CN110195080A - 稳定表达cd163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，属于生物技术领域。该重组质粒是以慢病毒表达载体pLV‑sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD163编码基因。本发明提供的这种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，采用特殊的慢病毒***将CD163基因整合到永生化的PAM细胞染色体上，使得永生化的PAM细胞系能够永久性地稳定表达CD163蛋白，而使细胞易受PRRSV感染。PRRSV在该细胞系(mPAM‑CD163)上的毒价可以高达106.9TCID50/0.1mL，且能够稳定传代。

Description

稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨 噬细胞系及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)在上世纪90年代初出现在欧洲和美国，此后成为全球养猪业的一个严重问题。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种持续的、严重的疾病，其特征是不同年龄段的猪呼吸道问题、生长性能差以及怀孕母猪生殖障碍。由于该病持续的亚临床感染及病毒的高度变异性和抗体反应不能完全免于病毒再感染和再出现，控制该疾病的措施变得复杂。目前，PRRSV几乎在全球每一个养猪国家都存在，并且呈现出一种严峻的流行态势，成为危害全球养猪业最为严重的疾病之一。
PRRSV的增殖具有非常严格的宿主嗜性。原代猪肺泡巨噬细胞(pPAM)和血液单核细胞是对PRRSV感染敏感的猪源细胞。PRRSV主要通过呼吸道和生殖道粘膜侵入动物机体，通过作用于pPAM在动物肺部引起强烈的炎症反应，继而在猪体出现典型的呼吸道症状。随着PRRSV的大量复制，在病毒感染后期，PAM细胞出现大量破裂溶解，PRRSV随着血液和淋巴液循环到达体内各组织器官。PRRSV可以导致宿主机体的持续性免疫抑制。另外，该病毒极易发生变异，容易出现免疫逃避、病毒持续感染的现象，并且容易诱导广范围的继发感染，使其他的病原微生物侵入机体。
然而，由于pPAM细胞不仅难以获得，而且不能方便地保存或长期使用。同时，在一些PRRSV流行国家(例如中国)，很难获得源自PRRS抗原和抗体双阴性猪的pPAM。虽然已经有报道了永生化的PAM细胞系(mPAM)，但由于该细胞系不能表达PRRSV感染所需的受体蛋白CD163，使得该细胞系不能被PRRSV感染。因此，这就严重制约了感染PAM与宿主免疫细胞之间作用机制等方面的研究，进而难以有效控制PRRSV。另一方面，当前PRRSV疫苗工业化生产中采用的细胞是MARC-145细胞，高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在该细胞上的毒价较低，一般是104-106TCID50/0.1mL，导致疫苗的生产效率还有较大的提升空间。
鉴于此，本申请提供一种能够稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，为研究PRRSV感染PAM与宿主免疫细胞之间的相互作用等提供有力工具，也为显著提升PRRSV疫苗的工业化生产效率提供了一种更加高效、实用的细胞。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种用于CD163受体表达的重组质粒及其构建方法，具体如下：
一种用于CD163受体表达的重组质粒，重组质粒是以慢病毒表达载体pLV-sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD-163编码基因。
一种上述重组质粒的构建方法，其包括：
对CD163基因进行PCR扩增，并将CD163基因克隆至pEASY-T1载体中，得到载体pEASY-T1-CD163；
从载体pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，用限制性内切酶Xba I和Xho I分别对pEASY-T1-CD163和pLV-sf GFP(2A)Puro进行双酶切；
用DNA连接酶将酶切得到的CD163基因产物和pLV-sf GFP(2A)Puro产物进行连接，得到重组质粒pLV-EGFP-CD163。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述对CD163基因进行PCR扩增的引物对为：
CD163-F：GCTCTAGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC；
