CN110180029A - 一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的制备方法及应用 - Google Patents

一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA‑214抑制剂可降解材料，由以下原料组成：氧化石墨烯、聚乙烯亚胺、micro RNA‑214抑制剂、丝素蛋白、纳米羟基磷灰石。本发明的具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA‑214抑制剂可降解材料在体内可降解，具有较好的成骨分化功能和更高的生物活性，在促进细胞增殖分化，促进细胞粘附等方面有明显优势，且降解产物对周围环境无明显影响。因此，本发明的具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA‑214抑制剂可降解材料适用于临床中的微创骨修复应用。

Description

一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的制备方 法及应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的制备方法及应用。
背景技术
目前，骨缺损已成为了临床上的最常见疾病。对于骨缺损面积较大的病人来说，受到破坏或修复环境等因素限制，依靠骨自身的再生和修复能力，往往难以达到自愈效果。替代材料是大面积骨缺损修复常用的方法，且具有广阔的应用前景。骨组织工程是一种很有前途的方法，它为设计用于因交通事故、创伤性损伤、骨骼疾病、肿瘤切除、骨组织坏死或风湿病引起的骨折修复的骨替代物/再生新骨组织提供了合适的技术。但是，骨替代物/移植物(同种/自体)由于缺乏理想的骨替代物、移植物的成骨潜能、免疫排斥和继发性创伤而受到限制。micro RNA-214能够靶向成骨细胞中的转录因子ATF4抑制骨形成，micro RNA-214抑制剂具有促进成骨的活性，抑制骨活性的双向调节作用，激活成骨细胞的AKT和ERK1/2信号通路，从而促进细胞的分化。针对这些问题，我们研究出一种负载micro RNA-214抑制剂的具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解三维支架。本发明从成骨分化和骨再生两方面将具有骨修复功能的可降解材料进行了分析。结果表明该负载micro RNA-214抑制剂的具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解三维支架不仅可以促进细胞的粘附还能有效的促进成骨的分化以及骨再生。
临床上针对骨缺损常用的治疗手段主要为骨移植和骨替代材料。其中骨移植包括自体骨、异体骨和异种骨移植。自体骨移植虽然不会产生免疫排斥反应而且还具有良好的骨诱导和骨传导性能，但其来源极其有限；异体骨和异种骨的来源虽然丰富，但会产生免疫排斥反应，还会伴有感染等并发症而且骨诱导作用较差。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而制备一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料，该种材料能促进细胞粘附以及成骨分化与骨形成，要优于传统的骨移植及传统的支架，并且其降解速度与骨修复速率相匹配。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料，其特征在于，由以下原料组成：氧化石墨烯、聚乙烯亚胺、micro RNA-214抑制剂、丝素蛋白、纳米羟基磷灰石。
本发明还提供了一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料生的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氧化石墨烯和聚乙烯亚胺配置成一定浓度的溶液后混合，然后超声处理，搅拌，得到氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物溶液；
(2)将步骤(1)的复合物溶液与micro RNA-214抑制剂在磷酸盐缓冲液中复合，室温条件下涡旋，孵育后，得到载有micro RNA-214抑制剂的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物溶液；
(3)将磷酸氢铵溶液与氯化钙溶液混合搅拌后，在室温条件陈化离心后，将所得的沉淀物冷冻干燥，得到纳米羟基磷灰石颗粒；再将从蚕茧中提取的丝素干燥后，置于溴化锂溶液中，加热溶解后，得到丝素蛋白溶液，经透析后，离心收集，备用；
(4)将浓度为步骤(3)的丝素蛋白溶液与纳米羟基磷灰石以及步骤(2)的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物混合搅拌后，加入到孔板中，冻干后得到具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料。
优选地，所述步骤(1)中氧化石墨烯的浓度为0.1～10mg/mL；所述聚乙烯亚胺的浓度为0.1～10mg/mL。
优选地，所述步骤(1)中氧化石墨烯的浓度为1mg/mL；聚乙烯亚胺的浓度为1mg/mL。
优选地，所述步骤(1)中氧化石墨烯和聚乙烯亚胺在反应体系中的质量比为1:1～5。
优选地，所述步骤(1)中氧化石墨烯和聚乙烯亚胺在反应体系中的质量比为1:2。
优选地，所述步骤(1)中超声时间为10～60min；搅拌时间为3～24h。
优选地，所述步骤(1)中超声时间为15min；搅拌时间为12h。
优选地，所述步骤(2)中所述的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物与micro RNA-214抑制剂的质量比为100～30:1。
