CN110177584B - 低温凝胶3d支架及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种生产基于低温凝胶的多区间3D支架的方法。该方法包括以下步骤：a)在保持于零下温度的冷冻支撑物上提供第一冻结聚合物层；b)通过可能地调节冷冻支撑物的零下温度，提供随后的聚合物层以获得聚合物层堆叠；c)任选地在零下温度下温育最终的聚合物结构；以及d)将所产生的低温凝胶置于高于0℃的温度下，其中每个随后的层i)在前一个层冻结之后沉积在该前一个层上；ii)在前一个层完全聚合之前沉积在该前一个层上；以及iii)以高于之前沉积的层的冻结温度的温度沉积。还公开了由所述方法获得的低温凝胶支架。

Description

低温凝胶3D支架及其生产方法

技术领域

本发明涉及生物支架的制造方法领域。

背景技术

能够在体内和体外支撑、指导和引导细胞的3D支架的设计是组织工程学的主要关注领域之一。3D结构可以通过多种方法来生产，包括铸造、立体光刻和光刻以及增材制造(3D打印)。特别是随着3D打印机的快速发展，以最终打印整个器官为目标对生物材料和细胞的组合进行增材制造已经成为主流方法。

3D支架制造通常需要使用聚合物、生物或仿生支架材料。从根本上说，细胞既可以存在于制造过程中，也可以在稍后的时间点接种，主流方法是将细胞与支架前体直接混合，特别是在3D打印方法中。由于凝胶形成在打印之后，这提供了对细胞位置的控制，并同时提供了必要的细胞粘附。同时打印细胞和材料的主要原因在于，很难以足够的空间控制和足够的深度将细胞接种到成品支架中。然而，这种方法有一些非常重要的弊端。首先，制造过程中存在细胞意味着一方面需要无菌环境，且另一方面需要保护操作人员免受可能的生物危害，这两方面都会增加成本，尤其是在临床环境中。其次，当同时打印细胞和支架时，用于支架的材料不是足够多孔的。因此，即使是在生物可降解的材料中，在植入后，由于孔隙度不足血管化也会减慢。作为对这些弊端的回应，目前正在开发允许生成多孔支架的技术，主要通过使用牺牲材料。这种支架解决了对孔隙度的需要，且一旦牺牲材料(例如墨)被移除，就可以进行后面的接种。

3D制造不应仅旨在控制生物基质的结构，而理想地也控制其内细胞的空间分布。当将细胞接种到另外已完成的多孔支架中时，需要找到替代的细胞定位策略。用通过整个器官的脱细胞化而获得的支架的实验表明，通过将细胞混合物接种到多孔的、最初无细胞的构造中确实有可能获得功能性器官。例如，在肺中，已经证明足以接种区间:当将肺上皮细胞(气道细胞)的混合物通过气道接种到脱细胞后的肺支架上，并将血管细胞的混合物通过肺血管支架时，无细胞基质中包含的指令足以允许功能性细胞类型的空间结构，并最终开发出新的最低限度功能的肺(Petersen,T.H.et al.,Science 30 Jul 2010,Vol.329,Issue 5991,pp.538-541)。

此外，在组织工程学领域，使用高度且可逆可压缩的智能细胞支架***用于微创植入手术是非常理想的。为了实现此目标，必须满足以下几个要求：支架必须是高度可压缩的，使得mL-规格体积可以通过窄孔管或针头递送，但在注射过程之后应迅速恢复其原始形状、体积和结构；在与递送过程相关的压缩过程中，它应保持细胞的完整性和形态，但也表现为全局地软材料，以最小化瘢痕形成反应；此外，为了发展分化细胞的网络所必需的长期培养和潜在的临床转化，需要对支架进行可靠的灭菌，优选地通过高压灭菌。具有这种形状记忆行为的大孔支架可以通过不同的技术来制造，诸如乳液聚合、冻干和低温凝胶化。(S.Zhou et al.,J.Mater.Chem.B 2013,1,4736；A.J.Thornton et al.,Transplantation2004,77,1798；S.A.Bencherif et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2012,109,19590)。后者特别地涉及水凝胶前体在零下温度下的聚合，并特别地产生坚固的、可逆可压缩的凝胶，例如其可用于微创递送(S.A.Bencherif et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2012,109,19590)。

中国专利申请CN 103057123描述了包括三维模型设计工作站和具有打印头、墨盒和打印平台的三维打印机的三维打印***。该***的特点是打印平台设置有制冷装置。该***及其使用方法特别适用于基于各种类型的细胞外基质分子以及低温凝胶形式的多糖分子支撑物制备神经再生植入体，并能准确地控制支撑物的形式和相应参数。然而，所述方法没有提供关于如何提供具有不同结构特征(诸如不同孔隙度)的内置区域的多区间低温凝胶支架的任何提示，以便控制在最终支架内接种细胞后细胞的后处理空间分布。它也没有提供获得足够坚固且可压缩的凝胶以允许微创递送的手段。

发明内容

考虑到现有技术的所有弊端，且为了解决并克服它们，本发明的发明人开发了一种利用增材制造技术来生产可压缩低温凝胶(cryogel)支架的方法。所获得的支架将自由形式设计与通过注射器针头或其它窄孔管的微创输送结合，在被移植细胞的情况下没有细胞活力的丧失。通过将无细胞的水凝胶墨打印到冷冻的冷台上，并利用低温凝胶化(cryogelation)技术，发明人证明了能够获得有极高的孔隙度和快速可逆的压缩性(即在压缩并释放后1分钟内恢复到高达99.9％的初始形状)的3D多孔支架，其然后可容易地被进一步灭菌。由于其高度互联的孔隙结构，它们可以很深地接种细胞，例如通过利用压缩/再水合循环将细胞悬浮液引入孔隙空间。对于微创递送，支架可以再次压缩和部分脱水，然后通过窄孔导管进行递送，然后恢复形状和体积。

最重要的是，在制造过程中可以在支架内部产生结构：支架的区域可以由小孔构成，且其它邻近区域可以由大孔或无孔以及其任何组合构成。孔隙度的差异可来自用于制造不同支架区域的温度的差异。在低温凝胶的情况下，温度低于0℃将导致多孔区域。生产的温度越低于冻结点，所得到的孔隙尺寸越小。然而，如果温度高于冻结温度，则所得到的支架区域将不是多孔的(在微观尺度上，仍然会有水凝胶的固有孔隙度，其通常在几纳米至几百纳米的范围内)。

在所提出方法的一种实施方式中，采用了3D打印方法，该方法使用用于3D打印的特定的牺牲材料：水冰。事实上，当打印到冷台上时，水基打印墨会迅速冻结。如果墨包含合适的预聚体混合物，则会在此过程中形成海绵状低温凝胶。孔隙尺寸可以控制在从小于1μm(细胞无法进入)至几百微米(在体外细胞可进入，且在体内也可血管化)。这是通过控制冻结速率来实现的，而冻结速率又由打印阶段的温度控制。在体内，孔隙度转化为植入后的快速血管化。

