CN110167674A - 用于隔离散液体中的物质的***和方法 - Google Patents

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Abstract

用于检测和隔离流体样品中目标分析物的***和方法。该***包括用于接收流体样品的散样本储存室，以及有效地、选择性地结合至感兴趣的目标分析物的顺磁性材料。端部与散样本储存室相互连接以限定样本腔室组件，围绕样本腔室组件的端部部分对样本腔室组件设置磁性腔室，并且有效地将磁性颗粒以及与磁性颗粒结合的任意目标分析物隔离在端部的内部。一旦能够具有足够的时间进行混合并能够使磁性舱将磁性颗粒充分保留在端部内，则使端部与样本储存室分离，并对保留在端部的顺磁性材料进行分析以确定目标分析物的存在。

Description

用于隔离散液体中的物质的***和方法
相关申请的交叉引用
不适用。
关于联邦政府资助的研究/开发的声明
不适用。
背景技术
本发明涉及用于识别、分离和隔离疑似存在于液体样品中、但存在量通常太低而不能使用现有技术机制进行检测的目标分析物或杂质的***和方法。本发明进一步涉及用于检测和隔离目标分析物的***和方法，该***和方法部分地基于样品(认为其中存在此类目标分析物)的体积减少，并结合此类目标分析物的磁分离。
能够识别特定生物大分子、细胞等(统称为“生物颗粒”)的分离技术在本领域中是公知的，并且被广泛用于生物研究、生物医学技术和诊断应用中的分析和纯化目的。通常，此类分离技术依赖于待识别的目标生物颗粒的一种或多种物理和/或化学性质，以便在固定位置或区域捕获或分离目标颗粒。已经用于促进生物颗粒的识别和分离的性质中包括密度、尺寸、疏水性、电荷和有效地与其他物质和/或免疫学试剂反应并结合的表面化学基团。此类技术的示例包括：离心，其可用于基于细胞成分的相对密度而分离细胞成分；液相色谱法，其包括使样品通过颗粒填充柱，所述颗粒具有既定的表面化学和/或孔隙度，能有效地与目标生物颗粒相互作用并使其保留；以及凝胶电泳，其通过施加电场而有效分离生物大分子，并基于目标大分子的电荷质量比进一步影响此类分子通过凝胶在一维或二维中移动的移动性。
经常应用于分离技术中还有微流控(microfluidics)技术，微流控技术的操作通常基于在微升至皮升的范围内、在不同直径(通常范围为5μm至500μm)的通道网络中操纵和控制流体。选择性地选择此类减小的尺寸，使得流体样品的颗粒或悬浮在流体样品中的颗粒变得与微流控装置本身的尺寸相当。在如此缩小的规模上，对流体进行定向、混合、分离或其他操纵方式以获得多路复用、自动化和高通量***。微流控技术能够分析和使用体积非常小的样品，以及相应较少量的、与样本一起使用的任何化学品和试剂，并且具有以较少的样品处理对样品进行处理和分析的能力。
除了此类技术之外，还采用了利用可有效地与所施加的磁场相互作用的磁性颗粒检测目标生物大分子和细胞的***和方法。在典型的应用中，磁性颗粒在其表面上携带配体，该配体使颗粒能够特异性地结合至目标生物大分子。在应用中，将此类磁性颗粒添加到样品中，并使其能够与目标大分子相结合，然后施加磁场，从而使磁性颗粒和所结合的目标大分子能够与样品的其余部分分离。然后通过检测(如基于荧光的发射)测定所捕获的目标大分子，并且可以与流式细胞术分析结合使用。
在以下的授权专利和公开的专利申请中阐述了关于生物大分子、细胞等的分离的现有技术的示例性参考文献：
2002年11月12日授予Bernd Dremel的名称为“METHOD FOR THE IMMUNOLOGICALDETERMINATION OF AN ANALYTE”的美国专利No.6,479,302 B1；
2006年10月5日公开的、Barber等人的名称为“DEVICES AND METHODS FORMAGNETIC ENRICHMENT OF CELLS AND OTHER PARTICLES”的美国公开专利申请No.2006/0223178 A1；
2007年7月19日公开的、Mark N.Bobrow的名称为“MULTIPLEX ASSAYS USINGMAGNETIC AND NON-MAGNETIC PARTICLES”的美国公开专利申请No.2007/0166835 A1；
2010年2月25日公开的、Barrault等人的名称为“ANALYTE MANIPULATION ANDDETECTION”的美国公开专利申请No.2010/0047766 A1；
2010年9月16日公开的、Barrault等人的名称为“ANALYTE MANIPULATION ANDDETECTION”的美国公开专利申请No.2010/0233675 A1；
2012年5月31日公开的、Murthy等人的名称为“SYSTEMS AND METHODS FORMAGNETIC SEPARATION OF BIOLOGICAL MATERIALS”的美国公开专利申请No.2012/0132593A1；
2012年10月25日公开的、Achrol等人的名称为“MICROFLUIDIC SYSTEM ANDMETHOD FOR AUTOMATED PROCESSING OF PARTICLES FROM BIOLOGICAL FLUID”的美国公开专利申请No.2012/0270331 A1；以及
2016年6月30日公布的、Oscarsson等人的名称为“NEW PROCESS AND SYSTEM FORMAGNETIC SEPARATION”的美国公开专利申请No.2016/0184737 A1。
所有前述内容的教导通过引用的方式明确地并入本文。
