CN110184256A - 耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用 - Google Patents

耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用，属于生物技术领域。所述耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。本发明制备的阿魏酸酯酶的最适反应条件为65℃和pH 7.0，具有良好的耐热性和耐碱性特点，使其在造纸、食品、制药与饲料等领域中具有应用潜力。

Description

耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用。
背景技术
阿魏酸酯酶是一类能够降解植物细胞壁中阿魏酸与木质素及***半糖相交联的酯键的水解酶。根据阿魏酸酯酶催化底物的专一性和其蛋白质序列特异性，可以把阿魏酸酯酶分为A、B、C、D四类。利用阿魏酸酯酶，可以降低生产工艺中采用化学法所带来的环境问题，因此在造纸、纺织、饲料、食品等轻工行业具有广泛应用前景。阿魏酸酯酶作用底物产生的阿魏酸作为一种天然抗氧化剂，在食品、保健品和化妆品的应用中具有巨大潜力。
微生物阿魏酸酯酶的性质具有多样性，来源不同的微生物具有各自不同的物理化学性质及生物学特点。微生物产生的阿魏酸酯酶分子量大小范围很大，目前已知最小的为Neocallimastix MC-2所产生的11kDa大小的阿魏酸酯酶，最大的为Aureobasidiumpullulans所产210kDa的阿魏酸酯酶，但是大部分都集中在30kDa-70kDa范围之内。由于结构的差异性，不同的微生物阿魏酸酯酶对各种底物的亲和性也不相同。不同来源的阿魏酸酯酶催化底物的最适pH值范围一般为4.0-8.0，最适温度一般为30℃-55℃。
中国专利一种酯酶及其应用(申请号201610086094.8)公开了一种来源于约氏乳杆菌的酯酶，该酶的最适反应温度为30℃，最适反应pH为6。专利一株产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌(申请号201810545554.8)公开了一种从青贮饲料分离得到的可以产阿魏酸酯酶的乳酸片球菌，其中阿魏酸酯酶的最适pH为6.4、最适温度37℃。
早期开发的阿魏酸酯酶最适pH值大多在酸性范围内,但是具有耐碱性或具有耐热性的新型阿魏酸酯酶具有更广阔的应用前景。以造纸行业为例，由于纸浆漂白时必须调节浆料pH值,给操作带来不便。为了适应碱法制浆的碱性高温条件,获得耐碱耐高温的新一代阿魏酸酯酶产品就变得十分重要，这样的酶用于纸浆漂白时无需调节浆料的pH值和温度。因此,从微生物中筛选、分离并鉴定,或者通过基因工程和蛋白质工程等手段获得耐热耐碱性阿魏酸酯酶，是目前该领域的研究热点。
发明内容
为解决现有阿魏酸酯酶的最适反应温度及pH值较低，本发明的目的在于提供一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
本发明提供一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，包括：
步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，纯化，制备得到阿魏酸酯酶。
进一步的，所述步骤1中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤包括：
(1)以卷曲乳杆菌的DNA为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因，PCR扩增所使用的上下游引物分别为：
上游引物FaeLcr-F5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′
下游引物FaeLcr-R5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′；
(2)将所得阿魏酸酯酶基因经NdeI和XhoI双酶切，与相同酶切线性化的表达载体pET-22b(+)连接，构建得到重组表达载体pET-FaeLcr；将重组表达载体pET-FaeLcr转化至宿主菌种大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌。
