孵育。
详细地，将10-20μL的Au-g-C3N4分散液滴涂在玻碳电极的表面上，在室温下晾干，再将10-20μL蛋白抗体(Ab1)溶液滴加在电极的表面，3-6℃下孵育过夜。然后将10-20μL己六醇(HT)滴加在电极的表面上孵育40-60min以封闭非特异性结合位点得到第一修饰电极。所得第一修饰电极(HT/Ab1/Au-g-C3N4/GCE)在3-6℃下保存备用。
通过分步进行各种溶液的滴涂，将金属-g-C3N4分散液、蛋白抗体溶液和封闭剂溶液依次滴涂在电极的表面上，使电极的表面修饰了第一修饰层，以便第一修饰层中含有Au-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂。
S170、制备第二修饰电极：
在第一修饰电极的表面修饰第二修饰层后得到第二修饰电极，其中，第二修饰层为蛋白液。其中，检测蛋白液的蛋白种类与蛋白抗体的蛋白种类有关。例如：蛋白液中包括铁蛋白、甲胎蛋白、癌胚蛋白和降钙素等；如果蛋白抗体为铁蛋白抗体，则铁蛋白抗体只能够将铁蛋白捕获在电极上，以便检测铁蛋白的浓度；如果蛋白抗体为甲胎蛋白抗体，则甲胎蛋白抗体只能够将甲胎蛋白捕获在电极上，以便检测甲胎蛋白的浓度；如果蛋白抗体为降钙素抗体，则降钙素抗体只能够将降钙素蛋白捕获在电极上，以便检测降钙素蛋白的浓度。使蛋白浓度的检测值更加准确。
S180、制备电化学比率传感器：
在第二修饰电极的表面修饰第三修饰层后得到电化学比率传感器，其中，第三修饰层包括异鲁米诺、蛋白抗体、金属-猝灭剂和封闭剂。其中，封闭剂溶液包括己六醇溶液和BSA溶液中的一种或两种，下面以封闭剂溶液为BSA溶液、金属-猝灭剂为Au-PANI分散液为例进行说明。
第三修饰层中，将金纳米粒子与PANI结合以后，使蛋白抗体能够与金纳米粒子进行键合作用，从而使蛋白抗体负载在PANI上，与异鲁米诺(ABEI，(N-(氨基丁基)-N-(乙基异鲁米诺)))配合，实现异鲁米诺、金纳米粒子、蛋白抗体和PANI的结合，且通过BSA溶液封闭非特异性结合位点。将蛋白液形成在第一修饰层和第三修饰层之间，与玻碳电极配合以后，形成电化学比率传感器，在进行电化学检测的时候，以g-C3N4作为阴极发光体，异鲁米诺作为阳极发光体，g-C3N4赋予电极一高的阴极信号，在将第三修饰层形成在第二修饰电极上以后，猝灭剂猝灭g-C3N4的信号，使阴极信号降低，而第三修饰层的异鲁米诺的阳极信号随着蛋白液的浓度增加而增大。通过阴极信号和阳极信号的同时改变，阴极信号下降，阳极信号的增加，从而使蛋白浓度的比率检测值更加准确。
本实施例中，可以先配置二抗复合溶液，再进行电化学比率传感器的制备。具体地，将Au-PANI分散液、蛋白抗体((Ab2)，其中：Ab1和Ab2的蛋白抗体种类一致，Ab1位于第一修饰层内，Ab2位于第三修饰层内))溶液、异鲁米诺溶液和BSA溶液混合后得到二抗复合物溶液，将二抗复合物溶液滴涂在第二修饰电极的表面后孵育1-2h，得到夹心免疫模式的电化学比率传感器。
详细地，在1-2mL的Au-PANI分散液中加入500-1000μL的蛋白抗体(Ab2)溶液，再加入500-1000μL的浓度为8-10mmol/L的ABEI溶液，将所得的混合溶液在3-6℃下搅拌过夜。然后加入100-200μL质量浓度为1-2％的BSA溶液继续搅拌1-2h。最后将混合溶液离心以收集二抗复合物溶液BSA-Ab2-ABEI-Au-PANI，分散在1-2mL水中，在3-6℃下储存备用。将10-20μL制备好的二抗复合物溶液滴涂在第二修饰电极的表面，室温下孵育1-2h，得到夹心免疫模式的电化学比率传感器。
先形成二抗复合物溶液，可以使Au-PANI、蛋白抗体(Ab2)和异鲁米诺ABEI能够很好的结合在一起，形成稳定的二抗复合物溶液，以便蛋白浓度的检测。
通过上述制备方法可以得到电化学比率传感器，得到的电化学比率传感器能够精确检测蛋白的浓度。
通过上述制备方法得到的电化学比率传感器可以用来检测蛋白的浓度。其具体方式包括如下步骤：
S210、使用Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、上述制备方法制备得到的电化学比率传感器作为工作电极，连接在电致化学发光分析仪的暗盒中，关闭暗盒，设置电致化学发光分析仪的参数。其中，电致化学发光分析仪参数为：扫描电压范围为-1.3-0.6V，光电倍增管电压设置为800V，扫描速率为300mV/S。使用含有溶解氧的过硫酸根溶液作为测试底液。可选地，使用浓度为0.1-0.2mol/L、pH值为7.4-8的PBS溶液作为底液，在底液中加入浓度为300-400nmol/L的K2S2O8溶液，得到测试底液，其中测试底液不被密封，从而使溶解氧能够进入测试底液内。
S220、获取线性曲线：