CD163-R：CCCTCGAGTCATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTG。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述对CD163基因进行PCR扩增的条件为：92-96℃下预变性6-8min；93-95℃下变形25-35s,50-60℃下退火40-50s,67-77℃下延伸50-70s,共30-40个循环；再于67-77℃下延伸8-12min。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述CD163基因来源于原代猪肺泡巨噬细胞。
第二方面，本发明提供一种用于CD163受体表达的重组慢病毒，具体如下：
一种用于CD163受体表达的重组慢病毒，其通过将上述重组质粒转染哺乳细胞所得。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述哺乳细胞为Lenti-X293T细胞系。
第三方面，本发明提供一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，具体如下：
一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系，其通过将上述重组慢病毒转导至永生化的猪肺泡巨噬细胞系中并进行筛选得到。
一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，其包括：
培养永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21至细胞密度达到70-80％；再与权利要求6或7的重组慢病毒混合，于35-39℃、4-7％CO2下培育6-8h；采用含有嘌呤霉素的培养基培养1-2周，每3-4d更换新的含有嘌呤霉素的培养基，直至出现单克隆细胞；挑选单克隆细胞，采用有限稀释法进行筛选。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述嘌呤霉素的浓度为最佳筛选浓度，其通过下述方法获得：
培养永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21至细胞密度达到70-80％，换成含有不同浓度的嘌呤霉素的培养基，在3-5d内能杀死所有细胞的最小嘌呤霉素的浓度为最佳筛选浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：
本发明提供的这种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，采用特殊的慢病毒***将CD163基因整合到永生化的PAM细胞染色体上，使得永生化的PAM细胞系能够永久性地稳定表达CD163蛋白，而易受PRRSV感染，为研究PRRSV感染PAM与宿主免疫细胞之间的相互作用及其他相关研究提供有力工具，也可为显著提升PRRSV疫苗的工业化生产效率提供一种更加高效实用的细胞。
本申请中采用的慢病毒表达载体为pLV-sfGFP[2A]Puro，该载体是基于HIV1的慢病毒基因过表达载体，采用CMV启动子启动目的基因的表达。通过将sfGFP基因放在不同的启动子，该载体保留了荧光标签在病毒包装检测中的便利性，也避免了融合标签蛋白对目的基因功能产生影响，因此通过荧光显微镜即可直观化的对后续重组阳性猪肺泡巨噬细胞系进行筛选，减少误差和筛选周期。此外，pLV-sfGFP[2A]Puro载体包含了生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件，该载体结构紧凑，能够产生高滴度病毒，且对导入的CD163基因片段的融合度高。
基于以上操作，发明人用高致病性HP-PRRSV毒株JXA1感染所获得的重组猪肺泡巨噬细胞系(命名为：mPAM-CD163)，能产生高滴度的子代病毒，其病毒核酸拷贝数高于109copies/mL、对该细胞的半数感染量(TCID50)则高达106.9/0.1mL；该细胞系能够稳定传代至少100代以上。同时，该mPAM-CD163细胞系与pPAM细胞相比显示了极其相似的病毒复制和细胞因子分泌规律。
因此，本发明提供的这种能够稳定表达CD163的PAM细胞系可替代原代PAM细胞用于体外实验，研究细胞因子分泌机制和PRRSV感染的PAM细胞与免疫细胞之间的相互作用以及相关的细胞因子分泌等机制；尤其也为显著提升PRRSV疫苗的工业化生产效率提供了一种更加高效、实用的细胞。同时，这种能够稳定表达CD163的PAM细胞系也有望应用于其它的猪源性病毒疫苗的研制中，例如非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为pLV-EGFP-CD163重组质粒鉴定图(1：重组质粒pLV-EGFP-CD163PCR扩增产物；M：DNA marker)。
图2为筛选出的4株单克隆细胞。