优选地，所述步骤(2)中所述的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物与micro RNA-214抑制剂的质量比为30:1。
优选地，所述步骤(2)中所述的涡旋时间为30～100s；所述的孵育时间为所述的孵育时间为10～120min。
优选地，所述步骤(2)中所述的涡旋时间为60～100s；所述的孵育时间为所述的孵育时间为60min。
优选地，所述步骤(3)中磷酸氢铵在反应体系中的浓度为0.1～1mol/L；氯化钙在反应体系中的浓度为0.1～1mol/L；溴化锂在反应体系中的浓度为1～20mol/L；丝素蛋白在反应体系中的质量分数为1～10％。
优选地，所述步骤(3)中磷酸氢铵在反应体系中的浓度为0.3mol/L；氯化钙在反应体系中的浓度为0.5mol/L；溴化锂在反应体系中的浓度为9.3mol/L；丝素蛋白在反应体系中的质量分数为4％。
优选地，所述步骤(3)中搅拌的时间为1～6h；陈化离心间12～36h；离心转速为1000～10000rpm，离心时间为5～60min；加热时间为1～12h，加热温度为30～100℃。
优选地，所述步骤(3)中搅拌的时间为2h；陈化离心间24h；离心转速为5000rpm，离心时间为10min；加热时间为5h，加热温度为60℃。
优选地，所述步骤(4)中所述的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺-micro RNA-214抑制剂复合物在体系中的浓度为0.1～10mg/mL。
优选地，所述步骤(4)中所述的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺-micro RNA-214抑制剂复合物在体系中的浓度为1mg/mL。
本发明的另一目的在于还提供一种如上所述的具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料在骨修复中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料，该种可降解材料是由纳米羟基磷灰石和丝素蛋白组成的支架和聚乙烯亚胺修饰的氧化石墨烯负载micro RNA-214抑制剂复合物组成。本发明的具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料在体内可降解，具有较好的成骨分化功能和更高的生物活性，在促进细胞增殖分化，促进细胞粘附等方面有明显优势，且降解产物对周围环境无明显影响。因此，本发明的种具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA-214抑制剂可降解材料适用于临床中的微创骨修复应用。
附图说明
图1为氧化石墨烯、聚乙烯亚胺和聚乙烯亚胺改性氧化石墨烯的红外光谱图。
图2为氧化石墨烯和聚乙烯亚胺改性氧化石墨烯的透射电镜图。
图3为本发明具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的凝胶阻滞实验结果示意图。
图4为本发明具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的细胞活性示意图。
图5为本发明具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料碱性磷酸酶(ALP)活性示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1本发明负载micro RNA-214抑制剂可降解材料的制备方法包括以下步骤：
步骤一：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺(GO-PEI)的合成
将氧化石墨烯(GO)配置成1mg/mL超声处理后备用，再将聚乙烯亚胺(25k)(PEI)配置成1mg/mL溶液并在10min内缓慢地加入到GO溶液中。通过将GO溶液与稀释的PEI溶液按1:2的质量比混合，然后超声处理15min后，搅拌12小时过夜，然后通过离心和洗涤的方法除去游离的PEI，得到GO-PEI复合物溶液。
步骤二：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物(GO-PEI-microRNA-214)的合成
将GO-PEI复合物溶液与micro RNA-214抑制剂在磷酸盐缓冲液中以30:1的质量比复合，室温条件下涡旋60s，孵育60min，即得载有micro RNA-214抑制剂的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物。其中：micro RNA-214抑制剂的具体信息如下：miRNA名称：mmu-miR-214-3pmiRBase Accession：MIMAT0000661 miRNA成熟体序列：acagcaggcacagacaggcagu。
步骤三：丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的制备
将浓度为0.3mol/L的磷酸氢铵溶液与浓度为0.5mol/L的氯化钙溶液混合搅拌后，在室温条件(pH＝10)陈化离心24小时，所得的沉淀物冷冻干燥24小时，得到纳米羟基磷灰石颗粒。再将从蚕茧中提取的丝素干燥后，置于浓度为9.3mol/mL的溴化锂溶液中，60℃加热溶解5h后，得到丝素蛋白溶液，然后透析3d，5000rpm离心10min收集，备用。
步骤四：具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的合成