虽然3D打印在几何上允许广泛的自由度，但这并不是可以应用本发明的唯一方式。例如，可以用不同形状的模具执行连续的铸造步骤，或者对连续层使用丝网印刷或立体光刻。

此外，本发明的方法提供了在完全3D打印的支架中在单个步骤中产生内置区间的原理证据。通过调节支撑物的温度，其中支架是打印的，并调整生物墨和水(任选地用作形成非常大的孔隙的牺牲材料)的打印/分配时间，可以容易地获得多个具有不同结构特点的区间。因此，由于不同孔隙尺寸的区域，故允许细胞在支架上接种后流经支架仅到达限定的区间。

本发明的关键技术挑战是获得彼此机械连接的所述区间从而保证最终支架的功能性。为此目的，有必要适当地控制聚合和冻结速率。事实上，如果聚合主要发生在冷的、半冻结状态下，且有冰晶和在它们之间的浓缩的聚合物溶液，则可获得具有足够坚固性的低温凝胶，用于通过部分脱水(压缩以除去孔隙流体)进行微创递送(A.Béduer,T.Braschleret al.,Adv.Healthc.Mater.2015 Jan 28；4(2):301-12)。

为了使连续层和不同区间之间具有强的粘附性，必须在它们之间建立强的材料连接。为此，需要满足以下条件：第一，聚合不应在相邻区间、滴或层的沉积之前完成。其次，新材料和已经冻结的材料之间需要发生亲密接触。这最好通过使用基本上高于冻结温度的墨将表面局部再融化来实现。第三，在沉积下一层之前在界面处应当不存在或存在最小量的不适当水(冰或液体)，以避免物理分离或形成机械薄弱区(由于生物墨的大量局部稀释)。

为了使已经沉积的、通常冻结的材料与下一层、滴或区间之间能够交联，有必要使新旧材料之间发生化学键形成。为此，在新材料到达时，之前沉积的材料的聚合需要是未完成的。这又可以例如通过适当控制反应动力学来实现，使得在新的相邻材料到达时，已经沉积的材料中的聚合是未完成的。

在双组分反应体系中，还可以使用非化学计量的量的两种反应配对物，使得官能团保持永久可用。可以有利地使用足够慢的反应动力学和化学计量不匹配的组合。

在沉积相邻材料之前在界面处不适当的水冰或液体沉积主要是通过从空气湿度的凝结而发生的，且因此可以通过控制空气湿度、通过提供临时保护层(特别是当使用成型技术时)或者(虽然不完全地)通过足够快速的打印来降低。

最后，由于通过窄孔导管进行微创递送的可逆压缩性和机械坚固性通常与主要处于半冻结状态的聚合有关(A.Béduer,T.Braschler et al.,Adv.Healthc.Mater.2015 Jan28；4(2):301-12；S.A.Bencherif et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2012,109,19590)，因此仍应选择足够快的反应速率以允许在可用的低温温育期间(通常少于一年，优选地少于1个月，且甚至更优选地少于一周)形成低温凝胶。

因此，本发明的目的是提供

一种生产基于低温凝胶的多区间三维支架的方法，所述方法的特征在于其包括以下步骤：

a)在保持于零下温度的冷冻支撑物上提供第一冻结聚合物层；

b)通过可能地调节冷冻支撑物的零下温度，提供随后的聚合物层以获得聚合物层堆叠；

c)任选地在零下温度下温育最终的聚合物结构；以及

d)将所产生的低温凝胶置于高于0℃的温度下

该方法的特征在于每个随后的层：

i)在前一个层冻结之后沉积在前一个层上；

ii)在前一个层完全聚合之前沉积在前一个层上；以及

iii)以高于之前沉积的层的冻结温度的温度沉积。

在一种实施方式中，该方法的特征在于步骤a)的提供第一冻结聚合物层包括以下步骤：

a')将至少一种聚合物材料的至少一种液体前体沉积在保持于零下温度的冷冻支撑物上以形成第一聚合物层；以及

a")允许所述第一聚合物层冻结以形成第一冻结聚合物层。

在一种实施方式中，该方法的特征在于步骤b)通过对至少一种聚合物材料的至少一种液体前体进行铸造和成型、3D打印、丝网印刷或光聚合以及上述的组合来执行。

在特定实施方式中，该方法的步骤b)通过3D打印来执行。在此实施方式中，该方法还包括以下步骤：

x)在计算机上获得三维支架的基于软件的3D模型；

xx)将所述计算机与具有至少一个生物材料类墨盒和水盒的3D打印机可操作地连接；以及

xxx)通过将盒的内容物分配到保持于零下温度的冷冻支撑物上来根据基于软件的3D模型打印低温凝胶的层。

在特定实施方式中，该方法的特征在于3D支架中存在的空隙是通过使用水盒的水来获得的。

在特定实施方式中，该方法的特征在于3D打印机的冷冻支撑物的温度由运行3D支架的基于软件的3D模型的计算机，并根据所述3D模型控制和调节。

在一种实施方式中，该方法的特征在于随时间调节冷冻支撑物的温度以便每个层限定一个支架区间。

在一种实施方式中，该方法的特征在于随时间调节冷冻支撑物的温度以便每个层可以限定多于一个支架区间。

在一种实施方式中，该方法的特征在于沿着支撑物调节冷冻支撑物的温度以便每个层可以限定多于一个支架区间。

在一种实施方式中，该方法的特征在于以10℃的步长进行温度调节。

在一种实施方式中，该方法的特征在于连续地进行温度调节。

在一种实施方式中，该方法的特征在于使用预定义的一组温度水平(例如：-20℃和-80℃)进行温度调节。

在一种实施方式中，该方法的特征在于冷冻支撑物是平板、腔室或储库。

在一种实施方式中，该方法的特征在于聚合物材料包括天然聚合物材料(诸如细胞外基质衍生的聚合物材料)、合成聚合物材料或其组合。

在一种实施方式中，该方法的特征在于冷冻支撑物的温度在聚合物材料的冻结点和绝对零度之间，优选地在0°和-200℃之间，对于水基聚合物材料甚至更优选地在-20°和-80℃之间。

在一种实施方式中，该方法的特征在于聚合物材料不包括任何交联剂。

本发明的另一目的涉及可通过本发明的方法获得的基于低温凝胶的多区间三维支架，其特征在于它包括通过内置的中间薄层在层之间机械地连接的层的堆叠。

在一种实施方式中，支架的特征在于它是可逆可压缩的，使得它在压缩和释放后一分钟内可恢复高达99％的其形状。

在一种实施方式中，支架的特征在于它具有孔隙度在50％和99％之间的相互连接的孔的网络。

在一种实施方式中，支架的特征在于它包括与大孔区间分开的小孔区间，其中平均大孔直径与小孔直径的比至少为2，优选地至少为5。

在一种实施方式中，内置的中间薄层具有足够小的孔隙尺寸，使得充当有较大孔隙尺寸的相邻层之间的活细胞的屏障。

在一种实施方式中，支架的特征在于它具有的平均孔隙尺寸在1μm和10mm之间，优选地在1μm和5mm之间，更优选地在1μm和2mm之间，甚至更优选地在5μm和500μm之间。

