CN110177523A - 血管移植物、制造其的方法及包含其的制品 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种制造血管移植物的方法，包括将第一细胞类型的细胞布置于具有纹理化的表面的芯上，其中纹理化的表面包括多个间隔的特征，间隔的特征排布为多个组，间隔的特征的组相对于彼此排布为使得当在第一方向上观察时限定弯曲的路径；使细胞生长以形成初级细胞接种构建体，其中初级细胞接种构建体具有纹理化的内表面，该内表面是芯的纹理化的表面的负像；使初级细胞接种构建体与第二细胞类型接触以形成次级细胞接种构建体；和移除芯产生血管移植物。

Description

血管移植物、制造其的方法及包含其的制品

相关申请的引证

本申请要求2016年11月7日提交的美国临时申请号62/418,402的优先权，其全部内容通过引证结合于本文中。

技术领域

本公开涉及血管移植物、制造其的方法和包含其的制品。

背景技术

临床上可用的小直径血管移植物不具有最佳的移植物引入和治愈所需的足够特性。目前的标准是使用自体血管如隐静脉和胸廓内动脉作为小直径移植物。然而，这种方法受限于可获得性和供体部位发病，并且失败率在10年内保持于约50％。因此，其不是理想的治疗。

合成移植物在大直径(15至35毫米(mm))和中等直径动脉(7至14毫米)中证实是成功的，但在小直径血管(≤6mm)中观察到较差的通畅率(patency rate)，并且使用这些移植物的血管再生通常并不可行。血栓形成和内膜增生是移植物失效的常见原因，这两种原因都是由于缺乏移植物内腔衬里的内皮细胞而发生。感染是移植物失效的另一个常见原因，最常发生于合成移植物和同种异体移植物中。同种异体移植物还具有来自尸体的组织可用性可变的缺点。因此，制造成功地快速重建血管流动，促进内皮化并且不引起免疫反应的小直径血管移植物是期望的。

发明内容

本文公开了一种制造血管移植物的方法，包括将第一细胞类型的细胞布置于具有纹理化表面的芯上，其中纹理化表面包括多个间隔的特征，间隔的特征排布为多个组，间隔的特征的组相对于彼此排布为使得之当沿第一方向观察时限定弯曲的路径；使细胞生长而形成初级细胞接种构建体，其中初级细胞接种构建体具有纹理化的内表面，其是芯的纹理化表面的负像；使初级细胞接种构建体与第二细胞类型接触而形成次级细胞接种构建体；和去除芯而产生血管移植物。

本文还公开了一种血管移植物，包括在其内表面上具有纹理的初级细胞接种构建体，其中纹理包括多个间隔的特征，间隔的特征排布为多个组，间隔的特征的组相对于彼此排布为使得在沿第一方向观察时限定弯曲的路径；和布置于初级细胞接种构建体上的次级细胞接种构建体。

本文还公开了一种使用血管移植物的方法，包括在生物体内布置血管移植物，血管移植物包括在其内表面上具有纹理的初级细胞接种构建体，其中纹理包括多个间隔的特征，间隔的特征排布为多个组，间隔的特征的组相对于彼此排布为使得当沿第一方向观察时限定弯曲的路径；和布置于初级细胞接种构建体上的次级细胞接种构建体，其中次级细胞接种构建体形成于生物的体内。

附图说明

图1描绘了在纹理化的芯上制造血管移植物的方法；

图2(A)描绘了芯的表面上的纹理的一种类型；

图2(B)描绘了芯的表面上的纹理的一种类型；

图2(C)描绘了芯的表面上的纹理的一种类型；

图2(D)描绘了芯的表面上的纹理的一种类型；

图3描绘了对于静态流(static flow)，给定区域内由细胞覆盖的芯的平均面积；和

图4描绘了对于层流，给定区域内由细胞覆盖的芯的平均面积。

具体实施方式

成纤维细胞是一类合成细胞外基质和胶原蛋白而提供动物组织的结构框架(基质)的细胞。

脱细胞化是生物医学工程中用于从其栖息细胞(inhabiting cell)中分离出组织的细胞外基质(ECM)，留下原始组织的ECM支架的过程，其可以用于人工器官和组织再生。

细胞外意指“细胞之外”而非细胞意指“不含细胞”。

本文公开了一种用于合成地制造直径为5mm至35mm的血管移植物的方法。该方法包括在纹理化的芯(在本文中也称为基质)上布置多个细胞，然后将其培养以形成移植物(在本文中也称为构建体)。在一个实施方式中，移植物是由细胞外基质制成的非细胞组织工程化材料。移植物可以包括单层或多层，其中一层设置于另一层的顶上。

细胞培养是细胞在受控条件下，通常在其天然环境之外生长的过程。在实践中，术语“细胞培养”现在是指源自多细胞真核生物的细胞，特别是动物细胞的培养。培养的细胞可以以由芯的纹理决定的图案生长。在示例性实施方式中，待培养的第一层细胞可以是内皮细胞，而第二层可以是平滑肌细胞。成纤维细胞也可以引入该结构中。所有这些细胞都存在于天然血管中并将沉积合适的细胞外基质组分。血管移植物旨在通过使用纹理化的微图案加速该过程以校正由于缺乏内皮化而导致的移植物失效的当前问题。纹理化的微图案被称为微图案，并详述于图2(A)中和描述如下。

本文公开了一种用于产生脱细胞的组织工程化构建体的方法，其中包含生物相容性材料的芯与包含第一细胞类型(例如，上皮细胞，肌肉细胞等)的第一悬浮液接触。第一类型的细胞粘附并覆盖芯，从而形成初级细胞接种构建体。然后将初级细胞接种构建体在适于包含第一细胞类型的组织生长的环境中维持第一生长期，以形成初级组织工程化构建体。在一个实施方式中，第一细胞类型包含上皮细胞。

芯是纹理化的，使得细胞可以在特定方向上生长，并且这有助于增进组织工程化构建体强度，并将图案转移到由初级细胞类型沉积的细胞外基质蛋白上。在另一个实施方式中，可以使初级细胞接种构建体与包含第二细胞类型(例如，上皮细胞，肌细胞，成纤维细胞，巨噬细胞等)的第二悬浮液接触，第二细胞类型粘附并适应初级细胞接种构建体的细胞结构，从而形成多层的细胞接种构建体，其包括初级细胞接种构建体(包含第一细胞类型的细胞)和次级细胞接种构建体(包含第二细胞类型的细胞)。将该次级细胞接种构建体在适于第二细胞类型生长的环境中维持第二生长期，以形成次级组织工程化构建体。第一细胞类型可以与第二细胞类型相同或不同。初级细胞接种构建体和/或次级组织工程化构建体可以根据需要脱细胞。

次级组织工程化构建体的形成可以发生于生物体的内部或外部。当构建体布置于动脉或静脉中时，可以将密封件添加到构建体的外表面，以抑制穿过动脉的体液泄漏。平滑肌细胞，例如成纤维细胞和内皮细胞，用于初级细胞接种构建体或次级组织工程化构建体。当次级组织工程化构建体的形成发生于生物的体内时，芯可以由可生物降解的材料制成。这允许用第二细胞类型接种初级细胞接种构建体，而可生物降解的芯在体内降解。可生物降解的芯在植入体内之前可以部分挖空，而允许灌注生物流体。

该方法的优点在于技术可以与多种细胞类型一起使用，包括干细胞、祖细胞和患者特异的诱导多能干细胞。在一个实施方式中，该步骤可以发生于生物反应器内以重构生理条件，包括体内存在的温度、营养和流动环境。