将浓度4％(w/v)的丝素蛋白溶液1mL与10mg纳米羟基磷灰石以及浓度为1mg/mL的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物溶液1mL混合搅拌后，加入到24孔板中，冻干后得到具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料。
实施例2本发明负载micro RNA-214抑制剂可降解材料的制备方法包括以下步骤：
步骤一：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺(GO-PEI)的合成
将氧化石墨烯(GO)配置成0.1mg/mL超声处理后备用，再将聚乙烯亚胺(25k)(PEI)配置成0.1mg/mL溶液并在10min内缓慢地加入到GO溶液中。通过将GO溶液与稀释的PEI溶液按1:1的质量比混合，然后超声处理15min后，搅拌12小时过夜，然后通过离心和洗涤的方法除去游离的PEI，得到GO-PEI复合物溶液。
步骤二：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物(GO-PEI-microRNA-214)的合成
将GO-PEI复合物溶液与micro RNA-214抑制剂在磷酸盐缓冲液中以100:1的质量比复合，室温条件下涡旋60s，孵育60min，即得载有micro RNA-214抑制剂的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物。
步骤三：丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的制备
将浓度为0.1mol/L的磷酸氢铵溶液与浓度为0.1mol/L的氯化钙溶液混合搅拌后，在室温条件(pH＝10)陈化离心24小时，所得的沉淀物冷冻干燥24小时，得到纳米羟基磷灰石颗粒。再将从蚕茧中提取的丝素干燥后，置于浓度为1mol/mL的溴化锂溶液中，60℃加热溶解5h后，得到丝素蛋白溶液，然后透析3d，5000rpm离心10min收集，备用。
步骤四：具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的合成
将浓度为1％(w/v)的丝素蛋白溶液1mL与10mg纳米羟基磷灰石以及浓度为0.1mg/mL的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物溶液1mL混合搅拌后，加入到24孔板中，冻干后得到具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料。
实施例3本发明负载micro RNA-214抑制剂可降解材料的制备方法包括以下步骤：
步骤一：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺(GO-PEI)的合成
将氧化石墨烯(GO)配置成6mg/mL超声处理后备用，再将聚乙烯亚胺(25k)(PEI)配置成6mg/mL溶液并在10min内缓慢地加入到GO溶液中。通过将GO溶液与稀释的PEI溶液按1:4的质量比混合，然后超声处理15min后，搅拌12小时过夜，然后通过离心和洗涤的方法除去游离的PEI，得到GO-PEI复合物溶液。
步骤二：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物(GO-PEI-microRNA-214)的合成
将GO-PEI复合物溶液与micro RNA-214抑制剂在磷酸盐缓冲液中以60:1的质量比复合，室温条件下涡旋60s，孵育60min，即得载有micro RNA-214抑制剂的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物。
步骤三：丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的制备
将浓度为0.6mol/L的磷酸氢铵溶液与浓度为0.8mol/L的氯化钙溶液混合搅拌后，在室温条件(pH＝10)陈化离心24小时，所得的沉淀物冷冻干燥24小时，得到纳米羟基磷灰石颗粒。再将从蚕茧中提取的丝素干燥后，置于浓度为5mol/mL的溴化锂溶液中，60℃加热溶解5h后，得到丝素蛋白溶液，然后透析3d，5000rpm离心10min收集，备用。
步骤四：具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的合成
将浓度为8％(w/v)的丝素蛋白溶液1mL与10mg纳米羟基磷灰石以及浓度为5mg/mL的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物溶液1mL混合搅拌后，加入到24孔板中，冻干后得到具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料。
实施例4本发明负载micro RNA-214抑制剂可降解材料的制备方法包括以下步骤：
步骤一：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺(GO-PEI)的合成
将氧化石墨烯(GO)配置成10mg/mL超声处理后备用，再将聚乙烯亚胺(25k)(PEI)配置成10mg/mL溶液并在10min内缓慢地加入到GO溶液中。通过将GO溶液与稀释的PEI溶液按1:5的质量比混合，然后超声处理15min后，搅拌12小时过夜，然后通过离心和洗涤的方法除去游离的PEI，得到GO-PEI复合物溶液。
步骤二：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物(GO-PEI-microRNA-214)的合成