图3为单克隆细胞株PCR鉴定(1：阳性对照；2-5：四株单克隆细胞株；6：阴性对照；M：DNA marker)。
图4为单克隆细胞培养形态图。
图5为Westernblot鉴定mPAM-CD163细胞中CD163的表达(1,2：阴性对照；3,4：mPAM-CD163；M：蛋白Marker)。
图6为共聚焦显微镜扫描CD163蛋白图。
图7为抗体阻断试验结果。(●)表示表达CD163的PAM细胞加入抗CD163抗体后PRRSV拷贝数的趋势；(■)表示表达CD163的PAM细胞加入阴性兔血清后PRRSV拷贝数的趋势。
图8为mPAM-CD163细胞病变图。
图9为不同代次mPAM-CD163细胞稳定性检测。
图10为PRRSV在不同代次的mPAM-CD163细胞上的半数感染量TCID50曲线。
图11为pPAM和mPAM-CD163细胞在HP-PRRSVJXA1株与经典株SD1感染下细胞因子IL-4的分泌水平(A:细胞中IL-4mRNA水平；B:上清中IL-4水平)。
图12为pPAM和mPAM-CD163细胞在HP-PRRSV JXA1株与经典株SD1感染下细胞因子IL-10的分泌水平(C:细胞中IL-10mRNA水平；D:上清中IL-10水平)。
图13为pPAM和mPAM-CD163细胞在HP-PRRSV JXA1株与经典株SD1感染下细胞因子IFN-α的分泌水平(E:细胞中IFN-αmRNA水平；F:上清中IFN-α水平)。
图14为pPAM和mPAM-CD163细胞在HP-PRRSVJXA1株与经典株SD1感染下细胞因子IFN-γ的分泌水平(G:细胞中IFN-γmRNA水平；H:上清中IFN-γ水平)。
图15为pPAM和mPAM-CD163细胞在HP-PRRSV JXA1株与经典株SD1感染下TLR的分泌水平(I:细胞中TLR-3mRNA水平；J:细胞中TLR-7水平)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供一种用于CD163受体表达的重组质粒(命名为pLV-EGFP-CD163)，其构建方法如下：
1.CD163基因的克隆和测序：
从4-6周龄的PRRSV阴性仔猪肺中获取pPAM细胞，按照猪CD163的基因序列设计引物(引物序列如表1所示)，利用PCR方法扩增猪CD163基因(PCR扩增的反应体系和反应条件如表2和表3所示)。
表1用于扩增CD163基因的引物
表2 PCR反应体系
表3 PCR反应条件
2.构建克隆质粒pEASY-T1-CD163：
将猪CD163基因与克隆载体pEASY-T1进行连接(连接体系如表4所示)，并对所得克隆质粒进行测序，测序结果与GenBank中公布的猪CD163序列进行比对、分析。
表4 pEASY-T1载体连接体系
3.构建重组质粒pLV-EGFP-CD163：
从载体pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至慢病毒基因过表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro(购买至Inovogen公司)中，用限制性内切酶Xba I和Xho I分别双酶切pEASY-T1-CD163和pLV-sf GFP(2A)Puro，所有操作均在冰盒上进行，具体反应体系如下：
表5双酶切反应体系
将加完试剂后的离心管轻轻混匀，低速离心之后置于37℃水浴锅中反应4h。反应完成后将酶切产物用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳观察结果。切取目的条带CD163区域和pLV-sf GFP(2A)Puro载体区域进行胶回收，测定浓度后使用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接，连接体系如下：
表6 pLV-sfGFP(2A)Puro表达载体连接体系
加完试剂后轻柔混匀，然后低速瞬时离心，连接条件为：50℃15min连接。
4.重组质粒pLV-EGFP-CD163的鉴定：
将上述连接产物取2.5μL热转化至E.coli Competent Cell JM109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取单菌落摇菌培养，提取质粒。质粒用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果显示重组质粒条带大小与预期结果一致(如图1所示)。将初步鉴定为阳性的重组质粒送青岛擎科有限公司测序。基因测序验证正确，表明猪CD163基因已正确连接到慢病毒载体，将该重组质粒命名为pLV-EGFP-CD163。
实施例2
本实施例提供一种稳定表达CD163受体表达的重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系，其构建方法如下：
1.重组慢病毒的制备：