如上所述，待培养的细胞经由第一悬浮液置于可移除的芯上。芯有时被称为芯轴并且使其外表面纹理化。图1描绘了可移除的芯102，其布置有待培养的细胞104。在一个实施方式中，芯不是多孔的。在另一个实施方式中，芯可以是多孔的。可移除的芯通常由在其表面上完成适当量的细胞生长之后可以移除的材料制造。细胞生长导致形成初级细胞接种构建体(也称为移植物)。芯102具有纹理化的外表面。这种纹理化作为模板以引导初级细胞接种构建体中的细胞生长。一旦出现期望的细胞生长水平，芯102也可以与初级细胞接种构建体分离。芯102可以是一次性芯(即，其仅使用一次然后丢弃)，或可替代地，其是可重复使用的(即，其可以多次使用)。芯的去除优选不损害初级细胞接种构建体。

在另一个实施方式(此处未描述)中，其上布置有初级细胞接种构建体的芯与包含粘附并适应初级细胞接种构建体的细胞结构的第二细胞类型(例如，上皮细胞，肌肉细胞，成纤维细胞，巨噬细胞等)的第二悬浮液接触，从而形成包括初级细胞接种构建体(包含第一细胞类型的细胞)和次级细胞接种构建体(包含第二细胞类型的细胞)的多层细胞接种构建体。该次级细胞接种构建体在适于第二细胞类型生长的环境中维持第二生长期，以形成次级组织工程化构建体。然后可以使次级组织工程化构建体经受脱细胞，之后将其从芯上移除。然后，次级组织工程化构建体可以用于血管移植物中并植入位于生物体内的导管之中或之上。

在一个实施方式中，当芯102是可重复使用的时，其是具有加压流体由其充入而使芯膨胀的入口端口的囊袋的形式。囊袋通常由可以通过加压流体膨胀的弹性体制造。加压流体可以是气体或液体。囊袋的外表面是纹理化的，并且在细胞培养期间可以改变纹理的尺寸(通过改变囊袋膨胀的量)。使用可膨胀的囊袋作为芯还允许制造不同直径的初级细胞接种构建体，或在初级细胞接种构建体开始形成后改变直径。

在将囊袋膨胀至所需水平后，可以使期望的细胞(悬浮液形式)与其接触而促进细胞生长。细胞生长可以在合适的条件下发生于在反应器中。当完成细胞培养并形成初级细胞接种构建体时，从囊袋中移除加压流体，留下可用的移植物，可以将其储存以备将来使用，或可替换地，转移到生物体内。

囊袋也可以可替换地填充有磁流变流体或电流变流体，其可以经受适当的磁场或电场而发生固化。在形成初级细胞接种构建体后，施加的磁场或电场可以反转而使芯变松并移除初级细胞接种构建体。在示例性实施方式中，囊袋在膨胀时具有圆柱形状或锥形部分的形状。

用于芯的合适的弹性体是聚丁二烯、聚异戊二烯、苯乙烯-丁二烯橡胶、聚(苯乙烯)-嵌段-聚(丁二烯)、聚(丙烯腈)-嵌段-聚(苯乙烯)-嵌段-聚(丁二烯)(ABS)、聚氯丁二烯、表氯醇橡胶、聚丙烯酸橡胶、硅酮弹性体(聚硅氧烷)、氟硅酮弹性体、含氟弹性体、全氟弹性体、聚醚嵌段酰胺(PEBA)、氯磺化聚乙烯、乙烯丙烯二烯橡胶(EPR)、乙烯-乙酸乙烯酯弹性体等或它们的组合。示例性的弹性体可以包括具有有限的溶胀性的水凝胶，以促进营养物向细胞培养物的递送。

在另一个实施方式中，芯102可以由在移植物的制造期间不膨胀的固体聚合物块制成。固体嵌段聚合物可以是有机聚合物。芯中使用的有机聚合物可以选自各种热塑性聚合物、热塑性聚合物的共混物、热固性聚合物或热塑性聚合物与热固性聚合物的共混物。有机聚合物也可以是聚合物、共聚物、三元共聚物或包含至少一种前述有机聚合物的组合的共混物。有机聚合物也可以是低聚物、均聚物、共聚物、嵌段共聚物、交替嵌段共聚物、无规聚合物、无规共聚物、无规嵌段共聚物、接枝共聚物、星形嵌段共聚物、树枝状聚合物等或它们的组合。

有机聚合物的实例是聚缩醛、聚烯烃、聚丙烯酸、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚酯、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚芳酯、聚芳砜、聚醚砜、聚苯硫醚、聚氯乙烯、聚砜、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、聚四氟乙烯、聚醚酮、聚醚醚酮、聚醚酮酮、聚苯并噁唑、聚酞酰胺、聚缩醛、聚酐、聚乙烯醚、聚乙烯基硫醚、聚乙烯醇、聚乙烯酮、聚乙烯卤化物、聚乙烯腈、聚乙烯酯、聚磺酸酯、多硫化物、聚硫代酯、聚砜、聚磺酰胺、聚脲、聚磷腈、聚硅氮烷、苯乙烯丙烯腈、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚对苯二甲酸乙二酯、聚对苯二甲酸丁二酯、聚氨酯、聚四氟乙烯、氟化乙烯丙烯、全氟烷氧基乙烯、聚三氟氯乙烯、聚偏二氟乙烯等，或它们的组合。

适用于聚合物组合物的热固性聚合物的实例包括环氧聚合物、不饱和聚酯聚合物、聚酰亚胺聚合物、双马来酰亚胺聚合物、双马来酰亚胺三嗪聚合物、氰酸酯聚合物、乙烯基聚合物、苯并噁嗪聚合物、苯并环丁烯聚合物、丙烯酸、醇酸树脂、苯酚-甲醛聚合物、酚醛树脂(novolac)、可溶酚醛树脂(resole)、三聚氰胺-甲醛聚合物、脲-甲醛聚合物、羟甲基呋喃、异氰酸酯、邻苯二甲酸二烯丙酯、氰脲酸三烯丙酯、异氰脲酸三烯丙酯、不饱和聚酯酰亚胺等，或它们的组合。

热塑性聚合物的共混物的实例包括丙烯腈-丁二烯-苯乙烯/尼龙、聚碳酸酯/丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯/聚氯乙烯、聚苯醚/聚苯乙烯、聚苯醚/尼龙、聚砜/丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚碳酸酯/热塑性聚氨酯、聚碳酸酯/聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯/聚对苯二甲酸丁二醇酯、热塑性弹性体合金、尼龙/弹性体、聚酯/弹性体、聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚对苯二甲酸丁二醇酯、缩醛/弹性体、苯乙烯-马来酸酐/丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚醚醚酮/聚醚砜、聚醚醚酮/聚醚酰亚胺聚乙烯/尼龙、聚乙烯/聚缩醛等。

在芯102中使用的上述聚合物可以在芯中含有通过其可以输送温度控制流体如冷水、液氮、液态二氧化碳的通道。冷却剂可以用于在制造移植物之后收缩芯102的直径。芯直径的减小可以用于从芯102上移除移植物。在一个实施方式中，温度控制流体可以控制温度并且为细胞提供营养。

在另一个实施方式中，芯102可以包含可生物降解的聚合物。可以用于图案或基质的聚合物包括可生物降解的材料。可生物降解聚合物的合适实例有聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸-乙醇酸和聚己内酯的共聚物(PCL-PLGA共聚物)、聚羟基丁酸-戊酸酯(PHBV)、聚原酸酯(POE)、聚氧化乙烯-对苯二甲酸丁二醇酯(PEO-PBTP)、聚-D,L-乳酸-对二氧杂环己酮-聚乙二醇嵌段共聚物(PLA-DX-PEG)等，或包含至少一种前述可生物降解聚合物的组合。制造后的移植物104可以随着芯102生物降解而被移除。虽然本文列出(用于芯)的几种聚合物不是生物相容的，但它们可以通过增加表面的亲水性而具有生物相容性。这可以通过等离子体处理表面、用电子束或X射线处理表面、用水凝胶处理表面等，或它们的组合而实现。