获取线性曲线的方式是：先配置不同浓度的标准蛋白液，例如：蛋白液的浓度分别为0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、40pg/mL六种标准蛋白液，分别在制备电化学比率传感器的时候，滴涂上述不同浓度的标准蛋白液得到六个电化学比率传感器。也就是说，分别将上述步骤S170中的蛋白液选择为上述六种标准蛋白液中的其中一种，得到一个电化学比率传感器，每种标准蛋白液选择一次，最后得到六个电化学比率传感器。
分别将六个电化学比率传感器置于测试底液中，使用电致化学发光分析仪进行检测，得到电化学比率传感器的六个不同的阴极信号值和阳极信号值。计算出阴极信号值和阳极信号值的比值，并计算出比值的对数值，获得6个比值的对数值，计算出浓度的对数值，获得6个对应的浓度的对数值。以浓度的对数值为横坐标，比值的对数值为纵坐标，得到线性曲线。
S230、检测蛋白液的浓度：
上述步骤S170中的蛋白液选择为待检测蛋白液，获得电化学比率传感器，将电化学比率传感器置于含有溶解氧的过硫酸根溶液中，以电化学比率传感器作为工作电极进行电化学检测，得到阴极信号值和阳极信号值。计算出阴极信号值和阳极信号值的比值，再计算出比值的对数值，将该对数值放入线性曲线中，获得待检测蛋白的浓度的对数值，从而计算出待检测蛋白的浓度。
其中，在进行电化学检测的时候，以g-C3N4作为阴极发光体，异鲁米诺作为阳极发光体，g-C3N4赋予电极一高的阴极信号，在将第三修饰层形成在第二修饰电极上以后，猝灭剂猝灭g-C3N4的信号，使阴极信号降低，而第三修饰层的异鲁米诺的阳极信号随着蛋白液的浓度增加而增大。通过阴极信号和阳极信号的同时改变，阴极信号下降，阳极信号的增加，从而使蛋白浓度的比率检测值更加准确。
且使用过硫酸根和溶解氧作为电化学比率传感器的共反应试剂，g-C3N4发光体以过硫酸根作为共反应试剂，异鲁米诺发光体以溶解氧作为共反应试剂，g-C3N4发光体和异鲁米诺发光体的发光电位能够很好分辨且不相互干扰，且两发光体不共用同一共反应试剂，避免共反应试剂的竞争，使蛋白浓度的比率检测更加精确。
实施例1
图1为二抗复合物以及电化学比率传感器的构建方法图。请参阅图1，
降钙素浓度的检测方法，包括如下步骤：
(1)、制备g-C3N4：
首先将称量好的10g三聚氰胺放置于瓷坩埚中，再将坩埚置于马弗炉中在600℃的条件下加热2h，其中，马弗炉中的升温速率为5℃/min。冷却后，所得的黄色块状固体即为块状g-C3N4，研磨成粉末备用。称取g-C3N4粉末100mg，将其分散在100mL水中，连续超声10以上，将超声后的分散液于5000rpm下离心，收集上层悬浮液并将其干燥处理。悬浮液干燥后得到的固体即为g-C3N4纳米片。
(2)、制备Au-g-C3N4：
称取2mg的g-C3N4纳米片分散在2mL水中，搅拌下加入20μL质量浓度为1％的HAuCl4溶液，保持搅拌6h。然后将50μL现配的浓度为10mmol/L硼氢化钠(NaBH4)溶液加入至上述混合溶液中，搅拌20min以还原AuCl4 —。继续加入20μL浓度为10mmol/L的柠檬酸钠溶液，搅拌30min后将混合溶液离心分离并洗涤数次，将所得到的固体Au-g-C3N4分散在2mL水中备用，得到Au-g-C3N4分散液。
(3)、合成聚苯胺(PANI)：请参阅图1(A)，二抗复合物的制备过程，
分别将0.91g过硫酸铵和184μL的苯胺单体溶解于4mL浓度为1mol/L的盐酸溶液中。两溶液均超声10min后，在搅拌条件下将过硫酸铵盐酸溶液滴加到苯胺溶液中，然后再加入250μL的无水乙醇得到混合物。将混合物在冰浴下搅拌12h以上，将最后得到的混合物离心分离并洗涤数次后，分散在8mL水中得到PANI溶液。
(4)、制备Au@PANI：请参阅图1(A)，
将50μL的PANI溶液加入到2mL水中，搅拌下加入20μL质量浓度为1％的HAuCl4溶液，保持搅拌6h。然后将50μL现配的浓度为10mmol/L的硼氢化钠(NaBH4)溶液加入至上述混合溶液中，搅拌30min以还原AuCl4 —。继续加入20μL浓度为10mmol/L的柠檬酸钠溶液，搅拌30min后将混合溶液离心分离并洗涤数次得到Au@PANI，分散于2mL水中得到Au@PANI分散液备用。
(5)、制备二抗复合物溶液：请参阅图1(A)，
在1mL的Au@PANI分散液中加入500μL的降钙素抗体(Ab2)溶液，再加入500μL的浓度为8mmol/L的异鲁米诺ABEI溶液，将所得的混合溶液在4℃下搅拌过夜。然后加入100μL质量浓度为1％的BSA溶液继续搅拌1h。最后将混合溶液离心以收集二抗复合物溶液BSA-Ab2-ABEI-Au@PANI，分散在1mL水中，在4℃下储存备用。
(6)、电极预处理：
将直径为4mm的玻碳电极(GCE)分别用粒径为3μm和粒径为0.05μm的氧化铝粉进行打磨，打磨后分别用水和无水乙醇超声处理三次，得到洁净的玻碳电极的表面。
