CN110161170B - 样品处理装置及含有该装置的生物活性筛选*** - Google Patents

Abstract

本发明属于活性成分筛选领域，涉及一种样品处理装置、制备平面色谱微阵列的装置以及生物活性筛选***。该***含有平面色谱、网格板、微孔板、生物活性检测单元和质谱分析单元；该***用于将平面色谱制备成“平面色谱成分微阵列”样本，以该样本开展生物活性试验、聚焦到显著生物活性阵列单元开展质谱分析；以生物活性强度与相应阵列单元的生物质谱准分子离子峰强度之间的依赖关系及它们的色谱行为耦合度为指征，从成分复杂、含量悬殊的复杂成分中解析生物活性成分。本发明***无须预先对化学成分逐一分离纯化，无须全面的分析检测，不依赖分子多样性化合物库、样本可平行扩增、兼容性好、高通量、数字化，极大提高筛选效率，减少工作量和成本。

Description

样品处理装置及含有该装置的生物活性筛选***

技术领域

本发明属于药物分析和生物检验技术领域，具体涉及一种样品处理装置以及含有该装置的以平面色谱成分微阵列高通量筛选复杂成分中生物活性成分的***。

背景技术

天然产物、中药及其复方以及人工合成和生物工程产品，如陆生动植物、海洋生物和微生物体内各类物质成分以及分离出来的生物二次代谢产物，是潜在的药用资源化合物库。它们大多具有成分复杂且含量差异悬殊的特点，从中筛选出具有显著生物活性的新药一直是困扰我们的问题。

高通量药物筛选技术作为快速发现药用先导化合物的手段发展迅猛，微阵列及化合物芯片技术是其发展的前沿。

微阵列及化合物芯片技术是指将分子多样性化合物库中的化合物按二维阵列逐个有序编排在平面载体上接受生物活性反应检测，筛选其中的生物活性化合物、揭示化合物与生物活性大分子(RNA、DNA、蛋白或配基)相互作用的实验方法。以它为框架发展出了小分子化合物芯片(SMMs)、微流控芯片(microfluidic live-cell microarray)等多种实验平台，为组合化学所得的大量化合物库的药用开发提供了卓越的技术手段[Ma H,HoriuchiK Y.Chemical microarray:a new tool for drug screening and discovery[J].Drugdiscovery today,2006,11(13): 661-668.]。但该方法是近乎理想的筛选方法，它严重依赖分子多样性化合物库[Janzen W P. Screening technologies for small moleculediscovery:the state of the art[J].Chemistry&biology, 2014,21(9):1162-1170.],这对于经常超乎设想的庞大而复杂的天然产物的活性成分筛选来说是难以做到的。

平面色谱法(Plane Chromatography)因兼具色谱分离、差异分布和原位记载特点而有别于HPLC等其它色谱方法。平面色谱(TLC)生物自显影方法也在生物活性分子筛选中得到应用[E.G.

A,Gether J,Landmark L,

M,Detection of mutagens incomplex samples by the salmonella assay applied directly on thin-layerchromatography plates,Science.215 (1982)87-89.]，但由于平面色谱的分离介质对生物活性反应和化学分析检测的干扰或妨碍而受到一定限制[Choma I M,Grzelak EM.Bioautography detection in thin-layer chromatography, Journal ofChromatography A.1218(2011)2684-2691.]。

派生于平面色谱的West-Blot(免疫印迹检测)方法将生物大分子从凝胶电泳层转移到亲电膜上，以特异免疫反应识别生物活性大分子。该方法在免疫分析方面得到了普及应用。但该方法依赖免疫特异反应，应用范围受限。

CAMAG公司(Muttenz,Swit-Zerland)的薄层色谱-质谱接口(TESI-MS Interface)提供了从薄层板上选择4mm直径环形区域半自动提取色谱成分用于各种实验的方法，美国专利 US20060160127“EXTRACTION OF MOLECULES USING FRAME”公开了用板框压住电泳条带目标区域组成液体池提取色谱斑点成分的方法。二者都用于局部色谱成分的提取，存在溶剂在固定相的毛细作用带来的色谱斑点扩散和交叉干扰。