进一步的，所述步骤(1)中，卷曲乳杆菌的DNA获得方法为：取过夜活化的卷曲乳杆菌菌液1ml，6000rpm,4℃离心3min收集菌体，重悬于567μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)，添加25μL50mg/ml溶菌酶，混匀，37℃水浴处理1h。加入30μL10％(质量百分比)SDS、3μL20mg/ml的蛋白酶K，65℃条件下水浴1h，再加入预冷的氯仿3mL，混匀后离心收集上清；加入等体积预冷的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，颠倒混匀后离心，取上层水相加入等体积的24：1(氯仿：异戊醇)，再次离心，取上层水相加入0.6倍体积的预冷异丙醇，室温水浴醇沉1h，离心收集沉淀；最后用70％乙醇清洗沉淀2次，吹干，TE缓冲液溶解，即得卷曲乳杆菌DNA。
进一步的，所述步骤(1)中，PCR扩增条件：2×Taq Master Mix25μL，上下游引物(10μM)各2μL，DNA模板1μL,add ddH2O至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
进一步的，所述步骤(2)中，酶切条件为37℃，3h，酶切体系为：NdeI5μL，XhoI5μL，10×K Buffer10μL，0.1％BSA 10μL，阿魏酸酯酶DNA/pET-22b(+)质粒DNA 5μg，无菌水补足至100μL；将经过双酶切的阿魏酸酯酶DNA片段和pET-22b(+)载体DNA按照10:1的摩尔比例混合，加入T4 DNA连接酶，16℃过夜连接；将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上孵育30min，42℃水浴热激60s，后加入900μL LB液体培养基37℃孵育1h；150rpm将菌液离心去掉上清液800μL，用剩余的菌液重悬菌体，涂布于加有100μg/mL氨苄霉素的LB平板；转化，得到重组大肠杆菌。
进一步的，所述步骤2中，将重组大肠杆菌接种至LB液体培养基，37℃过夜培养，取菌液，以1-2％接种量加入到100mL的LB液体培养基中，37℃培养，生长至菌液OD为0.5-0.8时，加入终浓度0.1-1mM的IPTG，继续诱导发酵16-24h；将诱导表达的大肠杆菌培养液，13000rpm离心10min，去除菌体，收集上清液用0.22μm滤膜过滤后，即得阿魏酸酯酶。
另一方面，本发明还提供上述阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述制备阿魏酸的条件为温度55～65℃、pH6.5～9。
进一步的，所述制备阿魏酸的条件为温度56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或以上任意两个数值之间的范围；所述制备阿魏酸的条件为pH7.0、7.5、8.0、8.5或以上任意两个数值之间的范围。
进一步的，所述制备阿魏酸的原料为去淀粉麦麸；所述阿魏酸作为抗氧化剂，应用于食品、制药、化妆品、造纸或饲料领域。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种来源于卷曲乳杆菌的阿魏酸酯酶，酶学性质研究表明本发明制备的阿魏酸酯酶的最适反应pH7.0，最适反应温度65℃，具有良好的耐热性和耐碱性；该酶可以从去淀粉麦麸中释放高价值的阿魏酸，重组大肠杆菌也可在含有去淀粉麦麸的培养基中释放出高价值的阿魏酸，可广泛应用于饲料、造纸、化妆品、食品、制药等领域。
附图说明
图1为本发明实施例3中不同诱导时间胞外组分阿魏酸酯酶FaeLcr降解阿魏酸乙酯的活性测定结果照片；
图2为本发明实施例3中阿魏酸酯酶FaeLcr蛋白检测及纯化结果照片；
其中，图A：胞外组分阿魏酸酯酶的SDS-PAGE图谱，条带1-8分别代表不同时间点4、8、12、24、36、48、60、72h取样；
图B：12h胞外组分阿魏酸酯酶的western-blot检测分析；
图C：阿魏酸酯酶FaeLcr的纯化，条带1代表48h胞外组分阿魏酸酯酶，条带2代表纯化后的阿魏酸酯酶蛋白)；
图3为本发明实施例4的阿魏酸酯酶FaeLcr酶学性质测定结果；
其中，图A：阿魏酸酯酶FaeLcr对不同底物的水解效率关系曲线图；
图B：实心曲线为阿魏酸酯酶FaeLcr的最适温度曲线，空心曲线为阿魏酸酯酶FaeLcr的温度稳定性曲线；
图C：实心曲线为阿魏酸酯酶FaeLcr的最适pH曲线，空心曲线为阿魏酸酯酶FaeLcr的pH稳定性曲线；
图4为本发明实施例5中不同量的阿魏酸酯酶FaeLcr降解去淀粉麦麸的曲线关系图；
图5为本发明实施例6的不同取样时间含阿魏酸酯酶FaeLcr重组菌株降解去淀粉麦麸的曲线关系图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
除特殊说明，本发明所用组分均为市售产品。
本发明中卷曲乳杆菌所使用为标准菌CGMCC1.2743，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌
含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的制备方法，包括：
获取卷曲乳杆菌DNA：购买的卷曲乳杆菌菌株接种于MRS培养基，37℃培养进行活化，MRS培养基成分为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂18.0g，蒸馏水1 000mL，pH6.2～6.6。取过夜活化的卷曲乳杆菌菌液1mL，6000rpm,4℃离心3min收集菌体，重悬于567μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，添加25μL50mg/ml溶菌酶，混匀，37℃水浴处理1h。加入30μL10％(质量百分比)SDS、3μL20mg/ml的蛋白酶K，65℃条件下水浴1h，再加入预冷的氯仿3mL，混匀后离心收集上清；加入等体积预冷的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，颠倒混匀后离心，取上层水相加入等体积的24：1(氯仿：异戊醇)，再次离心，取水相加入0.6倍体积的预冷异丙醇，室温水浴醇沉1h，离心收集沉淀；最后用70％乙醇清洗沉淀2次，吹干，TE缓冲液溶解DNA。
PCR扩增：PCR反应条件为：2×Taq Master Mix25μL，上下游引物(10μM)各2μL，卷曲乳杆菌DNA1μL,ddH2O补足至50μL；
上游引物FaeLcr-F5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′
下游引物FaeLcr-R5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存，将PCR产物电泳，采用胶回收试剂盒，得到纯化的阿魏酸酯酶基因PCR产物。
构建得到重组表达载体pET-FaeLcr：将上述PCR产物进行NdeI和XhoI双酶切，酶切条件37℃、3h；酶切体系为：NdeI5μL，XhoI5μL，10×K Buffer10μL，0.1％BSA10μL，阿魏酸酯酶DNA5μg，ddH2O补足至100μL，将酶切产物电泳，采用胶回收试剂盒得到纯化的酶切DNA片段；
采用质粒抽提试剂盒提取pET-22b(+)质粒，进行NdeI和XhoI双酶切，酶切条件37℃、3h，酶切体系为：NdeI5μL，XhoI5μL，10×K Buffer10μL，0.1％BSA10μL，DNA5μg，ddH2O补足至100μL，采用胶回收试剂盒得到纯化的酶切载体；
将经过双酶切回收的DNA片段和pET-22b(+)载体按照10:1的摩尔比例混合，加入T4 DNA连接酶，16℃过夜连接，将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上孵育30min，42℃水浴热激60s，后加入900μL LB液体培养基37℃孵育1h，150rpm将菌液离心去掉上清液800μL，将剩余菌液将菌体进行重悬，涂布于加有100μg/mL氨苄霉素的LB平板，进行蓝白斑筛选，挑取白色菌斑，接种到LB液体培养基，37℃摇床培养12h，对菌液进行测序，测序结果显示与FaeLcr的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)一致，并将已整合FaeLcr基因的pET-22b(+)质粒命名为pET-FaeLcr。
实施例2获取阿魏酸酯酶
将重组大肠杆菌pET-FaeLcr接种至LB液体培养基，37℃过夜培养，取菌液，以1％接种量加入到100mL的LB液体培养基中，37℃培养，生长至菌液OD为0.6时，加入终浓度0.5mM的IPTG，继续诱导发酵16-24h；将诱导表达的大肠杆菌培养液，13000rpm离心10min，去除菌体，收集上清液用0.22μm滤膜过滤后，即得胞外组分阿魏酸酯酶。
实施例3阿魏酸酯酶的检测
与不同时间点取经过诱导表达的大肠杆菌培养液，13000rpm离心10min，收集上清液用0.22μm滤膜过滤后，取200uL胞外组分溶液加入放置于用于检测阿魏酸酯酶活性固体培养基上的牛津杯中，37℃放置4小时后，观察降解圈产生情况。所使用牛津杯规格为内径Φ6×10mm。
其中，阿魏酸酯酶活性培养基成分为加有阿魏酸乙酯的水琼脂培养基，其中水琼脂培养基的配方为：1.5g琼脂粉，1000mL水，灭菌后使用；添加量为每升水琼脂培养基中加入15mL溶于N,N-二甲基甲酰胺的10％的阿魏酸乙酯溶液，降解结果见图1所示，可以看出，随着时间的增加到48h，水解圈逐渐增大，胞外阿魏酸酯酶活性逐渐增加，此后不再增加。