(7)、制备电化学比率传感器：请参阅图1(B)，电化学比率传感器的构建及检测，
将10μL的Au-g-C3N4分散液滴涂在玻碳电极的表面上，在室温下晾干后得到第一电极，再将10μL降钙素抗体(Ab1)溶液滴加在第一电极的表面，4℃下孵育过夜得到第二电极。然后将10μL己六醇(HT)滴加在第二电极的表面上孵育40min以封闭非特异性结合位点。所得第一修饰电极(HT/Ab1/Au-g-C3N4/GCE)在4℃下保存备用。
分别将浓度为0.1pg/mL的标准降钙素液、浓度为0.5pg/mL的标准降钙素液、浓度为1pg/mL的标准降钙素液、5pg/mL的标准降钙素液、浓度为10pg/mL的标准降钙素液、浓度为40pg/mL的标准降钙素液、第一待测降钙素液、第二待测降钙素液和第三待测降钙素液分别滴涂在第一修饰电极的表面，室温下孵育1h得到第二修饰电极。其中，每一个电化学比率传感器滴涂一种降钙素液。
将10μL制备好的二抗复合物溶液滴涂在第二修饰电极的表面，室温下孵育1h，得到夹心免疫模式的电化学比率传感器。其中，一共获得5个标准的电化学比率传感器，3个待测的电化学比率传感器。
(8)、获取标准曲线：
使用Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、上述制备方法制备得到的标准的电化学比率传感器作为工作电极，连接在电致化学发光分析仪的暗盒中，以浓度为0.1-0.2mol/L、pH值为7.4-8的PBS溶液作为底液，在底液中加入浓度为300-400nmol/L的K2S2O8溶液作为测试底液，且测试底液中含有溶解氧。关闭暗盒，设置电致化学发光分析仪的参数，在扫描电压范围为-1.3-0.6V，光电倍增管电压设置为800V，扫描速率为300mV/S的条件下进行标准降钙素液的检测。
使用上述6个标准的电化学比率传感器检测得到六个不同的阴极信号值和阳极信号值。计算出阴极信号值和阳极信号值的比值，并计算出比值的对数值，获得6个比值的对数值，计算出浓度的对数值，获得6个对应的浓度的对数值。以浓度的对数值为横坐标，比值的对数值为纵坐标，得到关于降钙素浓度的标准曲线。
(9)、获得待检测降钙素液的浓度：
上述步骤(7)中获得的3个待检测的电化学比率传感器作为工作电极进行步骤(8)中的电化学检测，得到3个不同的阴极信号值和阳极信号值。计算出阴极信号值和阳极信号值的比值，再计算出比值的对数值，将该对数值放入标准曲线中，获得待检测降钙素液的浓度的对数值，从而计算出待检测降钙素液的浓度。
实验例1
图2为PANI和Au@PANI的特征图，使用扫描电子显微镜(SEM)对上述实施例1提供的PANI和Au@PANI的微观形貌进行了观察，PANI(A)和PANI-Au(B)的SEM图，使用X射线光电子能谱(XPS)对Au@PANI的元素进行了表征，(C)PANI-Au的XPS谱图；(D)Au，(E)C，(F)N的XPS谱图。其中，图2(A)示出了PANI的扫描电镜图，可以看出，PANI具有相互交错的纳米棒结构。图2(B)示出了Au@PANI的扫描电镜图，可以看出，在PANI表面生成了大量的Au纳米粒子。使用X射线光电子能谱(XPS)表征了Au-PANI的元素组成。图2(C)示出了Au@PANI的XPS全谱图，可以清晰地观察到Au 4f、C 1s和N 1s的特征峰。图2(D)显示的88.05eV和84.35eV，图2(E)显示的284.55eV以及图2(F)显示的399.45eV等特征峰分别对应Au 4f、C 1s和N 1s的特征峰。说明Au@PANI的成功制备。
图3为g-C3N4和Au-g-C3N4的特征图，使用透射电子显微镜(TEM)对上述实施例1提供的g-C3N4和Au-g-C3N4的微观形貌进行了观察，g-C3N4(A)和Au-g-C3N4(B)的SEM图，使用X射线光电子能谱(XPS)对Au-g-C3N4的元素进行了表征，(C)Au-g-C3N4的XPS谱图；(D)C，(E)N，(F)Au的XPS谱图。其中，图3(A)示出了g-C3N4的投射电镜图，可以看出，g-C3N4呈现出薄片状结构。图3(B)示出了Au-g-C3N4的投射电镜图，可以看出，Au纳米粒子均匀的生长在g-C3N4纳米片的表面。使用X射线光电子能谱(XPS)表征了Au-g-C3N4的元素组成。图3(C)示出了Au-g-C3N4的XPS全谱图，可以观察到C 1s、N 1s和Au 4f特征峰。其中，图3(D)显示的288.3eV，图3(E)显示的398.85eV以及图3(F)的87.35eV和83.65eV等特征峰分别对应C 1s、N 1s和Au 4f的特征峰。说明了Au-g-C3N4的成功制备。