CN 106818868 A“复杂天然产物中活性成分筛选方法及应用”公开了一种采用多通道高效液相色谱分离、质谱检测并联，由馏分自动收集到96孔微孔板上进行活性评价连贯结合方法，将常规筛选方法“连贯结合”起来，但效能和质量却打折扣：①虽然并列到同一恒流泵的五根色谱柱的总流量是恒定的，但是各色谱柱的柱压曲线不尽相同，各自流量自然也不一样，而且柱压是动态变化的，加上色谱馏分在微孔板上的排布是流水式的、没有定峰收集，这使分析检测、活性评价与馏分三者的对应关系得不到保证；②为了适应微孔板的容量，将中药提取物在粒径5μm、直径4.6mm的高效液相色谱上的分离限制在0.40ml/min流量和 35min内完成，这使得HPLC的分离性能和ESI-MS检测的选择性和灵敏度得不到发挥；③仅按流出体积将成分复杂、含量十分悬殊的中药成分分成96个馏分，在96孔微孔板上做生物活性检测，微孔池中化学成分不能保证是单体，生物活性归属化学成分难以确定。这些都对分析检测和活性评价的选择性和灵敏度造成不利影响，令实验结果难以重复与再现，给活性化合物的甄别和筛选造成困难，容易发生漏筛和误筛。

CN 104792914 A“一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法及其应用”公开一种平面色谱与微孔板阵列映射关联实验方法及其应用，该方法将平面色谱斑点成分映射到微孔板阵列单元上进行生物活性实验和分析检测，在活性指导下筛选中药和天然产物中的活性组分。为了使每个色谱斑点尽可能地落入同一个微孔池内，该方法要求平面色谱斑点与微孔板阵列严格对应，这对于斑点形状和位置不规则的薄层色谱图来说实施难度大；对于一个色谱斑点分落到多个微孔池、微孔池中有多种共存成分的情况，生物活性归属化学成分难以确定。再之，用硅胶密封圈将薄层板与微孔板组合成的腔体在翻转洗脱时，不能消除溶剂在固定相的毛细作用带来的不同的微孔池的色谱斑点扩散和交叉干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种样品处理，用于划分剥离平面色谱指纹图的色谱薄层。

本发明的目的另一目的在于提供一种制备平面色谱微阵列的装置，用于使平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离到微孔板中，进行生物活性成分的筛选。

本发明的另一目的还在于提供一种生物活性筛选***，用于高通量筛选生物活性成分。

本发明的目的还提供上述装置和***的使用方法。

本发明的目的还在于提供一种不完全依赖分子多样性化合物库的生物活性成分的装置、***。

本发明的目的还在于提供一种微量/半微量水平、可重复再现的生物活性成分筛选装置、***。

本发明的目的还在于提供一种将色谱分离、生物活性检测和质谱联用从复杂成分中解析出生物活性成分的装置、***。

本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

一方面，本发明提供了一种样品处理装置，该样品处理装置为网格板，具有多个由网格边框所限定出来的通道型空间，所述通道型空间具有开放的第一端和第二端，其中在第一端的开放平面上，限定各个通道型空间的网格边框的面积优选地小于等于该通道型空间第一端面积的10％，更优选小于等于5％，更优选小于等于3％；下限可以为2％，例如大于等于2％，或者1％，例如大于等于1％。当限定各个通道型空间的网格边框的在第一端平面的面积足够小时，小于等于该通道型空间第一端面积的10％，此时，各网格边框在第一端的边框厚度足够窄，形成锐边，可用于切割平面色谱的色谱薄层，保证所有的色谱薄层均能够被切割分离开来。理论上，该比例可无限接近0％，但实际上，无法做到每个网格边框没有厚度。

其中，每个通道型空间在第一端平面为正n边形，且满足n边形内角度数＝180(n-2)÷n。此时，通道型空间的第一端可以铺满整个平面，保证平面色谱的色谱薄层被完全切割。

作为优选的实施方式，所述的样品处理装置还含有微孔板，所述的网格板的阵列格式与微孔池的阵列格式对应。所述通道型空间的开放的第二端用于与微孔板的微孔池对接。

作为优选的实施方式，在第二端的开放平面上，限定每个通道型空间的网格边框的厚度大于第一端的开放平面上的网格边框厚度，并且与微孔板的微孔池池边厚度相同。

作为本发明一种优选的实施方式，通道型空间在第一端平面为正四边形，所述的接口板的通道型空间为正四棱台，其中正四棱台的下底面即为通道型空间的开放的第一端，上底面即为通道型空间的开放的第二端。进一步地，限定每个通道型空间的网格边框纵截面为等腰梯形，等腰梯形的下底边宽度与微孔板的微孔池池边厚度相同；等腰梯形的上底边宽度≤0.15mm，使等腰梯形尽可能近似于等腰三角形，等腰梯形的上底边的网格边框形成方口锐边，用于切割平面色谱的色谱薄层；等腰梯形的下底边宽度与微孔板的微孔池池边厚度相同。