对不同时间点的取样的胞外组分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，蛋白胶配方如下表所示，western-blot法检测阿魏酸酯酶表达条带，所使用一抗和二抗分别为小鼠抗6×His单克隆抗体和羊抗鼠lgG。结果如图2A所示，48h以后取样测定的蛋白条带浓度不再增加；
分离胶12％ 浓缩胶5％
ddH<sub>2</sub>O 2.1mL 1.46mL
40％Acrylamide 1.5mL 250μL
1.5M Tris-HCl(pH8.8) 1.3mL -
1.0M Tris-HCl(pH6.8) - 250μL
10％SDS 50μL 20μL
10％过硫酸铵 50μL 20μL
10％TEMED 2μL 2μL
取12h的胞外组分，利用组氨酸标签特异性抗体，western-blot检测胞外阿魏酸酯酶，结果如图2B所示，可确定本发明所测定的蛋白为阿魏酸酯酶。
western-blot具体步骤如下：SDS-PAGE电泳分离目的样品；剪取适当大小的PVDF膜和2张相应大小的滤纸，PVDF膜预先在甲醇中浸泡活化5min，后将PVDF膜、滤纸、海绵以及蛋白胶都放于转膜缓冲液中；200mA恒流，冰水浴条件下转膜，时间根据蛋白大小确定；将PVDF膜放入预冷的TBST中，摇动清洗15min，重复3次；将PVDF膜放入15mL封闭缓冲液中，摇动孵育封闭1h；将PVDF膜放入预冷的TBST中，摇动清洗15min，重复3次；将anti-His单克隆抗体按照1:1000比例加入封闭液中，放入PVDF膜，4℃过夜孵育；将PVDF膜放入预冷的TBST中，摇动清洗15min，重复3次；将辣根过氧化物酶偶联的二抗按照1:300比例加入封闭液，放入PVDF膜，摇动孵育1h；将PVDF膜放入预冷的TBST中，摇动清洗15min，重复3次；使用辣根过氧化物酶法显色，结束后放入蒸馏水中终止反应。
离心收集经过48h诱导表达的大肠杆菌培养液，使用0.22μm过滤，加入PBS缓冲液中进行透析，之后透析液过Ni-NTA纯化树脂预装柱进行洗脱纯化，洗脱后的蛋白通过SDS-PAGE进行检测分析，见图2C，纯化后的阿魏酸酯酶的分子量约为28kDa。
纯化方法具体步骤如下：用5倍柱体积的超纯水过柱，速度为1mL/min；用5倍柱体积的Binging Buffer过Ni-TED1mL预装重力柱；样品过柱子；10倍柱体积的Binding Buffer过柱子；10倍柱体积的Washing Buffer过柱子，洗掉未结合的蛋白组分；5倍柱体积的Elution Buffer过柱子，收集的液体中包含目的蛋白；目的蛋白加入透析袋中，放到PBS缓冲液中，4℃下过夜透析除去咪唑。其中：PBS Buffer成分为137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钾；Binging Buffer成分为20mM磷酸盐，500mM氯化钠，25mM咪唑，调节pH为7.4；Washing Buffer成分为20mM磷酸盐，500mM氯化钠，50mM咪唑，调节pH为7.4；Elution Buffer成分为20mM磷酸盐，500mM氯化钠，500mM咪唑，调节pH为7.4。
实施例4：阿魏酸酯酶FaeLcr的酶学性质研究
酶活测定：反应体系为1mL，其中包含40μL25mM的底物的DSMO溶液，950μL含有1％(V/V)的吐温-80的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)和10μL的酶溶液，反应10min后加入等体积的50％的冰乙酸，HPLC检测底物的水解，本发明中测定的底物溶液为阿魏酸甲酯(MFA)、咖啡酸甲酯(MCA)、对香豆酸甲酯(MpCA)、芥子酸甲酯(MSA)。
HPLC分析阿魏酸含量测定方法如下：高效液相色谱配备有SCL-10A控制器，LC-10AT泵，SIL-10AD自动进样器，SPD-M10A发光二极管检测器。使用液相柱为C18反相柱，流动相A为甲醇，B为99:1的水和冰乙酸，流速为1mL/min，检测波长为320nm。
底物特异性分析：如图3A所示，基于酶活测定方法，比较该酶对不同底物的水解能力，阿魏酸酯酶对底物的偏好性为MCA>MpCA>MFA>MSA。
本发明采用底物特特异性最好的咖啡酸甲酯作为底物，测定阿魏酸酯酶的最适温度、热稳定性、最适pH及pH稳定性。
最适温度及热稳定性的测定：在pH7.0条件下，测定不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)条件下的酶活力，确定该酶发挥催化活性的最适温度；将酶液分别放置于以上温度中水浴1h，然后测定残余酶活，确定该酶的热稳定性；结果如图3B所示，其最适温度为65℃，在55℃以下都能够保持较好的热稳定性。