设置于芯102的外表面上的图案或纹理包括多个间隔的特征；特征排列成多个组；特征的组相对于彼此排布为使得在沿第一方向观察时限定弯曲的路径。当在其他方向上观察时，特征的组排布成限定线性路径。多个间隔的特征可以从表面向外突出或突入表面中。在一个实施方式中，多个间隔的特征可以具有与表面相同的化学组成。在另一个实施方式中，多个间隔的特征可以具有与表面不同的化学组成。

在至少一部分表面中，相邻特征之间的平均第一特征间距为1μm至100μm，其中所述多个间隔的特征由周期函数表示。应该注意的是，多个特征的每个特征彼此分开并且彼此不接触。

在另一个实施方式中，纹理的形貌提供1至50，且优选1.5至40的平均粗糙度因数(R)。如上所述，图案通过弯曲的路径与相邻图案分隔。弯曲的路径可以由周期函数表示。对于不同的弯曲路径，周期函数可以不同。在一个实施方式中，图案可以通过弯曲的路径彼此分隔，弯曲的路径可以由两个或多个周期函数表示。周期函数可以包括正弦波。在示例性实施方式中，周期函数可以包括两个或多个正弦波。

在另一实施方式中，当多个不同的弯曲的路径分别由多个周期函数表示时，各个周期函数可以由固定的相位差分开。在又一个实施方式中，当多个不同的弯曲路径由多个周期函数表示时，各个周期函数可以由可变的相位差分开。

在一个实施方式中，多个间隔的特征具有基本上平坦的顶表面。在另一个实施方式中，多元件平台层可以设置于表面的一部分上，其中所述平台层的元件之间的间隔距离提供第二特征间隔；当与第一特征间隔相比时，第二特征间隔基本上是不同的。

在一个实施方式中，图案包括布置在所述基础制品上的涂层。换句话说，涂层包括图案并布置于基础制品上。

在一个实施方式中，特征彼此分开，并且平均特征间距为约1纳米至约500微米。形貌在数字上使用至少一个周期函数可表示的；周期函数由基本上位于间隔的特征的多个图案之间的路径表示。

在一个实施方式中，第一特征间距在表面的至少一部分中为0.5微米(μm)至5μm。在另一个实施方式中，第一特征间距在所述表面的至少一部分中为15至60μm。如上所述，周期函数包括两个不同的正弦波。在一个实施方式中，形貌类似于鲨鱼皮(例如，Sharklet)的形貌。在另一个实施方式中，图案包括布置于表面的一部分上的至少一个多元件平台层，其中平台层的元件之间的间隔距离提供第二特征间隔；当与所述第一特征间隔相比时，第二特征间隔基本上不同。

在一个实施方式中，由两个相邻的组共享的特征的数量的总和等于奇数。在另一个实施方式中，由两个相邻的组共享的特征的数量的总和等于偶数。

给定图案中的特征的数量可以是奇数或偶数。在一个实施方式中，如果给定图案中的特征的总数等于奇数，则共享的特征的数量通常等于奇数。在另一实施方式中，如果给定的图案中的特征的总数等于偶数，则给定的图案中的特征的数量等于偶数。纹理或图案可以压印于芯上。

纹理或图案可以包括具有不同几何形状的特征。图2(b)、2(c)和2(d)显示了包括圆形、圆形的部分(例如，半圆，四分之一圆)、三角形等的特征。

在一个实施方式中，重复单元可以与相邻的重复单元组合，使得产生具有由欧几里德数学描述的几何形状的间隔的特征的组合。如图2(c)和2(d)可以看出，各个重复单元可以组合以产生不同的几何形状。例如，在图2(d)中，重复单元可以与单个相邻的重复单元组合以产生菱形几何形状。类似地，3个或更多个相邻的重复单元可以组合而产生菱形，而六个重复单元可以组合而产生六边形。因此，重复单元可以组合而产生其几何形状可以由欧几里德数学描述的结构。

在一个实施方式中，间隔的特征可以具有可以由非欧几里德数学描述的不规则几何形状。非欧几里德数学通常用于描述质量与提升到小数幂(例如，如1.34、2.75、3.53等的小数幂)的间隔的特征的特性尺寸直接成正比的那些结构。通过非欧几里德数学可以描述的几何形状的示例包括分形和其他不规则形状的间隔的特征。

在一个实施方式中，其几何形状可以通过欧几里德数学描述的间隔的特征可以组合而产生其几何形状可以通过非欧几里德数学描述的特征。换句话说，特征的组可以具有膨胀对称性(dilational symmetry)。分形维数可以垂直于特征布置在其上的表面测量，或可以平行于特征布置在其上的表面测量。分形维数在形貌间的间隙之间测量。

在一个实施方式中，分形维数可以具有在平行于特征布置在其上的表面平面中测量的约1.00至约3.00，具体约1.25至约2.25，更具体约1.35至约1.85的小数幂。在另一个实施方式中，分形维数可以具有在垂直于特征布置在其上的表面平面中测量的约1.00至约3.00，具体地约1.25至约2.25，更具体地约1.35至约1.85的小数幂。

在又一个实施方式中，分形维数可以具有在垂直于特征布置在其上的表面平面中测量的约3.00至约4.00，具体约3.25至约3.95，更具体约3.35至约3.85的小数幂。换言之，弯曲的路径或每个特征的表面可以纹理化有与图案的那些类似的特征(尽管尺寸更小)，从而在弯曲的路径本身内产生微弯曲路径和纳米弯曲路径。

在又一个实施方式中，间隔的特征可以在垂直于特征布置在其上的表面的方向上具有多个分形维数。间隔的特征可以排布为在平行于特征布置在其上的表面的方向上具有2个或更多个分形维数，具体地3个或更多个维数，具体地4个或更多个维数。

如下所述，弯曲的路径可以由正弦函数、曲线函数(spline function)、多项式函数等定义。弯曲的路径通常存在于间隔的特征的多个组之间，并有时可以由于特征的存在或两个特征之间的接触而中断。弯曲的路径和间隔的特征之间的交叉的频率可以是周期性的或非周期性的。在一个实施方式中，弯曲的路径可以具有周期性。在另一个实施方式中，弯曲的路径可以是非周期性的。在一个实施方式中，两个或更多个单独的弯曲路径从不相互交叉。

如果在弯曲的路径中充当障碍物的特征被绕过，则弯曲的路径可以具有延伸越过在其上布置图案的表面的整个长度的长度。在两个相邻图案的两个相邻特征之间测量的弯曲的路径的宽度为约10纳米至约500微米，具体地约20纳米至约300微米，具体地约50纳米至约100微米，并且更具体地约100纳米至约10微米。

间隔的特征在它们之间具有线性路径或通道。在一个实施方式中，间隔的特征在它们之间可以具有多个线性路径或多个通道。

间隔的特征可以是周期性的或非周期性的。如上所述，间隔的特征可以具有不同的尺寸(大小)。间隔的特征的平均大小可以是纳米级(例如，它们可以小于100纳米)或大于或等于约100纳米。在一个实施方式中，间隔的特征可以具有1纳米至500微米，具体地约10纳米至约200微米，更具体地约50纳米至约100微米的平均尺寸。