虽然上述方法具有一般效力，但感兴趣的目标分析物(尽管存在于样品中)的数量通常太少而不能使用此类现有技术进行检测。在这方面，此类方法通常不能充分地浓缩或富集样品以能够分析可能存在于样品中的稀有成分。此外，此类方法可能导致稀有成分的不可接受的损失，如通过目标生物颗粒的低效分离或降解而发生的损失。可能众所周知的示例性的、与发现稀有且难以鉴定的分析物有关的缺点是循环肿瘤细胞(CTC)的鉴定，如在***网站上的https://en.wikipedia.org/wiki/Circulating_tumor_cell更详细地说明的那样。
例如，如图1所示，微流控流道设计被公认为低效且缓慢。如上所述，典型的微流控设计包括布局10，其限定了使流体样品如方向A所示流过的通道12。存在于流体样品中的多个分析物14以及待测的目标分析物16被引导以流过表示为18的障碍、流动通道、网格等，因而通过此类结构18提供的物理障碍可有效地、选择性地控制分析物流过***的速率和位置。最好的方法需要15小时以处理7.5mL的全血并且仅产生40％的回收率。这些方法不适合用于商业规模的应用，如筛选癌细胞的患者。参见(例如)Miyamoto，D.T.等人，Nat.Rev.Clin.Oncol.11,401-412(2014)。“研究表明，相比于CTC芯片，使用HB芯片以捕获循环肿瘤细胞具有若干优势。首先，HB芯片在仍能保持效率的同时，具有以比CTC芯片更高的流量过滤血液的能力。在低流量(约0.12mL/hr)时，HB芯片的细胞捕获效率平均为79％，而CTC芯片等扁平腔室装置平均为29％。当流量达到0.48mL/hr时，HB芯片的细胞捕获效率超过40％，而CTC芯片在此流量时的平均效率为约8％。”
关于与磁分离技术相关的缺点，图2至图5中示出了这此类磁分离技术在有效地取出和分离感兴趣的目标生物颗粒/大分子方面是如何低效的。如上所述，使顺磁性颗粒与感兴趣的目标分析物相结合的能力在本领域中是公知的，并且如图2所示，描述了具有散液体样本的容器20，该液体样本包含多种分析物22和与顺磁性颗粒24相结合的目标分析物。基于通过施加磁场吸引顺磁性颗粒的能力，从而用作将此类颗粒连同所结合的目标分析物分离出来的基础；然而，向此类***施加磁场的现有技术是次优的。
关于图3，其利用小磁体30在样品收集装置20的选定区域周围产生小的静磁场32，易于确认的是，使用小的静磁场使目标物集中到小的区域中是无效的。由于随着远离磁源，磁场强度指数损失，小的磁源(如30)不能发射足够的磁场32以穿透整个样本。这种方法依赖于目标物随机扩散到磁场32的吸引力中。由于必须将目标物转移至小得多的反应容器以进行后续分析，因而该方法更加不利。
可供选择地，如图4所示，使用较大的磁体34以产生相应较大的磁场36，该磁场内在地穿透样本的全部体积而将目标物吸引至成比例扩大的捕获区域，这使得将稀有目标物(如24)集中至适合于分析腔室的体积内的尝试变得复杂或产生阻碍。在这方面，磁场36和随后的捕获区域的表面积太大而无法有效地分离并浓缩所寻求的分析物24。
现在参照图5，其示出了另一种磁分离技术，其中将磁源40浸入样本中以提高磁场42吸引目标分析物(即生物大分子或细胞)24的效率；然而，将目标分析物24从磁体40转移并将目标分析物再悬浮在体积小得多的容器中的挑战可能导致目标生物颗粒的损失、损坏和/或降解。为了克服该缺点，现有技术依赖于精心制作的机械护套型装置和方法，其中将护套放置在磁源和目标物之间，使得所述目标物附着到能够移除磁体的护套的表面。不可避免地，该方法使得目标分析物遍布于大的表面区域上，这进而需要使用洗涤体积从护套上除去目标分析物，从而再次产生分析物的稀释溶液。
即使在将最有效的技术用于使给定样品中的目标生物颗粒群体的浓度富集或最大化之后，通常样品的体积仍然太大而不能够进行精确且全面的研究以确定颗粒是否存在，更不用说到达什么程度。例如，为了进行PCR(即，用于分析DNA或RNA的短序列的聚合酶链式反应)，从7.5ml样本量的样品，需要60x至1500x的体积减少，因为众所周知PCR的工作容积为0.005ml至0.125ml，并且最大容积为0.20ml。类似地，显微镜载玻片的工作容积通常为约0.002mL至0.007mL，并且最大容积为0.020mL，因而需要使7.5ml样品的体积减少1071x至3750x，以达到可处理的体积。此外，对于在微孔中进行的检测，各微孔的工作容积通常为0.075ml至0.200ml，并且最大容积为0.36ml。因此需要37.5x至100x的体积减小，以使样品合适。
因此，本领域实质上需要能够有效地检测、分离和隔离感兴趣的目标分析物、特别是可能以非常低的量存在的目标生物大分子和细胞的***和方法，其中通过使大量散样本或者样品的体积减小到可接受的工作体积，并且使感兴趣的目标分析物在其中浓缩或富集。还需要这样的***和方法，该***和方法可以利用磁性富集方法和其他富集方法，以便提高从初始的大量或大体积减少至可接受的工作体积的样品中感兴趣的目标分析物的浓度或存在。此类改进的***和方法进一步优选地具有简单的设计，易于操作，可以产生高度精确且可再现的结果，相对廉价且可省时地进行，并且在以使样品损失和/或目标分析物的潜在污染或降解最小化的方式对感兴趣的目标分析物进行检测、分离和隔离方面异常有效。
发明内容
本发明特地解决和减轻了本领域中的上述缺陷。在这方面，本发明涉及一种***和该***的用途，该***通过在流体样品的实质上减少的体积内的俘获目标分析物以检测液体样品中目标分析物的存在；与传统方法相比，该方法进而极大地促进了检测分析物的能力。
为了实现该目的，提供了一种样本腔室组件，其可有效地接收散流体样品并最终将感兴趣的目标分析物浓缩或富集在样品流体的实质上减少的体积内。根据优选实施方案，样本腔室组件包括可有效地相互连接的散样本储存室与至少一个端部的组合。优选地，此类部件被配置成使得储存室的体积比附接到其上的至少一个端部的体积更大。还提供了一种磁性舱，其有效地与样本腔室组件的端部部分接合并向该端部部分施加磁场。在这方面，优选将磁性舱设计成可围绕端部呈轴向定位，以便将磁性吸引力施加到该端部的内部。