在一种实施方式中，支架的特征在于支架的孔隙体积/孔隙的壁厚比至少为5，优选地大于10。

在一种实施方式中，支架的特征在于水合和脱水状态之间的可逆压缩性体积比在1.2和50之间，优选地在2至15之间。

在一种实施方式中，支架的特征在于水合和干燥状态之间的可逆压缩性体积比在2和1000之间。

在一种实施方式中，支架的特征在于支架的干物质含量的总质量在0.1％和10％之间，优选地在0.5％和3％之间。

在一种实施方式中，支架的特征在于它能够通过注射器针头流动和注射。

在一种实施方式中，支架的特征在于它包括在其中和/或在其上的活性化合物。

附图说明

在附图中

图1示出了使用3D打印方法来创建由两种不同材料和水(作为牺牲材料)制成的3D结构支架的本发明的方法的实施方式；

图2示出了使用如图1中的3D打印方法的本发明的方法的类似实施方式，其中通过使用水盒中的水来打印3D支架中的空隙；

图3描绘了由不同孔隙尺寸的低温凝胶的区域组成的示例性圆柱形支架。外部区域以及中心导管内衬区域例如在-20℃下进行低温凝胶化，并显示出大于细胞尺寸的平均孔隙尺寸。另一方面，圆柱体壁的内部区域在降低的温度(诸如例如-80℃)下进行低温凝胶化，得到减小的孔隙尺寸；

图4A示出了在-20℃(右)和-80℃(左)下聚合的水凝胶的并置层的显微照片；图4B示出了所获得的低温凝胶的平均孔隙尺寸的量化结果和细胞尺寸范围的指示；

图5A示出了多层单块低温凝胶支架的显微照片，其中一层在其它层上地增材生产层，且不同的孔隙尺寸基于所选择的冻结温度；图5B示出了包括小尺寸孔隙的区间的屏障活性的效率，限定对于每个层在每mm³支架上接种的细胞数量的量化；

图6示意性地描绘了可设想的细胞接种策略的一种实施方式，其中圆柱形多层低温凝胶支架按顺序地在每个可进入的层中接种细胞；

图7示出了本发明的不同形状的低温凝胶支架；

图8描绘了本发明的低温凝胶支架的设计策略，其中存在许多区间或区域或灌注通路。区间特异性细胞接种通过细胞浸透区和细胞非浸透(小孔)区的差别来实现。在因而分开的每个区间中，在通过灌注或抽吸接种之后，因此建立了限定的且先前的不同的细胞群；

图9示出了根据本发明的低温凝胶支架的放大图，包括由内置的中间薄层分开的两个层，该内置的中间薄层充当聚合物低温凝胶层之间的机械稳定的连接。

具体实施方式

通过参考以下关于所附附图呈现的详细描述可以更容易地理解本公开，其构成本公开的一部分。应理解的是，本公开并不局限于本文所述的和/或示出的特定条件或参数，且本文使用的术语是仅通过举例的方式出于描述特定实施方式的目的，而并不旨在限制所要求保护的本发明。

除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”及“所述/该”可以包括复数指示物。因此，例如，提及“盒”包括多个这样的盒，且提及“区间”包括指代一个或多个区间，等等。

此外，除非另有说明，否则使用“或”意为“和/或”。类似地，“包含”、“包含”、“包含”、“包括”、“包括”和“包括”是可互换的，且不旨在限制。还需要理解的是，当对各种实施方式的描述使用术语“包括”时，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以替代地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”来描述实施方式。

本发明提供了一种生产基于低温凝胶的多区间三维支架的方法。与其它大孔形成技术相比，用于在组织工程学和再生医学领域中的用途的低温凝胶由于其固有的相互连接的大孔结构和形成容易而受到越来越多的关注。低温凝胶化是一种简单的方法，其避免了去除致孔剂的需要，并形成内在互相连接的支架。低温凝胶，典型地在低于溶剂(通常是水，尽管来自适当单体的低温凝胶也可以使用有机溶剂制成)的冻结点的温度下形成的海绵状大孔水凝胶，通过使用冻结的溶剂晶体作为相互连接的致孔剂来避免诸如细胞毒性的问题。只需将低温凝胶保持在高于溶剂冻结点的温度下即可实现致孔剂去除。通常，将凝胶溶液冷却到低于冻结点。在这些温度下，大比例的溶剂结晶；然而，部分凝胶溶液保持其液体形式。随着溶剂结晶，水凝胶组分浓缩于液体微相中，而不是保存在结晶的宏观相中。水凝胶单体、低聚物或聚合物的浓缩被称为低温浓缩，且加速凝胶形成的速度。在合适的凝胶化期之后，将低温凝胶恢复到室温。随着溶剂晶体融化，水合网络，形成了相互连接的大孔水凝胶结构。对于组织工程学应用，期望水凝胶内的孔隙是高度互连的，以允许细胞的迁移和增殖，并限制不可进入的区域。孔隙相互连接的必要性凸显了低温凝胶技术相对于其它孔形成技术的显著优势，因为低温凝胶是固有地高度相互连接的(开孔型凝胶)。在溶剂结晶过程中，溶剂晶体生长直到前缘与另一晶体前沿接触，得到高度相互连接的多孔凝胶。

与例如通过相分离获得的常规的大孔水凝胶相比，低温凝胶的优点是其高的机械稳定性。它们非常坚韧并能承受高度的变形，主要是压缩，但也有一些拉伸和扭转；特别是它们能在机械力的作用下被挤压以排出其溶剂含量。

在低温凝胶在组织工程学和作为细胞支撑结构中的应用中，天然存在的材料诸如壳聚糖、海藻酸盐、明胶和胶原由于其生物相容性且存在充分记载的交联方法因而受到了关注。在一些生物相关应用中，包括生物分离、生物催化、色谱、单层细胞增殖以及最近的再生医学，低温凝胶已经并将继续得到研究。低温凝胶支架具有在从软骨到神经组织修复的广泛的组织工程学应用中得到利用的潜力。由于聚合物的低温浓缩，低温凝胶产生了非常坚固的多孔海绵状凝胶，这使得它们成为用于例如软骨和非承重骨骼应用的合适的支架。因此，低温凝胶支架具有用于广泛的组织工程学应用的潜力。

本发明的方法包括以下步骤：

a)在保持于零下温度的冷冻支撑物上提供第一冻结聚合物层；

b)通过可能地调节冷冻支撑物的零下温度，提供随后的聚合物层以获得聚合物层堆叠；

c)任选地在零下温度下温育最终的聚合物结构；以及

d)将所产生的低温凝胶置于高于0℃的温度下

该方法的特征在于每个随后的层：

i)在前一个层冻结之后沉积在前一个层上；

ii)在前一个层完全聚合之前沉积在前一个层上；

iii)以高于之前沉积的层的冻结温度的温度沉积。

在一种实施方式中，步骤b)通过对至少一种聚合物材料的至少一种液体前体进行铸造和成型、3D打印、丝网印刷或光聚合以及上述的组合来执行。

在一种实施方式中，步骤a)被以下步骤代替：

a')将至少一种聚合物材料的至少一种液体前体沉积在保持于零下温度的冷冻支撑物上以形成第一聚合物层；以及

a")允许所述第一聚合物层冻结以形成第一冻结聚合物层。

根据本发明的生产支架的方法，尤其还涉及使用3D打印方法。3D打印作为复杂的组织制造技术正在兴起，并提供了很高的精度来控制支架的内部构造，并打印出在构造上与天然组织接近的复杂结构。基于计算机辅助设计(CAD)模型，3D打印机可以以逐层的方式制造预先设计的患者特异性组织结构。此外，可以获得患者组织或缺陷的无创成像技术并用于为CAD设计提供信息，这将允许支架成为特定尺寸的植入物，完美地适合缺陷部位。