将Lenti-X 293T细胞在含有10％FBS的DMEM中于37℃和5％CO2下培养。在转染前24h，用胰蛋白酶消化对数期293T细胞，接种于100mm组织培养皿(培养基体积8mL)中，轻轻摇动，并在37℃5％CO2下温育。当细胞密度达到80％-90％时进行转染实验。
用无菌水稀释慢病毒载体质粒(pLV-EGFP-CD163)DNA并通过涡旋混合均匀。将所得DNA溶液加入到Lenti-X包装单次注射(VSV-G)管中。盖紧盖子，将所得溶液涡旋20s。在室温下温育10min后，将DNA溶液慢慢滴加到293T细胞溶液中，轻揉混匀。于37℃5％CO2培养箱中培养。4h后，添加新鲜培养基，继续在37℃5％CO2培养箱中培养24-48h。最后，收集病毒上清液。
2.最佳嘌呤霉素浓度的筛选
将永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21细胞接种在6孔细胞培养板中，待细胞贴壁达到70％-80％左右，换成含有嘌呤霉素的培养基(0.25-10μg/mL浓度范围内)，在3-5d内能杀死所有细胞的最小嘌呤霉素的浓度为最佳筛选浓度。
发明人经筛选后得到的最佳嘌呤霉素浓度为0.75μg/mL。
3.稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系(命名为mPAM-CD163)的构建
使用胰蛋白酶消化处于对数生长期的3D4/21细胞，按照6×105cells/well接种于6孔细胞培养板中，在37℃5％CO2培养箱中培养，直至细胞密度达到70％-80％后进行感染实验。约24h后，向6孔板中加入所得的重组慢病毒，并加入适量的聚凝胺。通过温和摇动混合溶液，置于37℃5％CO2培养箱中培养。
感染6-8h后，吸掉培养基，加入完全培养基，于37℃5％CO2培养箱中培养。24h后吸掉培养基，使用胰蛋白酶消化6孔板中感染病毒的细胞，然后添加含有0.75μg/mL嘌呤霉素的培养基。每3-4d更换新的含有嘌呤霉素的培养基，在培养箱中培养1-2周后得到含有目的基因的细胞群细胞。
将细胞群细胞稀释后接种到多个96孔板，加入含有0.75μg/mL的嘌呤霉素培养基培养。每日观察细胞生长状况，每3-4d更换新的含有嘌呤霉素的培养基，直至细胞单克隆出现。
单克隆细胞出现后，进行单克隆细胞的挑选及扩大培养。待单克隆细胞生长至合适的密度，收集细胞，进行基因组DNA提取。以DNA为模板，设计VP1和P1引物进行PCR扩增。阳性质粒作为阳性对照模板，对得到的单克隆进行鉴定。引物序列具体如下：
表7鉴定单克隆细胞的PCR引物
PCR反应体系如下：
表8 PCR反应体系
PCR反应条件设置：
表9 PCR反应条件
使用核酸电泳技术对PCR产物进行测定。
在本实施例中，发明人筛选出4株单克隆细胞株(图2)。对筛选得到的4株细胞株进行PCR初步鉴定，如图3所示。从4株单克隆细胞株中随机挑选一株进行培养，细胞形态如图4所示。
实验例
下面对本发明实施例2提供的稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系mPAM-CD163进行鉴定和性能评估：
一.蛋白质印迹分析：
用补充有蛋白酶抑制剂的RIPA(Beyotime)裂解酶裂解用PBS洗涤的单层细胞以制备全细胞裂解物。煮沸5分钟后，将样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白质条带转移到硝酸纤维素滤膜上。在室温下用5％脱脂乳封闭1小时后，将膜在4℃下与第一抗体兔抗CD163多克隆抗体(1：1000稀释)一起温育过夜。然后，将膜与山羊抗兔二抗(Earthox)(1：5000稀释)在室温下孵育1小时。最后，添加颜色溶液以避免光照。
检测结果如图5所示，由此表明，CD163蛋白得到了正确的表达，分子量约为130kDa。
二.激光共聚焦检测：
将mPAM-CD163接种到含有细胞爬片的24孔板并保持在含有10％FBS的37℃，5％CO2的培养箱中。当细胞密度达到80-90％时，弃掉培养基，加入300μL提前预冷的PBS洗涤细胞3次。然后用提前预冷的4％多聚甲醛(Sigma)固定7-8min并用PBS洗涤。加入抗CD163多克隆抗体(1：200稀释)，37℃孵育2h，用PBS轻轻洗3次，每次10min(在摇床上)。加入羊抗兔IgG抗体(Alexa Fluor 594,1:200稀释)(Abways Biotechnology)，避光孵育2h，用PBS轻轻洗3次，每次10min(在摇床上)。加入DAPI(Sigma)(1：5000)染核7-8min并用PBS轻轻洗3次，每次10min(在摇床上)。最后将爬片取出置于含有PBS的载玻片上，用指甲油进行封边，然后使用共聚焦激光扫描显微镜分析样品。
分析结果如图6所示，由此表明，实施例2克隆的稳定表达CD163的细胞系共聚焦激光扫描显微镜显示，CD163蛋白主要定位在胞膜。
三.抗体阻断试验：