在使用中，将含有目标分析物的液体样本与顺磁性材料一起引入散样本储存室中，该顺磁性材料可有效地、选择性地与待测的目标分析物相结合。在这方面，据信目标分析物可为各种分子、化学物质、物理试剂等，特别是可以包括生物材料，尤其是被统称为生物颗粒的生物大分子、细胞等。
将液体样品和对目标分析物具有特异性的顺磁性颗粒引入散样本储存室中，随后将端部与散样本储存室相互连接，以限定样本腔室组件。在优选实施方案中，一定体积的空气或其他气体被捕获在样本腔室组件内，以促进样本腔室组件内所含的液体样本充分混合并能够在整个相互连接的样本腔室组件中充分循环，从而使顺磁性颗粒能够充分地与感兴趣的目标分析物相结合的能力。根据优选实施方案，允许保留在样本腔室内的空气或气体的量的范围可以为总体积的10％至50％，并且在更优选的实施方案中，该范围可以为40％至20％。在最优选的实施方案中，样本腔室组件中存在的空气或气体的量的范围为25％至35％。在混合步骤的同时或之后，磁性舱与端部相互连接，并且可有效地向端部施加磁性吸引力，从而对端部内的顺磁性材料进行影响、吸引和隔离。借助于磁性吸引力，磁性材料的主要部分、并且优选至少大部分，与磁性材料结合的目标分析物一起被隔离在端部内。此外，借助于端部相对于散样本储存室的减小的体积，相对于引入样本腔室组件的总样本体积，端部中包含被隔离的顺磁性颗粒(因此，目标分析物)的液体样本的量显著减少。相对于现有技术方法，通过减少体积以及富集其中存在的感兴趣的目标分析物，目标分析物因此更容易且方便地被识别和量化。
在本发明的进一步改进中，可以预期两个或多个可拆卸的端部可与样本储存室相互连接，各个端部可单独与专用磁性舱接合，以便促进隔离顺磁性颗粒的能力，并且有可能检测单个流体样品中的两种或多种不同的目标分析物。此外，可以预期，取决于待测的分析物的类型，可对样本腔室组件内所含的空气或气体的量、所用的气体的类型(例如5％CO2)、混合的持续时间、混合的类型和该混合的强度进行修改，所有这些都可选择性地进行控制。此外，可以预期，通过引入化学添加剂，如洗涤剂、缓冲剂、防腐剂、酶等催化剂、可检测部分加上许多其他本领域技术人员公知的物质，可在样本腔室组件内引起可有效地促进目标分析物的检测的某些反应。更进一步地，根据所需程度，可有效地对样本腔室组件施加热能(如加热)、电磁能(包括紫外线或红外线辐射、微波等)和/或机械能或力(如超声波、离心等)。沿着这些思路，本发明可以预期，可根据需要使用促进混合的任何力或能量或者引入所需反应以促进：1)目标分析物最终与磁性颗粒反应的能力；以及2)目标分析物被隔离在端部内。
因此，本文提出的发明提供了一种简单、通用、可扩展的***，其用于隔离溶解的、悬浮的或以其他方式分散在大的液体体积中的稀有目标物，而不依赖于与现有技术相关的复杂的工作流程、精确的流控技术和过多工作时间。本发明通过使用配置有单个端部或多个端部以及所述单个或多个端部外部的一个或多个聚焦磁场的单个样本腔室即时、容易地处理样本，大大提高了样本的体积，由此可用于扩展与现有技术的磁分离方法相关的检测下限。本发明还可以用于非分析应用，以提高从大量溶液中除去杂质或回收高价值稀有材料(如工业处理中使用的分散的催化剂)的效率。
附图说明
参照以下说明书和附图将更好地理解本文公开的各种实施方案的这些和其他特征和优点，说明书和附图中相同的标号始终表示相同的部件，并且其中：
图1示出了从散流体样本中分离目标分析物的代表性现有技术的微流控方法；
图2示出了具有包含多种分析物和与顺磁性颗粒相结合的目标分析物的散流体样本的容器；
图3示出了具有包含多种分析物和与顺磁性颗粒相结合的目标分析物的散流体样本的图2的容器，该容器接近产生小磁通量的磁源；
图4示出了具有包含多种分析物和与顺磁性颗粒相结合的目标分析物的散流体样本的图2的容器，该容器接近产生大磁通量的磁源；
图5示出了具有包含多种分析物和与顺磁性颗粒相结合的目标分析物的散流体样本的图2的容器，该容器还具有浸入其中的产生大磁通量的磁源；
图6为本发明的***的示例性部件的分解透视图；
图7为图6的***部件的分解剖视图，该***部件的散样本储存室中具有散流体样本；
图8为图7的***部件的剖视图，其中多个部件有效地彼此相互连接，用于检测散流体样品；
图9为图8的***部件的分解剖视图，其中示出了存在于散流体样品中的目标分析物的一部分通过***的附接磁性舱而被分离并磁性地保留在端部部件内；
图10为图9的端部和磁性舱的分解剖视图，示出了从磁性舱中拆出端部；
图11为图8的剖视图，进一步示出了在混合区间内转动运动的含有样本的样本腔室；
图12为图11的剖视图，示出了在目标物隔离区间内运动中的相互连接的具有样本的样本腔室和磁性舱组件；
图13为本发明的***的第二实施方案的示例性部件的分解透视图；并且
图14为图13的***部件的剖视图，其中多个部件有效地彼此相互连接，用于检测尿液样品。
具体实施方式
以下阐述的详细描述旨在作为本发明的当前优选实施方案的描述，而不是旨在表示可实施或进行本发明的唯一形式。该描述阐述了用于实施本发明的功能和步骤顺序。然而，应当理解，相同或等同的功能和顺序可通过不同的实施方案来实现，并且这些实施方案也旨在包含在本发明的范围内。
现在参照图6至图12，并且首先参照图6，其示出了用于促进疑似存在于散流体样品中的目标分析物的检测、分离和隔离的***100。根据***100，提供了有效地与端部120相互连接的散样本储存室102。样本储存室102包括内部104，内部104限定了用于接收散流体样本的容积。样本储存室102还包括近端108，近端108配置有用于与端部120相互连接的套环或其他类似类型的结构，以下将更全面地讨论。在所示的实施方案中，最远端106可配置成具有大致截头锥形的结构，以便使样本储存室易于用于其他分离应用，如离心或沉淀反应。