最适pH及pH稳定性分析：在65℃条件下，测定不同pH(3.0-11.0)条件下的酶活力，根据酶活大小确定酶的最适pH；将酶液分别加到不同pH的缓冲液中，4℃放置24h，测定剩余酶活，确定酶的稳定性；结果如图3C所示，其最适pH为7.0，且在碱性条件下具有较强的酶活性以及稳定性。
实施例5：阿魏酸酯酶FaeLcr在降解麦麸的活性测定
将麦麸粉碎后浸没在0.25％的乙酸钾溶液中，用90℃高温水浴20min，用热水反复洗涤后尽可能去除淀粉，烘干至恒重，过筛获取去淀粉麦麸；
称取0.2g去淀粉麦麸，悬浮于10mL pH7.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入不同量的纯化后的阿魏酸酯酶，放置于55℃，150rpm的摇床中，8h后离心收集上清液，分析其中阿魏酸生成量；结果如图4，随着阿魏酸酯酶添加量的增多，降解的阿魏酸也逐渐增多，当添加量为2mg时，获得最大产量199μg阿魏酸。
实施例6：产阿魏酸酯酶FaeLcr重组菌株降解麦麸的活性测定
挑取pET-FaeLcr转化子到5mL含有Amp抗生素的LB中，过夜培养后以2％转接至100mL添加有2％去淀粉麦麸的LB培养基中，培养3h后，加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导蛋白表达；37℃培养72h，于不同时间间隔进行取样，离心收集上清液，过滤后使用HPLC分析阿魏酸含量。结果如图5，随着时间的延长，降解的阿魏酸也逐渐增多，在72h时能够获得1.86mg阿魏酸。
本发明提供了一种来源于卷曲乳杆菌的阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将该酯酶基因***到质粒pET-22b(+)后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，能够实现阿魏酸酯酶的胞外分泌表达，从上清液中纯化后的重组酶(FaeLcr)分子量为28kDa，酶学性质分析发现此阿魏酸酯酶发挥活性的最适条件为65℃和pH7.0，并且其具有良好的耐热性和耐碱性；本发明制备的新型阿魏酸酯酶，由于其特有的酶学性质，使其可应用于饲料、造纸、化妆品、食品、制药等领域。
对比例1
文献《Characterization of Feruloyl Esterases Produced by the FourLactobacillus Species:L.amylovorus,L.acidophilus,L.farciminis andL.fermentum,Isolated from Ensiled Corn Stover》中，Zhenshang Xu等,Frontiers inMicrobiology，2017.6.2)中公开了制备以噬淀粉乳杆菌来源的阿魏酸酯酶，经序列比对，与本发明中所提供的阿魏酸酯酶核苷酸序列相似性高达86％，但以噬淀粉乳杆菌为来源的阿魏酸酯酶最适温度为55℃，热稳定结果显示其在50℃处理1h后，只有50％的活性残留。其最适反应温度及耐热性均差于本申请中的阿魏酸酯酶。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 耐热耐碱阿魏酸酯酶及其制备方法和应用
<130> 2019.4.22
<141> 2019-05-08
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)
<400> 1
atgtcccgcg ttacaattga aagagatggt ctcaccttag taggagaccg cgaagaacca 60
ttcggcgaaa tctatgacat ggctatcctc atgcatggtt ttaccgctaa ccgcaacact 120
gaattattaa gacaaattgc cgatgatcta cgcgacgaaa atgtcgctag cgtccgtttt 180
gactttaatg gtcatggcga aagtgacggc aagtttgaaa atatgactgt gccaaacgaa 240
atcgctgacg gcaaggcaat cttagaatac gttcgcaccg atccacatgt acgtaatatt 300
ttcttagttg gtcattccca aggcggtgta attgcatcaa tgctcgccgg tctttatcct 360
gatgtgatta aaaaagttgt ccttttagca ccagctgctc aattaaaaga cgatgcactt 420
aaaggtaaca cacaaggcgc agtctatgat cctaaccata ttcctgatac tgttccacta 480