在另一个实施方式中，间隔的特征之间的平均周期性可以为约1纳米至约500微米。在一个实施方式中，间隔的特征之间的周期性可以为约2、5、10、20、50、100或200纳米。在另一个实施方式中，间隔的特征之间的平均周期性可以为约2、5、10、20、50、100或200纳米。在另一个实施方式中，周期性可以为约0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100、200、300、400或450微米。在又一个实施方式中，平均周期性可以为约0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100、200、300、400或450微米。

在一个实施方式中，间隔的特征可以具有1纳米至500微米，具体地约10纳米至约200微米，更具体地约50纳米至约100微米的维度。

在一个实施方式中，图案的每个特征具有至少一个具有不同的几何形状(例如，大小或形状)的相邻特征。图案的特征是单个元件。图案的每个特征具有至少2个，3个，4个，5个或6个与该特征具有不同的几何形状的相邻特征。在一个实施方式中，存在形成图案的至少2种或更多种不同的特征。在另一个实施方式中，存在形成图案的至少3种或更多种不同的特征。在又一个实施方式中，存在形成图案的至少4个或更多种不同的特征。在又一个实施方式中，存在形成图案的至少5种或更多种不同的特征。

在另一个实施方式中，每个图案具有至少一个或多个具有不同尺寸或形状的相邻图案。换言之，第一图案可以具有虽然包含与第一图案相同的特征但可以具有与第一图案不同形状的第二相邻图案。在又一个实施方式中，每个图案具有至少两个或更多个具有不同尺寸或形状的相邻图案。在又一个实施方式中，每个图案具有至少三个或更多个具有不同尺寸或形状的相邻图案。在又一个实施方式中，每个图案具有至少四个或更多个具有不同尺寸或形状的相邻图案。

在一个实施方式中，图案的纵轴XX'平行于芯102的纵轴。这可以在图2A中看出。图案的纵轴XX'是将图案分成两个相等的一半并与图案的0或1元件相交的线。

上文详述的图案化的芯102用于培养血管细胞以形成初级细胞接种构建体。在一个实施方式中，在图案化的芯102的外表面上可以培养多层细胞以形成初级细胞接种构建体。在示例性实施方式中，待培养的第一层细胞可以是内皮细胞，第二层可以是平滑肌细胞。成纤维细胞也可以引入该结构中。所有这些细胞都存在于天然血管中并将沉积合适的细胞外基质组分。该技术可以用于多种细胞类型，包括干细胞、祖细胞和患者特异的诱导多能干细胞。

将细胞培养成血管移植物的步骤通常在生物反应器内进行，以重构生理条件，包括体内存在的温度、营养和流动环境。在细胞生长至聚集，沉积细胞外基质组分和形成组织后，将血管使用“Bioengineered human acellular vessels for dialysis access inpatients with end-stage renal disease:two phase 2 single-arm trials,LawsonJH,Glickman MH,et.al.,2016”中描述方法脱细胞，并且可以使细胞外基质材料交联以保持由芯的表面赋予的微图案结构。如果芯是可生物降解的，则其可以通过将次级组织工程化构建体暴露于加速降解但不破坏非细胞组织结构的溶液而除去。

在一个实施方式中，芯的外表面可以具有布置于其上的水凝胶的薄层。水凝胶可以具有几纳米至几微米的厚度。在一个实施方式中，水凝胶可以具有2至500纳米的厚度。水凝胶可以含有生物标记物以增强细胞生长。生物标记物通常是指某种生物状态或状况的可测量标志。该术语偶尔也用于指代其检测指示生物体存在的物质。

在将水凝胶置于芯的表面上之后，芯可以经受含有第一种细胞类型的悬浮液以形成初级细胞接种构建体，然后经受含有第二细胞类型的第二悬浮液以形成次级细胞接种构建体。然后可以将芯移除，留下血管移植物。然后可以将血管移植物脱细胞并使用。

水凝胶的实例是聚丙烯酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、羟烷基纤维素(羟丙基纤维素，羟乙基纤维素，羟甲基纤维素等)，或它们的组合。

初级细胞接种构建体在其内表面上具有纹理的负像。这种图案在上文详述，并且虽然在下面的后续段落中提供一些额外的细节，但为了简洁起见，不再重复主要细节。换言之，移植物的表面将具有其中间隔的特征之间的平均周期性可以为约1纳米至约500微米的纹理。在一个实施方式中，间隔的特征之间的周期性可以为约2、5、10、20、50、100或200纳米。在另一个实施方式中，间隔的特征之间的平均周期性可以为约2、5、10、20、50、100或200纳米。在另一个实施方式中，周期性可以为约0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100、200、300、400或450微米。在又一个实施方式中，平均周期性可以为约0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50、100、200、300、400或450微米。

在一个实施方式中，间隔的特征可以具有1纳米至500微米，具体地约10纳米至约200微米，更具体地约50纳米至约100微米的尺寸。

在一个实施方式中，图案的每个特征具有至少一个具有不同几何形状(例如，尺寸或形状)的相邻特征。图案的特征是单个元件。图案的每个特征都具有至少2个、3个、4个、5个或6个与该特征具有不同的几何形状的相邻特征。在一个实施方式中，存在形成图案的至少2种或更多种不同的特征。在另一个实施方式中，存在形成图案的至少3种或更多种不同的特征。在又一个实施方式中，存在形成图案的至少4种或更多种不同特征。在又一个实施方式中，存在形成图案的至少5种或更多种不同的特征。

在另一个实施方式中，初级细胞接种构建体中(并且最终在血管移植物中)的每种图案具有至少一个或多个具有不同尺寸或形状的相邻图案。换言之，第一图案可以具有虽然包含与第一图案相同的特征但可以具有与第一图案不同的形状的第二相邻图案。在又一个实施方式中，每个图案具有至少两个或更多个具有不同尺寸或形状的相邻图案。在又一个实施方式中，每个图案具有至少三个或更多个具有不同尺寸或形状的相邻图案。在又一个实施方式中，每个图案具有至少四个或更多个具有不同尺寸或形状的相邻图案。

在又一个实施方式中，纹理的形貌提供1至50的平均粗糙度系数(R)。如上所述，通过弯曲的路径将初级细胞接种构建体中的图案与相邻图案分开。弯曲的路径可以由周期函数表示。对于不同的弯曲路径，周期函数可以是不同的。在一个实施方式中，移植物中的图案可以通过可以由两个或更多个周期函数表示的弯曲路径彼此分开。周期函数可以包括正弦波。在示例性实施方式中，周期函数可以包括两个或更多个正弦波。

在另一实施方式中，当多个不同的弯曲路径分别由多个周期函数表示时，各个周期函数可以由固定的相位差分开。在又一个实施方式中，当多个不同的弯曲的路径分别由多个周期函数表示时，各个周期函数可以由可变的相位差分开。

在一个实施方式中，初级细胞接种构建体中的多个间隔的特征具有基本上平坦的顶表面。在另一个实施方式中，多元件平台层可以布置于表面的一部分上，其中所述平台层的元件之间的间隔距离提供第二特征间隔；当与第一特征间隔相比时，第二特征间隔基本上不同。

取决于产生的组织工程构建体的预期功能，许多不同的细胞类型或其组合可以用于制造初级细胞接种构建体。初级细胞接种构建体的脱细胞可以在移除芯之前或之后进行，以形成基底膜。使用酸、碱处理、离子洗涤剂、非离子洗涤剂、两性离子洗涤剂或它们的组合脱细胞。

通常使用离子洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)，因为其具有高溶解细胞效率而对ECM没有显著损害。洗涤剂有效地溶解细胞膜并使内容物暴露于进一步的降解。在SDS溶解细胞膜后，内切核酸酶和外切酶核酸会降解遗传内容物，而细胞的其他组分被溶解并从基质中洗掉。通常使用SDS，即使其有轻微破坏ECM结构的倾向。碱处理和酸处理可以是SDS处理的有效伴随操作，因为它们能够降解核酸并溶解细胞质内含物。

