CN110172080B - 乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学免疫学和感染病学领域,特别涉及十一种乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用,所述抗原表位肽分别是由HLA‑A1101、A2402分子限制性的抗原肽,可以特异性地与细胞毒性胸腺依赖性淋巴细胞结合,刺激后者活化、增殖和分化,从而发挥抗乙型肝炎病毒的免疫效应作用;这些抗原肽可以用来制备乙型肝炎病毒感染的治疗性和预防性疫苗,也可以用来制备检测乙型肝炎病毒特异性细胞毒型胸腺依赖性淋巴细胞的检测试剂,在乙型肝炎的预防、治疗和诊断中有着潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫学和感染病学领域,特别涉及十一种乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是最常见感染性疾病之一,严重危及人类的健康。世界卫生组织2015年7月统计数据显示,预计全球1/3的人口感染过HBV,约2.48亿HBV携带者,后期可发展为肝硬化和原发性肝细胞癌。每年约78万HBV感染的患者因疾病进展为肝硬化、肝衰竭或是肝癌而导致死亡。流行病学调查显示在中国大陆地区约8亿人感染过HBV,乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)携带率高达10.34%,即我国目前约有1.2亿人为HBV携带者,占全球慢性感染人数的一半。另外,我国也是一个肝癌大国,约占全球肝癌人数的55%以上。
HBV基因组由不完全双链环状DNA组成,长的为负链,含3020-3320个碱基,短的为正链,含1700-2800个碱基。包括四个开放阅读框(ORF),分别称为C、X、P和S编码区。C区由pre-C和C基因组成,分别由不同的起始密码子调控,在相同的终止密码子处结束,pre-C和C基因共同编码pre-C蛋白,Pre-C蛋白再经过切割加工后形成核心抗原(HBeAg)。S区由S基因、PreS1和PreS2基因组成,由3个不同的起始密码子启动翻译,在同一个终止密码子处终止翻译,分别编码表面抗原(HBsAg)蛋白、PreS1蛋白和PreS2蛋白。P区基因编码的HBV的聚合酶蛋白(HBpol)。X区的基因编码X蛋白(HBx),包含154个氨基酸,是最小的一个开放阅读框。
细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)是介导适应性免疫应答的核心细胞,在抗感染、抗肿瘤以及超敏反应和自身免疫病的发生中起着至关重要的作用,其细胞膜上的T细胞受体(T cell receptor,TCR)能够特异性识别并结合抗原递呈细胞表面MHC I类分子与抗原肽的复合物,即MHC/抗原肽复合体分子。CTL表位是指与MHC I类分子结合的抗原肽,是抗原分子中能被TCR特异性识别的线性片段或空间构象性结构,是引起免疫应答反应的基本抗原单位,在CTL活化过程中扮演着关键角色。
MHC***指主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC),是脊椎动物基因组中一组紧密连锁的基因群,编码表达MHC I类和II类蛋白分子。HLA(human leukocyte antigen)是人类的MHC***,是人体最复杂的基因群,在人群中具有高度多态性。HLA在抗原识别、抗原呈递等机体免疫过程中发挥重要作用,是影响人体免疫反应的主要因素。HLA I类分子主要负责将内源性HBV抗原呈递给CD8+CTL,活化的CTLs通过分泌穿孔素和颗粒酶等使病毒感染的肝细胞凋亡,同时分泌特定的细胞因子抑制HBV的复制。因此,动态监测HBV抗原特异性CD8+T细胞的数量和功能可以准确反映乙肝感染者针对HBV的特异性免疫功能状态。由于不同人的HLA分子型别不同,其对HBV不同抗原的加工、处理和提呈能力也不相同,从而引起不同程度的HBV抗原特异性免疫应答反应。根据乙肝患者不同的HLA分子型别,选择其所提呈的HBV特异性抗原肽,动态监测该HBV抗原肽特异性的CD8+T细胞的数量和功能,对HBV感染者的疾病进程监测、诊断与治疗方案的制定、疗效观察和预后转归的判断等都有重要意义,是实现乙肝精准医学治疗的重要技术手段。同时,利用这些HLA-A分子高亲和力结合的HBV特异性抗原肽,还可以制备多肽疫苗或基因疫苗,预防和治疗HBV感染。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题,提供乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用。
为解决上述问题,本发明的技术方案如下:
乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽,其氨基酸序列为如下所示表位肽序列中的任一种:
由上述的表格可看出,上述序列分别为乙肝病毒核心抗原HBcAg、表面抗原HBsAg、聚合酶蛋白HBpol或X蛋白(HBx)的抗原肽序列,上述序列分别与HLA-A1101、A2402分子呈高亲和力结合,在抗原提呈细胞表面组成MHC/抗原肽复合体分子,与抗原肽特异性CD8+T细胞克隆结合,刺激其活化、增殖和分化,发挥抗乙型肝炎病毒的免疫效应作用。
所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备乙型肝炎多肽疫苗或基因疫苗:将与HLA-A1101、A2402分子呈高亲和力结合的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽制备成乙型肝炎多肽疫苗或基因疫苗。
所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备检测乙型肝炎病毒抗原特异性T细胞的检测制剂或试剂盒:以与HLA-A1101、A2402分子呈高亲和力结合的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽作为试剂,检测乙型肝炎病毒抗原表位肽特异性胸腺依赖性淋巴细胞。
优选地,所述试剂为酶联免疫斑点法试剂、酶联免疫吸附试验试剂、人类白细胞抗原多聚体荧光染色或流式细胞分析法试剂。
所述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽序列可用于制备治疗乙型肝炎的药物。