gtcggcaata aattaggaat gaaactaggc ggattttatc tccgaaccgc tcaagtttta 540
ccgatttacg aggtctctgc ccgctttagt ggcccagtat cagtcattta tggtactaat 600
gaccaagtag ttaaccctaa atatgctaaa aaataccatg atatttatga aaatagcgaa 660
cttcatgcca ttacggatgc agatcacaga ttcactggtc aatacaaaaa gtcagcatca 720
gatttcactg ctcaattttt aaaaccatta ttttag 756
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> 卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)
<400> 2
Met Ser Arg Val Thr Ile Glu Arg Asp Gly Leu Thr Leu Val Gly Asp
1 5 10 15
Arg Glu Glu Pro Phe Gly Glu Ile Tyr Asp Met Ala Ile Leu Met His
20 25 30
Gly Phe Thr Ala Asn Arg Asn Thr Glu Leu Leu Arg Gln Ile Ala Asp
35 40 45
Asp Leu Arg Asp Glu Asn Val Ala Ser Val Arg Phe Asp Phe Asn Gly
50 55 60
His Gly Glu Ser Asp Gly Lys Phe Glu Asn Met Thr Val Pro Asn Glu
65 70 75 80
Ile Ala Asp Gly Lys Ala Ile Leu Glu Tyr Val Arg Thr Asp Pro His
85 90 95
Val Arg Asn Ile Phe Leu Val Gly His Ser Gln Gly Gly Val Ile Ala
100 105 110
Ser Met Leu Ala Gly Leu Tyr Pro Asp Val Ile Lys Lys Val Val Leu
115 120 125
Leu Ala Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asp Asp Ala Leu Lys Gly Asn Thr
130 135 140
Gln Gly Ala Val Tyr Asp Pro Asn His Ile Pro Asp Thr Val Pro Leu
145 150 155 160
Val Gly Asn Lys Leu Gly Met Lys Leu Gly Gly Phe Tyr Leu Arg Thr
165 170 175
Ala Gln Val Leu Pro Ile Tyr Glu Val Ser Ala Arg Phe Ser Gly Pro
180 185 190
Val Ser Val Ile Tyr Gly Thr Asn Asp Gln Val Val Asn Pro Lys Tyr
195 200 205
Ala Lys Lys Tyr His Asp Ile Tyr Glu Asn Ser Glu Leu His Ala Ile
210 215 220
Thr Asp Ala Asp His Arg Phe Thr Gly Gln Tyr Lys Lys Ser Ala Ser
225 230 235 240
Asp Phe Thr Ala Gln Phe Leu Lys Pro Leu Phe
245 250

Claims (10)

1.一种耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：以卷曲乳杆菌的DNA为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，所述阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤2：将所述重组大肠杆菌经IPTG诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶。
2.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌的步骤包括：
(1)以卷曲乳杆菌的DNA为模板，PCR扩增阿魏酸酯酶基因片段，PCR扩增所使用的上下游引物分别为：
