CN110186861B - 一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒，该试剂盒包括如下组份：具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体；3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺‑乙醇溶液；过氧化氢水溶液和pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液。利用本发明的试剂盒能够方便地对人血清和商品中肝素含量进行测定，其具有灵敏度高、选择性好、检测范围宽等优点。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术和生物检测领域，具体涉及一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒。
背景技术
肝素是一种带有大量负电荷的高硫酸盐线性多糖，广泛的存在于哺乳动物的肝脏、胸腺、血液中。由于其可以通过加速凝血酶等多种凝血因子的失活而具有快速的抗凝作用，因此在外科和治疗血栓、心血管性疾病中常被用作抗凝剂。然而，肝素的过量使用往往会导致严重的副作用，常见的有导致大出血、血小板减少、骨质疏松等症状[Talanta 118(2014)348–352]。因此，在手术和抗凝治疗过程中密切监测和量化肝素的含量具有十分重要的意义。迄今为止，传统的肝素检测的方法包括荧光法、阴离子交换色谱、活化凝血时间法、反相离子色谱法、毛细管电泳，然而这些方法仍具有检测不精确、操作复杂、重现性差、特异性差等不足[Biosensors and Bioelectronics 74(2015)284–290；Biosensors andBioelectronics 92(2017)442–448]。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒，包括如下组份：
(1)具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体；
(2)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)过氧化氢水溶液；
(4)pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液；
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体用下述方法制成：按比例，将50-200μL20-80mM pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液，20-100μL 20-100mM四氯钯酸钠水溶液，20-100μL20-100mM还原型辅酶I二钠盐水溶液加入到1.5mL的离心管中，加入蒸馏水使总体积为400μL，振荡混匀，在20-30℃下静置12-24h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体。
pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸二氢钠-磷酸缓冲溶液。
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液的浓度优选为10-50mM。
过氧化氢水溶液的浓度优选为4-10M。
pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液的浓度优选为20-80M，最好是40mM。
pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液优选为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸二氢钠-磷酸缓冲溶液。
本发明的优点：
利用本发明的试剂盒能够方便地对人血清和商品中肝素含量进行测定，其具有灵敏度高、选择性好、检测范围宽等优点。
附图说明
图1是实施例1制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体的透射电镜图。
图2是实施例1制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体对不同浓度过氧化氢的动力学曲线图。
图3为图2的双倒数曲线图。
图4是实施例1制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体对不同浓度3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的动力学曲线图。
图5为图4的双倒数曲线图。
图6为实施例7的标准工作曲线图。
图7为不同浓度肝素水溶液检测颜色图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。
实施例1
一种具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体的制备方法，包括如下步骤：
将100μL 40mM pH为5.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，20μL 100mM四氯钯酸钠水溶液，40μL 100mM还原型辅酶I二钠盐水溶液加入到1.5mL的离心管中，加入蒸馏水使总体积为400μL，振荡混匀，在25℃下静置24h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体，通过透射电镜扫描获得其平均粒径为1.7nm。(见图1)
测定钯纳米颗粒的过氧化物酶活性：
取12μL本实施例获得的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体于500μL离心管中并加入188μL三蒸水进行稀释混匀，在9个4mL比色皿中，均加入6μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体、500μL 40mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，10μL 25mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺乙醇溶液并加入蒸馏水使其体积维持在1960μL，再分别向1-9号比色皿中依次加入40μL的1.25M、1.5M、2M、2.5M、4M、5M、6.25M、7.5M、9M过氧化氢水溶液，采用紫外分光光度计扫描652nm处的吸收光谱随时间的变化，得到吸光度随时间的变化率，通过Lineweaver–Burk方程计算出其米氏常数。(见图2和图3)
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒表现出高的酶活性，对过氧化氢的Km值为80.8mM。
取12μL实施例1获得的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体于500μL离心管中并加入188μL三蒸水进行稀释混匀，在8个4mL比色皿中，均加入6μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体、500μL 40mM pH为4.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，再向1-8号比色皿中依次加入10μL的6mM、10mM、12mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺乙醇溶液，并加入蒸馏水使其体积维持在1974μL，加入25.5μL 9.8M过氧化氢水溶液后采用紫外分光光度计扫描652nm处的吸收光谱随时间的变化，得到吸光度随时间的变化率，通过Lineweaver–Burk方程计算出其米氏常数。(见图4和图5)
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒表现出高的酶活性，对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的Km值为0.063mM。
实施例2
一种具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体的制备方法，包括如下步骤：
将50μL 80mMpH为5.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液，100μL 20mM四氯钯酸钠溶液，20μL 20mM还原型辅酶I二钠盐水溶液依次加入到1.5mL的离心管中，加入蒸馏水使体积为400μL，振荡混匀，在20℃下静置24h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体，通过透射电镜扫描获得其平均粒径为1.1nm。
测定方法同实施例1，对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的Km值为0.019mM，对过氧化氢的Km值为142.4mM。
实施例3
一种具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体的制备方法，包括如下步骤：
将200μL 20mM pH为5.0的磷酸二氢钠-磷酸缓冲溶液，20μL 100mM四氯钯酸钠溶液，100μL 100mM还原型辅酶I二钠盐溶液依次加入到1.5mL的离心管中，加入蒸馏水使体积为400μL，振荡混匀，在30℃下静置12h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体，通过透射电镜扫描获得其平均粒径为1.6nm。
测定方法同实施例1，对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的Km值为0.057mM，对过氧化氢的Km值为89.4mM。
实施例1-3均采用相同的方法测定钯纳米颗粒液体对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺以及过氧化氢的Km值，总结见表1。
表1