作为更优选的实施方式，所述的网格板的阵列格式与384微孔板阵列格式对应为4.5mm×4.5mm方格的横24×纵16阵列格式。更具体地，网格边框纵截面为高2.5mm的等腰梯形。等腰梯形的下底边宽度与384方口微孔板微孔池池边厚度相同，为0.68‐0.72mm；等腰梯形的上底边宽度≤0.15mm。

需要说明的是，这里的网格边框纵截面是以接口板水平放置时，沿通道型空间纵切面切出的截面，且是以一个网格一边的边框的纵截面说明其构造。

本发明中，作为一种可选的实施方式，所述的网格板通过3D打印制备。

该网格板用于划分、剥离平面色谱指纹图的色谱薄层。因其网格内空为四棱台，因此，网格板两边网格边框的厚度不同，一边厚度小，形成方口锐边，该方口锐边用于与平面色谱指纹图的色谱薄层对接，划分、剥离平面色谱指纹图的色谱薄层。另一边则相对较钝一些，一般厚度是以微孔池池边厚度相同，用于与微孔板对接，将划分和剥离后的色谱薄层被微孔板的微孔池接收。

另一方面，本发明提供了一种制备平面色谱微阵列的装置，该制备平面色谱微阵列置含有阵列格式一一对应的平面色谱、上述的网格板、微孔板。

其中，所述的平面色谱用于构建待筛选样本的平面色谱指纹图；

所述的网格板用于将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离；

所述的微孔板用于定位接收平面色谱的成分，制备成平面色谱成分微阵列样本(也称为为平面色谱微阵列)。

需要说明的是，平面色谱微阵列具体是指微孔板上含有经前处理的样本，所述的经前处理的样本即待筛选活性成分的样本经色谱薄层分离后，按微孔板阵列格式划分后，将其色谱成分整体映射并移植到微孔板相应的微孔池上，去除色谱薄层基质后的阵列样本。该阵列样本每个阵列单元保留了薄层色谱对应区域的化学成分特征、组成和色谱信息，微阵列样本整体保留了平面色谱指纹图谱色谱的化学成分、组成及其色谱差异和特征。

其中，该平面色谱可选自无支撑基体的平面色谱和/或有支撑基体的平面色谱；作为示范性的实施方式，所述的无支撑基体的平面色谱如凝胶电泳、聚合物膜电泳、聚合物膜薄层色谱或电泳条带转膜的聚合物膜。作为示范性的实施方式，所述的有支撑基体的平面色谱选自玻璃板基体的制备型薄层硅胶色谱板或铝基薄层色谱硅胶板。作为一种优选的实施方式，所述的平面色谱选自铝基薄层色谱硅胶板，尤其是高效铝基薄层色谱硅胶板。

当所述的平面色谱选自铝基薄层色谱硅胶板时，所述的平面色谱还含有PVDF膜；还更优选地，所述的平面色谱还含有硅橡胶片和纸片；在该***运行时，硅橡胶片、网格板、PVDF膜、铝基薄层色谱硅胶板和纸片依序由下至上平行层叠放置。

本发明的制备平面色谱微阵列的装置中，平面色谱指纹图谱的色谱图展距和通道宽度的微孔板阵列格式对应。作为优选的实施方式，所述的平面色谱的展距和通道宽度为4.5mm 的倍数，包含展距9.0cm×通道7.2cm的一维平面色谱和展距7.2cm×通道7.2cm的二维平面色谱。

作为优选的实施方式，该***中，所述的微孔板为方口微孔板。作为更优选的实施方式，所述的方口微孔板为384孔方口微孔板，其阵列格式为4.5mm见方的横24×纵16阵列。

该***中的网格板见上述的样品处理装置的描述。

作为优选的实施方式，该制备平面色谱微阵列的装置还含有微孔过滤板。该微孔过滤板用于将网格接口划分和剥离的色谱薄层定位洗脱到微孔板。作为其中一种优选的实施方式，所述的微孔过滤板为384方口微孔过滤板；更优选地，所述的384方口微孔过滤板的型号为 Pall No.5072。

另一方面，本发明还提供了该制备平面色谱微阵列的装置的使用方法。

1)用平面色谱构建待筛选样本的平面色谱指纹图谱；

2)采用网格板，将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离、定位洗脱到微孔板的微孔池中，制备成平面色谱成分微阵列样本。