上游引物FaeLcr-F 5′-atacatatgtcccgcgttacaattg-3′
下游引物FaeLcr-R 5′-gcgctcgagaaataatggttttaaaaattg-3′；
(2)将所得阿魏酸酯酶基因片段经NdeI和XhoI双酶切，与相同酶切线性化的表达载体pET-22b(+)连接，构建得到重组表达载体pET-FaeLcr；将重组表达载体pET-FaeLcr转化至宿主菌种大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，卷曲乳杆菌的DNA获得方法为：取过夜活化的卷曲乳杆菌菌液1ml，6000rpm,4℃离心3min收集菌体，重悬于567μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，添加25μL50mg/ml溶菌酶，混匀，37℃水浴处理1h；加入30μL 10％(质量百分比)SDS、3μL 20mg/ml的蛋白酶K，65℃条件下水浴1h，再加入预冷的氯仿3mL，混匀后离心收集上清；加入等体积预冷的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，颠倒混匀后离心，取上层水相加入等体积的24：1(氯仿：异戊醇)，再次离心，取上层水相加入0.6倍体积的预冷异丙醇，室温水浴醇沉1h，离心收集沉淀；最后用70％乙醇清洗沉淀2次，吹干，取40μL TE缓冲液溶解沉淀，即得卷曲乳杆菌DNA。
4.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增条件：2×Taq Master Mix 25μL，上下游引物(10μM)各2μL，DNA模板1μL,addddH2O至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
5.根据权利要求2所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酶切条件为37℃，3h，酶切体系为：NdeI 5 μL，XhoI 5μL，10×K Buffer 10μL，0.1％BSA10μL，阿魏酸酯酶DNA/pET-22b(+)质粒DNA 5μg，无菌水补足至100μL；将经过双酶切的阿魏酸酯酶DNA片段和pET-22b(+)载体DNA按照10:1的摩尔比例混合，加入T4 DNA连接酶，16℃过夜连接；将10μL连接产物加入100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰上孵育30min，42℃水浴热激60s，后加入900μL LB液体培养基37℃孵育1h；150rpm将菌液离心去掉上清液800μL，用剩余的菌液重悬菌体，涂布于加有100μg/mL氨苄霉素的LB平板；转化，得到重组大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述的耐热耐碱阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，将重组大肠杆菌接种至LB液体培养基，37℃过夜培养，取菌液，以1％-2％接种量加入到100mL的LB液体培养基中，37℃培养，生长至菌液OD为0.5-0.8时，加入终浓度0.1-1mM的IPTG，继续诱导发酵16-24h；将诱导表达的大肠杆菌培养液，13000rpm离心10min，去除菌体，收集上清液用0.22μm滤膜过滤后，即得阿魏酸酯酶。
7.权利要求1-6任一所述的阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.根据权利要求7所述的阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用，其特征在于，所述制备阿魏酸的条件为温度55～65℃、pH6.5～9。
9.根据权利要求8所述的阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用，其特征在于，所述制备阿魏酸的条件为温度56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或以上任意两个数值之间的范围；所述制备阿魏酸的条件为pH7.0、7.5、8.0、8.5或以上任意两个数值之间的范围。
10.根据权利要求7所述的阿魏酸酯酶在制备阿魏酸中的应用，其特征在于，所述制备阿魏酸的原料为去淀粉麦麸；所述阿魏酸作为抗氧化剂，应用于食品、制药、化妆品、造纸或饲料领域。
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