CN110168369A - 使用maldi-tof质谱法的配体结合测定 - Google Patents

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Abstract

用于配体结合测定的设备，其包括将多个珠与目的样品进行孵育的培养箱，其中多个珠中的每一个珠都包含预定质量的标签和诱饵分子。冲洗器冲洗经孵育的珠，以便除去弱结合的分子同时保留强结合的分子。样品板加载器将经冲洗的珠加载到样品板中，使得多个珠中的相应珠都被加载到多个孔中的相应孔中。喷雾器将基质辅助激光解吸电离(MALDI)基质材料沉积在样品板的表面上，使得多个珠中的每一个珠都暴露于MALDI基质材料。MALDI‑TOF质谱仪接收样品板并对多个孔中的样品进行质谱分析。计算机执行分析质谱的算法。

Description

使用MALDI-TOF质谱法的配体结合测定
本文所使用的章节标题仅用于组织行文目的，不应被理解为以任何方式限制本申请中所描述的主题。
相关申请的交叉引用
本申请是2017年1月5日提交的名称为“使用MALDI-TOF质谱法的配体结合测定”的美国临时专利申请序列号62/442,512的非临时申请。美国临时专利申请序列号62/442,512的全部内容都通过引用并入本文。
背景介绍
主要的研究工作都集中于表征人蛋白质组与其他分子的数百万种相互作用方面。这些分子包括蛋白质、核酸、脂质和代谢物。免疫测定是用于进行该工作的非常重要的工具。预期诸如以下的因素将在未来几年推动免疫测定市场的增长：(1)慢性病和传染病的发病率上升；(2)迅速发展的生物技术和制药业；(3)由于其成本效益和快速作用而在肿瘤学中广泛使用免疫测定；(4)以及不断增长的老年人群。参见例如Genetic and Engineering&Biotechnology News,2016年9月15日,第12页。然而，非常希望有一种广泛使用的显著更快、更灵敏且更便宜的酶联免疫吸附测定(ELISA)的替代性测定。
已将配体结合测定用于测量两个分子之间发生的相互作用，例如蛋白质结合以及反应物相结合的亲和度。更具体地，将配体结合测定用于测试靶分子在已知与受体结合的样品中的存在。已经使用各种检测方法来确定所形成的配体-受体复合物的存在和程度。已知方法包括通过各种荧光检测方法进行的电化学检测。
附图简述
在下面的详细描述中，结合附图更具体地描述了根据优选和示例性实施方案的本教导及其进一步的优点。本领域技术人员将理解，下述附图仅用于说明目的。附图不一定是按比例的，而是通常将重点放在说明教导的原理上。附图并不以任何方式旨在限制申请人的教导的范围。
图1示出了根据本教导的配体结合测定设备的实施方案的方框图，所述设备产生并分析配体结合测定。
图2示出了根据本教导通过MALDI-TOF质谱法产生配体结合测定的方法的实施方案的流程图。
图3A示出了根据本教导的配体结合测定设备的微孔样品板一部分的布局。
图3B示出了图3A中所示的六边形阵列中的一个具体六边形的详细视图。
图4A示出了根据本教导的具有划分区域的样品板的实施方案的布局。
图4B示出了根据本教导的具有划分区域的样品板的另一实施方案的布局。
图5示出了用来将生物素共价连接到目的分子上的市售生物素接头，其用于本教导的配体结合测定方法和设备。
各种实施方案的描述
现在将参考附图中所示的示例性实施方案更详细地描述本教导。尽管结合各种实施方案和实施例描述了本教导，但是并不意味着本教导限于这些实施方案。相反，如本领域技术人员将理解的，本教导包括各种替代、修改和等同方案。能够得到本文教导的本领域普通技术人员将认识到另外的实施、修改和实施方案以及其他使用领域，它们都在本文所述的本公开内容的范围内。
说明书中对“一个实施方案”或“实施方案”的提及意味着所描述的与所述实施方案有关的具体特征、结构或特性都包括在本教导的至少一个实施方案中。在说明书中各处出现的短语“在一个实施方案中”不一定都是指同一实施方案。
应当理解，本教导的方法的各个步骤可按任何顺序和/或同时进行，只要教导仍然可操作。此外应该理解，本教导的设备和方法可以包括任意数量或全部所述的实施方案，只要教导仍然可操作。
本教导的一个方面涉及提供高度多重质谱免疫测定(MSIA)，其可用作被广泛使用的酶联免疫吸附测定(ELISA)的替代。特别地，本教导的设备和方法可用于进行单个细胞的多重检测和表征。与广泛使用的酶联免疫吸附测定相比，使用本教导的高度多重质谱法免疫测定提供结果可以快得多，具有更高的灵敏度和更高的动态范围，产生的成本更低。本教导的设备可以完全自动化，以相对低的成本实现非常高的吞吐量。这些设备的一个特征是：它们可以是无标记的，因为不需要荧光标签。