作为优选的实施方式，步骤2)中，把剥离并定位于网格板中的色谱层先推入微孔过滤板的微孔池中，然后将微孔过滤板对齐接受洗脱液的微孔板，再采用溶剂将色谱固定相上的色谱成分定位洗脱到微孔板中相应的微孔池中。

另一方面，本发明还提供了含有上述制备平面色谱微阵列的装置或装置的使用方法制备平面色谱微阵列。

该平面色谱微阵列为微孔板上包含经平面色谱薄层分离，采用与微孔板阵列格式对应的接口板划分，将其色谱成分整体映射并移植到微孔板相应的微孔池上，去除色谱薄层基质的待筛选生物活性的样本。该阵列样本每个阵列单元保留了薄层色谱对应区域的化学成分特征、组成和色谱信息，微阵列样本整体保留了平面色谱指纹图谱色谱的化学成分、组成及其色谱差异和特征。

另一方面，本发明还提供了一种含有上述制备平面色谱微阵列的装置的生物活性筛选***。

在该***中，除了上述的制备平面色谱微阵列的装置，其还含有质谱分析单元和生物活性检测单元。

所述的质谱分析单元用于测定平面色谱成分微阵列样本中的活性成分的质谱信息；

所述生物活性检测单元用于检测平面色谱成分微阵列样本中的生物活性。

本发明的***中，所述的质谱分析单元选自带有软电离离子源的质谱分析单元。更具体地，所述的软电离离子源可以选自液相色谱-质谱联用中的电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)，基质辅助激光解吸电离(MALDI)，或为气相色谱-质谱联用中的化学电离中的一种或几种。作为优选的实施方式，所述的软电离离子源为电喷雾电离。

本发明的***中，所述的生物活性检测单元含有酶标仪、多功能微孔板检测***、高通量微孔板检测仪等中的一种或几种。

作为优选的实施方式，本发明的***中还含有数据处理***，用于进行平面色谱成分以阵列方式进行数字化表述，构建生物活性分布图，生物活性强度与质谱信息关联、耦合、归一化分析，活性物质遴选和构建“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱等操作中的一种或几种操作。

另一方面，本发明还提供了上述的生物活性筛选***的使用方法，其包含以下步骤：生物活性筛选***。

1)用平面色谱构建待筛选样本的平面色谱指纹图谱；

2)采用网格板，将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离、定位洗脱到微孔板的微孔池中，制备成平面色谱成分微阵列样本；

3)采用生物活性检测单元，对平面色谱成分微阵列样本进行生物活性检测；

4)采用质谱分析单元，对活性热点阵列单元及其毗邻区阵列单元开展质谱分析；

作为优选的实施方式，在步骤2)制备成平面色谱成分微阵列样本，采用数据处理***对平面色谱成分以阵列方式进行数字化表述；

作为优选的实施方式，步骤3)中，生物活性检测完成后，采用数据处理***构建生物活性分布图；

作为优选的实施方式，步骤4)中，质谱分析后，采用数据处理***对生物活性强度与质谱信息关联、耦合、归一化分析，遴选出活性物质，构建“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱。

为了更充分地说明本发明的生物活筛选***的操作或者使用方法，以下将进一步描述。

本发明将反映复杂成分化学成分特征的平面色谱指纹图谱按微孔板阵列格式划分，将其色谱成分整体映射并移植到微孔板相应的微孔池上，制备成“平面色谱成分-微阵列”样本；在该微阵列样本上开展生物活性试验、活性成分追踪分析和和色谱行为考察，把色谱斑点形状和位置分布不规则的平面色谱成分特性以阵列方式进行数字化，将微阵列单元活性成分的生物活性强度和质谱准分子离子峰强度这些特有属性的阵列分布作为色谱行为进行关联分析；以平面色谱微阵列样本中生物活性强度与质谱准分子离子峰强度相互依赖、色谱行为耦合的化合物分子作为药效物质基础的筛选指征，并对阵列单元中归属于相同分子的生物活性归一化作为该分子的活性贡献度纳入遴选考量，构建起一个色谱分离、生物活性检测和化学分析相结合的高通量筛选平台。在此基础上，将平面色谱图、生物活性热力图和活性化合物之间的对应关系量化可比地表达出来，构建“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱。