图4为电化学比率传感器的表征图，修饰电极的循环伏安(CV)结果示于图4(A)中，a、裸电极，b、裸电极/Au-g-C3N4,c、裸电极/Au-g-C3N4/Ab1,d、裸电极/g-C3N4/Ab1/HT，e、裸电极/g-C3N4/Ab1/HT/CT。CV表征在含有5.0mmol/L[Fe(CN)6]4–/3–的PBS溶液(pH7.4)中进行，与裸电极(玻碳电极)相比(曲线a)，修饰Au-g-C3N4的电极，其峰电流减小(曲线b)。由于蛋白质分子和己六醇(HT)分子对电子传递的阻碍作用，当电极依次孵育了Ab1、HT和降钙素(CT)后，CV曲线的氧化还原峰电流依次减小(曲线c、d、e)。
修饰电极的交流阻抗(EIS)结果示于图4(B)中，a、裸电极，b、裸电极/Au-g-C3N4,c、裸电极/Au-g-C3N4/Ab1,d、裸电极/g-C3N4/Ab1/HT，e、裸电极/g-C3N4/Ab1/HT/CT。EIS检测在含有5.0mmol/L[Fe(CN)6]4–/3–的PBS溶液(pH7.4)中进行，裸电极(玻碳电极)的半圆直径较小(曲线a)，对应相对低的交流阻抗值。Au-g-C3N4修饰电极与裸电极相比，阻抗图谱中的半圆直径增大(曲线b)，是因为修饰层Au-g-C3N4阻碍电子传递的缘故。当电极依次孵育了抗体，HT和CT之后，EIS图谱的半圆直径依次增加(曲c，d，e)，表明阻抗值依次增加，这是由于抗体，HT和CT对电子传递的阻碍作用引起。CV和EIS表征了电极的成功修饰。
如图4(C)所示，a、未孵育BSA-Ab2-ABEI-Au@PANI和b、孵育BSA-Ab2-ABEI-Au@PANI后的ECL响应，在未孵育二抗复合物之前(曲线a)，阳极几乎没有ECL信号，而g-C3N4在S2O8 2-存在下，在阴极-1.3V产生强烈的ECL信号。Au-g-C3N4在S2O8 2-存在情况下，发光机理为：
g-C3N4+e-→g-C3N4 - (1)
S2O8 2-+e-→SO4 2-+SO4 ·- (2)
g-C3N4 ·-+SO4 ·-→g-C3N4*+SO4 2- (3)
和/或
g-C3N4+SO4 ·-→g-C3N4 ++SO4 2- (4)
g-C3N4 ++g-C3N4 ·-→g-C3N4*+g-C3N4 (5)
最后，
g-C3N4*→g-C3N4+hν (6)
当二抗复合物孵育在电极上后(曲线b)，ABEI在+0.6V产生了ECL信号，而Au-g-C3N4在-1.3V的信号降低。ABEI在溶解氧存在下的发光机理为：
ABEI－e-→ABEI·+ (1)
O2+e-→O2 ·- (2)
ABEI·++O2 ·-→ABEI* (3)
ABEI*→ABEI+hv (4)
在负载了二抗复合物以后，g-C3N4阴极发光体的阴极信号降低，g-C3N4与阳极发光体PANI之间发生了能量转移。为了验证g-C3N4与PANI之间的能量转移机理，对g-C3N4的ECL光谱和PANI的UV-vis吸收光谱进行了扫描。如图4(D)所示，a、PANI的UV-vis吸收光谱和b、g-C3N4的ECL光谱，PANI在300至500nm左右有一个较宽的吸收带(曲线a)，g-C3N4的ECL光谱的最大辐射波长在460nm左右。g-C3N4的ECL光谱和PANI的UV-vis吸收光谱之间有较大程度重叠，说明他们之间的能量转移是有可能发生的，PANI对g-C3N4的猝灭是由能量转移所致，可以通过PANI降低g-C3N4的信号，避免阴极信号和阳极信号相互干扰，以便得到准确的降钙素的检测值。
图5为降钙素液的浓度的检测图。如图5(A)所示，传感器对不同浓度CT的ECL响应，a-f分别为0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、40pg/mL，当在制备的传感器上孵育不同浓度的目标物CT后，随着浓度的增大，阳极的ABEI信号逐渐增强，同时，阴极的Au-g-C3N4信号逐渐降低。如图5(B)所示，标准曲线，阴极信号与阳极信号比值的对数值与目标物CT的浓度的对数值表现出了较好的线性关系，线性回归方程为lg(IAu-g-C3N4/IABEI)＝-0.43lgc-5.23，相关系数R＝0.993，c为目标物CT的浓度，检测限为0.033pg/mL，与现有的其他检测方法相比得到表1。
表1不同方法检测降钙素的性能比较
方法 线性范围(ng/mL) 检测限(mol/L) 参考文献
放射性免疫分析 0.02-3.0 —— 对比例1
电化学 10-8.0×10<sup>6</sup> 3.5 对比例2
电化学 1.0×10<sup>-3</sup>～1.0 0.7×10<sup>-3</sup> 对比例3
电化学比率传感器 1.0×10<sup>-4</sup>～4.0×10<sup>-2</sup> 0.33×10<sup>-4</sup> 本申请