本教导的方法和设备的一个应用涉及筛选人蛋白质文库来发现患者血清中新的用于临床诊断和免疫疗法的自身免疫抗原和肿瘤抗原。本教导的方法和设备的另一个应用涉及筛选针对特异性蛋白质靶标的合成组合文库来发现新药物。本教导的方法和设备的另一个应用涉及开发具有高效力和最低副作用的药物化合物来辅助新药发现。
更具体地，根据本教导的用于配体结合测定的设备和方法的一些实施方案使用了珠，将所述珠制备成具有预定质量的标签和附接的诱饵分子。在一个实施方案中，珠包括链霉抗生物素蛋白琼脂糖高性能珠，可从GE Healthcare Life Sciences商购获得。一种类型的合适的珠是GEHealthcare Life Sciences产品代码：17-5113-01。这些链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠的标称直径为34μm。将质量标签分子和诱饵分子生物素化并通过链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用结合到珠上。生物素化是将生物素共价连接到蛋白质、核酸或其他分子上的过程。生物素化是快速且特异性的过程。此外，由于生物素的小尺寸(MW＝244.3Da)，进行生物素化不会明显干扰分子的天然功能。
图1示出了根据本教导的配体结合测定设备的一个实施方案的框图100，所述设备产生并分析配体结合测定。配体结合测定设备100将具有预定质量的标签和附接诱饵分子的珠102接收到培养箱104中。在一个实施方案中，珠102包括链霉抗生物素蛋白琼脂糖高性能珠。在该实施方案中，将质量标签分子和诱饵分子生物素化并通过链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用结合到珠102上。将珠102加载到培养箱104中。培养箱104将诱饵分子与目的样品进行孵育，使得诱饵分子与样品中所包含的靶分子强结合。
配体结合测定设备100还包括冲洗经孵育的珠102的冲洗器106。冲洗器106将冲洗液分配到珠上并摇动冲洗液中经孵育的珠102。在一些实施方案中，选择冲洗液的性质，使弱结合的分子从珠102上切割下来，而强结合的分子则保持附着在珠102上。
然后将冲洗过的珠102转移到样品处理器108，其包括样品板加载器110和基质材料点样器112如喷雾器。本领域技术人员将理解，可以使用多种类型的基质材料点样器来喷雾和/或直接施加基质材料。在一些实施方案中，将经孵育并冲洗过的珠置于适于进行MALDI-TOF分析的样品板上。在一个实施方案中，样品板的表面包含多个微孔，其中选择微孔的尺寸使得在任何指定微孔内仅包含一个珠。也就是说，施加到微孔样品板上的珠数量不大于微孔样品板每个区域的微孔数量。结合图3A、3B、4A和4B更详细地描述微孔样品板。在一个实施方案中，微量滴定样品板的微孔的直径和深度均为约40μm的量级。
样品板加载器110将合适液体中的经孵育且冲洗过的珠102的悬浮液施加到样品板的每个期望区域，其中所施加的珠102的数量不大于样品板在该期望区域中可单层铺展的珠的数量。在包括微孔板的一些实施方案中，珠的数量不大于微孔样品板那个区域的微孔数量。在一个实施方案中，通过具有小孔(aperture)的盖子将样品板分成多个区域，这些区域将样品板分隔成具有垫圈(gasket)的预定部分，所述垫圈防止液体在分开的区域之间流动。然后样品板加载器110用振动器摇动样品板，使珠在样品板上以单层展开。此外，在包括微孔板的一些实施方案中，然后样品板加载器110用振动器摇动样品板，使每个珠都稳定在微孔中并最终干燥。
样品处理器108还包括基质材料点样器112，用于将MALDI基质沉积在样品板表面上。在一些设备中，基质材料点样器112可包括喷雾器或等效类型的设备，它用MALDI基质材料产生小液滴。用于喷雾这些极小液滴的一种合适的喷雾器是HTX TM-喷雾器，它可从北卡罗来纳州教堂山(Chapel Hill,NC)的HTX Technologies商购获得。使喷雾在微量滴定样品板上的基质溶液干燥。干燥过程导致链霉抗生物素蛋白-生物素连接键的断裂以及诱饵分子与强结合的靶分子之间非共价键的断裂。所述断裂造成所释放的分子被掺入到基质晶体中。