下文所指的平面色谱可以选自无支撑基体和/或有支撑基体的平面色谱。作为无支撑基体的平面色谱的例子如凝胶电泳、聚合物膜电泳、聚合物膜薄层色谱或电泳条带转膜的聚合物膜；作为有支撑基体的平面色谱的例子如玻璃板基体的制备型硅胶薄层色谱板或铝基薄层色谱硅胶板。作为本发明一种优选的实施方式，所述的平面色谱选自铝基薄层色谱硅胶板。

待筛选样本为复杂成分提取物，包括但不限于天然产物，例如陆生动植物、海洋生物、微生物中的天然产物提取物。

或者，作为一种优选的实施方式，所述的待筛选样本为中药复方提取物和人工合成产物、生物工程产物。

待筛选样本成分经过平面色谱分离之后按色谱保留时间差异分布所形成的色谱带称为平面色谱斑点。

需要说明的是这里所说的平面不是一个绝对的平面。其可以具有不等的厚度。

具体地，本发明的方法包括以下步骤：

S1.构建充分反映和记载待筛选样本化学成分差异特征及其色谱行为、且色谱图展距和通道宽度与方口微孔板阵列格式一致的平面色谱指纹图谱；

S2.将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离、定位洗脱到微孔板的微孔池中，制备成平面色谱成分微阵列样本；

S3.将色谱斑点的平面色谱成分的化学和生物特性以阵列方式进行数字化表述；

S4.将平面色谱成分微阵列样本进行生物活性检测，构建生物活性热点图(HeatMap)，选取活性热点阵列单元；

S5.针对活性热点阵列单元及其毗邻区阵列单元开展质谱分析；

S6.对活性热点阵列单元及其毗邻区阵列单元的生物活性强度和质谱准分子离子峰强度进行关联、耦合、归一化分析，遴选出生物活性成分；

S7.将平面色谱图、生物活性热力图和活性化合物之间的对应关系量化可比地表达出来，构建“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱。

其中S3中，在将平面色谱斑点对应于微孔板阵列进行数字化表述时，可能存在一些斑点恰好对应于微孔板中的某个或某些微孔池，我们称之为“规则斑点”；但也存在更多的情况，某个平面色谱斑点，其形状和位置分布并不能完全与某个或某些微孔池对应，我们称之为“不规则斑点”。上述的平面色谱斑点包括规则斑点和不规则斑点。

作为本发明一种优选的实施方式，所述的提取物的制备方为：分别采用Snyder(Snyder L R.Classification of the solvent properties of common liquids[J].Journal of Chromatography A, 1974,92(2):223-230.)提出的8类溶剂中每类各选至少一种溶剂进行超声提取，合并提取液后，再除溶剂得到中药或天然产物提取物。

在本发明一示范性的实施例中，所述的溶剂包含了典型的石油醚、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、苯和水；合并8种溶剂的提取液，制得充分反映该样本化学组成特征的提取物。

作为优选的实施方式，步骤S1的构建好待筛选样本的平面色谱指纹图谱，还需要考察平面色谱的分离度和浓度分布。作为一种可选的实施方式，采用紫外光下观察和碘熏和硫酸 -香草醛试剂显色考察平面色谱的分离度和浓度分布。

其中，步骤S1和S2中，平面色谱指纹图谱的色谱图展距和通道宽度与微孔板阵列格式一致。需要强调的是，平面色谱指纹图谱的色谱图展距和通道宽度与微孔板阵列格式一致，是为了整体建立平面色谱被划分阵列单元与微孔板微孔池阵列单元的对应性，但对于色谱层或其洗脱成分，仅要求其落入相同阵列格式微孔板对应的微孔池中即可，而对于微孔板微孔池的形状则无要求，如圆口和方口的微孔板即可。为了达到这一要求，网格板朝向平面色谱的一面的阵列格式与微孔板阵列格式对应，采用的是方口锐边，以在保证阵列格式的前提下尽量减少对接时与平面色谱层接触的面积，最大程度将色谱层导入微孔板；而与微孔板对接的一面，只要有利于将色谱层或其洗脱成分导入对应阵列单元，可以为方口或圆口或其他形状。

作为一种可选的方案，所述的微孔板为常用的方孔微孔板。作为一种优选的实施方式，所说的方孔微孔板为市面上常见的384孔方口微孔阵列板，其阵列格式为4.5mm见方的横 24×纵16阵列。与之相对应的，步骤S1中的平面色谱的展距和通道宽度为4.5mm的倍数，包含展距9.0cm×通道7.2cm的一维平面色谱和展距7.2cm×通道7.2cm的二维平面色谱。