有用的非离子型洗涤剂是Triton X-100，其由于其能够破坏脂质之间以及脂质和蛋白质之间的相互作用而受欢迎。Triton X-100不破坏蛋白质-蛋白质相互作用，这有利于保持ECM完整。EDTA是一种结合钙的螯合剂，钙是蛋白质相互作用的有用组分。通过使钙不可用，EDTA防止了细胞之间的整合蛋白彼此结合。EDTA通常与胰蛋白酶一起使用，胰蛋白酶是充当蛋白酶切割组织内相邻细胞的整合蛋白之间已存在的结合键。EDTA-胰蛋白酶组合物一起用于对组织脱细胞。

酶也可以用于脱细胞处理，用于破坏核酸之间的结合键和相互作用，通过邻近蛋白使细胞与其他细胞组分相互作用。脂肪酶、嗜热菌蛋白酶、半乳糖苷酶、核酸酶和胰蛋白酶都已用于去除细胞。在用洗涤剂、酸、物理压力等溶解细胞后，内切核酸酶和外切核酸酶可以开始遗传物质的降解。内切酶核酸在序列中间切割脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。内切酶，一种内切核酸酶，产生多个可以进一步降解并从ECM支架中除去的小细胞核碎片。外切核酸酶在DNA序列的末端发挥作用而切割磷酸二酯键并进一步降解核酸序列。

如胰蛋白酶的酶会充当切割蛋白质之间的相互作用的蛋白酶。尽管胰蛋白酶可能对ECM的胶原蛋白和弹性蛋白纤维具有不良影响，但以时间敏感的方式使用其可以控制其可以对细胞外纤维造成的任何潜在损害。分散酶(Dispase)用于防止不期望的细胞聚集，这有利于促进它们与ECM支架的分离。分散酶在薄组织，如肺组织再生中的肺的表面最有效。为了用分散酶成功去除组织的深层细胞，通常在该过程中包括机械搅拌。

仅当ECM支架产品不需要完整的胶原蛋白结构时使用胶原蛋白酶。当需要脱细胞的皮肤移植物时，通常使用脂肪酶。脂肪酶酸通过脱脂质和切割重度脂质化的细胞之间的相互作用而在真皮组织脱细胞中发挥作用。当从细胞表面除去Gal表位抗原时，酶α-半乳糖苷酶是相关的处理。

如上所述，许多不同的细胞类型或它们的组合可以用于制造初级细胞接种构建体，这取决于产生的组织工程化构建体的预期功能。因此，例如，平滑肌细胞和内皮细胞可以用于肌肉、管状组织工程化移植物或构建体(例如，血管，食道，肠，直肠或输尿管构建体)；并且上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和神经细胞可以用于其中存在这些细胞的各种组织的组织工程化构建体。更通常地，可以使用在组织工程化构建体旨在对应的天然组织中存在的任何细胞。另外，可以有利地使用祖细胞，如成肌细胞或干细胞，以在组织工程化构建体中产生其相应的分化细胞类型。

因此，例如，天然动脉由组织化为三层：内膜，中膜和外膜的内皮、平滑肌和成纤维细胞组成。内膜主要由内皮细胞组成，并具有三个部分：内皮，中间层和内部弹性薄层。小动脉的中膜由***的层之间的25至40层圆周布置的平滑肌纤维组成，而静脉中膜包含相对较少(例如，5至20)的平滑肌层。成纤维细胞主要出现于体外的外膜中，并且不是正常内膜或内侧层的主要组分。因此，血管组织工程化构建体将优选地包括这些细胞类型中的每一种。

在一个实施方式中，细胞外基质包含与初级细胞接种构建体的细胞类型不同的细胞类型。在一个实施方式中，细胞外基质包含与初级细胞接种构建体的细胞类型相同的细胞类型。

在初级构建体的形成中，例如内皮细胞可以直接接种至图案化的芯上以产生构建体的腔表面。优选地，使内皮细胞生长第一生长期并沉积细胞外基质蛋白，其将呈现芯上的图案的形状并形成初级组织工程化构建体。然后，可以将例如平滑肌细胞接种到初级细胞接种组织构建体上，使其生长第二生长期以形成次级组织工程化构建体。低百分比的成纤维细胞也可以包括在该次级构建体中以增加获得的构建体的强度。在第二个生长期后，这将产生具有围绕内皮细胞的层的平滑肌细胞层(和可选的成纤维细胞)的次级组织工程构建体。

优选地，细胞由活体供体获得并作为初级细胞系培养。具体地，如果旨在将组织工程化的移植物/构建体植入活的宿主中，细胞优选从预期的宿主或组织相容的供体收获，从而最小化或消除组织排异的可能性。例如，期望的细胞可以从患者的活组织检查中获得。因此，在患者具有冠状动脉搭桥术的情况下，动脉(例如，锁骨下动脉，腋窝，肱动脉，桡动脉，髂骨，尺骨，股骨，前胫骨或后胫骨)或外周静脉(例如，头静脉，贵要静脉，隐静脉，股静脉)可以用于获得动脉平滑肌、内皮细胞和成纤维细胞。可替换地，在患者需要例如肝、胰腺、输尿管、食道、肠、直肠或其他组织工程化植入物的情况下，合适的细胞可以通过这些组织的组织活检而获得。还应该注意的是，尽管不一定是优选的，但可以使用来自不对应于预期的植入物而是在表型上相似的组织或器官的组织活检。例如，源自动脉的平滑肌细胞可以用于产生静脉、食道、肠、直肠、心脏或输尿管组织工程构建体的平滑肌层。

为了从供体获得细胞，可以使用本领域已知的标准活组织检查技术。简言之，通过外科手术取出所需组织，并将组织切碎或均质化，可选地用蛋白酶(例如，胰蛋白酶或胶原蛋白酶)处理，并制备解离的细胞或细胞的小聚集体的悬浮液。可选地，细胞随后可以在标准细胞生长培养基中体外培养，直到获得合适的细胞数量或密度。虽然细胞可以在这种培养物中多次传代，但这种传代通常会导致分化的表型的丧失，并因此优选的是传代次数限于少于5次，或更优选少于3次。最优选地，细胞完全不传代。

可替换地，可以使用源自已经建立的细胞培养系的细胞，其可以在实验室中获得或从商业来源(例如，ATTC，Rockville，Md.)购买。通常地，这种细胞系已经失去一定程度的分化，并因此，它们通常不是优选的。当使用已经建立的细胞系时，胎细胞系或祖细胞系可能是更理想的，因为这种细胞通常更强健。这些细胞也可以在标准细胞生长培养基中体外培养，直至获得合适的细胞数量或密度。

在另一个实施方式中，使用了通过外源遗传序列的引入或内源序列的失活或修饰而遗传操作的细胞。因此，例如，可以引入基因以使细胞产生否则在宿主中不存在或缺失的蛋白质。可替换地，通过接种的细胞的合适遗传操作，可以增强稀有但天然存在的和期望的蛋白质如弹性蛋白的生产。当植入宿主中时，携带这种细胞的组织工程化构建体可以充当在宿主中否则不存在、缺失或不足的蛋白质的生产和递送***。因此，例如，Shayani及其同事(Shayani et al.(1994))和Chen(Chen et al.(1994))将分泌组织纤溶酶原激活子的基因工程化内皮细胞接种于各种合成移植物上，证明了腺病毒介导的基因转移到自体静脉移植物的内皮细胞中作为改进通畅的可能方法的可行性。