将永生化的mPAM-CD163(稳定表达猪CD163的细胞)与500μL兔抗CD163多克隆抗体(Bioss)稀释液一起温育。作为对照，在一式两份孔中使用等量的阴性兔血清。在37℃温育1小时后，用HP-PRRSV病毒感染单层细胞。吸附1小时后除去接种物，用PBS(BI)洗涤细胞。在37℃下将溶液维持24小时后提取细胞RNA，用于随后的定量PCR，以确定在用不同浓度的抗CD163抗体温育后细胞产生的病毒颗粒拷贝数。
结果分析如图7所示，表明抗CD163抗体能够剂量依赖性地阻断PRRSV病毒感染。阳性对照细胞产生的病毒颗粒数为2.60×106，而加入2μg抗CD163抗体细胞产生的病毒颗粒数为1.30×106。通过添加4μg抗CD163抗体细胞产生的病毒颗粒数为2.78×105，这表明病毒颗粒呈指数下降。随后，当6,8和10μg抗CD163抗体时，细胞产生的病毒颗粒的数量趋于稳定。对照兔IgG不会减少细胞的感染。
五.mPAM-CD163细胞的稳定性测试：
为了确定mPAM-CD163细胞系的稳定性，发明人使用HP-PRRSV JXA1毒株或SD1毒株孵育细胞系的第5代，第10代，第20代，第50代，第80代和第100代，以比较不同代次产生的病毒颗粒的数量。
结果如图9所示，用不同毒力的毒株监测了几十至百代细胞系的病毒载量基本相同，由此说明，该mPAM-CD163细胞系具有很好的稳定性，至少可稳定传代100代，并且在整个实验过程中可以产生大于109copies/mL的子代病毒。
六.PRRSV在mPAM-CD163细胞上的半数感染量测定：
为了确定PRRSV在mPAM-CD163细胞系上的半数感染量，发明人用PRRSV病毒液(10-1-10-10的十倍梯度稀释浓度)感染mPAM-CD163细胞，同时设置正常细胞作为对照组，逐日观察并记录结果(如表7所示)，连续观察6天，按照Reed-Muench两氏法计算PRRSV对该细胞的半数感染量。
表7细胞病变统计结果
结果计算：
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)
lgTCID50＝距离比例×稀释对数之间的差+高于50％病变率后稀释度的对数
按上述公式计算TCID50的值为106.9，即PRRSV感染mPAM-CD163对应的半数感染量可以达到106.9TCID50/0.1mL。针对选取的6个细胞代次，上述试验均进行三次独立重复，结果如图10所示，TCID50平均值为106.8/0.1mL。
HP-PRRSV在MARC-145细胞上可以获得104-106/0.1mL范围的TCID50滴度。HP-PRRSV毒株在mPAM-CD163不同细胞代次之间的TCID50无显著性差异(p>0.05)，且不同代次mPAM-CD163细胞的TCID50平均数均显著高于MARC-145对应的TCID50(p<0.05)。由此说明，该mPAM-CD163细胞系较MARC-145细胞对PRRSV更加易感，同等条件下mPAM-CD163细胞系能够比MARC-145细胞产生更多量的PRRSV病毒粒子。当前PRRSV疫苗生产一般采用MARC-145细胞，本发明为PRRSV的科研试验，尤其是提升PRRSV疫苗的工业化生产效率提供了更好的细胞。
七.不同毒力PRRSV感染pPAM与mPAM-CD163后细胞因子与TLR表达水平的比较：
研究表明，PRRSV感染可诱导猪的IL-10表达。因此，发明人使用mPAM-CD163细胞来研究IL-10以及IL-4，IFN-α，IFN-γ，TLR-3和TLR-7的表达，并将这些数据与pPAM细胞中的表达进行比较。分别通过用荧光定量PCR和ELISA检测细胞和细胞上清液中的mRNA和蛋白水平的细胞因子。
pPAM和mPAM-CD163细胞在HP-PRRSV JXA1株与经典株SD1感染下细胞因子(如图11-14所示)和TLR的分泌水平(如图15所示)。具体如下：
如图11所示，与对照组细胞相比，PRRSV接种的pPAM中IL-4的浓度和mRNA水平均没有显著性差异，而PRRSV接种的mPAM-CD163细胞在24h时显示出显著增加(P<0.05)。
如图12所示，PRRSV接种的pPAM细胞中IL-10水平随时间呈上升趋势，但在PRRSV接种的mPAM-CD163细胞中，与对照组细胞相比，在6hpi和12hpi时表现出抑制的IL-10mRNA表达(P<0.05)，随后从24hpi至48hpi，IL-10水平呈现递增。
如图13所示，在pPAM细胞和mPAM-CD163细胞中，IFN-α的相对表达水平较低。
如图14所示，与对照组细胞相比，PRRSV接种的pPAM细胞和mPAM-CD163细胞中的IFN-γ水平也没有显着差异。
如图15所示，与对照组细胞相比，在36hpiTLR-3的表达水平较高，而与对照组相比，TLR-7的表达水平在36hpi和48hpi时较高(P<0.01)。没有进行超过48hpi的测量，因为在60hpi时出现明显的细胞病变效应。