作为对本发明一种有利的实施方式，步骤S2中，采用与微孔板阵列格式对应的接口板对步骤S1中的色谱薄层进行划分、剥离。

作为一种优选的实施方式，所述的接口板的网格内空为四棱台。作为更优选的实施方式，所述的网格板为4.5mm×4.5mm方格的横24×纵16阵列格式，网格边框纵截面为高2.5mm 的等腰梯形。等腰梯形的下底边宽度与384方口微孔板微孔池池边厚度相同，具体为0.68- 0.72mm，市售的方口微孔板，不同的厂家的微孔池壁厚小有差异，如Corning板为0.70mm，而Pall No.5072过滤板为0.68，国产的一些板约为0.72。等腰梯形下底边的一面用于与微孔板对接；等腰梯形的上底边宽度≤0.15mm，使等腰梯形尽可能近似于等腰三角形，等腰梯形的上底边的网格边框形成方口锐边，用于切割平面色谱的色谱薄层。

作为一种可选的实施方式，所述的接口板通过3D打印制备。

作为一种可选的实施方式，所述的接口板材料为硬质、有韧性的金属材料，例如钴铬合金或不锈钢等等。

针对不同类型的平面色谱，色谱薄层进行划分、剥离主要分为以下4种方式进行，但也不排除其他的可行的方案：

1)对于凝胶电泳等胶体无支撑基体的平面色谱层，在湿态时将其平行夹在接口板与玻璃板之间，放置到平行压板上平压，把整个平面色谱层分割成方形阵列并嵌在接口中。

2)对于聚合物膜电泳、膜色谱或电泳条带转膜的聚合物膜等无支撑基体的平面色谱层，将其平行夹在铝、铅等软金属薄片与接口板之间，接口板的锐边面朝聚合物膜，放置到平行压板上平压，把聚合物分割成方形阵列并嵌在接口中后，掀去软金属薄片即可。

3)对于玻璃板基体的制备型薄层硅胶色谱板，包含厚度为2.0mm的制备型薄层硅胶色谱板，将其干燥的硅胶面朝向网格板的锐边面并对齐，接口板的另一面垫上硅胶片，平行层叠在一起放置到平行压板上平压，压至整个平面色谱层分割成方形阵列并嵌在网格板的方格阵列中；然后释放压力至玻璃板在平行压板与网格板间刚刚可以平行滑动，侧向磕击玻璃板使之左右、前后各平行位移至少一个阵列单元，致玻璃板与硅胶层完全剥离。

4)对于铝基薄层色谱硅胶板，将硅橡胶片、网格板、PVDF膜、干燥的铝基薄层色谱硅胶板和薄纸片依序由下至上平行层叠，网格板的锐边面隔着PVDF膜对齐薄层色谱硅胶层，一起放置到平行压板上以1～80MPa的压力平压；具有延展性的薄铝板与松脆的薄层硅胶在网格板锐边的压迫下发生不同的变化，薄层硅胶整体有序地***成方形片状阵列，从微有变形的薄铝板上剥离并贴附在微嵌在接口中的PVDF膜上。PVDF膜柔软而有韧性，带有静电吸附性，衬有PVDF膜有助于防止色谱薄层剥离时碎裂散落，得到完整并整齐排列的硅胶薄层方格阵列。

色谱薄层划分、整体有序剥离完成后，接下来进行定位洗脱。进一步地，定位洗脱的步骤为：把剥离并定位于网格板中的硅胶薄层推入微孔过滤板的微孔池中，然后将微孔过滤板对齐接受洗脱液的微孔板，采用溶剂把色谱固定相上的色谱成分定位洗脱到微孔板中相应的微孔池中，得到平面色谱成分微阵列样本。其中，所述的微孔过滤板的阵列格式与微阵列的阵列格式相对应。作为一种优选的实施方式，与384孔方孔微孔板对应的微孔过滤板为384 方口微孔过滤板。在本发明一种示范性的实施例中，所采用的384方口微孔过滤板的型号为 Pall No.5072。

为了得到能够充分反映待筛选样本分子多样性的平面色谱成分微阵列样本，本发明多次重复步骤S1～S4，优化平面色谱指纹图的试验浓度区间、制备调制样品、以及优化平面色谱的二维溶剂***，经过优化后，制备能更好地反映平面色谱成分微阵列样本阵列单元的化学成分特性和生物活性、又能兼顾平面色谱分离度和容量的平面色谱成分微阵列样本。