可替换地，基因表达的抑制也可以用于修饰接种的细胞和组织构建体的表面上的抗原表达，从而改性宿主的免疫应答而使细胞不被识别为外来物。因此，例如，可以使用不能产生一种或多种MHC蛋白或不能用抗原肽加载MHC分子的细胞来降低组织排异的可能性。在这种情况下，当将非自体组织工程化构建体植入宿主中时，可以不需要免疫抑制。

根据本公开，将哺乳动物细胞从悬浮液接种于多孔基质(例如，初级细胞接种构建体)之上和之内，地方它们优选以相对高的密度均匀分布于整个基质中。优选地，细胞悬浮液包含约1×10⁶至5×10⁷个细胞/mL培养基，优选2×10⁶至2×10⁷个细胞/mL培养基，更优选约5×10⁶个细胞/mL培养基。当然，悬浮液中细胞的最佳浓度可以根据细胞类型、细胞形成聚集体的倾向、细胞类型的生长速率、它们对使用的底物的结合亲和力和使用的底物材料而变化。悬浮液可以在任何生理上可接受的流体中形成，该流体不会破坏细胞或损害其结合能力(例如，标准细胞生长培养基，如补充有10％胎牛血清的DMEM)。

细胞可以通过任何标准方法接种于芯上和芯内。例如，在一个实施方式中，初级细胞接种构建体通过浸入细胞悬浮液中一段固定的时间而接种，并随后从悬浮液中除去初级细胞接种构建体，并洗掉未结合的细胞。可替换地，可以使用注射器或其他无菌递送装置用细胞接种初级细胞接种构建体。在目前优选的实施方式中，将细胞悬浮液滴至初级细胞接种构建体上，并随后在例如旋转容器中旋转初级细胞接种构建体。

例如，用于制备肌肉管状组织工程化构建体(例如，血管构建体)的管状初级细胞接种构建体可以在细胞接种期间或之后围绕其内腔轴旋转以促进细胞均匀分布于底物表面上。在使细胞结合一段时间(可选地将细胞接种的初级细胞接种构建体在生长培养基中温育一段时间)后，可以将细胞接种的初级细胞接种构建体浸入培养基中。

“接种时间”或最初使哺乳动物细胞与底物接触并随后加入培养基之间的时间可以显著变化。接种时间可以为10分钟至超过1小时。然而，在本发明中，特别是当使用本文描述和公开的亲水性合成聚合物底物时，发现显著更短的接种时间，10至30分钟，或更优选约20分钟，产生高密度的单个接种的细胞，并降低了细胞聚集体形成。该接种时间与下面讨论的“生长期”是不同的。

如上所述，本发明的底物可以采用包含多种细胞类型的悬浮液接种。因此，例如，两种或更多种细胞类型(例如，平滑肌细胞和成纤维细胞，或平滑肌细胞和内皮细胞)的混合物可以同时接种于底物上，或可以首先接种一种或多种细胞类型，然后用一种或多种另外的类型接种，之后将细胞接种的基质置于合适的条件下一段生长期。在任一种情况下，这可以认为是单次“接种”，尽管在一个或多个步骤中可以接种几种细胞类型。

因此，如本文使用的，“初级细胞接种构建体”是已经用至少一种细胞类型，但可能多于一种细胞类型进行第一次接种，但尚未维持于合适条件下一段生长期的底物。在第一个生长期期间，初级细胞接种构建体的细胞生长并繁殖以产生其中细胞可能达到或可能尚未达到聚集的“初级组织工程化构建体”。然后这种初级组织工程化构建体可以第二次，再次用一种或多种包含一种或多种细胞类型的悬浮液接种，以形成“次级细胞接种构建体”。在适当条件下将次级细胞接种构建体维持第二生长期(在其间第二次接种的细胞可以生长和繁殖)后，获得的构建体在本文中称为“次级组织工程化构建体”。按照这种方式，可以将几个不同的组织层布置于芯上，之后将芯去除。

因此，例如，血管组织工程化构建体可以通过以下来生产：将平滑肌细胞接种于管状多孔基底的外表面上以形成初级细胞接种构建体，将其保持第一生长期以形成初级组织工程化构建体，并且随后可以在内腔(和可选地外部)表面上用内皮细胞(和可选的成纤维细胞)接种该构建体以形成次级细胞接种构建体，将其在合适的条件下保持第二生长期，而形成次级组织工程化构建体。类似地，根据本发明可以(通过例如将血管组织工程化构建体***到用例如肝细胞接种的更大基底中，而最终形成血管化的肝组织工程化构建体)工程化任何数量的包含各种细胞层或混合物的其他构建体(三元构建体等)。按照这种方式，在从芯上移除之前，可以在构建体上布置几层不同的细胞物质。

在一个实施方式中，初级细胞接种构建体可以由包含内皮细胞的第一细胞类型形成，而次级细胞接种构建体可以由包含内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞中的至少一种的第二细胞类型形成。

在一个实施方式中，脱细胞或未脱细胞的“初级细胞接种构建体”可以移植或植入以替换静脉或动脉的一部分。密封件可以附接到构建体的端部以防止流体泄漏。密封件可以包括在一段时间后降解而没有任何不利影响的可生物降解的材料。现在位于动脉或静脉内的这种构建体在内腔(和可选地外部)表面上接种有内皮细胞(和可选的成纤维细胞)以形成次级细胞接种构建体，其在合适的条件下保持第二个生长期而在静脉或动脉的位置上形成次级组织工程化构建体。在一个实施方式中，次级细胞接种构建体包含含有平滑肌细胞的细胞外基质。基于血管移植物的总体积，细胞外基质构成构建体的大部分体积。

在另一个实施方式中，多层组织工程化构建体的最外层可以适合于移植物的处理和将移植物转移至用于生物体内的装置。因此其对于强健且多用途的多层组织工程化构建体的最外层是期望的。其能够承受20至60℃的高温，并保护其他组织在运输和处理期间免受冲击和损坏。在一个实施方式中，多层构建体的最外层可以包含胶原蛋白、聚乳酸或其组合。

培养中用于培养细胞的合适生长条件和培养基在本领域内是熟知的。细胞培养基通常包含必需营养物，而且也可选地包括可以为具体细胞类型的生长和分化定制的其他成分(例如，生长因子，盐和矿物质)。例如，“标准细胞生长培养基”包括低葡萄糖的达尔伯克氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco's Modified Eagles Medium)(DMEM)，具有110mg/L丙酮酸和谷氨酰胺，补充有10-20％胎牛血清(FBS)或10-20％小牛血清(CS)和100U/ml青霉素。其他标准培养基包括基础伊戈尔培养基(Basal Medium Eagle)、最低必需培养基(MinimalEssential Media)、McCoy 5A培养基等，优选补充如上(可商购自例如JRH Biosciences，Lenexa，Kans.；GIBCO，BRL，Grand Island，NY；Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。

为了在本发明的方法中使用，已经开发出标准细胞生长培养基的若干变体。具体地，当生长平滑肌细胞时，发现应该避免包含链霉素，因为这种常用的抗生素倾向于响应外部施加的物理力，如本发明的脉冲力而抑制期望的表型的发育。此外，为了生长通常产生大量胶原细胞外基质的任何细胞，开发出“增强细胞生长培养基”，其包含如上描述的标准细胞生长培养基，补充有1-10mM，优选5mM HEPES缓冲液；0.01-0.1g/L，优选0.02-0.06g/L维生素C；0.01-0.1g/L，优选0.02-0.06g/L脯氨酸；0.01-0.1g/L，优选0.02-0.06g/L甘氨酸；0.01-0.1g/L，优选0.02-0.06g/L丙氨酸；和0.5-5.0μg/L，优选1.0-3.0μg/L铜盐(例如，CuSO₄)。因为维生素C在37℃下在培养基中具有仅6至8小时的半衰期，优选每天补充维生素C以增强细胞的胶原蛋白合成。此外，过量提供脯氨酸、甘氨酸和丙氨酸以提供足够量的这些氨基酸，用于合成胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白如弹性蛋白。铜离子是弹性蛋白合成的必要辅因子，因此铜离子源(例如，CuSO₄)优选包括于用于生长富弹性蛋白的组织的培养基中。对于内皮细胞的生长，优选使用CS而不是FBS。此外，生长因子如酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)或血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)可以以合适的浓度(即，1-10ng/mL)使用，以增强细胞生长或分化或细胞外基质蛋白的分泌。