其中，对比例1为文献Radioimmunoassay of Calcitonin in Normal HumanUrine.Analytical Chemistry，Snider,R.h.；Moore,C.F；Silva,O.L.；Becker,K.L..1978,50,449-454中记载的内容；对比例2为文献Detection of calcitonin in medullarythyroid carcinoma by an electrochemical sensor，Sha,D.S.；Zhuge,b.z.；Lin,F..Int.J.Electrochem.Sci.2017,12,10129-10139中记载的内容；对比例3为文献Alabel-free electrochemical immunosensor based on gold nanoparticles andgraphene oxide for the detection of tumor marker calcitonin，Alarfaj,N.A.；El-Tohamy,M.F..New J.Chem.2017,41,11029-11035中记载的内容。
从表1可以看出，本申请提供的电化学比率传感器具有更低的检测限，降钙素液的浓度的检测值更加准确。
图6为电化学比率传感器的稳定性和选择性检测图。其中，图6(A)表示传感器的稳定性，图6(B)表示传感器的选择性。如图6(A)所示，孵育1pg/mL CT的传感器连续循环扫描5个周期以测试传感器的稳定性。ECL强度变化较小，表明其稳定性较好。为了评估所制备的ECL传感器的选择性，选择了铁蛋白(Fer)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)进行测试。如图6(B)所示，与空白实验相比，上述干扰物没有引起明显的信号变化。然而，在CT存在的情况下，ECL强度比的对数值显著降低。因为CT抗体对CT具有特异性，其他蛋白无法被捕获在电极上，无法产生相应的信号变化。上述结果表明，所得到的比率ECL传感器对CT具有高选择性。
上述实施例1提供的三种待检测降钙素液的检测结果如表2。其中，三种待检测降钙素液为重庆市第九人民医院取得实际血清样品3份，分别用所构建的传感器测试其降钙素的含量，并与医院提供的检测值进行比较，并计算其相对误差(Er)。
表2待检测降钙素液的检测值
样品 医院测定值(pg/mL) 检出值(pg/mL)<sup>a</sup> Er(％)
第一待检测降钙素液 3.25 3.35±0.176 +3.1
第二待检测降钙素液 1.62 1.55±0.125 -4.3
第三待检测降钙素液 0.67 0.743±0.069 +10.1
从表2可以看出，本申请提供的降钙素浓度的检测方法得到的降钙素浓度值与医院中提供的检测值相比，其误差较小，具有广泛的应用前景。
综上，本申请提供的电化学比率传感器检测降钙素浓度的主要优点为：
(1)、以无毒害的g-C3N4作为阴极发光体，ABEI作为阳极发光体，S2O8 2-和溶解O2分别作为其共反应试剂构建ECL比率型传感器，不但避免了使用传统的含有重金属的量子点作为阴极发光体所带来的毒性问题，还打破了常见的ECL比率策略中两发光体分享同一共反应试剂的局限，有效避免了因两种发光体使用一种共反应试剂时的竞争消耗而导致的检测结果的不准确性。
(2)聚苯胺(PANI)作为g-C3N4的ECL信号的高效猝灭剂，可以使g-C3N4的阴极信号下降，以便获得比率检测值。
(3)本申请提供的电化学比率传感器具有快速、灵敏、成本较低等优点，使用阴极信号和阳极信号-双信号对降钙素浓度进行检测，能有效克服现有的单信号基础的降钙素检测方法易受环境和仪器因素干扰的缺陷(如果在检测的过程中，是阴极信号减小，阳极信号增加，则是蛋白液的浓度不同引起的；如果不是阴极信号减小，阳极信号增加，则是外界环境因素的干扰)，显著提高检测结果的准确性和可靠性。
以上所述仅为本申请的具体实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
在电极的表面修饰第一修饰层后得到第一修饰电极，其中，所述第一修饰层包括金属-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂；
在所述第一修饰电极的表面修饰第二修饰层后得到第二修饰电极，其中，所述第二修饰层为蛋白液；
在所述第二修饰电极的表面修饰第三修饰层后得到所述电化学比率传感器，其中，所述第三修饰层包括异鲁米诺、蛋白抗体、金属-猝灭剂和封闭剂。
2.根据权利要求1所述的检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，其特征在于，所述金属-g-C3N4的制备方法，包括：
将g-C3N4分散液、金属盐溶液和还原剂混合，后加入稳定剂继续混合，固液分离得到金属-g-C3N4。