具体地，其步骤为：

A.优化平面色谱指纹图的试实验浓度区间，参照S1和S2方法，在一定浓度范围内阶梯浓度点样，包含横向以4个浓度、优选涵盖20倍浓度范围、每个浓度平行5个阵列单元的布局点样，纵向展开16阵列单元，制备成横20×纵16阵列格式的一维平面色谱成分微阵列样本。在该微阵列样本上开展生物活性检测，以EXCEL电子表格处理数据、构建生物活性热力图；考察生物活性热度在阵列上的分布及其对应的试液浓度，优选可显著反映样本各阵列单元生物活性的试液浓度区间。

B.制备调制样品，参照S1和S2方法，在制备平面色谱板上高浓度平行点样，包含在薄层厚度2.0mm的制备平面色谱板上以10倍于高效平面色谱板的点样量平行点样20个阵列单元，展开16个阵列单元，制备成横20×纵16阵列格式的平面色谱成分微阵列样本。依据A中优选的试液浓度区间，在该微阵列样本上取样，组合16个阵列单元试液(对应于色谱成分)的比例，得到能更好反映平面色谱成分微阵列样本阵列单元的生物活性及其差异特征的调制样品。

C.以步骤B得到的调制样品参照S1和S2优化二维平面色谱溶剂***，使平面色谱的分离度和容量得到综合提升。

D.整合步骤A-C的结果，参照S1和S2，用调制样品点样、以优化的二维平面色谱溶剂***展开，制备出能从化学成分特性和生物活性两方面充分反映各阵列单元分子多样性及其差异特征的二维平面色谱成分微阵列样本。

其中，步骤S3中，将色谱斑点的平面色谱成分的化学和生物特性以阵列方式进行数字化表述。具体地，在平面色谱成分微阵列样本上开展生物活性检测和化学分析，以各阵列单元的实验数据反映平面色谱相应区域的色谱成分的特性，实现图形文件数字化。作为优选的实施方式，采用计算机对这些数据进行处理；进一步地，作为一种更优选方案，所述的具体步骤如下：将平面色谱成分微阵列样本上开展的各种生物活性检测和化学分析检测数据按其阵列坐标纳入计算机软件、包含EXCEL电子表格等进行数字化表达、数据分析和处理。

其中，该步骤S3，对色谱斑点，尤其是对色谱斑点形状和位置分布不规则的平面色谱成分特性用阵列进行数字化表述，其有助于后续的数据分析处理步骤，因为色谱斑点形状和位置分布不规则的斑点，该斑点的生物活性成分有可能分布在多个阵列单元。通过后续的对阵列单元中归属于相同分子的生物活性归一化作为该分子的活性贡献度纳入遴选考量”，可有效避免这种情况下出现的漏筛、错筛现象。

其中，步骤S4中，在平面色谱成分微阵列样本上开展生物活性检测，构建生物活性分布图，选取活性热点阵列单元”，作为一种优选方案，所述的具体步骤如下：

从优化后得到的二维平面色谱成分微阵列样本上，按阵列坐标分取试液到相同阵列格式微孔板对应的反应池里进行各种生物活性检测，包括细胞生存率检测、免疫反应、配体反应、探针检测、细菌培养和斑马鱼药效模型等中的一种或几种，以EXCEL电子表格等软件处理数据，构建生物活性热点图(Heat Map)，选取具有显著生物活性成分的阵列单元。

需要说明的是，所述的生物活性热点图(Heat Map)是指将在平面色谱微阵列样本上开展生物活性实验所得到的生物活性值按相应的阵列格式以数字、颜色等直观地标示出来，以便确定具有显著生物活性成分的阵列单元。

其中，步骤S5中，从样本庞大而复杂的成分中聚焦到生物活性热点区域，针对活性热点及毗邻区域开展液质谱分析，作为一种优选方案，所述的具体步骤如下：

在优化所得的二维平面色谱成分微阵列样本上，针对平面色谱成分微阵列样本具有显著生物活性的阵列单元及其毗邻阵列单元开展色谱分析检测，获得各阵列单元的准分子离子峰强度及其阵列分布差异等化学成分信息。

步骤S5中，所述的色谱分析方法选自可得到与样品各化学组分分子量有对应关系的准分子离子峰的带有软电离离子源的质谱分析。这些软电离离子源可以为诸如液相色谱-质谱联用中的电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)，基质辅助激光解吸电离(MALDI)，或为气相色谱-质谱联用中的化学电离。作为优选的实施方式，这些软电离离子源选自电喷雾电离；与传统质谱采用70电子伏特电压将化合物打成“碎片”离子不同，带有软电离离子源的质谱分析采用诱导电离等技术，化合物结构很少受到破坏，得到的是准分子离子，质谱图中的谱峰与样品各化学组分的质量数有对应关系。