本发明利用六种在线表位预测数据库虚拟预测两种HLA-A分子限制性的HBV特异性抗原表位肽序列,获得一组能分别与HLA-A1101和A2402分子呈高亲和力结合的HBV特异性抗原表位肽序列,然后通过ELISPOT功能性实验验证了其免疫原性,为制备HBV感染的治疗和预防性疫苗以及研制HBV抗原特异性T细胞检测试剂等提供了特异性抗原肽。
1.选择乙肝病毒核心抗原(HBcAg)、表面抗原(HBsAg)、聚合酶蛋白(HBpol)和X蛋白(HBx)氨基酸序列为靶向序列;
2.选择预测结果获得研究者公认的、具有较高准确性的、常用的六种表位预测数据库:SYFPEITHI、BIMAS、SVMHC、IEDB、NETMHC和EPIJEN预测上述两种HLA-A分子限制性的HBV特异性抗原表位肽序列;
3.根据一定的预测标准,对六个在线表位预测网站的预测结果进行整合分析,获得六个网站预测结果较一致的候选抗原肽序列。
4.通过IFN-γELISPOT细胞功能性实验验证HBV抗原表位肽的免疫原性。
本发明为乙肝病毒核心抗原(HBcAg)、表面抗原(HBsAg)、聚合酶蛋白(HBpol)和X蛋白(HBx)中能分别与HLA-A1101、A2402分子呈高亲和力结合并且具有免疫原性的抗原肽序列;还涉及到以上述抗原肽为基础的乙型肝炎多肽疫苗、基因疫苗、乙型肝炎的治疗与预防方法,以及以上述抗原肽为基础的检测乙型肝炎病毒抗原特异性T细胞的试剂和方法。
相对于现有技术,本发明的优点如下,
经在线虚拟预测和功能性实验验证获得的HLA-A1101、A2402分子限制性的HBV特异性抗原表位肽以前没有被报道过。这些HLA-A分子以前也没有被报道有限制性的HBV抗原肽。因此这些新的抗原表位肽序列将为研制针对乙型肝炎治疗性和预防性多肽疫苗和基因疫苗、设计检测乙型肝炎病毒抗原特异性T细胞的试剂和方法等提供所需的关键抗原组分,即抗原表位肽序列;同时这些抗原表位肽也为针对这些特定HLA-A等位基因的乙型肝炎患者进行个体化检测和精准医疗提供了关键的抗原组分。
附图说明
图1为HLA-A1101分子限制的HBV抗原T细胞表位肽;(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A1101分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图;(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图;(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统计图;
图2为HLA-A2402分子限制的HBV抗原T细胞表位肽;(A)IFN-γELISPOT方法鉴定HLA-A2402分子限制性HBV抗原T细胞表位肽的检测孔、阴性对照孔和阳性对照孔斑点图;(B)检测孔与阴性对照孔斑点数统计图;(C)检测孔与阴性对照孔斑点数比值(P/N)统计图;
图3为两种HLA-A分子交叉限制的抗原肽。
具体实施方式
实施例1:
本发明的HLA-A1101、A2402分子限制性HBV特异性抗原肽,序列通过以下步骤筛选和鉴定:
1在线虚拟预测两种HLA-A分子限制的4种HBV抗原的优势T细胞表位肽
选取4种HBV蛋白:表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)、DNA多聚酶(HBpol)和X蛋白(HBx),通过UniProt全球蛋白资源数据库检索获得其氨基酸序列,选择研究最多的标准序列,其中HBsAg为D3基因型adw的氨基酸序列;再通过SYFPEITHI、BIMAS、SVMHC、IEDB、NETMHC、EPIJEN等六种常用的表位肽预测数据库对HLA-A1101和A2402分子限制的针对上述每种HBV蛋白的T细胞表位肽进行虚拟预测,其中SVMHC数据库包括MHCPEP model和SYFEPITHI model两种预测算法;IEDB数据库包括了ANN、SMM和ARB三种方法,本实验选择其中具有更好统计学意义的ANN和SMM方法。这些表位肽预测数据库网站见表1。
HLA I类分子的抗原结合凹槽两端封闭,接纳的抗原肽长度为8-11个氨基酸残基,其中以9和10个氨基酸最为常见,因此,本实验分别选择9和10个氨基酸长度的多肽作为研究对象。分别将每种HBV蛋白的氨基酸序列输入到预测数据库网站的相应氨基酸序列输入框,再分别选择表位肽的长度为9和10个氨基酸,然后选择特定的HLA-A分子,对HBV抗原的T细胞表位肽进行在线虚拟预测。
表1表位肽预测数据库网站
针对每种HLA-A分子和每种HBV蛋白,将不同数据库预测出的9肽和10肽分别按评分从高到低进行排列,再从中选择至少满足两种以上预测方法评分标准的表位肽作为候选表位肽。每种HLA-A分子,针对每种HBV蛋白,再从候选表位肽中选出评分最高(亲和力最高)的1-4种多肽作为待鉴定表位肽。
2分离HBV慢性感染患者外周血PBMC
取室温保存的新鲜抗凝全血,用无菌PBS适当稀释;将1倍原血体积的人淋巴细胞分离液(达科为生物,深圳)加入15mL离心管;将稀释后的血液缓缓平铺于分离液上,室温离心20min,2500rpm;吸取单个核细胞(PBMCs)层,离心洗涤2次;用无血清培养基(达科为生物,深圳)重悬,细胞计数,调整细胞浓度为2×106/mL备用。
3用IFN-γELISPOT法鉴定HBV抗原T细胞表位肽的免疫原性
首先筛选出对混合肽组有阳性反应的HBV慢性感染者:将每种HLA-A分子限制的针对4种HBV蛋白的待鉴定表位肽混合为一组,每组8-9种表位肽;取预包被抗人IFN-γ抗体的ELISPOT板(达科为生物,深圳),用无血清培养基(200μL/well)活化8min,每孔加入HBV慢性感染者PBMC悬液(100μL/well);然后在检测孔中补加每种HLA-A分子限制的混合肽,混合肽中单种多肽为14μg/mL,在阳性对照孔补加PHA(2.5μg/mL),在阴性对照孔补加与检测孔相同浓度的DMSO多肽溶解液;置37℃,5%CO2培养箱孵育40-48h;按照人IFN-γELISPOT试剂盒说明书裂解并洗去细胞;每孔加入生物素标记的抗人IFN-γ抗体工作液(100μL/well),于37℃孵育1h;洗板后加入酶联亲和素工作液(100μL/well),继续于37℃孵育1h;洗板后加入现配的AEC显色液(100μL/well),室温避光显色20min;用去离子水洗板4-5次以终止显色;将ELISPOT板避光放置,晾干后送深圳达科为生物技术公司自动化扫描计数斑点。若阴性孔斑点数为0-5时,检测孔-阴性对照孔斑点数≧5判定为CTL反应阳性;若阴性对照孔斑点数≧5时,检测孔≧2倍阴性孔斑点数判定为CTL反应阳性。