3.根据权利要求2所述的检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，其特征在于，所述在电极的表面修饰第一修饰层后得到第一修饰电极的步骤，包括：将所述金属-g-C3N4分散液、所述蛋白抗体溶液和所述封闭剂溶液依次滴涂在所述第一电极的表面孵育得到所述第一修饰电极。
4.根据权利要求1所述的检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，其特征在于，所述金属-猝灭剂的制备方法，包括：
将猝灭剂溶液、金属盐溶液和还原剂混合，后加入稳定剂继续混合，固液分离得到金属-猝灭剂。
5.根据权利要求4所述的检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，其特征在于，所述还原剂包括硼氢化钠和/或盐酸羟胺。
6.根据权利要求4所述的检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，其特征在于，所述在所述第二修饰电极的表面修饰第三修饰层后得到所述电化学比率传感器的步骤，包括：
将所述金属-猝灭剂分散液、蛋白抗体溶液、异鲁米诺溶液和封闭剂溶液混合后得到二抗复合物溶液，将所述二抗复合物溶液滴涂在所述第二修饰电极的表面孵育得到所述电化学比率传感器。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，其特征在于，所述封闭剂溶液包括己六醇溶液和BSA溶液中的一种或两种。
8.根据权利要求1-6中的任一项所述的检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法，其特征在于，所述猝灭剂为聚苯胺。
9.一种检测蛋白的电化学比率传感器，其特征在于，包括：
电极，
第一修饰层，所述第一修饰层修饰在所述电极的表面，其中，所述第一修饰层包括金属-g-C3N4、蛋白抗体和封闭剂；
第二修饰层，所述第二修饰层修饰在所述第一修饰层的表面，其中，所述第二修饰层为蛋白液；
第三修饰层，所述第三修饰层修饰在所述第二修饰层的表面，其中，所述第三修饰层包括异鲁米诺、蛋白抗体、金属-猝灭剂和封闭剂。
10.一种蛋白浓度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1-8任一项所述的检测蛋白的电化学比率传感器的构建方法构建得到的电化学比率传感器置于含有溶解氧的过硫酸根溶液中，以所述电化学比率传感器作为工作电极进行电化学检测，得到阴极信号值和阳极信号值，其中，所述蛋白液为待检测蛋白液；
通过所述阴极信号值和所述阳极信号值计算所述待检测蛋白液的浓度。
CN201910582347.4A 2019-06-28 2019-06-28 检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法 Active CN110196272B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910582347.4A CN110196272B (zh) 2019-06-28 2019-06-28 检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910582347.4A CN110196272B (zh) 2019-06-28 2019-06-28 检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110196272A true CN110196272A (zh) 2019-09-03
CN110196272B CN110196272B (zh) 2020-07-10

Family

ID=67755497

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910582347.4A Active CN110196272B (zh) 2019-06-28 2019-06-28 检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110196272B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110967491A (zh) * 2019-12-16 2020-04-07 西南大学 一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒
CN115015352A (zh) * 2022-06-01 2022-09-06 青岛科技大学 一种检测β-淀粉样蛋白的抗污染生物传感器及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109100400A (zh) * 2018-07-17 2018-12-28 西南大学 用于检测刀豆蛋白a的传感器及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109100400A (zh) * 2018-07-17 2018-12-28 西南大学 用于检测刀豆蛋白a的传感器及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YIN HUANG ET.AL: "Ratiometric electrochemiluminescent strategy regulated by electrocatalysis of palladium nanocluster for immunosensing", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
YIN-ZHU WANG ET.AL: "A ratiometric electrochemiluminescence detection for cancer cells using g-C<sub>3</sub>N<sub>4</sub> nanosheets and Ag-PAMAM-luminol nanocomposites", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
张涵: "基于新型发光体系构建的电致化学发光传感器检测刀豆蛋白A和胰岛素", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110967491A (zh) * 2019-12-16 2020-04-07 西南大学 一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒
CN115015352A (zh) * 2022-06-01 2022-09-06 青岛科技大学 一种检测β-淀粉样蛋白的抗污染生物传感器及其制备方法
CN115015352B (zh) * 2022-06-01 2023-10-10 青岛科技大学 一种检测β-淀粉样蛋白的抗污染生物传感器及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110196272B (zh) 2020-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110220888A (zh) 一种三联吡啶钌功能化mof检测降钙素原的电化学发光免疫传感器的制备方法
Zhang et al. An ultrasensitive multi-walled carbon nanotube–platinum–luminol nanocomposite-based electrochemiluminescence immunosensor
Huang et al. Highly sensitive luminol electrochemiluminescence immunosensor based on platinum-gold alloy hybrid functionalized zinc oxide nanocomposites for catalytic amplification
Xiang et al. A redox cycling-amplified electrochemical immunosensor for α-fetoprotein sensitive detection via polydopamine nanolabels
Xiong et al. A novel solid-state Ru (bpy) 32+ electrochemiluminescence immunosensor based on poly (ethylenimine) and polyamidoamine dendrimers as co-reactants
Han et al. Gold nanoparticles enhanced electrochemiluminescence of graphite-like carbon nitride for the detection of Nuclear Matrix Protein 22
Zheng et al. Electrochemiluminescence and photoelectrochemistry dual-signal immunosensor based on Ru (bpy) 32+-functionalized MOF for prostate-specific antigen sensitive detection