关于端部120，其配置有近端配合表面124，以有效地与样本储存室102的108相互连接。端部120还包括内部部分122，内部部分122限定的容积比样本储存室102的内部104限定的容积小。端部120的最远端126也可采用截头锥形的结构，以有助于用于分离端部120中所含物质的其他应用(如离心)，以下也将更全面地讨论。
***100还包括磁性舱130，磁性舱130包括围绕内部通道132径向设置的至少一个且优选多个磁体。在这方面，通道132可有效地轴向接纳端部120并将磁通量施加到端部120的内部，以用于通过使用顺磁性颗粒来促进感兴趣的目标分析物的隔离，以下将更全面地讨论。
虽然描述为具有传统的试管结构，但应当理解，样本储存室102和与其相互连接的端部120可采用各种形状和尺寸中的任意一种，并不一定需要采用如图所示的圆柱形结构。在这方面，只要将端部设计成内部容积小于样本储存室102的内部容积，并且还可有效地与磁性舱130接合以使磁性舱130可以向端部施加磁通量即可；形状和尺寸的所有变化应当被认为完全处于普通技术人员的技能水平之内。此外，可以预期，***100可包括两个或多个端部，所述端部可以在不同的位置处与散样本储存室102相互连接，从而根据需要分离不同的分析物和/或根据需要顺序地隔离一种或多种目标分析物。同样地，应当理解，用于制造***100的部件102、120和130的材料可采用任意的本领域公知的各种材料，材料可以包括如可适用于特定的分离应用的某些塑料、玻璃器皿等。同样地，用于特定应用的材料的选择完全处于普通技术人员的技能之内。
现在参照图7，其示出了在用于分离疑似存在于散流体样品中的感兴趣的目标分析物的方法的初始步骤中***100的用途。如图所示，含有多种分析物22的流体样本被接收在散样本储存室102内。此外包括可有效地与疑似存在于流体样品中的目标分析物相结合的顺磁性材料。如背景技术中所讨论的，磁性颗粒的用途以及设计磁性颗粒以使得此类颗粒特异性地与感兴趣的目标分析物相结合的能力是本领域公知的并且容易理解的，并且包括任意的和所有的机理，如使用配体、受体、螯合物、结合配偶体和本领域已知的任意其他的机构，以促进顺磁性颗粒与目标分析物之间形成复合物。在附图中以24表示由顺磁性颗粒和感兴趣的目标分析物通过配体所形成的复合物。
此类散样品可采用可能含有待测的目标分析物的各种液体样品中的任意一者，并且如果需要，随后进行分离和隔离。因此，应当理解，目标分析物可能包括任意类型的分子、颗粒、物质等。特别是可以预期，与顺磁性颗粒偶联的目标分析物24将包括生物大分子(如DNA的片段、RNA、蛋白质、肽)、细胞内结构、特定类型的细胞(如癌细胞)等，所有这些都统称为生物颗粒。在这方面，可以预期，***100及其使用方法将特别适用于生命科学应用，其中期望检测特定类型的稀有生物颗粒，否则非常难以发现这些稀有生物颗粒。
图7进一步描绘了当散样本储存室102中接收了散流体样品时，与散样本储存室102接合的端部120的定位和定向。重要的是，借助于端部120与样本储存室102之间的相互连接，一旦部件102、120相互连接，则包含在端部120的内部122中的大量空气或气体将被引入样本腔室。目前，据信样本腔室(由图8所示的内部容积122和104所限定)内捕获的空气的体积的存在量范围将为样本腔室的总容积的10％至50％。在更加优选的实施方案中，空气/气体的存在范围将为总容积的20％至40％，并且在最为优选的实施方案中，范围为总容积的25％至35％。在这方面，包含空气和/或气体的空间对样本腔室内的充分混合是至关重要的，从而使得具有结合至其上的目标分析物的顺磁性材料能够在整个样本腔室中充分循环、并最终受到由磁性舱130施加的磁场的作用，以下将更全面地讨论。同样地，当样本储存室102与端部120相互连接时，留下以填充样本腔室组件的剩余容积的空气和/或气体的类型可根据具体应用而选择性地选择。例如，诸如氮气或氦气之类的惰性气体可用于待测的目标分析物可能发生氧化风险的某些应用中。认为由此使用的气体的类型和体积处于普通技术人员的技能范围之内。
如本领域技术人员将容易理解的，根据待测的目标分析物的特定类型，可以设置多种参数和调整以促进顺磁性材料对感兴趣的目标分析物的结合能力和/或促进目标分析物通过与顺磁性颗粒的相互作用而更容易且方便地被检测的能力。为此，应当理解，如图7所示引入样本储存室102的散流体样品可另外与其他物质混合，例如，如可适用于特定试验或用于特定分析物的检测的化学试剂、添加剂、洗涤剂、缓冲剂、防腐剂、催化剂(如酶等)、一种或多种可检测部分和/或络合剂。
还应当理解，磁性舱130还可被设计成围绕端部120充分地施加磁通量或磁场(以下将更全面地讨论)，以便产生足够强的磁力以进行相互作用、吸引并隔离结合至目标分析物24的磁性颗粒。为此，认为本领域普通技术人员可以容易地设计各种的磁体设置，通过使设置在磁性舱130内的磁性元件取向以将端部120的内部122中的磁场定向。例如，可以预期，可围绕磁性舱130径向地设置一系列磁性元件并且使之取向成使磁性元件的磁极将所需磁场施加到端部120的内部12中。可以进一步预期，可利用各种环形磁体和具有多种磁极取向的磁体以施加所需和必要程度的磁力，从而吸引并隔离与感兴趣的目标分析物24复合的磁性颗粒。为此，可以预期，磁体的类型、磁体的磁性强度、磁体相对于端部120的内部空间122的取向、所测试的流体样品的粘度和用于特定应用的顺磁性颗粒的类型和浓度都将被选择性地选择，以达到目标分析物24的最佳检测程度。
现在参照图8，其示出了与散样本储存室102相互连接的端部120。如图所示，端部120与样本储存室102之间的相互连接限定了样本腔室组件。在这样的结构中，含有分析物、和顺磁性:目标分析物复合物24两者的流体样品能够在相互连接的部件102、120的结合的内部部分104和122内自由循环。当在这样的结构中时，如图所示，通过穿过轴向开口132使端部120***，使磁性舱130轴向地设置在端部120上。如图所示，基于磁性舱130与端部120的接近度，设置在磁性舱130内的磁性元件选择性地施加可有效地保留顺磁性颗粒:目标分析物复合物24的磁通量。在这方面，借助于磁场和磁性颗粒之间的吸引力，结合有目标分析物的此类颗粒24的主要部分、并且优选至少大部分将被隔离在端部120内。
如本领域技术人员将容易理解的，可以预期，为了将顺磁性材料保留在端部120内，可用受体、某些物质等对端部120的内部进行表面处理，从而使顺磁性材料一旦被磁性吸引至端部120的内部就能够保持隔离。本领域技术人员还将容易理解可能促进顺磁性材料一旦通过磁性舱130的作用被吸引至端部120内就保留在端部120内的能力的其他修改。
如图9所示，一旦充分包含在端部120内，结合有目标分析物的顺磁性颗粒24将继续被隔离在端部120中，只要磁性舱130有效地施加保留磁场即可。当在这样的结构中时，可将端部120从散样本储存室102拆下，从而从散液体样本中实质上除去目标分析物。然后如图10所示，可通过拆下磁性舱130并且使得目标分析物能够根据特定应用而再悬浮在最小体积的流体中或者进行干燥，从而进一步分离和隔离在端部120内捕获的保留的目标分析物24。
据认为在获得最佳结果方面具有重要意义的本申请的另一方面包括各种因素，这些因素涉及合适的孵育时间、混合间隔、混合强度以及对样本腔室组件施加机械能、热能和/或电磁能，以便不仅提高顺磁性材料结合感兴趣的目标分析物的能力，而且使由顺磁性材料和目标分析物形成的复合物24能够在样本腔室组件内循环并最终经受由磁性舱130施加的保留磁力。为此，并且如上所述，可将许多试剂与顺磁性颗粒一起添加到散流体样本中，以便使可检测到给定的目标分析物的可能性最大化。例如，在期望识别特定生物颗粒(如细胞器或特定类型的DNA片段)的情况中，可使用洗涤剂和消化酶，以便促进含有细胞的样品的溶解能力或消化能力，从而能够获取细胞内结构和大分子。类似地，如上所述，可选择性地选择留在样本腔室组件内的空气的体积，以便促进较高或较低程度的混合，并因此促进顺磁性材料循环进出端部120的内部122。
更进一步地，可以预期，可选择性地设置机械能(如超声波)、热能(如加热或制冷)以及电磁能(如紫外线或红外线辐射、微波)等，以便促进样本腔室组件内部的反应或者提高顺磁性颗粒与由磁性舱130产生的磁力相互作用的能力。
为此，并且如图11和图12所示，如果需要混合区间以确保目标分析物与结合用顺磁性颗粒的结合复合物的形成，则可将样本腔室组件的运动方式设定为样本腔室组件内所含的液体和空气最终填充样本腔室的端部部分。如图所示，由散样本储存室102和端部120的相互连接限定的样本腔室组件可以图11中所示的顺时针方式转动，以呈现图12的倒置结构。然而，如本领域技术人员应当容易理解的，根据特定应用的需要，样本腔室组件的运动可以采取包括摇动、振动、压缩的多种形式中的任意一种，这些运动与所示的转动运动分别进行或者同时进行，或者可包括此类运动的组合。实际上，可以明确地预期，必须发生一些混合活动以确保样本腔室组件内所含的液体和空气能够实现液体和空气两者交替地填充端部120的内部122，因此使磁性舱130的磁力能够产生隔离效果。同样地，此类混合活动(无论是转动、摇动、振动、压缩还是它们的组合)，都必然导致液体从端部120退出并随后被空气和/或气体代替，这进而消除了液体的表面张力以及任意未结合的背景分析物22，这些未结合的背景分析物可能干扰顺磁性颗粒与目标分析物的期望复合物24的检测。
更进一步地，可以预期，将针对特定应用选择性地选择混合的程度和类型，并且混合的程度和类型可包括第一持续时间内在样本腔室组件内仅混合样本和顺磁性颗粒而不施加任何由磁性舱130产生的磁场，所述混合可持续给定的持续时间和强度从而足以使顺磁性颗粒能够首先充分地与感兴趣的目标分析物形成复合物，并且一旦此类反应实质上完成，则可随后引入磁性舱130以选择性地向端部120的内部施加磁场，从而实现本文所讨论的隔离效果。在这方面，可以预期，所使用的***和方法可以依次用于进行第一顺磁性颗粒混合步骤，然后进行第二隔离步骤。
如上所述，可以预期，本发明的***和方法可广泛应用于检测各种目标分析物中的任意一种，尤其是以痕量存在并且使用现有技术方法通常难以检测的目标分析物。可以预期许多临床应用和工业应用，包括但不限于：诊断应用，如癌细胞、特定类型的抗原、病原体等的检测；水***和食物来源中的杂质和污染物的检测；液体的净化；各种烃类的制造和加工等。
在癌症诊断的情况中将容易理解说明本发明效用的实例。在这方面，癌症患者的治疗和管理越来越依赖于精准治疗原则。代替基于群体平均值的治疗，疾病治疗和预防考虑了基因方面的个体差异。因此，该原则检查导致癌症的潜在基因和基因表达，并预测患者的最佳治疗和管理。由于癌症为器官或组织特异性的疾病，因此基因检测结果的分析有效性基于以下假设：检测结果可追踪至来源于特定器官或组织的特定细胞类型。
尽可能地，需要使用所谓的液体活组织检查方法评价上述个体基因变异性，以评价体液中肿瘤细胞的存在。液体活组织检查方法采用微创取样技术，该技术通常不涉及外科手术以取下身体组织的样品。例如，与外科手术方法相比，可以对患者造成最小的风险或创伤的方式收集体液，如血液、尿液、唾液、脑脊髓液、胸膜液等。这是有利的，因为这些液体可补充，容易获得，并可提供用于疾病监测的理想方法。因此，液体活组织检查方法能够开发早期检测(筛查)的便利模式，以及对响应于治疗的疾病进展或康复的监测。
液体活组织检查方法的限制在于其依赖于这些体液中少量存在的肿瘤细胞。而且，感兴趣的目标细胞通常存在于含有相对较多数量和种类的非诊断性背景细胞的体液中，背景细胞与诊断无关并且会掩盖目标细胞的存在。在许多情况中，早期疾病检测或最低残留疾病检测是不可行的，这是因为目标细胞的相对数量低于现有技术的检测下限。在一些应用中，这可通过收集更大量的体液样本进行补救，然而，当使用大体积样本时，现有技术的尝试难以处理，缺乏稳健性，成本高，难以自动化，并且不利于大规模商业化。本发明的目的是从大体积的样本中隔离目标分析物，样本的总体积包括液体体积和固体体积，如包含许多生物流体总体积的液体和细胞成分。提供了用于此目的的特定应用：
实施例1：15毫升至30毫升的人全血中的循环肿瘤细胞。
通过内部容积为58mL的散样本腔室102和内部容积为2mL的端部120之间的相互连接得到60mL样本腔室组件。
在拆下端部120之后，将15mL至30mL全血引入散样本储存室120中。将含有750亿至1500亿个细胞的15mL至30mL的血液放置在散样本储存室102中，然后添加20mL的液体试剂，该液体试剂包含缓冲液、调节剂、化学试剂和适当数量的目标细胞特异性顺磁性颗粒。例如，占样本腔室组件总体积(SCV)的71％的平均总组合液体体积42.5mL的总液体体积范围可以为35mL(58％SCV)至50mL(83％SCV)。这进而在样本腔室组件内产生17.5mL(29％SCV)的平均空气空间和范围为25mL至10mL(42％SCV至17％SCV)的空气空间。
关于液体试剂组合物，缓冲液可以是任意合适的缓冲液，通常在pH 6至8.5的范围内。调节剂和化学试剂可包括：盐、金属离子、糖、氨基酸、抗生素、抗凝血剂、消泡剂、表面活性剂、固定剂和许多其他通常用于组织培养、免疫化学、细胞学、病理学和血液病理学的调节剂或其组合。顺磁性颗粒数量范围可为数千至数十亿，并且包含在液体试剂的总体积内，单独添加或与其他液体试剂成分同时添加均可。
在将样本和液体试剂添加到散样本储存室102之后，然后通过更换如图7中的可拆卸端部120来重新组装样本腔室组件，以形成样本腔室组件。
将样本腔室组件安装在水平转动装置上，并以一定的速率进行转动运动，以进行混合，该混合足以在目标细胞和目标细胞特异性顺磁性颗粒之间形成复合物。混合区间的持续时间应足以使大多数目标细胞与目标细胞特异性顺磁性颗粒相结合。
在混合区间结束时，将磁性舱130安装至样本腔室组件的端部部件120。这可以在保持转动运动的同时完成，或通过短暂地中断转动运动，以便能够在静止时将磁性舱130安装至端部120。
在安装磁性舱130之后，***持续其转动运动一段时间，该时间足以使大部分的目标细胞/目标特异性磁性颗粒复合物经由磁性舱130产生的磁场而被隔离在样本腔室组件的端部部件120中。
在隔离持续时间结束时，停止转动运动并从转动装置中取下整个***组件。使样本腔室组件保持在竖直位置一段时间，该时间足以使大部分的液体从端部120排出。一旦排空，则拆下端部/磁性舱组件120/130并翻转以使端部120能够从磁性舱130拆下而不损失目标细胞。然后可以将目标细胞以任意适当的工作容积再悬浮，以适合于显微镜检查、PCR、测序和其他类型的分析。
除了CTC应用以外，可采用本发明的***和方法以检测尿液中存在的癌细胞。为此，尿细胞学领域的技术人员已知排出的尿液可能含有从肾脏、膀胱、***、尿道和其他组织脱落的数量不可预测(如果有的话)的癌细胞。与血液不同，如果出现血尿，则尿液总细胞计数范围可以为数个细胞至数十亿个细胞。除了来自上述器官和身体组织的脱落的目标细胞以外，尿液样本成分还可以包括血细胞(称为血尿的情况)、细菌、大量粘液、晶体和***。作为结果，检测低程度病变的挑战在26％和45％之间变化((Laucirica,R.等人ArchPathol Lab Med.Vol 134,2010年1月)。还据报道，通过评价较大尿液体积和多次尿液排空，使检测尿道恶性肿瘤的诊断准确率总体上从50％提高至75％至90％(参考文献：Elsheikh,T,Cleveland Clinic presentation,URL:https://www.ahn.org/sites/default/files/file/elsheikh-2.pdf)。临床研究还表明，检测沙眼衣原体的核酸扩增试验灵敏度随着首次获取的尿液样本体积的增加而提高(Moncada,J.等人Journal ofClinical Microbiology.2003年10月，第4848-4843页)。
排出尿液的体积在个体和个体之间可能有很大差异。也可根据每次排空或每24小时区间确定尿液体积。24小时尿液排空的正常范围为800毫升至2000毫升(mL)，而年龄为50至54岁的男性每次排空的平均体积范围为210mL至346mL。参见，例如，Blanker,M.等人Voided Volumes:Normal Values and Relation to Lower Urinary Tract Symptoms inElderly Men,A Community Based Study.Urology 57(6),2001。作为这些体积的结果，诸如脱落的细胞之类的目标分析物可能非常难以检测。在以下具体实例中提供了如何通过本发明的应用克服这些缺点：
实施例2：从尿液中隔离目标细胞，然后从同一尿液样本中隔离DNA。
现在参照350mL样本腔室组件，其具有容积为345mL的散样本储存室和容积为5mL的端部。为了促进对这种体积的样本进行收集和试验的能力，可以预期除了上述设计和本领域技术人员容易理解的该设计的其他变型之外，图13和图14示出了另一个示例性实施方案。如图13的分解图所示，提供了***部件散样本储存室102、端部120和磁性舱130并有效地相互连接，使得散样本储存室102的远端108可与端部120的远端124螺旋地相互连接。根据上述其他实施方案，端部120和散样本储存室102之间的相互连接配合以限定样本腔室组件，如图14中具有这些相互连接的部件的剖视图所示的那样。与如上所述的与血液检测相关的样品等较小体积样品截然相反地，由于散样本储存室的主体具有大致球形的形状，因此散样本储存室102能够容纳更大的样品体积，这对于诸如尿液之类的样本是理想的。
如图14所示，根据以上所述的其他实施方案，磁性舱130设置有环形孔132，以便轴向地容纳端部120。根据以上所述的实施方案，磁性舱130有效地向端部120的内部发射磁场，使得当结合有目标分析物的顺磁性颗粒循环通过端部120的内部122时，此类物质将保持隔离在内部122中。
在拆下端部120之后，将含有未知数量的细胞、细菌、粘液和其他背景成分的200mL尿液200引入散样本储存室中。添加样本之后添加50mL液体试剂，该液体试剂由缓冲液、调节剂、化学试剂和适当数量的目标细胞特异性顺磁性颗粒24组成。例如，占样本腔室组件总体积(SCV)71％的平均总组合液体体积250mL。这进而在样本腔室组件内产生100mL(29％SCV)的平均空气空间。
关于液体试剂组合物，缓冲液可以是任意合适的缓冲液，通常在pH 6至8.5的范围内。调节剂和化学试剂可包括：盐、金属离子、糖、氨基酸、抗生素、抗凝血剂、消泡剂、表面活性剂、固定剂和许多其他通常用于组织培养、免疫化学、细胞学、病理学和血液病理学的调节剂或其组合。顺磁性颗粒数量范围可为数千至数十亿，并且包含在液体试剂的总体积内，单独添加或与其他液体试剂成分同时添加均可。
在将样本和液体试剂添加到散样本储存室之后，然后通过更换如图14中的可拆卸端部来重新组装样本腔室组件。此时不向样本腔室组件增加磁性舱。
将由相互连接的散样本储存室102和端部120限定的样本腔室组件安装在水平转动装置上，并以一定的速率进行转动运动，以进行混合，该混合足以在目标细胞和目标细胞特异性顺磁性颗粒之间形成复合物。混合区间的持续时间应足以使大多数目标细胞与目标细胞特异性顺磁性颗粒结合。
在混合区间结束时，将磁性舱安装至样本腔室组件的端部120部件。这可以在保持转动运动的同时完成，或通过短暂地中断转动运动，以便能够在静止时将磁性舱安装至端部。
在安装磁性舱130之后，***组件继续其转动运动一段时间，该时间足以使大部分的目标细胞/目标特异性磁性颗粒复合物经由磁性舱产生的磁场而被隔离在样本腔室组件的端部部件中。
在隔离持续时间结束时，停止转动运动并从转动装置中取下整个***组件。使***保持在竖直位置一段时间，该时间足以使大部分的液体从端部排出。一旦排空，则拆下端部120/磁性舱130组件并翻转以使端部120能够从磁性舱130拆下而不损失目标细胞。然后可以将目标细胞以任意适当的工作容积再悬浮，以适合于显微镜检查、PCR、测序和其他类型的分析。
随后的DNA的隔离：
在从尿液样本200中除去目标细胞之后，可能还需要从同一样本中隔离DNA，以检测由性传播的微生物。
将大量DNA结合顺磁性颗粒添加到已除去目标细胞的样本中，所述顺磁性颗粒足以结合足够量的PCR用DNA。顺磁性颗粒可充分浓缩，以对***不产生明显的体积效应。可从许多制造商处容易地获得这些颗粒。
然后通过更换可拆卸端部120来重新组装样本腔室组件。此时不向样本腔室组件增加磁性舱130。
将样本腔室组件安装在水平转动装置上，并以一定的速率进行转动运动，以进行混合，该混合足以在DNA和DNA结合顺磁性颗粒之间形成复合物。混合区间的持续时间应足以使大多数目标细胞与目标细胞特异性顺磁性颗粒相结合。
在混合区间结束时，将磁性舱130安装至样本腔室组件的端部120。这可以在保持转动运动的同时完成，或通过短暂地中断转动运动，以便能够在静止时将磁性舱安装至端部。
在安装磁性舱130之后，***组件继续其转动运动一段时间，该时间足以使大部分的DNA/DNA结合磁性颗粒复合物经由磁性舱130产生的磁场而被隔离在样本腔室组件的端部120中。
在隔离持续时间结束时，停止转动运动并从转动装置中取下整个***组件。使***保持在竖直位置一段时间，该时间足以使大部分的液体从端部排出。一旦排空，则拆下端部/磁性舱组件并翻转以使端部能够从磁性舱拆下而不损失结合了顺磁性颗粒的DNA。然后可以将DNA以任意适当的工作容积再悬浮，以适合用于显微镜检查、PCR、测序和其他类型的分析。
对于本领域普通技术人员而言，本发明的其他修改和改进也是显而易见的。因此，本文描述和说明的部件和步骤的特定组合旨在仅代表本发明的某些实施方案，而不旨在用作对本发明的精神和范围内的可供选择的装置和方法的限制。

Claims (24)

1.一种用于隔离认为存在于散液体样本中目标分析物的***，所述***包括：
a.散样本储存室，其限定用于接收疑似含有所述目标分析物的所述散液体样本的第一内部容积；
b.多个顺磁性颗粒，其有效地、特异性地结合至疑似存在于所述散液体样本中的所述目标分析物；
c.至少一个端部，其限定第二内部容积，所述至少一个端部可拆卸地与所述散样本储存室相互连接，使得所述端部的内部与所述散样本储存室的内部配合以限定样本腔室组件；以及
d.至少一个磁性舱，其可拆除地与所述至少一个端部中的专用端部接合，所述至少一个磁性舱有效地在所述至少一个端部的第二内部中发射磁场并磁性地隔离分布在含有感兴趣的所述目标分析物的散液体样品中的顺磁性颗粒的一部分。
2.根据权利要求1所述的***，其中所述散样本储存室的容积大于所述至少一个端部的内部容积。
3.根据权利要求2所述的***，其中所述***包括有效地与所述散样本储存室相互连接的单个端部以及可拆除地与所述端部接合的单个磁性舱。
4.根据权利要求2所述的***，其中感兴趣的所述目标分析物为生物颗粒。
5.根据权利要求4所述的***，其中所述生物颗粒选自由大分子、蛋白质、肽、细胞内结构和特定类型的细胞组成的组。
6.根据权利要求5所述的***，其中所述细胞包括癌细胞。
7.根据权利要求1所述的***，其中所述顺磁性颗粒包括选自由配体、受体、螯合物组成的组中的结合结构以及有效地与感兴趣的所述目标分析物形成复合物的结合配偶体。
8.根据权利要求1所述的***，其中所述至少一个端部中的每一个形成为具有大致管状形状，并且所述至少一个磁性舱中的每一个有效地围绕所述管状结构径向地发射磁场。
9.根据权利要求3所述的***，其中所述端部形成为具有大致管状形状，并且所述磁性舱有效地围绕所述管状结构径向地发射磁场。
10.一种用于隔离认为存在于散液体样本中的感兴趣的目标分析物的***，其中所述散液体样本包括在所述目标分析物存在的情况下有效地结合至感兴趣的所述目标分析物的顺磁性颗粒，所述***包括：
a.限定第一内部的端部；
b.限定第二内部并有效地接收所述散液体样品的散样本储存室，所述端部可拆卸地与所述散样本储存室相互接连，使得当二者相互连接时，所述端部的内部与所述散样本储存室的内部相结合以限定样本腔室组件；
c.磁性舱，其有效地与所述端部相互连接并且有效地将磁场发射到所述端部的内部，由所述磁性舱发射的所述磁场足够强，以便将存在于所述散液体样本中的顺磁性颗粒的一部分保留在所述端部的内部。
11.根据权利要求3所述的***，其中当将所述散液体样本放置在所述散样本储存室内并且所述至少一个端部与所述散液体样本储存室相互连接时，所述散液体样本占所述样本腔室组件的总容积的50％至90％。
12.根据权利要求3所述的***，其中当将所述散液体样本放置在所述散样本储存室内并且所述端部与所述散液体样本储存室相互连接时，所述散液体样本占所述样本腔室组件的总容积的40％至80％。
13.根据权利要求3所述的***，其中当将所述散液体样本放置在所述散样本储存室内并且所述端部与所述散液体样本储存室相互连接时，所述散液体样本占所述样本腔室组件的总容积的65％至75％。
14.根据权利要求10所述的***，其中当将所述散液体样本放置在所述散样本储存室内并且所述端部与所述散液体样本储存室相互连接时，所述散液体样本占所述样本腔室组件的总容积的65％至75％。
15.一种用于隔离认为存在于散液体样本中的目标分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供散样本储存室，其限定了用于接收所述散液体样本的内部，并将所述散液体样本放置在所述散样本储存室的内部；
b.使所述散液体样本与多个在所述目标分析物存在的情况下能有效地、选择性地结合至感兴趣的所述目标分析物的磁性颗粒相接触；
c.提供具有内部容积的端部，使所述端部与步骤b)中含有所述散液体样本和所述顺磁性颗粒的所述散样本储存室可拆卸地相互连接，以使得具有顺磁性颗粒和与其结合的任意目标分析物的所述散液体样本有效地流动并在所述至少一个端部的内部循环；
d.当在步骤c)中，所述端部与所述散样本储存室相互连接时，提供与所述端部可拆卸地相互连接的磁性舱，所述磁性舱与所述端部相互连接，以便在所述端部的内部内发射磁场；
e.使所述磁性舱与所述端部连接至足够使所述顺磁性颗粒的大部分保留在所述端部的内部内的持续时间的同时，使具有所述顺磁性颗粒和与其结合的任意目标分析物的所述散液体样本在所述端部的内部内充分循环；
f.在步骤e)之后，将所述端部从所述散样本储存室拆下；
g.将所述磁性舱与步骤f)中拆下的所述端部分离；以及
h.分析保留在所述端部内的所述顺磁颗粒，以确定感兴趣的所述目标分析物的存在。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述目标分析物为生物颗粒。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物颗粒选自由大分子、蛋白质、肽、细胞内结构和特定类型的细胞组成的组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞为癌细胞。
19.根据权利要求17所述的方法，其中通过选自由摇动、振动、转动和压缩组成的组中的方法使具有所述多个顺磁性颗粒的所述散液体样本循环。
20.根据权利要求17所述的方法，其中对含有所述多个顺磁性颗粒的所述散液体样本进一步施加电磁能，如果存在所述目标分析物的话，则可促进顺磁性颗粒与感兴趣的所述目标分析物的结合，并使所述顺磁性颗粒保留在所述端部的所述内部内，所述电磁能选自由UV辐射、红外线辐射和微波组成的组。
21.根据权利要求17所述的方法，其中对含有所述多个顺磁性颗粒的所述散液体样本进行加热，如果存在所述目标分析物的话，则可促进顺磁性颗粒与感兴趣的所述目标分析物的结合，并使所述顺磁性颗粒保留在所述端部的内部内。
22.根据权利要求17所述的方法，其中对含有所述多个顺磁性颗粒的所述散液体样本进行冷却，如果存在所述目标分析物的话，则可促进顺磁性颗粒与感兴趣的所述目标分析物的结合，并使所述顺磁性颗粒保留在所述端部的内部内。
23.根据权利要求17所述的方法，其中对含有所述多个顺磁性颗粒的散液体样本施加机械能，如果存在所述目标分析物的话，则可促进顺磁性颗粒与感兴趣的所述目标分析物的结合，并使所述顺磁性颗粒保留在所述端部的内部内。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述机械能为超声波。
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