样品板处理器108还包括转移机构，它将样品板中经孵育并冲洗过的珠102转移到样品质量分析仪114中。样品质量分析仪114包括质谱仪116，例如飞行时间(TOF)质谱仪，如由本申请的受让人Virgin Instruments Corporation所制造的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)TOF质谱仪。MALDI TOF质谱仪的操作是本领域中所公知的。激光电离源生成激光束扫描样品板的表面，产生并记录多孔样品板上每个位置的质谱。
本教导的一个特征是可以使用平移台在两个维度上移动样品板，扫描MALDI-TOF质谱仪116中的激光，在样品板的整个二维表面上电离样品，使得MALDI-TOF质谱仪116能够产生并记录板上每个位置的质谱。
与MALDI TOF质谱仪116接口的处理器118(例如计算机)使用由MALDI TOF质谱仪116所生成的光谱数据来执行算法，从而检测预定质量，产生通过链霉抗生物素蛋白-生物素连接键而最初结合到珠上的分子的质谱。根据本教导的一种方法中，将检测到质量标签的预定质量的质谱相加，产生通过链霉抗生物素蛋白-生物素连接键而最初结合到珠上的分子的质谱，以及结合到诱饵分子上的靶分子的质谱。然后处理器使用质谱来产生配体结合测定。
图2示出了通过根据本教导的MALDI-TOF质谱法100产生配体结合测定的方法200的流程图。同时参考图1相关的所述配体结合测定设备100的实施方案的框图和方法200的流程图，在步骤一202中，提供珠102。在一些实施方案中，珠包括预定质量的标签和附接的诱饵分子。在一个具体实施方案中，珠102包括可从GE Healthcare Life Sciences商购获得的链霉抗生物素蛋白琼脂糖高性能珠。在一些实施方案中，将质量标签分子和诱饵分子生物素化并通过链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用结合到珠上。在另一个具体实施方案中，在生物样品中产生配体结合测定，其中将小份等分亲和珠添加到生物样品中。例如，生物样品可以是适当稀释的人血清。
方法200的步骤二204包括将珠102与目的样品进行孵育。在孵育步骤二204中，诱饵分子强结合样品中所包含的分子。在一个实施方案中，将珠102与目的样品进行孵育包括将样品和珠102以预定的相对液体体积混合在微量滴定板的孔中。摇动品和珠102的混合物以使珠102与样品分子接触。然后，在预定时间之后，使珠102稳定在孔底部并去除上清液。在一个具体实施方案中，将珠102在摇动下孵育30分钟以使得分析物能够结合。
方法200的步骤三206包括冲洗经孵育的珠102。在一个具体实施方案中，通过在微量离心管中离心收集珠102，并在20mM Tris pH 7.3,5mM EDTA,1M NaCl中多次冲洗，然后在不含盐的相同Tris pH 7.3缓冲液中多次冲洗。最后一次冲洗后，将剩余的珠重悬浮在最小体积缓冲液中，该缓冲液也称为载体溶剂。
在冲洗过程中，除去弱结合的分子，同时保留强结合的分子。在根据本教导的一种方法中，步骤三206包括将冲洗液添加到微量滴定板中的孔中，然后摇动微量滴定板，使珠与冲洗液相互作用。在根据本教导的一些方法中，选择冲洗液使冲洗步骤将弱结合的分子从珠上切割下来，而强结合的分子则保持附着在珠上。
方法200的步骤四208包括将经孵育并冲洗过的珠102加载到样品板中。在一些方法中，样品板包括具有多个孔的微孔样品板，其中每个孔具有经选择的尺寸，使得孔内仅含有一个珠。在微孔样品板的一个具体实施方案中，孔的直径及其深度都约为40μm的量级。在一些方法中，步骤四208包括将经孵育的珠转移到样品板的表面，使得每个珠102都包含在样品板预定区域的孔中。在根据本教导的一些方法中，加载经孵育并冲洗过的珠102的步骤包括将重悬浮在载体溶剂中的剩余珠102铺展在样品板的明确限定区域上并干燥珠102。
在样品板的一个具体实施方案中，通过具有小孔的盖子将样品板划分多个区域，这些区域将板分隔成具有垫圈的预定部分，所述垫圈防止液体在分开的区域之间流动。使用这些样品板，将珠102在合适液体中的悬浮液施加到每个区域，所施加的珠102的数量受限于样品板那个区域的微孔数量。然后摇动板，使每个珠102都稳定在样品板的微孔中。然后将板干燥。