3D打印和快速成型工艺已被用于创建具有用户定义的微结构和微尺度构造的3D支架，允许在几乎任意的几何形状下完全控制孔隙和壁材的分布和尺寸。这确保可以实现大量更复杂的、预先设计的构造模式和结构。无论是硬组织还是软组织，相互连接的孔隙、微观尺度上的特定孔隙结构以及相互连接对于支架设计都是非常重要的。复杂的层次化结构是一种难以复制的结构，而且使用其它常见的支架制造技术更加难控制。随着3D打印的应用，不仅可以由强大坚固材料的先进工作创造精细复杂的结构，还可以创造出可以与任何期望的构造令人信服地相匹配的高度有序的结构。

然而，所有的3D打印过程都有优势和弊端。所选择的用于应用的3D打印机的类型通常取决于待使用的材料以及成品中的层是如何结合的。医学应用中最常使用的三种3D打印技术是选择性激光烧结(SLS)、热喷墨(TIJ)打印和熔融沉积成型(FDM)。这些***的主要特点是它们能够打印载满细胞的凝胶以产生可行的和功能性的支架。打印机利用气动加压***从包括所选生物材料的“生物墨”盒中挤出材料。使用这些***的弊端通常是来自不同尺寸的喷嘴的剪切应力，这可能负面地影响打印过程期间细胞的活性，需要经常添加合成聚合物来改善天然聚合物的机械特性(与可能的生物相容性或安全性问题)，需要包括其它制造步骤，诸如向3D打印添加静电纺丝，以及高温，其有杀死细胞、使生物材料变性/改变以及阻碍所需支架构造的正确形成的风险。例如，可以应用于FDM工艺的生物材料类型通常局限于热塑性或热稳定性材料。常规FDM工艺中的高温可导致聚合物链断裂和降解，且支架容易损失机械强度。

Yen H.J.和他的同事开发了基于非加热过程的被称为液体冷冻沉积制造(LFDM)的方法(Tissue Eng Part A.2009 May；15(5):965-75)，其允许处理许多容易热水解的聚合物。通过输出喷嘴喷射的材料在低温平台上冻结并逐层沉积，以形成为所设计形状的精密结构。然而，该***和方法不能微调所形成的支架的孔隙度。

鉴于所有这些缺点，在一方面本发明涉及用于创建3D生物启发的支架的新方法，该支架用于例如组织工程学、美容或移植装置，具有优异的功能特性和生物相容性。该方法允许获得非常复杂的形状和体积，包括限定结构内部的孔隙和空隙，并使用不同的打印条件或材料组织细胞生长。例如，这可以用于在支架内创建孔以有利于支架灌注，或者促进并增加血管化从支架内宿主的迁移，或给出关于目标应用的特定的3D形状。该构造方法也可用于对现有对象上的支架形成图案，例如在微电极阵列、隐形眼镜或其它医疗装置上的。3D打印方法特别适合于打印低温凝胶，并利用其相互连接的孔隙度和可注射性的优势来创建3D结构对象。

在该实施方式中，本发明的方法涉及3D打印多区间基于低温凝胶的支架，包括以下步骤：

a)在计算机上获得三维支架的基于软件的3D模型；

b)将所述计算机与具有至少一个生物材料类墨盒和水盒的3D打印机可操作地连接；

c)通过将盒的内容物分配到保持于零下温度的冷冻支撑物上来根据基于软件的3D模型打印低温凝胶的层。

d)通过可能地调节冷冻支撑物的零下温度，重复步骤c)多次以获得层堆叠；以及

e)在零下温度下经过任选的温育期之后完成聚合，将产生的低温凝胶置于高于0℃的温度下

该方法的特征在于每个随后的层：

i)在前一个层冻结之后沉积在前一个层上；

ii)在前一个层完全聚合之前沉积在前一个层上；以及

iii)以高于之前沉积的层的冻结温度的温度沉积。

本方法的主要优势在于可以通过随着时间、沿支撑物本身或甚至两者调节在其上注射支架材料的冷冻支撑物的温度来控制孔的尺寸，这又提供了机会以在支架内创建充当物理“屏障”的具有例如不同的细胞群/活性分子的多个被限定的区间。所述温度通常在-20℃和-200℃之间，优选地在-20℃和-80℃之间。

如本文所用，“区间”是支架的一部分，具有结构和/或机械特性，其适于使用时发挥功能活性。一般来说，区间是支架的一部分，具有均匀的孔隙度和/或均匀的孔隙尺寸，优选地沿其整个体积。这些结构特性又反映了一旦例如支架如前所述在体内、离体或在体外用于组织工程学方法时，区间的机械行为就转化为功能性特点。由于本发明方法的增材制造方法利用温度变化来改变支架内的孔隙度和/或孔隙尺寸，因此获得包括多个区间的低温凝胶变得特别容易和便利。在非限制性示例性实施方式中，支架包括与大孔区间分开的小孔区间，其中平均大孔直径与小孔直径的比至少为2，优选地至少为5。例如，小孔区间可具有的平均孔隙尺寸在10和50μm之间，而大孔区间可具有的平均孔隙尺寸在150和250μm之间。

图1示出了打印方法的示例性方法，用于创建由两种不同材料和水(作为牺牲材料)制成的3D结构支架；该方法的第一步涉及获得人们想要使用的支架的基于软件的3D模型。这可以从数据库中获取，或者通过CAD软件创建，例如基于通过例如非侵入性身体扫描获得的目标器官或组织的部分的数字化图像。在与可商购的3D打印机可操作地连接的计算机上运行基于软件的3D模型，该3D打印机是改良后的使得打印平台带有至少两个但在一些实施方式中带有多个喷嘴，每个喷嘴均与盒连接，按顺序使用以创建3D支架的不同部分。至少一个盒包括水或水溶液，并且至少一个盒包括生物材料类墨，生物材料类墨包括例如天然聚合物材料(诸如细胞外基质衍生的聚合物材料)、合成聚合物材料或其组合。在一种实施方式中，生物材料类墨不包括任何交联剂。一旦开始运行，3D打印机就开始根据基于软件的3D模型打印低温凝胶，其中所述低温凝胶打印在保持于零下温度下的冷冻支撑物上，例如使用Peltier***。事实上，对于低于0℃的温度，会发生低温凝胶化过程(零下温度下的水凝胶聚合，使用冰晶来限定孔隙空间)。此外，在优选的实施方式中，3D打印机的冷冻支撑物的温度由运行3D支架的基于软件的3D模型的计算机，并根据所述3D模型控制和调节。由于孔隙尺寸取决于用于低温凝胶化的温度，因此温度控制允许限定具有不同孔隙尺寸的对象的部分，并且该性质可以用于例如限定细胞的粘附区域和非粘附区域。在一种实施方式中，冷冻支撑物是平板、腔室或储库。