结论：本发明的试剂盒制备的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒对过氧化氢的Km值小，说明具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒与过氧化氢的亲和力高，反应速率快，催化活性高。
实施例4
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒，包括如下组份：
(1)具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体(实施例1制备)；
(2)25mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)9.8M的过氧化氢水溶液；
(4)40mMpH为6.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液。
实施例5
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒，包括如下组份：
(1)具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体(实施例2制备)；
(2)10mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)10M的过氧化氢水溶液；
(4)20mM pH为6.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液。
实施例6
一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒，包括如下组份：
(1)具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体(实施例3制备)；
(2)50mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)4M的过氧化氢水溶液；
(4)80mM pH为6.0的磷酸二氢钠-磷酸缓冲溶液。
实施例7
用实施例4的一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒对肝素进行可视化检测，具体步骤如下：
取12μL具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体于500μL离心管中，并加入288μL蒸馏水进行稀释混匀，在13个4mL比色皿中，均加入10μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体、500μL 40mM pH为6.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、10μL 25mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液后，再向1-13个比色皿中依次加入20μL浓度分别为：0mg/mL(空白)、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL肝素钠水溶液，加入蒸馏水使体系体积为1974μL，最后加入25.5μL9.8M过氧化氢水溶液，混匀后反应30min；
采用紫外分光光度计扫描1-13个检测溶液在602nm处的吸收光谱，并通过数码相机拍照记录不同浓度肝素存在下反应液的颜色，获得颜色比较图像(见图7颜色从左到右由浅蓝到深蓝)；计算不同浓度的肝素在602nm处的吸光度获得其校准曲线为y＝0.02815x+0.0446，其中y代表肝素检测液在602nm处的紫外吸收值，x则表示肝素浓度(见图6)。其线性相关系数R2为0.995，线性检测范围为0.5-25μg/mL，检测限为1.1ng/mL。
分别用实施例5、6的一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒对肝素进行可视化检测，步骤同实施例7，所获得的校准曲线与实施例7获得的相似。
实施例8
用实施例4的一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒，对血清中肝素进行可视化检测，具体步骤如下：
取12μL具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体于500μL离心管中并加入288μL蒸馏水进行稀释混匀，在4个4mL比色皿中，均加入10μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体、500μL 40mM pH为6.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、10μL 25mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液后，再向1-4个比色皿中分别加入：
10μL稀释100倍的人血清；
10μL稀释100倍的人血清和20μL 0.5mg/mL肝素钠水溶液；
10μL稀释100倍的人血清和20μL 1.5mg/mL肝素钠水溶液；
10μL稀释100倍的人血清和20μL 2.0mg/mL肝素钠水溶液。
再向每个管中加入蒸馏水使体系体积为1974μL，最后加入25.5μL 9.8M过氧化氢水溶液，混合反应30min，采用紫外分光光度计扫描1-4个检测溶液在602nm处的吸收光谱，根据实施例7获得的线性方程测定样品溶液，从而得出样品溶液中肝素的含量。(见表2)
表2
实施例9
用实施例4的一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒，对血清中肝素进行可视化检测，具体步骤如下：
取12μL具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体于500μL离心管中并加入288μL蒸馏水进行稀释混匀，在4个4mL比色皿中，均加入10μL上述稀释后的具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体、500μL 40mM pH为6.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、10μL 25mM 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液后，再向1-4个比色皿中分别加入：
10μL稀释100倍的人血清、
10μL稀释100倍的人血清和20μL 0.2mg/mL肝素钠水溶液、
10μL稀释100倍的人血清和20μL 1.0mg/mL肝素钠水溶液、
10μL稀释100倍的人血清和20μL 1.5mg/mL肝素钠水溶液。
再向每个管中加入：蒸馏水使体系体积为1974μL，最后加入25.5μL 9.8M过氧化氢水溶液，混合反应30min，采用紫外分光光度计扫描602nm处的吸收光谱，根据线性方程测定样品溶液，从而得出样品溶液中肝素的含量。(见表3)
表3
Claims (7)
1.一种基于钯纳米过氧化物酶可视化检测肝素的试剂盒，包括如下组份：
(1)具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体；
(2)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液；
(3)过氧化氢水溶液；
(4)pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液；
具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体用下述方法制成：按比例，将50-200μL 20-80mM pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液，20-100μL 20-100mM四氯钯酸钠水溶液，20-100μL 20-100mM还原型辅酶I二钠盐水溶液加入到1.5mL的离心管中，加入蒸馏水使总体积为400μL，振荡混匀，在20-30℃下静置12-24h，得到具有过氧化物酶活性的钯纳米颗粒液体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸二氢钠-磷酸缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-乙醇溶液的浓度为10-50mM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述过氧化氢水溶液的浓度为4-10M。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是所述pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液的浓度为20-80M。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征是所述pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液的浓度为40mM。
7.根据权利要求1、5或6所述的试剂盒,其特征是所述pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸二氢钠-磷酸缓冲溶液。
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| CN102768207A (zh) * | 2012-08-01 | 2012-11-07 | 福建医科大学 | 基于纳米金模拟过氧化物酶的三聚氰胺测定方法 |
| CN105466876A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-04-06 | 天津大学 | 一种基于钯纳米颗粒可视化检测6-巯基嘌呤的试剂盒 |
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| A visualized colorimetric detection strategy for heparin in serum using a metal-free polymer nanozyme;Yin mengyuan et al.;《Microchemical Journal,》;20190331;第145卷;摘要 * |
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