鉴定单种表位肽的免疫原性:重新收集对混合肽有CTL阳性反应的HBV慢性感染者外周血PBMC,加入上述ELISPOT板中,每个检测孔中补加阳性混合肽中的单种HBV多肽(50μg/mL),同上设置阳性对照孔和阴性对照孔,置37℃,5%CO2培养箱孵育40-48h,同上做ELISPOT检测。CTL反应阳性孔即表示该孔内的待鉴定表位肽具有免疫原性。对该HBV感染者进行HLA-A等位基因分型,结合该表位肽的虚拟亲和力,明确其被哪种HLA-A分子所限制和提呈。
4 HLA-A等位基因分型
选择在表位肽鉴定实验中呈CTL阳性反应的HBV慢性感染者,取200μL抗凝血,利用人全血基因组DNA提取试剂盒(天根生物,北京)提取基因组DNA;采用HLA-A位点特异性引物A1和A3进行PCR,扩增A位点的外显子2、内含子2、外显子3以及部分内含子l和3的DNA序列,产物大小为985bp。扩增条件为:95℃预变性3min;95℃变性15s;62℃退火15s;72℃延伸90s;35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小,并送上海桑尼生物科技公司进行纯化和双向测序。PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技公司。
表2 HLA-A位点特异性的PCR扩增引物
通过Lasergene程序的Seqman软件把外显子2和外显子3的测序结果拼成一条完整的HLA-A重叠序列(Contig),仔细检查双向测序的碱基是否完整一致,找出杂合子的碱基并用兼并碱基代替,例如M表示A和C,R表示A和G,W表示A和T,S表示C和G,Y表示C和T,K表示G和T,最终确定扩增出来的HLA-A等位基因的序列片段。利用Nucleotide BLAST工具,将拼接好的HLA-A碱基序列与数据库中所有HLA-A等位基因的外显子2和外显子3序列进行比对,直到获得完全匹配的基因组合,从而确定HLA-A的等位基因。
表3是通过上述六个在线表位预测网站预测并最终鉴定具有免疫原性的HLA-A1101、A2402限制性HBV抗原T细胞表位肽序列。
表3 HLA-A*1101、A*2402限制性HBV抗原T细胞表位肽的预测验证结果
---:该预测网站没有针对该MHC分子的预测方法;
NS:没有获得该表位的计算数据。
通过IFN-γELISPOT方法从126例HBV慢性感染患者中筛选出11例对HBV混合肽有CTL阳性反应的患者。再重新收集这些患者的PBMC,用ELISPOT法进行单种表位肽免疫原性的验证,然后结合患者的HLA-A等位基因以及表位肽与这些等位基因的虚拟预测亲和力进行综合分析。结果显示:有6种HBV表位肽(P1-P6)能刺激HLA-A*11:01阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图1);有5种HBV表位肽(P7-P11)能刺激HLA-A*24:02阳性患者的PBMC呈现CTL阳性反应(图2)。在每种HLA-A分子限制的HBV表位肽之间,免疫原性存在明显差异。同时,有很多表位肽呈现HLA分子交叉限制性:P7、P8、P9、P10和P11为HLA-A1101和A2402分子交叉限制(图3)。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例,并没有用来限定本发明的保护范围,在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
附:
四种被用来预测抗原表位的乙型肝炎病毒抗原的氨基酸序列如下:
HBsAg(P03138):
序列的分子类型:PRT
科学命名的生物属种;人体乙型肝炎病毒
HBcAg(P03146):
序列的分子类型:PRT
科学命名的生物属种;人体乙型肝炎病毒
HBpol(P03156):
序列的分子类型:PRT
科学命名的生物属种;人体乙型肝炎病毒
HBx(P03165):
序列的分子类型:PRT
科学命名的生物属种;人体乙型肝炎病毒
序列表
<110> 南京大户生物科技有限公司
<120> 乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 389
<212> PRT
<213> 人体乙型肝炎病毒(Human hepatitis B virus)
<400> 1
Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95
Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn
100 105 110
Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
115 120 125
Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Leu
130 135 140
Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro
145 150 155 160
Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu
165 170 175
Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro
180 185 190
Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr
195 200 205
Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser
210 215 220
Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu
225 230 235 240
Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe
245 250 255
Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu
260 265 270
Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met
275 280 285
Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys
290 295 300
Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala
305 310 315 320
Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu
325 330 335
Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr
340 345 350
Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu
355 360 365
Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys
370 375 380
Leu Trp Val Tyr Ile
385
<210> 2
<211> 183
<212> PRT
<213> 人体乙型肝炎病毒(Human hepatitis B virus)
<400> 2
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1 5 10 15
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35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
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130 135 140
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Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
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<212> PRT
<213> 人体乙型肝炎病毒(Human hepatitis B virus)
<400> 3
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Arg Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly
20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val
35 40 45
Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro His Trp Lys Thr Pro Ser Phe Pro
65 70 75 80
Asn Ile His Leu His Gln Asp Ile Ile Lys Lys Cys Glu Gln Phe Val
85 90 95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Gln Leu Ile Met Pro
100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Lys Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly
115 120 125
Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln Thr
130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg
145 150 155 160
Glu Thr Thr His Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu
165 170 175
Gln Asp Leu Gln His Gly Ala Glu Ser Phe His Gln Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Arg Pro Pro Val Gly Ser Ser Leu Gln Ser Lys His Arg
195 200 205
Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gln Ser Gln Gln Gly His Leu Ala Arg Arg
210 215 220
Gln Gln Gly Arg Ser Trp Ser Ile Arg Ala Gly Phe His Pro Thr Ala
225 230 235 240
Arg Arg Pro Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Asn
245 250 255
Phe Ala Ser Lys Ser Ala Ser Cys Leu His Gln Ser Pro Val Arg Lys
260 265 270
Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu Lys His Ser Ser Ser Gly
275 280 285
His Ala Val Glu Phe His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln
290 295 300
Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser
305 310 315 320
Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser Leu Ile Val Asn Leu Leu Glu
325 330 335
Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro
340 345 350
Arg Thr Pro Ser Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn
355 360 365
Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe
370 375 380
Ser Arg Gly Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn
385 390 395 400
Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser
405 410 415
Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala
420 425 430
Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala
435 440 445
Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Leu Asn Asn Gln His Gly Thr Met
450 455 460
Pro Asp Leu His Asp Tyr Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu
465 470 475 480
Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro
485 490 495
Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro
500 505 510
Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg
515 520 525
Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu
530 535 540
Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr
545 550 555 560
Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys
565 570 575
Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr
580 585 590
Gly Ser Leu Pro Gln Glu His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe
595 600 605
Arg Lys Leu Pro Ile Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg
610 615 620
Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr
625 630 635 640
Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe
645 650 655
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660 665 670
Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala
675 680 685
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705 710 715 720
Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn Ile Ile Gly Thr
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Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu
740 745 750
Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr
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785 790 795 800
Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro
805 810 815
Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
820 825 830
<210> 4
<211> 154
<212> PRT
<213> 人体乙型肝炎病毒(Human hepatitis B virus)
<400> 4
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Thr Leu Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Val Pro Thr Asp
35 40 45
His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu
65 70 75 80
Thr Thr Val Asn Ala His Gln Ile Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg
85 90 95
Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe
100 105 110
Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg
115 120 125
Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ala
130 135 140
Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala
145 150
Claims (4)
1.乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽,其特征在于,所述抗原表位肽的氨基酸序列为如下序列:ASPLSSIFSR。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽在制备乙型肝炎多肽疫苗或基因疫苗中的应用。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽在制备检测乙型肝炎病毒抗原特异性T细胞的检测制剂或试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述检测试剂为酶联免疫斑点法试剂、酶联免疫吸附试验试剂、人类白细胞抗原多聚体荧光染色或流式细胞分析法试剂。
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