在主要应用中，与低温凝胶化过程相容的水凝胶，诸如例如海藻酸盐、纤维素、丙烯酸盐或胶原，被用于在3D对象中创建相互连接的多孔区域。其它材料可以与这些并置以在3D对象中限定机械上更坚固的区域，或者在3D结构中限定将是空隙的空间(“牺牲材料”)。构造这些空隙以在支架内创建例如流体路径，或者例如引导将包括在其中的灌注***的管状元件。在该方法的优选实施方式中，通过使用水盒中的水打印3D支架中的空隙(图2)。事实上，打印低温凝胶的另一优势是可以仅用水作为牺牲层来创建3D空隙空间：通过在零下温度下打印水，可创建冰3D结构，其会在融化后消失，这就留下空隙空间。可用作牺牲材料的其它材料有例如蔗糖溶液、PLGA或PLA，或甚至pluronics F127，以及具有温度相关的水溶性的其它材料。

通过使用不同的组合物或冷冻温度产生不同的支架区域，可以获得对于不同细胞类型有粘附差异的结构化3D支架。参考图3，示出了由具有不同孔隙尺寸的低温凝胶的区域组成的圆柱形支架。外部区域例如在-20℃下进行低温凝胶化，并显示出大于细胞尺寸的平均孔隙尺寸。另一方面，内部区域在降低的温度(诸如例如-80℃)下进行低温凝胶化，得到减小的孔隙尺寸。该区域构成支架内细胞穿透的屏障。通过从该屏障的两侧接种细胞，可以组织不同细胞类型在3D支架的特定区域中的重新分配，例如从而复制在诸如肺、肾和肝的许多代谢内部器官中存在的上皮/脉管***功能结构。

通过精细地调节上述参数，并特别是冻结温度，可以获得有不同孔隙度或者孔隙度呈线性变化的更多支架区域。图4A中概述了该方面，示出了在-20℃(右)和-80℃(左)下聚合的水凝胶的并置的层。图4B示出了所获得的低温凝胶的平均孔隙尺寸的量化结果和细胞尺寸范围的指示。在根据本发明的优选实施方式中，生物材料类墨的每个层在前一打印层部分或完全聚合之前分配。替代地或额外地，可以使用非化学计量的二元聚合混合物来提供远远超过主要聚合的终止的官能团。在一种实施方式中，随时间调节冷冻支撑物的温度以便每个层限定一个支架区间。替代地或额外地，在一种实施方式中随时间调节冷冻支撑物的温度以便每个层可以限定多于一个支架区间。替代地或额外地，在一种实施方式中沿着支撑物调节冷冻支撑物的温度以便每个层可以限定多于一个支架区间。这些不同的设置允许用单个程序来生产具有特定特点的多种多样的支架。据了解层本身可以是图案化的(不同位置处不同墨，不同位置处不同制造温度，无墨的位置，不同位置处不同生物活性添加剂或粘附分子，有不同冻结温度的墨，在以凝胶态沉积时聚合已经完成了的墨，等等)。为了获得具有不同结构/机械特性的区间，冷冻支撑物的温度调节可以例如通过10℃的步长来实现。这可以例如通过按步长(例如10℃的步长)、通过连续调节温度或使用预定义的一组温度水平(例如-20℃和-80℃)来增加或降低冷冻支撑物的温度来实现。

一些层或一些层的部分可以高于其冻结温度沉积和聚合，以提供有减少的孔隙度的部分，和/或根据所用的化学，减少与相邻部分的粘附。

在制造步骤之后，通常(但不必需)是低温温育步骤，将低温凝胶支架放置在大于0℃的温度下。水凝胶部分中的微观冰晶和牺牲的宏观冰晶部分融化并限定了微观和宏观尺度的空隙空间，可用于增强3D对象中的扩散和流动。对于细胞培养和组织工程学应用，微观空隙空间用于例如模式化3D对象内的细胞扩散及其附着，或增强人造组织血管化。

正如在其它地方已经概述的，本发明的发明人经过大量研究努力，提出了通过利用与其它凝胶溶液相比低温凝胶中绝对独特的特性的本发明的方法；实际上，由于其固有的特性和制造方法，发明人认识到低温凝胶提供了用简单增材工艺来生产具有功能上和机械上不同的区间的固体支架的可能性。事实上，当将一个层或区间添加(例如，在室温下以液体形式)到另一个之前产生的冷冻区上时，由于两种材料之间的温度差异，前者在后者的接触表面上开始局部融化过程，其通过创建充当打印层之间的机械稳定的连接的中间薄层而诱导了在两个层/区间之间的自发且稳定的融合，如图9所示。如图5A中示例性示出的，可以例如一层在其它层上地增材生产几个低温凝胶层，并且不同的孔隙尺寸基于所选择的冻结温度，其又根据即时需求(例如，必须阻塞/允许通过支架的区间的细胞的尺寸)调整，得到多层、单块支架。在所实行的实施方式中，可以清楚地显示出屏障活性的效率(图5B)，定义了对在每mm³支架上接种的细胞数量的量化。

因此很明显，本发明的另一目的涉及通过所开发的方法获得的基于低温凝胶的多区间三维支架，其特征在于它包括通过内置的中间薄层在层之间机械地连接的层的堆叠(参考图9)。此外，在优选的实施方式中，所获得的支架的特征在于它是可逆可压缩的，使得它在其压缩和释放后一分钟内可恢复高达99％的其形状。在一些实施方式中，内置的中间薄层具有的孔隙度相比于相邻区间的孔隙度更小。

通过同时结合生物材料生产中的先进技术与用于获得可注射的产品的创新的制造方案，所开发的支架处理并解决了基于支架的组织工程学方法的一些主要问题，并且其可以提供瞬时短期膨化效应而同时诱导对受损组织(特别是难以接近的受损组织)的长期功能性修复。所获得的材料在尤其是1)可压缩性和可注射性，特别是用于微创外科手术的针头可注射性；以及2)对宿主组织的生物相容性、无菌性和生理适应性方面具有优化的特性。

为了清楚起见，下文将提供一些定义。如本文所用，“支架”是具有框架构造，即包括在其内部的中空空间的支撑结构的任何三维材料。在优选的实施方式中，支架是能够在体内或离体支撑三维身体组织/器官形成的人工结构。在此背景下，支架也因此被称为“生物材料”或“生物支架”。在此实施方式中，支架可认为是细胞连接或附着在其上或其中的物理结构(包括可生物降解的和/或永久性材料)。生物支架允许细胞附着和迁移，递送并保留细胞和生化因子，能够使重要的细胞营养物质和表达的产物扩散，施加一定的机械和生物影响以修改细胞周期的行为，等等。

构想和制造本发明的支架以充当生物相容的、非致癌的且非免疫原性的膨胀剂。一般目的是开发具有改善的长期效力的膨胀制剂，其一旦植入宿主中后可以刺激宿主细胞浸润并与周围组织结合，因而通过促进应用(例如注射)部位内的生物活性环境而触发新组织形成并得到长期的功能性修复。特别地，本发明的支架优选地基本上由可逆可压缩的凝胶状材料(低温凝胶)构成。所述材料通常(但不完全)是适合于生成软凝胶状结构的聚合物材料。

如本文所用，“聚合物材料”是包括聚合物、大分子(又称高分子)的任何材料，由通过共价键紧密键合在一起的许多重复的较小单位或亚单位(称为单体)组成。如本文所用，术语“凝胶”是指非流体胶质网络或聚合物网络，其通过流体在其整个体积中膨胀。凝胶是固体三维网络，其包括一定体积的液体介质并通过表面张力效应诱捕它。内部网络结构可以由物理键(物理凝胶)或化学键(化学凝胶)形成。

在优选的实施方式中，凝胶状材料是水凝胶。如本文所用，术语“水凝胶”是指其中溶胀剂为水的凝胶。水凝胶是由交联聚合物链的网络构成的高分子聚合物凝胶。它由亲水性单体合成，有时作为胶态凝胶存在，其中水是分散介质。水凝胶是高吸水性(它们可以包含超过90％的水)天然或合成聚合物网络。由于其特性，水凝胶具有典型的坚实而又有弹性的机械性质。水凝胶已被用于生物医学应用，诸如隐形眼镜和伤口敷料。水凝胶的优点之一是其比疏水弹性体和金属更具有生物相容性。这种生物相容性在很大程度上是由于水凝胶的独特特性，因为它们是软的，且像周围组织一样包含水，并相对于周围组织具有相对低的摩擦系数。此外，水凝胶允许水成分和溶质在其中扩散，并对水和水溶性物质(诸如营养物质、代谢物等)具有高渗透性。

(水)凝胶的几种物理性质与浓度有关。(水)凝胶浓度的增加可以改变水凝胶孔隙半径、形态或其对不同分子量蛋白质的渗透性。本领域技术人员将明白，水凝胶的体积或尺寸(长度、宽度和厚度)可以根据用户的需要进行选择，诸如例如在外科手术的框架内水凝胶将被植入的区域或环境。通过改变水凝胶组成(分子链长度、交联度、水含量等)，可以根据应用部位调整材料的机械性质。

用于生产本发明的支架的合适材料的一些非限制性实例包括天然聚合物，诸如多糖、多糖的共聚物(纤维素、琼脂糖、海藻酸盐、淀粉、壳聚糖和许多其它的)、多肽(丝、胶原、明胶和许多其它的)、釉原蛋白(amelogenin)或合成聚合物，诸如聚氨酯、聚烯烃、聚乙二醇(PEG)、聚(乙交酯)(PGA)、聚(L-丙交酯)(PLA)、羧甲基纤维素(CMC)或聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)。低温凝胶支架还可以包括至少一种糖胺聚糖或至少一种蛋白聚糖或这两种物质的混合物。糖胺聚糖可以是例如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素或硫酸角质素。使用不同材料的能力在不同应用中均是有用的，并进一步增加了本文所述的装置和方法的通用性。在任何情况下，只要满足其它基本的机械要求(例如孔隙尺寸、孔隙相互连接等)，基础材料就不受限制。

为了优化本发明的支架的机械性质，并在一些方面优化其再吸收/生物降解速率，在优选的实施方式中，考虑对于实质上构成聚合物材料的大分子，聚合物密度至少为0.1mg/mL。合适的聚合物密度范围取决于例如单体的分子量、单体的性质、交联策略和聚合物的比例。这些参数影响所获得的凝胶的机械性质，并可根据应用进行调整。例如，在本发明的一些实施方式中，使用的生物墨中存在的聚合物含量可以在0.1mg/ml和100mg/ml之间。

关于在宿主中体内应用/植入时载体的降解/再吸收速率，这主要取决于组成它的聚合物材料的物理-化学性质，以及其它因素，诸如聚合物的交联、聚合物浓度、植入到宿主中的部位等。降解/再吸收速率可以通过调整所述物理-化学参数来校准，诸如例如通过聚合物交联(如果存在)、抑制剂分子的使用、通过改变聚合物密度、结晶度和/或其分子量分布、改变材料的孔隙度等。一般来说，支架在体内可以至少部分地并至少在其一些部分是内在地可生物降解的。

如所述，此外支架的孔隙度也很高。在本发明的优选实施方式中，孔隙都是相互连接的以便创建材料的连续的网，其可以充当用于诸如细胞或生物活性剂的元素的合理的物理支撑物，而同时为支架提供其它关键特性，诸如其柔软性、间隙渗流的低阻力、高压缩性、在很宽的水合状态范围内调节毛细管压至恒定水平的突出的能力、易于细胞/组织侵入等。材料的孔隙度优选地在50％和99％之间，允许压缩后液体从孔隙中排出。

在优选的实施方式中，支架的孔隙尺寸在1μm和10mm之间，优选地在1μm和5mm之间，更优选地在1μm和2mm之间，甚至更优选地在5μm和500μm之间。这种范围的孔隙尺寸对于在组织工程学中使用的支架材料是特别便利的，因为例如其足够高以使血管能够通过多孔材料生长。由于孔隙的相互连接，本发明的支架表现为具有不规则形状的三维相互连接且扭曲的聚合物材料片。

此外，限定支架的孔隙边缘的聚合物壁与孔隙本身相比是薄的(孔隙体积/壁厚比至少为5，优选地大于10，更优选地大于20)，从而提供了极好的压缩性质，同时如果需要则在整个压缩和注射过程中保持所接种的细胞的完整性和形态。

在支架的最大水合状态下，总聚合物含量在按干聚合物材料的质量计0.1％和10％之间，优选地在0.5％和3％之间。脱水之后，水从支架中去除且水合水平降低。材料的逐步脱水导致干聚合物含量增加至100％。从水合到脱水状态的可逆压缩性体积比在1.2和50之间，优选地在2至15之间。从水合到干燥状态的可逆压缩性体积比在2和1000之间。

在本公开的框架内，“软”材料是可压缩的、可逆可压缩的、柔性的、弹性的或其任何组合的任何材料。此外，为了在活体中使用，支架还必须是适合医学用途的生物相容的和/或无菌材料。

本发明的低温凝胶还可以具有形状记忆行为。“形状记忆”材料是一种智能材料，其具有从由于例如压缩或拉伸导致的变形状态(临时形状)通过诸如温度变化、水合/脱水、光脉冲、电刺激等的外部刺激(触发)恢复到其原始(永久)形状的能力。形状记忆效应不是固有的性质，意味着聚合物本身不会显示这种效应。形状记忆是聚合物化学、聚合物形态学和特定工艺相结合的结果。通过制造工艺，将聚合物形成其初始的、永久形状。然后，在被称为程序化的过程中，将聚合物样品变形并固定为临时形状。在施加外部刺激之后，聚合物恢复其初始的、永久形状。例如，在压缩或脱水之后，支架保持其结构完整性和形状记忆性质，即，在压缩或脱水后，该组合物在再水合或移除压缩力之后恢复其形状。当必须进行微创手术时，诸如通过空心针将支架注射到受试者的器官/组织中，这样的特性是特别期望的。在根据本发明的优选实施方式中，所获得的低温凝胶在压缩(通过例如脱水)和随后的释放(通过例如再水合)之后，能够非常快地，通常在一分钟或更短的时间内，恢复至99％的其初始形状的高，且甚至高至99.9％。

在制造过程中或之后，支架材料可以用其它元素(诸如例如生物活性分子)进行功能化。可以将所述元素用本领域已知的任何合适的方式涂覆在所获得的支架上或嵌入所获得的支架中，并可以为材料提供其它功能性质，诸如提高/降低的生物降解、物理稳定性、生物活性等。如本文所用，“生物活性分子”以及“(生物)活性化合物”或“治疗剂”，是对活的生物体、组织或细胞产生作用的任何活性剂。本文使用该表达来指代改变、抑制、激活或以其它方式影响生物或化学事件的任何化合物或实体。

本领域技术人员将认识到，可以根据需要使用各种生物活性化合物，前提是在某种实施方式中它们是相容的且在功能上不受低温凝胶方法、打印程序和/或低温的影响。示例性治疗剂包括但不限于小分子、生长因子、蛋白质、肽、酶、抗体或其任何衍生物(诸如例如多价抗体、多特异性抗体、scFv、二价或三价scFv、三抗体、微抗体、纳米抗体、双抗体等)、抗原、核酸序列(例如DNA或RNA)、激素、抗炎剂、抗病毒剂、抗菌剂、细胞因子、癌基因、肿瘤抑制因子、跨膜受体、蛋白受体、血清蛋白、黏附分子、脂质分子、神经递质、形成蛋白、分化因子、止痛剂、有机分子、金属粒子、放射性剂、多糖、基质蛋白和上述的功能片段或衍生物以及其任何组合。本文中“功能片段”意为能够发挥其生理/药理学活性的活性剂的任何部分。例如，抗体的功能片段可以是Fc区域、Fv区域、Fab/F(ab')/F(ab')₂区域等。

可以使用本领域已知的任何合适方法诸如表面吸收、物理固定化，例如使用相变将物质困在支架中等，将生物活性化合物添加到支架材料中。例如，生长因子可以当其在水相或液相中的同时与支架材料组合物混合(例如在包括生物墨的盒内)，并在环境条件(例如pH、温度、离子浓度)改变之后，液体凝胶化或固化，从而困住生物活性物质。替代地，共价偶联，例如使用烷基化剂或酰化剂，被用于在限定构象的支架上提供生物活性物质的稳定、长期的呈现。替代地，可以使用非共价吸附，例如静电的、疏水的、偶极-偶极、氢键结合、物理吸附等。

支架基本上是无细胞的，但它们可以在其生产之后在体外或体内随后接种细胞，特别是如果它们旨在以组织工程学方法移植细胞的情况。细胞接种，在其最简单的实施中，包括将支架置于细胞悬浮液中，并让细胞粘附并定植于支架。在添加细胞悬浮液之前，通过对支架进行部分脱水(压缩)可以大大增强细胞接种过程。在这种情况下，由压缩支架的扩张趋势所产生的吸力将细胞悬浮液吸到支架中，并将细胞深深地接种到支架内。此外，还可以使用外部灌注装置(注射泵、压力驱动流等)来诱导流动穿过支架，并使用这种流动有效地将细胞接种到支架深处。

在所有情况下，支架的孔隙度和细胞黏附性在组织细胞接种中起着至关重要的作用。给定类型的细胞将通过流体流动或者迁移(从长期角度看)仅粘附在它们可以到达的区域，且允许它们附着的区域。孔隙尺寸非常小(与细胞尺寸相当和更小)的区域将充当通过流动(无论是通过外部灌注还是通过由于支架扩张而固有地产生的流动)的细胞接种的完全屏障。这允许限制细胞进入的区域，并从而限定功能接种区间。即使孔隙尺寸超过细胞尺寸，小孔隙尺寸的区域也将充当相对的屏障，因为进入的细胞可接触相对更多的粘附表面。

在存在多个由小孔屏障分隔的区间的情况下，可以将不同细胞群接种到每个区间中。这可以在不同的配置下实现，例如通过移液或注射器注射给定细胞群至每个区间中，或者通过外部施加不同方向上的流动，通过使用例如灌注***，如图6中示意性所示。替代地，可以按顺序使用限制进入不同区间的已知“入口端”的模板。

其它技术，诸如细胞的液滴沉积通过喷墨打印或平行层流可用于选择性接种区间。也可以将技术组合。

不同的细胞类型或组织片段，例如干性的与分化的，和/或在分化、活化、代谢或功能状态方面具有各种表型的，可任选地共存于支架中。支架适用于人们可能想要移植的任何细胞类型或组织片段。这样的细胞包括但不限于各种干细胞群(分化成各种细胞类型的胚胎干细胞)、骨髓或脂肪组织衍生的成体干细胞、间充质干细胞、心脏干细胞、胰腺干细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、***和***、内皮祖细胞、生长晕内皮细胞、树突细胞、造血干细胞、神经干细胞、卫星细胞、侧群细胞。这样的细胞可还包括但不限于分化的细胞群，其包括骨祖细胞和成骨细胞、软骨细胞、皮肤角质形成细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、尿道上皮细胞、成纤维细胞、成肌细胞、成软骨细胞、破骨细胞、肝细胞、胆管细胞、胰岛细胞、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、下丘脑、垂体、卵巢、睾丸、唾液腺细胞、脂肪细胞及其组合。例如，平滑肌细胞和内皮细胞可以用于肌肉或管状支架，例如旨在作为血管、食管、肠道、直肠或输尿管支架的支架；软骨细胞可以用于软骨支架；心肌细胞可以用于心脏支架；肝细胞和胆管细胞可以用于肝支架；成肌细胞可以用于肌肉再生；上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和神经细胞可以用于旨在对包含这些细胞的范围广泛的组织类型的任何一种的起替代或增强的作用的支架。一般而言，本发明的支架可以包括能够参与目标组织或器官的再生、替换或修复的任何细胞群，特别是难以进入的组织或器官，诸如肾、脑、肺或胰腺。

可以通过使用按比例混合的可降解组分制造根据本发明的支架，使得可以控制降解时间，以实现所需的降解速率。替代地，细胞本身有助于降解。例如，支架组合物对由通过接种在支架内的细胞自身分泌的物质的降解是敏感的。

本发明的支架可以组织成各种几何形状(例如珠、球)、龛结构、平面层(例如薄片)、管、贴片、环形物等(图7)，并在一些实施方式中可以包括具有不同结构/功能性质的至少两个区域或区间。例如，在例如同心层中构建多组分支架，每个同心层由不同的物理-化学性质(％聚合物、％聚合物的交联、支架的化学组成、孔隙尺寸和/或构造、孔隙度、存在或不同浓度的生物活性剂等)来表征。每个龛结构可以承载一个或多个细胞群，并对其产生特定的作用，例如促进或抑制特定的细胞功能、增殖、分化、迁移等。例如可以诱导支架中温育的细胞分化或迁移出支架，从而直接影响目标组织，例如受伤的组织部位。这样的构造特别地可用于长期维持细胞群的“干性”，而同时促进子细胞迅速繁殖和适当分化以参与组织再生。

可以通过理性设计和制造工艺获得支架的区间化和功能化，对于每个区间使用不同组合物或组合物的浓度。例如，可以使用标准的封装技术将干细胞群封装在支架内。替代地或额外地，可以在生物支架内由包含不同因素(例如形态产生素、生长因子、粘附配体)的相同材料、不同形式(例如不同的力学性质或孔隙度)的相同材料或提供适当的化学/物理性质的完全不同的材料形成两个不同的区域或区间。可以将支架设计成具有多个区间或区域，其中细胞平行进入并根据其特点(例如尺寸或移动性)分布，连续穿过所有或一些区间，或两者的组合。不同区间甚至可以理解为诱导所包含的细胞在其中通过期间的不同命运(图8)。

例如，支架可以包括通道网络和/或其它结构，其允许以灌注通路的形式将营养物质供应给细胞，并将废物从支架上的细胞中移除。“灌注通路”是一组一个或多个受限的或部分受限的通道，这些通道被配置并布置成引导支架内和/或支架上的流体(液体或气体)流动。在一些实施方式中，灌注通路与一个或多个入口是流体连通的(例如流体连接的)，通过该一个或多个入口将流体供应至灌注通路。在一些实施方式中，灌注通路与一个或多个出口是流体连通的(例如流体连接的)，流体通过该一个或多个出口离开灌注通路。具有不同构造和性质的不同灌注通路可用于控制不同材料到支架的分布模式和时间(图8)。此外，流体可以通过简单的扩散或通过由大气压施加的力进入、流经和/或离开一个或多个灌注通路。

此外，支架可以具有不同的渗透性，允许细胞仅在支架的某些物理区域内移位。例如，通过选择或工程化材料得到较大或较小孔隙尺寸、密度、聚合物交联、刚度、韧性、延展性和/或粘弹性，从而调节支架组合物的渗透性。

再回到低温凝胶，这种特定类型的水凝胶在生物支架制造方面提供了其它优势。在水凝胶中，孔隙尺寸在细胞与支架的粘附和细胞在支架内的穿透中起着重要作用。当平均孔隙尺寸大于细胞尺寸时，细胞可以穿透相互连接的孔隙网络内部并粘附在凝胶纤维上，而当平均孔隙尺寸小于细胞尺寸时，细胞无法穿透支架内部。这种孔隙尺寸的差别可以用于创建3D支架内的细胞的结构。低温凝胶支架内的平均孔隙尺寸可以通过不同参数容易地控制，包括聚合时的冻结温度、预聚物组成或交联开始之后但在凝胶产生之前的温育时间，其中较低温度会导致减小的孔隙尺寸。本发明的发明人观察到，所有这些参数都必须进行研究、调整和甚至动态调节，使得在凝胶聚合之前开始凝结，以便支架具有其关键特性。

许多器官呈现出具有功能性、局部2D上皮区间和确保血液供应的血管区间的微观结构。这种结构的主要实例是肺、肝和肾。上皮的顶端表面与连接到外部世界的通道(即肺的肺泡和气道、肝的胆管以及肾的肾小管和最终的泌尿道)接触，而上皮细胞的基部位于血管结构上。当使用本公开的3D结构化技术时，复制这种一般类型的结构是可能的。例如，需要在两个区间之间制造细胞非通透性屏障，并且两个区间接种一个细胞群，或接种甚至两种不同的细胞类型(或细胞类型的混合)。该结构的总体多孔性质允许高效接种两种不同的细胞供应，每种细胞在其区间中，但抵靠在小孔隙界面。

可以使用本领域已知的各种方法和工具，优选地通过微创手术装置和包括通过使用导管、插管或优选地注射器针头的注射步骤的程序，理想地将支架移植到目标组织上或接近目标组织，引入到身体组织/器官中或身体组织/器官上。

Claims (19)

1.一种生产基于低温凝胶的多区间三维支架的方法，所述方法的特征在于其包括以下步骤：

a)在保持于零下温度的冷冻支撑物上提供第一冻结聚合物层；

b)通过调节所述冷冻支撑物的零下温度，提供随后的聚合物层以获得聚合物层的堆叠；

c)任选地在零下温度下温育最终的聚合物结构；以及

d)将所产生的低温凝胶置于高于0℃的温度下

该方法的特征在于每个随后的层：

i)在前一聚合物层冻结之后沉积在所述前一聚合物层上；

ii)在所述前一聚合物层完全聚合之前沉积在所述前一聚合物层上；以及

iii)以高于之前沉积的层的冻结温度的温度沉积。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤a)的提供第一冻结聚合物层包括以下步骤：

a')将至少一种聚合物材料的至少一种液体前体沉积在保持于零下温度的冷冻支撑物上以形成第一聚合物层；以及

a")允许所述第一聚合物层冻结以形成第一冻结聚合物层。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤b)通过对至少一种聚合物材料的至少一种液体前体进行铸造和成型、3D打印、丝网印刷或光聚合以及上述的组合来执行。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b)通过3D打印执行。

5.根据权利要求4所述的方法，还包括以下步骤：

x)在计算机上获得所述三维支架的基于软件的3D模型；

xx)将所述计算机与具有至少一个生物材料类墨盒和水盒的3D打印机可操作地连接；以及

xxx)通过将盒的内容物分配到保持于零下温度的冷冻支撑物上来根据基于软件的3D模型打印低温凝胶的层。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述3D打印机的冷冻支撑物的温度由运行3D支架的所述基于软件的3D模型的计算机，并根据所述3D模型控制和调节。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，随时间调节所述冷冻支撑物的温度以便每个层能够限定一个或多于一个支架区间。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，沿着所述支撑物调节所述冷冻支撑物的温度以便每个层能够限定多于一个支架区间。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述冷冻支撑物的温度在所述聚合物材料的冻结点和绝对零度之间。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述冷冻支撑物的温度在0°和-200℃之间。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，对于水基聚合物材料，所述冷冻支撑物的温度在-20°和-80℃之间。

12.一种通过根据权利要求1至11所述的方法获得的基于低温凝胶的多区间三维支架，其特征在于，所述支架包括通过内置的中间薄层在层之间机械地连接的层的堆叠。

13.根据权利要求12所述的支架，其特征在于，所述支架具有孔隙度在50％和99％之间的相互连接的孔的网络。

14.根据权利要求12或13所述的支架，其特征在于，所述支架包括与大孔区间分开的小孔区间，其中平均大孔直径与小孔直径的比为至少2。

15.根据权利要求12或13所述的支架，其特征在于，所述支架包括与大孔区间分开的小孔区间，其中平均大孔直径与小孔直径的比为至少5。

16.根据权利要求12或13所述的支架，其特征在于，所述支架的孔隙体积/孔隙的壁厚比至少为5。

17.根据权利要求12或13所述的支架，其特征在于，所述支架的孔隙体积/孔隙的壁厚比大于10。

18.根据权利要求12或13所述的支架，其特征在于，所述支架能够通过注射器针头流动和注射。

19.根据权利要求12或13所述的支架，其特征在于，所述支架包括在其中和/或在其上的活性化合物。

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