将GO-PEI复合物溶液与micro RNA-214抑制剂在磷酸盐缓冲液中以90:1的质量比复合，室温条件下涡旋60s，孵育60min，即得载有micro RNA-214抑制剂的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物。
步骤三：丝素蛋白与纳米羟基磷灰石的制备
将浓度为1mol/L的磷酸氢铵溶液与浓度为1mol/L的氯化钙溶液混合搅拌后，在室温条件(pH＝10)陈化离心24小时，所得的沉淀物冷冻干燥24小时，得到纳米羟基磷灰石颗粒。再将从蚕茧中提取的丝素干燥后，置于浓度为20mol/mL的溴化锂溶液中，60℃加热溶解5h后，得到丝素蛋白溶液，然后透析3d，5000rpm离心10min收集，备用。
步骤四：具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料的合成
将浓度为10％(w/v)的丝素蛋白溶液1mL与10mg纳米羟基磷灰石以及浓度为10mg/mL的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物溶液1mL混合搅拌后，加入到24孔板中，冻干后得到具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料。
实施例5：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺(GO-PEI)的合成及红外分析
FTIR傅立叶红外光谱是一种显示分子振动的光谱，可鉴别待测物质中的官能团，通过傅立叶红外光谱表征GO、PEI、GO-PEI特征峰变化。将GO-PEI和原料GO、PEI做红外测试，可证明目标产物是否被成功合成。分别取1-2mg的GO、PEI和实施例1的GO-PEI的样品置于玛瑙研钵研碎后，再依次加入100-200mg干燥24小时后的溴化钾粉末(待测试样在溴化钾中的比例大约是0.5％-1％)继续研磨至粒度细致，混合均匀后，将混合物在真空度10mmHg下2-5min压成透明薄片进行测试，扫描范围为4000-400cm-1，得到结果如图1所示。傅里叶变换红外(FT-IR)分析表明，GO和GO-PEI均具有-OH、C＝O和C-O基团，分别对应于3200-3500cm-1、1500-1760cm-1和1000-1500cm-1的峰值。PEI和GO-PEI的C-H、N-H和C-N振动峰值分别对应于500-900cm-1、1000-1250cm-1和1250-1500cm-1。这些峰的结果表明PEI是通过静电相互作用而非共价键接枝到氧化石墨烯上的，证明实施例1中的GO-PEI复合物成功合成。
实施例6：氧化石墨烯-聚乙烯亚胺(GO-PEI)的合成及透射电镜的分析
通过透射电镜(TEM)来观察实施例1步骤一制备的GO-PEI复合物颗粒的微观形貌。从图2透射电镜分析表明，氧化石墨烯表面相对光滑，PEI功能化的氧化石墨烯改变了氧化石墨烯表面的光滑度，增大了氧化石墨烯的尺寸。
实施例7：GO-PEI与micro RNA-214抑制剂的凝胶阻滞
将micro RNA-214抑制剂迅速的加入到实施例1所得的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺母液中上下缓慢颠倒8～10次，25℃孵育30min，待用。制备了一系列不同质量比(GO-PEI/micro RNA-214)的纳米复合复合物，设定的质量比为0，10，20，30，40，50和60。通过改变每组GO-PEI的加入量，来确保各组micro RNA-214抑制剂的加入量保持一致，以便用于后续凝胶阻滞实验的检测。再配制含0.1％EB染液的1％琼脂糖凝胶，在孔道中轻轻加入上述制备好的各组样品，用TAE缓冲液浸没凝胶。设定电压100V，开始进行电泳，25min后，停止电泳。将琼脂糖凝胶小心取出，经紫外照射后，用凝胶成像***对其进行拍照，结果如图3所示。实验结果表明，当GO-PEI与micro RNA-214抑制剂的质量比小于等于20时，micro RNA-214抑制剂与GO-PEI没有完全结合，当两者质量比达到30时，阻滞在上样孔处，两者形成紧密的纳米复合物结构。故在后续实验均选用质量比为30的GO-PEI/micro RNA-214。
实施例8：具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microvRNA-214抑制剂可降解材料的制的细胞活性检测
通过CCK-8法对实施例1制备的可降解材料(SF/HAP/GPM)进行细胞活性检测，并以丝素蛋白支架材料(SF)和丝素蛋白-纳米羟基磷灰石复合支架(SF/HAP)以作对照。本实验所用的细胞是成纤维细胞(3T3细胞)，而培养该细胞所用的培养液是含有10％的胎牛血清和1％的双抗(青霉素和链霉素的混合液)的DMEM的培养液，并且培养条件是在温度为37℃和CO2浓度为5％的培养箱中。在培养的过程中，每两天要给细胞换一次培养液，换细胞培养液的目的是为细胞增加新的营养物质、去除不贴壁的细胞以及细胞的代谢物。将灭菌过的不同组的材料置于48孔板中，随后将调整好的50μL的细胞悬浮液滴加到具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA-214抑制剂可降解材料上，在培养箱中，孵育2h后，取450μL的培养液加到材料上，继续培养。分别在培养到3和7天后加入CCK-8试剂，按照1:10的比例加入，也就是说100μL的培养液加入10μL的CCK-8试剂，继续培养2-4h。在450nm波长的条件下，使用酶标仪读取每个孔的吸光光度值。结果如图4所示，结果表明：SF/HAP/GPM支架的细胞增殖率均高于SF和SF/HAP支架。第3天，细胞增殖达到较高水平；然而，在第7天，细胞的增殖减少，细胞倾向于分化和矿化。以上结果表明，本发明的具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA-214抑制剂可降解材料具有良好的生物相容性和细胞粘附性。