方法200的步骤五210包括将MALDI基质沉积在样品板表面上。在一些沉积MALDI基质的方法中，从样品板上取下盖子和垫圈，用喷雾设备将MALDI基质溶液施加到样品板表面上。在一些方法中，喷雾设备产生非常小的液滴。在将MALDI基质溶液喷雾在样品板表面上之后，随后使样品板上的基质溶液干燥。干燥过程导致链霉抗生物素蛋白-生物素连接键的断裂以及诱饵分子与强结合的靶分子之间非共价键的断裂。所述断裂造成分子释放，然后被掺入基质晶体中。将施加了MALDI基质材料的加载的样品板安装在MALDI-TOF质谱仪中。
在一些沉积MALDI基质的方法中，将MALDI基质溶液直接沉积在样品板每个区域的表面上并使其干燥。干燥过程导致链霉抗生物素蛋白-生物素连接键的断裂以及诱饵分子与强结合的靶分子之间非共价键的断裂。所述断裂造成分子释放，然后被掺入到基质晶体中。从样品板上取下盖子和垫圈，然后将施加了MALDI基质材料的加载的样品板安装在MALDI-TOF质谱仪中。
方法200的步骤六212包括进行MALDI-TOF质谱分析以产生质谱。通过在样品板表面上扫描激光束以产生质谱来进行MALDI-TOF质谱分析。在一些方法中，移动样品板以使激光束扫过样品板的表面，从样品板上的每个位置或像素都产生质谱。在一些实施方案中，从样品板中的每个微孔位置记录质谱。
在一些方法中，MALDI-TOF光谱法的检出限不受化学噪声的限制。在这些实施方案中，MALDI-TOF光谱法的检出限为约1飞摩尔(femtomole)/mm2。MALDI-TOF光谱法的检出限对应于1.3埃摩尔(attomole)/珠或相当于780,000个分子/珠，对于PSA而言为0.04pg。在一些测量中，一个珠可足以实现MALDI-TOF光谱法的预期检出限。在其他测量中，使用多个珠来产生更低的检出限、更大的动态范围和更好的变异系数CV，所述变异系数是峰强度的标准差与平均值之比。
方法200的步骤七214包括分析质谱以产生免疫测定。在根据本教导的一些方法中，分析质谱包括执行计算机算法，将针对质量标签的预定质量而获得的质谱相加在一起，以产生通过链霉抗生物素蛋白-生物素连接键而最初结合到珠上的分子的质谱，以及结合到诱饵分子上的靶分子的质谱。在一种具体方法中，计算机算法将检测到预定质量标签的所有质谱相加，以产生所结合的靶分子的质谱。检测到的每个指定质量标签都对应独特的诱饵分子。因此，检测到质量标签的质谱还包括与诱饵分子强结合的所捕获分子的质量。
图3A示出了根据本教导的配体结合测定设备的微孔样品板一部分的布局。在图3A所示的实施方案中，微孔302具有40μm的直径，并且以正六边形阵列304排列，单个六边形306具有50μm的高度。图3A显示了与单个六边形306和正六边形阵列304的尺寸相关的25-μm像素308和10-μm像素310的尺寸。在图3A所示的示例性布局300中，名义上为462个小室/mm2。
图3B示出了图3A所示六边形阵列304的一个具体六边形的详细视图。六边形布局具有两种六边形尺寸，a 312和b 314。在一个具体例子中，六边形具有25μm的半高，相当于a＝25tan(30°)，且b＝50cos(30°)-a，使得b+2a＝57.72μm。
在根据本教导的配体结合测定设备的一些实施方案中，MALDI-TOF质谱仪中的激光束在包括图3A所示布局300的微孔板表面上进行光栅化。在一种具体方法中，以25μm的间隔使用直径为10μm的激光束进行光栅化，使用5kHz的激光重复频率、2.5mm/s的扫描速度且每像素总共50次激光发射以产生25μm长的像素。在该具体方法中，总像素/孔之比为约3.5，约一半是在孔上的，一半具有相邻孔的明显贡献。每个孔上的激光发射总数为100次，每个孔的激光照射时间等于约0.035s。
在另一种具体方法中，在包括图3A所示布局300的微孔板表面上以10μm的间隔使用直径为10μm的激光束进行光栅化，使用5kHz的激光重复频率、1mm/s的扫描速度且每像素总共50次激光发射以产生10μm长的像素。在该具体方法中，总像素/小室之比为约25，约58％是在孔上的且相邻孔没有显著贡献。孔上的激光发射总数为600次，每个小室的激光照射时间为0.25秒。
在另一种具体方法中，在包括图3A所示布局300的微孔板表面上以12.5μm的间隔使用直径为10μm的激光束进行光栅化，使用5kHz的激光重复频率、1.25mm/s的扫描速度且每像素总共50次激光发射以产生12.5μm长的像素。在该具体方法中，总像素/小室之比为约16，约58％是在孔上的且相邻孔没有显著贡献。每个孔上的激光发射总数为400次，激光照射时间等于0.16秒。
图4A示出了根据本教导具有划分区域的微孔样品板402的实施方案的布局400。在根据本教导的一个具体板中，微孔板402具有25×75mm的标称外部尺寸并且包含约866,250个微孔。通过罩子(mask)将微孔板402分成多个区域或点404，所述罩子用防止液体在点404之间流动的垫圈(未显示)夹紧到板上。图4A中所示的板400示出了包含以3×8阵列排列的二十四个点404的布局400。每个点404为7×7mm并且在点404之间有1mm长的间隔。每个点404包含约22,600个微孔。二十四个点总共包含约542,400个孔。每个点的MALDI-TOF处理时间为一小时，每个样品板的MALDI-TOF过程在24小时内完成。在板一端的6×25mm区域附有条形码408来标识板。
图4B示出了根据本教导具有划分区域的微孔样品板的另一个实施方案的布局450。图4B示出了包含以8×20阵列排列的九十六个点406的布局450。每个点406为3×3mm并且在点406之间有1mm长的间隔。每个点406包含约4100个微孔。
在另一具体布局(未显示)中，该板包含以12×32阵列排列的三百八十四个点，每个点的尺寸为1.5×1.5mm并且在点之间具有0.5mm长的间隔。每个点包含约1030个微孔。在另一个具体布局(未显示)中，该板包含以24×64阵列排列的一千五百三十六个点，每个点的尺寸为0.5×0.5mm，并且在点之间具有0.5mm的间隔。在这种布局中，每个点包含约115个微孔。本领域技术人员将认识到，可以按照具体应用所需来排列任何数量的点。
本教导的方法特别适合于从生物素产生配体结合测定。生物素(MW＝244.3Da)是参与几个生物学过程的维生素。这些生物学过程包括例如少量存在于所有活细胞中的细胞生长和柠檬酸循环。链霉抗生物素蛋白(MW～52K)是从细菌阿维丁链霉菌(StreptomycesAvidinii)纯化的四聚体蛋白质，它能够以极高的亲和力(Kd＝10-14M)结合4个生物素分子。生物素是相对较小的分子，很容易与肽或适配体结合而对生物活性的影响可以忽略不计。生物素/链霉抗生物素蛋白的结合迅速发生，对温度变化、有机溶剂和许多变性剂是相对稳定的，并且在约4-9的pH范围内都是稳定的。生物素和链霉抗生物素蛋白化学的这些特征使其成为设计生物学测定***特别有用的工具。
图5示出了在本教导的配体结合测定设备和方法的一个实施方案中，用于将生物素共价连接到目的分子上的市售生物素接头500。如图5所示，通过添加生物素，生物素化分子的质量增加了473.22Da。用于质量标签的生物素化肽的质量必须有通过质谱仪足以区分的差异。考虑到同位素包封，2000ppm的差异是足够的。理论上可区分的峰总数n为550，具有800-2400Da的质量范围mn-m0和2000ppm的分辨率。计算如下：
mn＝m0(1+0.002)n
n＝log(3)/log(1.002)＝550。
可生成具有800-2400Da的质量范围mn-m0和2000ppm分辨率的一列肽来接近该理论极限。用生物素化的N-末端和C-末端精氨酸(R)以及多达12个其他氨基酸来选择这些合适的肽，以便用MALDI-TOF MS获得相对一致的响应因子。
本教导的配体结合测定设备和方法的一个特征是能够利用许多已知的和可商购的珠。例如，在一些实施方案中，使用纯化的链霉抗生物素蛋白琼脂糖珠，它可通过GEHealthcare Life Sciences产品代码17-5113-01商购获得。这些珠包含高度交联的、化学稳定的、直径约34微米的刚性琼脂糖核心。这些珠非常适合放置在微量滴定样品板中，每个直径为40μm的孔中有一个珠。此外，规定这些珠每毫升(mL)珠结合6mg BSA。
假设悬浮液中珠的体积大约是(0.0034)3cm3，那么1.0mL珠就包含约2.5×107个珠/mL。分子数可由6mg BSA确定，它等于90纳摩尔或相当于5.4×1016个分子。那么5.4×1016个分子/2.5×107个珠等于2.16×109个分子/珠。如果十分之一的位点被质量标签占据，那么每个珠子有大约2x109个可用位点。这就产生了3.3飞摩尔/珠或相当于2.6皮摩尔/mm2，其中被照射的区域取直径40μm孔的面积。
在根据本教导的其他方法中，使用可从SomaLogic Inc.(Boulder,CO)商购获得的生物素化的适配体珠，以及可从21st Century Biochemicals(Marlborough,MA)商购获得的生物素化的肽珠。这些珠可以简单地构建靶分析物的各种阵列。在包括生物素化适配体珠(例如可从SomaLogic(Boulder,CO)商购获得的抗-β-2-微球蛋白，产品号为B-3485-28_2)的实施方案中，将珠和生物素化质量标签以10:1比例(适配体:质量标签)混合在20mM TrispH 7.3缓冲液、5mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1MNaCl缓冲液中。将该混合物孵育30分钟。然后通过离心收集经孵育的珠，并在不含NaCl的相同Tris pH 7.3缓冲液中冲洗三次。选择适配体与肽的比例以模拟质谱仪中目标分析物和肽质量标签的相对灵敏度。单个珠上的结合位点近似数量估计为2×109个。
在根据本教导的一种方法中，通过使用结合到珠上的分析物特异性适配体试剂将目标分析物与生物样品分开。珠还含有用于珠识别且有助于分析物信号平均的质量标签。通过生物素/链霉抗生物素蛋白连接将分析物特异性亲和适配体和珠特异性质量标签都非共价结合到珠上。
根据本教导的一些方法在微量滴定样品板中使用多组珠，其中每组珠包括独特的质量标签和独特的诱饵分子。在这些方法中，质谱仪能够以多重操作模式进行操作，其中可以在多个不同组的珠上进行质谱测量，并且使用计算机算法来处理光谱以产生用于多组珠的每一组的配体结合测定。
可以使用各种计算机算法处理质谱以进行各种类型的分析。一些算法将检测到预定质量标签的所有质谱相加以产生所结合分子的质谱。在这些算法中，所检测到的每个指定质量标签对应于独特诱饵分子。因此，检测到质量标签的质谱也就包括所捕获的捕获物分子的质量。处理每个质量标签的相加质谱来产生所检测到的每个质量峰的质量和强度。这些质量和强度包括标签分子离子的质量和强度、由所捕获的捕获物分子所产生的离子的质量和强度，并且可以包括由诱饵分子所产生的离子。由捕获物分子所产生的离子强度与来自质量标签的分子离子强度之比可用于确定目的样品中捕获物分子的浓度。在一些实施方案中，这可能需要通过质谱法定量应用中常用的技术使用分子标准来校准该比值。
等同方案
尽管结合各种实施方案描述了申请人的教导，但并不意味着申请人的教导限于这些实施方案。相反，申请人的教导包括如本领域技术人员应该理解的可以在不脱离本教导的精神和范围的情况下所进行的各种替代、修改和等同方案。

Claims (27)

1.一种用于配体结合测定的设备，所述设备包括：
a)培养箱，其将多个珠与目的样品进行孵育，其中多个珠中的每一个珠都包含预定质量的标签和诱饵分子，所述孵育使诱饵分子结合到目的样品所包含的样品分子上；
b)冲洗器，其冲洗经孵育的珠，以便除去弱结合的样品分子，同时保留强结合的样品分子；
c)样品板，其配置用于加载到MALDI-TOF质谱仪中；
d)样品板加载器，其将经孵育并冲洗的珠加载到样品板中，以便在样品板上形成单层珠；
e)基质材料点样器，其将基质辅助激光解吸电离(MALDI)基质材料沉积到样品板的表面上，使得多个珠中的至少一些珠暴露于MALDI基质材料；
f)基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪，其接收加载的样品板并对位于样品板上的珠进行飞行时间质谱分析，从而生成质谱；以及
g)计算机，其使用由MALDI-TOF质谱仪所生成的质谱执行算法以生成配体结合测定。
2.根据权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述样品板界定多个孔，所述多个孔中每一个孔的尺寸都使得每个孔中仅能安置一个珠。
3.根据权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述多个珠包括至少两组的多个珠，其中所述至少两组珠中的每一组都包含本组独特的质量标签和诱饵分子。
4.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述多个珠中的每一个珠都包括固定有链霉抗生物素蛋白的琼脂糖珠。
5.如权利要求4所述的用于配体结合测定的设备，其中将所述质量标签分子和诱饵分子生物素化并与固定在琼脂糖珠上的链霉抗生物素蛋白相结合。
6.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述质量标签分子和诱饵分子将生物素共价连接至肽、蛋白质或核酸中的至少一种上。
7.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述多个珠中的至少一个珠的标称直径为34μm。
8.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述多个珠中的至少一个珠包含生物素化的适配体。
9.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述多个珠中的至少一个珠包含生物素化的肽。
10.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述样品板包括微孔样品板。
11.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述样品板加载器包括振动器。
12.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述冲洗器包括微量离心机。
13.如权利要求1所述的用于配体结合测定的设备，其中所述基质材料点样器包括喷雾器。
14.一种用于产生配体结合测定的方法，所述方法包括：
a)提供多个珠，其中所述多个珠中的每一个珠都包含预定质量的标签和诱饵分子；
b)将所述的多个珠与目的样品进行孵育，所述孵育使诱饵分子结合到目的样品所包含的样品分子上；
c)冲洗经孵育的珠，以便除去弱结合的样品分子，同时保留强结合的样品分子；
d)用经孵育并冲洗的珠加载包括多个孔的样品板，使得多个珠中的相应珠都加载到多个孔中的相应孔中；
e)将基质辅助激光解吸电离(MALDI)基质材料添加到加载的样品板的表面上，使得多个珠中的至少一些珠暴露于MALDI基质材料；
f)在多个珠中的至少一些珠上进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析，从而生成质谱；以及
g)处理所生成的质谱以生成配体结合测定。
15.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中提供多个珠包括提供至少两组的多个珠，其中所述至少两组中的每一组都包含本组独特的质量标签和诱饵分子。
16.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中提供多个珠包括提供固定有链霉抗生物素蛋白的琼脂糖珠。
17.根据权利要求16所述的用于产生配体结合测定的方法，其中提供多个珠包括将固定在琼脂糖珠上的链霉抗生物素蛋白所结合的质量标签分子和诱饵分子生物素化。
18.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中所述质量标签分子和诱饵分子将生物素共价连接到肽、蛋白质或核酸中的至少一种上。
19.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中提供多个珠包括提供至少一些标称直径为34μm的珠。
20.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中提供多个珠包括提供至少一些包含生物素化适配体的珠。
21.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中提供多个珠包括提供至少一些包含生物素化肽的珠。
22.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中冲洗包括用TrispH7.3缓冲液进行冲洗。
23.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析包括移动加载的样品板，同时光栅化电离激光束。
24.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析包括以多重模式进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析。
25.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，其中处理所生成的质谱包括将所生成的质谱相加。
26.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，所述方法还包括干燥沉积在所述样品板表面上的MALDI基质材料，以断开所述质量标签分子、捕获物分子或诱饵分子中的至少一种。
27.根据权利要求14所述的用于产生配体结合测定的方法，所述方法还包括选择用于珠识别并有助于分析物信号平均的质量标签。
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