细胞在无菌条件下以5至15％，或优选10％CO₂和90％至100％，或优选100％湿度的气氛在细胞来源的物种或预期的宿主的体温下或接近体温(即体温±5℃，优选±2℃)下培养于培养基中。因此，例如，人细胞可以在32至43℃，更优选35至39℃，最优选37℃下培养。细胞活力可以通过本领域已知的标准方法(例如，台盼蓝(trypan blue)排除法)测定，或通过测量细胞对基底的附着和增殖程度进行测定。体外细胞附着和活力的定量评价还可以使用扫描电子显微镜、组织学和根据本领域已知方法引入放射性同位素(例如，3H胸苷)来评价。

为了进一步增强细胞与基底和/或彼此的附着，可以提供各种蛋白或生长因子。例如，可以将胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白提供于基底或生长的构建体以促进细胞附着。因此，在如聚酸酐基底的材料上覆盖胶原蛋白可以提高细胞如肝细胞的附着。类似地，基底或构建体可以用生长因子如AFGF、bFGF、PDGF、TGF-β、VEGF和各种其他血管生成和/或其他可以直接引入底物中或以其他方式与生长细胞接触(例如，通过添加到细胞培养基中)的生物活性化合物浸渍。已经研究了多种生长因子对内皮细胞和平滑肌细胞的促有丝***作用(D'Amore and Smith(1993))。例如，发现aFGF、bFGF、PDGF会刺激平滑肌细胞增殖，而bFGF和VEGF则会刺激主动脉内皮细胞生长。碱性FGF和VEGF也已经证实会结合至内皮下细胞外基质和基底膜，并是有效的血管生成因子(Edelman et al.(1991)；Rogelj etal.(1989))。

将向外科医生提供包装的和无菌的血管移植物。外科医生可以将移植物修剪至适当的长度。通过这种技术可以制造出多种直径的移植物。然后，可以由外科医生将移植物***并通过缝合固定就位。

在一个实施方式中，血管移植物可以加载有可以为移植物提供抗病特性、抗炎特性等的生物活性剂。血管移植物充当载体，并且生物活性剂在植入如动脉或静脉的血管中之后逐渐从血管移植物中释放。在一个实施方式中，血管移植物可以沿其长度切开并布置于血管上以减少由于动脉瘤引起的体积膨胀。

当血管移植物渗透有生物活性剂(即，不共价结合)时，生物活性剂从药物涂层中的释放受扩散控制。通常血管移植物基于血管移植物的总重量包含5至90wt％，优选20至75wt％，更优选30至65wt％的生物活性剂是期望的。

生物活性剂可以作为表面涂层添加到血管移植物中，或可替代地可以分散于血管移植物的细胞外基质中。当使用表面涂层时，生物活性剂的释放是界面控制的。药物涂层可以仅布置于特征的表面上，或可替代地布置于弯曲的路径的表面上。

在血管移植物中可以使用各种类型的生物活性剂。血管移植物可以用于递送治疗和药物生物活性剂，包括镇痛剂、抗心律失常剂、抗菌剂、抗胆碱能剂、抗凝血剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗利尿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、抗炎剂、抗疟剂、抗肿瘤剂、抗促智剂、抗帕金森剂、抗逆转录病毒剂、抗结核剂、镇咳剂、抗溃疡剂、抗病毒剂等，或包含至少一种前述治疗和药物生物活性剂的组合。

其他合适的治疗和药物生物活性剂的实例是抗增殖/抗有丝***剂，包括天然产物如长春花生物碱(例如，长春花碱，长春新碱和长春瑞滨)、紫杉醇、表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxins)(例如，依托泊苷，替尼泊苷)、抗生素(例如，更生霉素，放线菌素D，柔红霉素，多柔比星，青霉素V，青霉素G，氨苄青霉素，阿莫西林，头孢菌素，四环素，强力霉素，米诺环素，地美环素，红霉素，氨基糖苷抗生素，多肽抗生素，制霉菌素，灰黄霉素和伊达比星)、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素、光神霉素和丝裂霉素、酶(L-天冬酰胺酶，其***性代谢L-天冬酰胺并剥夺不具有合成其自身天冬酰胺能力的细胞)、抗血小板剂如G(GP)IIb/IIIa抑制剂和玻连蛋白受体拮抗剂、抗增殖/抗有丝***烷化剂，如氮芥(例如，二氯甲基二乙胺，环磷酰胺和类似物，美法仑，苯丁酸氮芥(chlorambucil))、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(例如，六甲基三聚氰胺和噻替派(thiotepa))、烷基磺酸盐-白消安(busulfan)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和类似物，链脲菌素(streptozocin))、曲秦(trazene)-达康巴嗪(dacarbazinine)(DTIC)、抗增殖/抗有丝***抗代谢物如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如，氟尿嘧啶，氟尿苷，阿糖胞苷)、嘌呤类似物和相关抑制剂(例如，巯基嘌呤，巯鸟嘌呤，喷司他丁和2-氯脱氧腺苷{克拉达滨})、铂配位络合物(例如，顺铂，卡铂)、丙卡巴肼(procarbazine)、羟基脲、米托坦、氨鲁米特(aminoglutethimide)、激素(例如，***)、抗凝血剂(例如，肝素，合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)、纤维蛋白溶解剂(例如，组织纤溶酶原激活剂，链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)、抗转移剂、抗分泌剂(例如，breveldin)、抗炎剂：如肾上腺皮质类固醇(例如，氢化可的松，可的松，氟氢可的松，***，***龙，6α-二甲基强的松龙，曲安西龙，倍他米松和***)、非甾体剂(例如，水杨酸衍生物如阿司匹林，对氨基苯酚衍生物如对乙酰氨基酚，吲哚和茚乙酸(例如，吲哚美辛，舒林酸，依托度酸)、杂芳基乙酸(例如，托美丁，双氯芬酸，酮咯酸)、芳基丙酸(例如，布洛芬和衍生物)、氨茴酸(例如，甲芬那酸，甲氯芬那酸)、烯醇酸(例如，吡罗昔康，替诺昔康，保泰松，oxyphenthatrazone)、萘丁美酮(nabumetone)、金化合物(例如，金诺芬(auranofin)，金硫葡糖(aurothioglucose)，金硫丁二钠(gold sodium thiomalate))、免疫抑制剂(例如，环孢菌素，他克莫司(FK-506)，西罗莫司(例如，雷帕霉素，硫唑嘌呤(azathioprine)，霉酚酸酯(mycophenolate mofetil))、血管生成剂如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管紧张素受体阻断剂、一氧化氮供体、反义寡芯苷酸及其组合、细胞周期抑制剂、mTOR抑制剂和生长因子受体信号转导激酶抑制剂、***、细胞周期蛋白/CDK抑制剂、HMG辅酶还原酶抑制剂(他汀)或蛋白酶抑制剂。生物活性剂还可以包括癌抑制剂。

本文详述的方法是有利的，因为移植物可以取决于用于生长其的支架尺寸而定制成任何直径。Sharklet图案化心轴可以由可生物降解的材料制成，该材料调节为随着将纹理赋予血管移植物的内腔表面的时间而降解，而不需要从图案化的杆上移除。