CN110196272A (zh) 检测蛋白的电化学比率传感器、其构建方法及蛋白浓度的检测方法
Hu et al. Dual-quenching electrochemiluminescence resonance energy transfer system from CoPd nanoparticles enhanced porous g-C3N4 to FeMOFs-sCuO for neuron-specific enolase immunosensing
Ge et al. Ultra-sensitive magnetic immunoassay of HE4 based on surface enhanced Raman spectroscopy
Zhong et al. Dual-wavelength responsive photoelectrochemical aptasensor based on ionic liquid functionalized Zn-MOFs and noble metal nanoparticles for the simultaneous detection of multiple tumor markers
Su et al. An electrochemiluminescence aptasensor for diethylstilbestrol assay based on resonance energy transfer between Ag 3 PO 4-Cu-MOF (ii) and silver nanoparticles
Li et al. Anodic near-infrared electrochemiluminescence from Cu-doped CdTe quantum dots for tetracycline detection
CN109100400B (zh) 用于检测刀豆蛋白a的传感器及其制备方法和应用
Olorundare et al. An electrochemical immunosensor for an alpha-fetoprotein cancer biomarker on a carbon black/palladium hybrid nanoparticles platform
Xiao et al. Electrochemiluminescence immunosensor using poly (l-histidine)-protected glucose dehydrogenase on Pt/Au bimetallic nanoparticles to generate an in situ co-reactant
Fan et al. Polyacrylic acid/polyethylene glycol hybrid antifouling interface for photoelectrochemical immunosensing of NSE based on ZnO/CdSe
CN113219016A (zh) 一种基于尿嘧啶改性类石墨相氮化碳的电化学免疫传感器的制备方法
Hua et al. Ultrasensitive electrochemiluminescent immunosensor using MoS2/g-C3N4 nanosheets
CN110702754B (zh) 一种测定人绒毛膜***的方法
CN110967491A (zh) 一种电化学免疫传感器和制备方法以及电化学免疫分析方法和试剂盒
Wang et al. A dual-emitting immunosensor based on manganese dioxide nanoflowers and zinc sulfide quantum dots with enhanced electrochemiluminescence performance for the ultrasensitive detection of procalcitonin
CN113281389A (zh) 一种基于2,4,6-三氨基嘧啶调控的类石墨相氮化碳的电化学免疫传感器的制备方法
CN115290630A (zh) 一种基于聚多巴胺修饰氧化钴猝灭磷掺杂石墨氮化碳电化学发光的免疫传感器的制备方法
Lai et al. Mesoporous nanogold–MnO 2–poly (o-phenylenediamine) hollow microspheres as nanotags and peroxidase mimics for sensing biomolecules

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant