CN110161671B

CN110161671B - 暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置

Info

Publication number: CN110161671B
Application number: CN201910361630.4A
Authority: CN
Inventors: 戴博; 周正萌; 张大伟; 王凯民; 郑璐璐
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110161671A

Abstract

本发明公开了一种暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置，具有样品台，所述样品台物镜焦点处用于放置样品，所述样品台一侧设置由若干台不同波长光源排列而成的光束发射单元，所述样品台另一侧依序设置光束处理单元、用于放大光束以保证光斑完整的照射在光束过滤单元的光束放大单元、光束过滤单元以及光束接收单元。本发明适用于生物观察检测，并且使用便捷，成本低，具有良好成像效果。

Description

暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置

技术领域

本发明涉及成像装置，尤其是涉及暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置。

背景技术

光学显微镜是不同学科中普遍存在的工具，提供材料和生物标本的详细可视化。在过去的几十年中，显微镜的不断进步已经引入了许多新的成像方式。然而，明场，暗场和相位对比显微镜仍然代表了最常见和广泛使用的非染色成像方法。明场(BF)显微镜通过映射穿过样本的光的强度调制来提供图像。虽然它是最简单和最常见的显微镜形式，但它不适合观察半透明样品，如未标记细胞和薄组织样本，因为这些样本在可见光下不会表现出强烈的衰减。暗场(DF)显微镜可以生成薄对象的高对比度图像，对样本边缘敏感。DF显微镜采用超出光学成像***可捕获的最大角度的倾斜光照射，从而最小化未散射的背景，同时收集来自样品的散射光。相衬显微镜，例如Zernike和微分干涉对比(DIC)显微镜，通过将照射样品的光的光学相位延迟呈现为强度分布来提供图像。在论文“Quantitative phaseimaging using a partitioned detection aperture”(OPTICS LETTERS/Vol.37,No.19/October 1,2012)中，描述了一种非干涉技术来进行定量相衬成像，但仍只能实现单一的成像模式。

尽管明场，暗场和相位对比图像提供了样本的互补信息，但是在传统显微镜中同时采集这些图像是不可行的，因为每种模态都需要不同的光学布置和专用光学元件。此外，成像模式之间的转换伴随着时间和额外光学元件的浪费，不够节能便捷。在论文“Real-time brightfield,darkfield,and phase contrast imaging in a light-emittingdiode array microscope”(Journal of Biomedical Optics 19(10),106002(October2014))和Microscopy refocusing and dark-field imaging by using a simple LEDarray(October 15,2011/Vol.36,No.20/OPTICS LETTERS)中，均提出了一种利用LED阵列实现多模式照明成像的方法，但都无法解决同步成像的问题，需要频繁地切换光源得到预期效果。

此外，市场现有的荧光检测显微镜功能单一，仅可实现特定物质的荧光检测。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置，旨在适用于生物观察检测，并且使用便捷，成本低，同时具有良好成像效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置，具有样品台，所述样品台物镜焦点处用于放置样品，所述样品台一侧设置由若干台不同波长光源排列而成的光束发射单元，所述样品台另一侧依序设置光束处理单元、用于放大光束以保证光斑完整的照射在光束过滤单元的光束放大单元、光束过滤单元以及光束接收单元。

进一步：所述光束发射单元具有405nm激光器、488nm激光器、532nm激光器、638nm激光器；所述405nm激光器以小于48.6°的入射角入射到样品台；所述488nm激光器与405nm激光器关于光轴对称；所述532nm激光器以大于48.6°的入射角入射到样品台；所述638nm激光器与532nm激光器关于光轴对称。

进一步：所述光束处理单元由放大倍率为20倍、数值孔径NA为0.75的物镜组成。

进一步：所述光束放大单元放大倍数为1.67，由焦距为30mm的第一透镜、焦距为50mm的第二透镜以及光阑组成，所述第一透镜布置在一侧，所述第二透镜布置在另一侧，所述光阑布置在第一透镜的像方焦平面处。

进一步：所述光束过滤单元具有依序布置的两组透镜阵列A，一组滤波片阵列以及一组透镜阵列B；每组透镜阵列A由四个子透镜A组成，以“田”字状分布，用于将光束分为4束光束，对应地射向滤波片阵列的四个窗口；所述滤波片阵列由四个子滤波片组成，以“田”字状分布，用于将接收到的光对应不同波长过滤，使每个窗口只透过对应波长的光并射向透镜阵列B；所述透镜阵列B由四个子透镜B组成，以“田”字状分布，用于将四束光线分别聚焦于由图像传感器构成的成像用光束接收单元。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明因为含有四套波长不同的光源，且两两成组，每组入射角度不同，可形成暗场、明场、相衬的同步成像，实现对不同物品的观测及多种模式的同步观测。

(2)本发明同时采用了两种荧光波段光源，可实现对特定荧光物质的检测。

(3)本发明所涉及的透镜阵列和滤波片阵列，将光分为四束，投射向滤波片的四个通道，通过滤波作用，可实现分区显示，最终在图像传感器上形成四个区域的像。

(4)本发明能够解决市场上传统显微镜功能单一，无法同步实现多模式成像的问题，操作简单，易于实现，能够填补市场上多功能显微镜的空缺，并且具有易操作、成本低的优点。

附图说明

图1为暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置结构图。

图2为透镜阵列A中子透镜A排列示意图。

图3为滤波片阵列中四个子滤波片排列示意图。

具体实施方式

参见图1到图3，一种暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置，具有样品台2，所述样品台2物镜焦点处用于放置样品，所述样品台一侧设置由若干台不同波长光源排列而成的光束发射单元1，所述样品台2另一侧依序设置光束处理单元3、用于放大光束以保证光斑完整的照射在光束过滤单元5的光束放大单元4、光束过滤单元5以及光束接收单元6。

样品台2为可上下位移平台，以保证光束汇聚点照射在样品上。

本实施例中，所述光束发射单元用来以不同角度发射不同波长的光，具有405nm激光器11、488nm激光器12、532nm激光器13、638nm激光器14；所述405nm激光器11以小于48.6°的入射角入射到样品台，使用时，需首先调整使其准直，并保证光线射入物镜；所述488nm激光器12与405nm激光器11关于光轴对称，使用方法同上，这两组激光用来实现明场和相衬的成像；所述532nm激光器13以大于48.6°的入射角入射到样品台，使用时需首先调整使其准直，并保证光线经由样品，却不射入到物镜；所述638nm激光器14与532nm激光器13关于光轴对称，使用方法同上。

光束发射单元有两种工作模式。模式一：打开405nm激光器11，488nm激光器12，630nm激光器，用于对荧光物质EGFP(增强绿色荧光蛋白)的检测，EGFP的激发波长在480nm左右，发射波长在530左右。模式二：打开405nm激光器，488nm激光器，530nm激光器，用于对荧光物质PPIX(原卟啉)的检测，PPIX的激发波长在405nm左右，发射波长在638nm左右。

需要说明的是，光束发射单元1中为四套不同波长的光源，每套光源出射光均为准直光，波长分别为λ₁、λ₂、λ₃、λ₄。(分别对应630nm激光器13、488nm激光器12、405nm激光器11、530nm激光器14)其中，λ₁、λ₂、λ₃波长的光源为一组，λ₂、λ₃、λ₄波长的光源为一组，使用时，只开启其中一组光源，即λ₁或λ₄波长的光源关闭。当开启λ₁、λ₂、λ₃波长的光源时，λ₁波长的光源用于暗场成像，λ₂、λ₃波长的光源用于明场、相衬、荧光成像，其中λ₂波长的光源作为荧光激发光源，荧光发射光的波长为λ₄；当开启λ₂、λ₃、λ₄波长的光源时，λ₄波长的光源用于暗场成像，λ₂、λ₃波长的光源用于明场、相衬、荧光成像，其中λ₃波长的光源作为荧光激发光源，荧光发射光的波长为λ₁。光源安置时，需确保λ₂、λ₃波长光源的光照射样品时，与物镜光轴呈对称的角度±α，0<α<θ_NA,θ_NA与物镜数值孔径的对应关系是θ_NA＝sin^-1NA，其中θNA为数值孔径角，NA为物镜的数值孔径；并且，需确保λ₁、λ₄波长光源的光照射样品时，与物镜光轴呈一定的角度β，β>θ_NA。

本实施例中，所述光束处理单元3由放大倍率为20倍、数值孔径NA为0.75的物镜组成。

本实施例中，所述光束放大单元4放大倍数为1.67，由焦距为30mm的第一透镜41、焦距为50mm的第二透镜42以及光阑组成，所述第一透镜41布置在一侧，所述第二透镜42布置在另一侧，所述光阑43布置在第一透镜的像方焦平面处，即第二透镜的物方焦平面。光束放大单元4将接收发射光线(图中光线①为明场或相衬光路，光线②为暗场光路)，并在其后聚焦于一点。

本实施例中，所述光束过滤单元5具有依序布置的两组透镜阵列A51，一组滤波片阵列52以及一组透镜阵列B53；每组透镜阵列A51由四个子透镜A组成，以“田”字状分布，用于将光束分为4束光束，对应地射向滤波片阵列52的四个窗口；所述滤波片阵列52由四个子滤波片组成，以“田”字状分布，用于将接收到的光对应不同波长过滤，使每个窗口只透过对应波长的光并射向透镜阵列B53；所述透镜阵列B53由四个子透镜B组成，以“田”字状分布，用于将四束光线分别聚焦于由图像传感器构成的成像用光束接收单元6。

以“田”字状分布的滤波片中，每个滤光片与透镜阵列中的子透镜单元一一对应形成四个窗口，四个窗口所作用的波长为λ₁、λ₂、λ₃、λ₄，使最终聚焦于图像传感器(光束接收单元6)的四个区域的图像分别为λ₁、λ₂、λ₃、λ₄的图像。

光束接收单元6用于接收最后形成的像，四个区域分别对应532nm、408nm、488nm、630nm波长的图像。工作模式一时，区域一为EGFP荧光成像，区域二、三为明场和相衬成像，区域四为暗场成像；工作模式二时，区域一为暗场成像，区域二、三为明场和相衬成像，区域四为PPIX荧光成像。

需要强调的是，图像传感器长或宽的尺寸需大于滤波片阵列每条边的尺寸，图像传感器的靶面分为四个区域，以“田”字状分布，区域一用于接收λ₁波长的光信号，区域二用于接收λ₂波长的光信号，区域三用于接收λ₃波长的光信号，区域四用于接收λ₄波长的光信号。当λ₁、λ₂、λ₃波长的光源开启时，区域一用于暗场成像、区域二和区域三用于明场和相衬成像、区域四用于λ₂经过荧光样品激发出的λ₄对应的荧光成像；当λ₂、λ₃、λ₄波长的光源开启时，区域一用于λ₃经过荧光样品激发出的λ₁对应的荧光成像、区域二和区域三用于明场和相衬成像、区域四用于暗场成像。对图像传感器接受面建立X-Y坐标，X表示横轴坐标，Y表示纵轴坐标，区域二和区域三的光强分布为I_λ2(x,y)和I_λ3(x,y)，明场成像的光强分布为I_BF(x,y)，相衬成像的光强分布为I_DPC(x,y)，其中I_BF(x,y)和I_DPC(x,y)分别由公式I_BF(x，y)＝I_λ2(x，y)+I_λ3(x，y)，

得到。当λ₁波长的光源用于暗场成像时，暗场成像的光强分布为I_DF(x,y)＝I_λ1(x,y)，荧光成像的光强分布为I_FL＝I_λ4(x,y)；当λ₄波长的光源用于暗场成像时，暗场成像的光强分布为I_DF(x,y)＝I_λ4(x,y)，荧光成像的光强分布为I_FL＝I_λ1(x,y)。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施方式，凡是属于本发明原理的技术方案均属于本发明的保护范围。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的原理的前提下进行的若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置，其特征在于，具有样品台（2），所述样品台（2）物镜焦点处用于放置样品，所述样品台一侧设置由若干台不同波长光源排列而成的光束发射单元（1），所述样品台（2）另一侧依序设置光束处理单元（3）、用于放大光束以保证光斑完整的照射在光束过滤单元（5）的光束放大单元（4）、光束过滤单元（5）以及光束接收单元（6）;

所述光束发射单元（1）包括四套不同波长的光源，每套的光源的波长分别为λ1、λ2、λ3、λ4，当λ2、λ3波长光源的光照射样品时，与物镜光轴呈对称的角度±α，0<α<θNA, θNA与物镜数值孔径的对应关系是θNA=sin-1NA，其中θNA为数值孔径角，NA 为物镜的数值孔径；并且λ1、λ4波长光源的光照射样品时，与物镜光轴呈一定的角度β，β>θNA；

所述光束过滤单元（5）具有依序布置的两组透镜阵列A（51），一组滤波片阵列（52）以及一组透镜阵列B（53）；每组透镜阵列A（51）由四个子透镜A组成，以“田”字状分布，用于将光束分为4束光束，对应地射向滤波片阵列（52）的四个窗口；所述滤波片阵列（52）由四个子滤波片组成，以“田”字状分布，四个子滤波片所作用的波长为λ1、λ2、λ3、λ4，使得最终聚焦于图像传感器的四个区域的图像分别为λ1、λ2、λ3、λ4的图像，用于将接收到的光对应不同波长过滤，使每个窗口只透过对应波长的光并射向透镜阵列B（53）；所述透镜阵列B（53）由四个子透镜B组成，以“田”字状分布，用于将四束光线分别聚焦于由图像传感器构成的成像用光束接收单元（6）；

其中λ3的波长的光源作为荧光激发光源，荧光发射光的波长为λ1，或λ2波长的光源作为荧光激发光源，荧光发射光的波长为λ4。

2.根据权利要求1所述的暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置，其特征在于：所述光束发射单元具有405nm激光器（11）、488nm激光器（12）、532nm激光器（13）、638nm激光器（14）；所述405nm激光器（11）以小于48.6°的入射角入射到样品台；所述488nm激光器（12）与405nm激光器（11）关于光轴对称；所述532nm激光器（13）以大于48.6°的入射角入射到样品台；所述638nm激光器（14）与532nm激光器（13）关于光轴对称。

3.根据权利要求1所述的暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置，其特征在于：所述光束处理单元（3）由放大倍率为20倍、数值孔径NA为0.75的物镜组成。

4.根据权利要求1所述的暗场、明场、相衬、荧光多模式同步成像显微成像装置，其特征在于：所述光束放大单元（4）放大倍数为1.67，由焦距为30mm的第一透镜（41）、焦距为50mm的第二透镜（42）以及光阑组成，所述第一透镜（41）布置在一侧，所述第二透镜（42）布置在另一侧，所述光阑（43）布置在第一透镜的像方焦平面处。