本文详述的方法和血管移植物通过以下实施例举例说明。

实施例

通过将聚二甲基硅氧烷弹性体(Xiameter RTV-4234-T2，Dow Corning；PDMSe)浇铸到负硅晶片模具上而制成光滑(SM)和微图案化的(+1.7SK2×2，+1.2SK10×5和+1.1SK50×50)样品并将这些表面粘附于硅烷处理的载玻片上。

本文中采用的命名法(例如，+1.7SK2×2)应该解释如下：+1.7表示基础表面上方的纹理的高度，以微米计，而SK指的是在Brennan等人的US 7143709B2和Brennan等人的具有序列号12/550,870的专利申请中描绘和描述的Sharklet图案。在1.7之前的负号(-)表示纹理低于基础表面。SK2×2中的第一个2代表图案中每个特征的宽度，而第二个2代表图案中特征之间的间距，以微米计。

PDMSe样品浇铸为使特征的长轴与载玻片的长轴对齐。用纤连蛋白(15μg/mL)和胶原蛋白(200μg/mL)处理所有样品以促进细胞附着和模拟ECM组成。

使用修改的划伤测试(scratch-wound assay)研究细胞迁移。简言之，沿着样品的中心放置SM PDMSe矩形(3mm×25mm)以产生人工创伤区域。将人冠状动脉内皮细胞(HCAECs；ATCC)以3×10⁴个细胞/cm²接种于整个构造结构上，并维持在完全血管内皮生长培养基(血管细胞基础培养基，2％FBS，5ng/mL rh VEGF，5ng/mL rh EGF，5ng/mL rh FGF，15ng/mL rh IGF-1，10mM L-谷氨酰胺，0.75单位/mL硫酸肝素，1μg/mL氢化可的松，50μg/mL抗坏血酸和50U/mL青霉素/链霉素)中。在～80％聚集时，移除PDMSe矩形以使细胞迁移穿过空的图案化区域。然后将样品保持于完全血管内皮生长培养基中3天进行静态实验(图3)或置于平行板流动室(Glycotech，31-010)中，在其中使其经受5达因/cm²的剪切24小时进行层流实验(图4)。然后，根据厂商的说明书用CellTracker Orange染色样品，并在室温下用4％多聚甲醛固定。拍摄创伤区域的荧光显微镜图像，并使用ImageJ软件计算该区域内细胞覆盖的平均面积。

静态迁移的结果表明，与光滑的相比，所有三种图案均显著改进了细胞迁移(邓奈特检验(Dunnett's Test)，图3)。+10SK50×50微图案导致最高水平的增加的迁移(40％，p＝0.01)。在层流下进行的试验揭示了各种Sharklet微图案的面积覆盖百分比的差异(图4)。与光滑的相比，+1.5SK10×5和+10SK50×50细胞迁移均分别显著增加139％，p＝0.05和181％，p＝0.01。

另外，可以看出在图案的各个特征之间具有较大间距和较大的单个特征宽度的纹理在层流条件下产生比静态生长条件下更大的表面覆盖率。因此，例如，具有3微米或更大，优选5微米或更大，更优选10微米或更大的宽度，以及3微米或更大，优选5微米或更大，更优选10微米或更大的平均特征间隔的特征，与具有3微米或更小，2微米或更小的宽度，以及3微米或更小，优选2微米或更小的平均特征间距的特征相比，在静态和流动生长条件下由于细胞生长而产生更大的表面覆盖率。

用于成功生长细胞物质的各个特征的上限间距为100微米或更小，90微米或更小，80微米或更小，60微米或更小，50微米或更小和30微米或更小，且单个特征宽度为100微米或更小，90微米或更小，80微米或更小，60微米或更小，50微米或更小和30微米或更小。单个特征的高度可以为0.5至15微米，优选2至12微米并优选3至10微米。

应当理解的是，虽然已经结合本发明的优选具体实施方式描述了本发明，但是前面的描述以及实施例旨在举例说明而不是限制本发明的范围。对于本发明所属领域的技术人员地，在本发明范围内的其他方面、优点和修改是显而易见的。

Claims (23)

1.一种制造血管移植物的方法，包括：

在具有纹理化的表面的芯上布置第一细胞类型的细胞，其中所述纹理化的表面包括多个间隔的特征，所述间隔的特征排布为多个组，并且所述间隔的特征的所述组相对于彼此排列为使得在第一方向上观察时限定弯曲的路径；

使所述细胞生长以形成初级细胞接种构建体，其中所述初级细胞接种构建体具有纹理化的内表面，所述纹理化的内表面是所述芯的所述纹理化的表面的负像；

使所述初级细胞接种构建体与第二细胞类型接触以形成次级细胞接种构建体；和

移除所述芯以产生所述血管移植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一细胞类型包括上皮细胞，并且所述第二细胞类型包括平滑肌细胞、上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞或它们的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纹理化的表面包括图案，并且其中所述图案的纵轴平行于所述芯的纵轴。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述芯包括可膨胀的囊袋或可生物降解的聚合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，单个间隔的特征具有大于3微米至小于100微米的宽度，并且其中单个间隔的特征之间的间距大于3微米至小于100微米。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述芯包括工作以传输促进所述芯的体积收缩的温度控制流体的通道。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述间隔的特征的组排布为在第二方向上观察时限定线性路径。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述多个间隔的特征可以从表面向外突出或突入所述表面中。

9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使所述血管移植物脱细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述初级细胞接种构建体和/或所述次级细胞接种构建体包括两层或更多层。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述芯和所述初级细胞接种构建体是生物相容的。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述初级细胞接种构建体和所述次级细胞接种构建体各自包含一种或多种细胞类型。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，初级细胞类型和次级细胞类型彼此不同，并且包括内皮细胞、内皮祖细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、成纤维细胞或它们的组合。

14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一细胞类型和所述第二细胞类型是相同的。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一细胞类型和所述第二细胞类型彼此不同。

16.一种血管移植物，包括：

在其内表面上具有纹理的初级细胞接种构建体，其中所述纹理包括多个间隔的特征，所述间隔的特征排布为多个组，并且所述间隔的特征的所述组相对于彼此排布为使得在第一方向上观察时限定弯曲的路径；和

布置于所述初级细胞接种构建体上的次级细胞接种构建体。

17.根据权利要求16所述的血管移植物，其中，所述初级细胞接种构建体包括两层或更多层。

18.根据权利要求16所述的血管移植物，进一步包含细胞外基质。

19.根据权利要求18所述的血管移植物，其中，所述细胞外基质包含与所述初级细胞接种构建体的细胞类型不同的细胞类型。

20.根据权利要求18所述的血管移植物，其中，所述细胞外基质是非细胞组织工程化材料。

21.根据权利要求16所述的血管移植物，其中，所述血管移植物具有管状的截面区域，其中纹理化的表面包含图案，并且其中所述图案的纵轴平行于所述血管移植物的纵轴。

22.根据权利要求16所述的血管移植物，其中，所述血管移植物包括两层或更多层，并且其中最外层包含水凝胶、胶原蛋白或它们的组合。

23.一种使用血管移植物的方法，所述方法包括：

在生物的体内布置血管移植物，所述血管移植物包括：

在其内表面上具有纹理的初级细胞接种构建体，其中所述纹理包括多个间隔的特征，所述间隔的特征排布为多个组，所述间隔的特征的所述组相对于彼此排布为使得在第一方向上观察时限定弯曲的路径；和

布置于所述初级细胞接种构建体上的次级细胞接种构建体，其中所述次级细胞接种构建体形成在所述生物的体内。