实施例9：具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA-214抑制剂可降解材料的碱性磷酸酶(ALP)活性检测
将已灭菌的具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA-214抑制剂可降解材料(SF/HAP/GPM)与丝素蛋白支架材料(SF)和丝素蛋白-羟基磷灰石支架材料(SF/HAP)分别放置于48孔培养板中。取培养至3代的细胞，使用0.25％胰酶将其从培养瓶中消化下来，再以转速为1000rpm进行离心，时间为5min，弃去上清液，再将含有血清和双抗(青霉素和链的混合液)的α-DMEM培养液加入其中，并调整细胞浓度为每毫升含有5×107个细胞。每个样品上种植20μL的上述细胞悬浮液，将其置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育的培养箱中孵育2个小时，再加入500μL的培养液继续的培养至7天，14天和21天。在培养期间，2-3天更换一次培养液，目的是为了细胞能够获得足够的营养。从孔板中将材料取出，再用无菌PBS溶液将具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA-214抑制剂可降解材料润洗3次，然后将500μL细胞裂解液加入其中，随后将置于温度为4℃的超声细胞破碎仪中进行细胞破碎。对其离心，收集上清液。将500μL ALP底物反应液加入上清液中，在水浴温度为37℃的条件下反应30min，为了终止反应，向反应液中加入500μL的浓度为0.1M的NaOH，随后用紫外可见光分度计测定样品在405nm处的分光度值，借助说明书计算ALP。每个时间点的每组材料至少平行测试3次。实验结果如图5所示，在14天内具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA-214抑制剂可降解材料中的细胞的ALP活性随着孵育时间的延长而呈现出增加的趋势，结果表明，具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载microRNA-214抑制剂可降解材料有利于成骨的分化，且表现出了优于不加microRNA-214抑制剂的材料的成骨分化能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料，其特征在于，由以下原料组成：氧化石墨烯、聚乙烯亚胺、micro RNA-214抑制剂、丝素蛋白、纳米羟基磷灰石。
2.一种如权利要求1所述的具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料生的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氧化石墨烯和聚乙烯亚胺配置成一定浓度的溶液后混合，然后超声处理，搅拌，得到氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物溶液；
(2)将步骤(1)的复合物溶液与micro RNA-214抑制剂在磷酸盐缓冲液中复合，室温条件下涡旋，孵育后，得到载有micro RNA-214抑制剂的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物溶液；
(3)将磷酸氢铵溶液与氯化钙溶液混合搅拌后，在室温条件陈化离心后，将所得的沉淀物冷冻干燥，得到纳米羟基磷灰石颗粒；再将从蚕茧中提取的丝素干燥后，置于溴化锂溶液中，加热溶解后，得到丝素蛋白溶液，经透析后，离心收集，备用；
(4)将步骤(3)的丝素蛋白溶液与纳米羟基磷灰石以及步骤(2)的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺负载micro-RNA-214抑制剂复合物混合搅拌后，加入到孔板中，冻干后得到具有诱导成骨分化与骨再生功能的可降解材料。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中氧化石墨烯的浓度为0.1～10mg/mL；所述聚乙烯亚胺的浓度为0.1～10mg/mL；其中氧化石墨烯与聚乙烯亚胺在反应体系中的质量比为1:1～5。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中氧化石墨烯的浓度为1mg/mL；聚乙烯亚胺的浓度为1mg/mL；氧化石墨烯与聚乙烯亚胺在反应体系中的质量比为1:2。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物与micro RNA-214抑制剂的质量比为100～30:1。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺复合物与micro RNA-214抑制剂的比例为30:1。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷酸氢铵在反应体系中的浓度为0.1～1mol/L；氯化钙在反应体系中的浓度为0.1～1mol/L；溴化锂在反应体系中的浓度为1～20mol/L；丝素蛋白在反应体系中的质量分数为1～10％。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的氧化石墨烯-聚乙烯亚胺-micro RNA-214抑制剂在体系中的浓度为0.1～10mg/mL。
9.一种如权利要求1所述的具有诱导成骨分化与骨再生功能的负载micro RNA-214抑制剂可降解材料在骨修复中的应用。
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