综上所述，本发明中提供的这种猪肺泡巨噬细胞系mPAM-CD163，PRRSV感染敏感并产生显著高于MARC-145细胞的高滴度子代病毒，且该细胞系能够稳定传代至少100代以上。用不同毒力的PRRSV株感染，该细胞系在病毒复制及细胞因子分泌等方面与原代PAM显示了极其相似的变化规律。由此说明，这种新型细胞系显示出与pPAM细胞几乎相同的特征，并且可以为进一步的体外研究感染的PAM细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用机制提供一个更好的工具，有望于代替pPAM细胞应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)等这类猪源性病毒的增殖及疫苗研制中，尤其是为提升PRRSV疫苗的工业化生产效率提供了更好的细胞。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种用于CD163受体表达的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是以慢病毒表达载体pLV-sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD-163编码基因。
2.一种根据权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，其包括：
对CD163基因进行PCR扩增，并将CD163基因克隆至pEASY-T1载体中，得到载体pEASY-T1-CD163；
从所述载体pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至所述慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，用限制性内切酶Xba I和Xho I分别对所述pEASY-T1-CD163和所述pLV-sf GFP(2A)Puro进行双酶切；
用DNA连接酶将酶切得到的CD163基因产物和pLV-sf GFP(2A)Puro产物进行连接，得到重组质粒pLV-EGFP-CD163。
3.根据权利要求2所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，对所述CD163基因进行PCR扩增的引物对为：
CD163-F：GCTCTAGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC；
CD163-R：CCCTCGAGTCATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTG。
4.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，对所述CD163基因进行PCR扩增的条件为：92-96℃下预变性6-8min；93-95℃下变形25-35s,50-60℃下退火40-50s,67-77℃下延伸50-70s,共30-40个循环；再于67-77℃下延伸8-12min。
5.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述CD163基因来源于原代猪肺泡巨噬细胞。
6.一种用于CD163受体表达的重组慢病毒，其特征在于，其通过将权利要求1-5任一项所述的重组质粒转染哺乳细胞所得。
7.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞为Lenti-X 293T细胞系。
8.一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系，其特征在于，其通过将权利要求6或7所述的重组慢病毒转导至永生化的猪肺泡巨噬细胞系中并进行筛选得到。
9.一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，其特征在于，其包括：
培养永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21至细胞密度达到70-80％；再与权利要求6或7所述的重组慢病毒混合，于35-39℃、4-7％CO2下培育6-8h；采用含有嘌呤霉素的培养基培养1-2周，每3-4d更换新的含有嘌呤霉素的培养基，直至出现单克隆细胞；挑选所述单克隆细胞，采用有限稀释法进行筛选。
10.根据权利要求9所述的稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的浓度为最佳筛选浓度，其通过下述方法获得：
培养所述永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21至细胞密度达到70-80％，换成含有不同浓度的嘌呤霉素的培养基，在3-5d内能杀死所有细胞的最小嘌呤霉素的浓度为所述最佳筛选浓度。
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