其中，步骤S6中，将微阵列单元活性成分的生物活性强度和质谱准分子离子峰强度进行关联、耦合、归一化分析，具体为以平面色谱微阵列样本中具有显著生物活性阵列单元区域及其毗邻单元上的生物活性强度与质谱准分子离子峰强度(峰高或峰面积)相互依赖、色谱行为耦合的化合物分子作为药效物质基础的筛选指征，并对阵列单元中归属于相同分子的生物活性归一化作为该分子的活性贡献度纳入遴选考量，从庞大而复杂的中药及天然药物中高通量筛选生物活性成分。

需要强调的是，对于色谱成分，尤其是对色谱斑点形状和位置分布不规则的平面色谱成分，它们有可能分布在多个阵列单元。“对阵列单元中归属于相同分子的生物活性归一化作为该分子的活性贡献度纳入遴选考量”这一方法，可有效避免这种情况下出现的漏筛、错筛现象；

作为一种优选的方案，步骤S6的具体步骤如下：

根据微阵列样本的对应关系，将S4得到的生物活性强度与S5得到的质谱准分子离子峰强度以及它们的阵列分布作关联、耦合及归一化分析，遴选出生物活性强度-质谱准分子离子峰强度相互依赖、色谱行为耦合的化合物分子作为药效物质基础的遴选化合物；采用常规方法，依据遴选化合物的准分子离子峰的质荷比、所处阵列单元试液的药物分析检测、并溯源到其在平面色谱上显示的色谱特性、光谱特性、原位化学鉴别反应以及样本来源等，结合检索相关的化合物谱库、化合物库和文献资料等，初步筛选出生物活性化合物分子；以其对照品或将其分离制备出来，作进一步生物活性评价和确认。

作为一种更优选的实施方式，步骤S6的操作如下：

选取平面色谱成分微阵列样本上具有显著生物活性阵列单元区域及其毗邻阵列单元的生物活性强度数据阵列作为变量1；以相应区域阵列单元中共存的各主要准离子峰的强度(准离子峰的峰高或峰面积)阵列作为变量2；对变量1和变量2进行阵列的相关性分析，计算出各准分子离子峰与生物活性的相关系数；根据相关系数的大小筛选出活性成分；具体地，以相关系数排序遴选准离子峰对应的化合物作为生物活性物质，相关系数越大、相互差异越显著，可信度越高；当相关系数为负数时，该准离子峰对应的化合物不考虑为生物活性物质；对阵列单元中归属于相同分子的生物活性归一化作为该分子的活性贡献度纳入遴选考量；

两个阵列的相关性分析可以采用多种计算机软件及函数、如Excel软件的Correl函数和 RSQ函数，Matlab软件的Corrcoef函数等中的一种，它们均能实现本发明的阵列相关性分析的目的。

作为一个可选的实施方式，在发明的实施例中，阵列的相关性分析采用Excel的Correl (Array1，Array2)函数。

注：Array1、Array2即为变量1、变量2。

平面色谱微阵列样本中具有显著生物活性阵列单元区域及其毗邻单元上的生物活性强度与质谱准分子离子峰强度(峰高或峰面积)相互依赖，是药物发挥作用的内在关联；它们之间的色谱行为耦合是同一药物成分的化学行为和生物活性作用的宏观体现。二者均可从阵列相关分析中得到表达和量化。

其中，步骤S7中，构建“谱-效”相关的中药及天然产物平面色谱指纹图谱，作为一种优选方案，所述的具体步骤如下：

综合S1～S6的结果，将平面色谱指纹图、活性热点图和药效化合物分子之间的对应关系量化可比、直观形象地表达出来，包括：以平面色谱成分微阵列样本的阵列格式为X、Y 二维坐标，映射到对应的平面色谱指纹图阵列单元区域，在阵列单元上建立Y轴标示该阵列单元的活性值和对应的化合物成分(结构式、分子式或名称)，构建起“谱-效”相关的中药及天然产物平面色谱指纹图谱。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本装置、***将平面色谱的色谱分离、差异分布和原位记载的特点与微阵列的高通量、数字化和兼容性结合，制备成“平面色谱成分-微阵列”样本。该样本既保留了平面色谱的分离特性，又与色谱基体彻底分离，微阵列单元间相互分隔，排除了毛细扩散、吸附干扰、背景噪音等色谱基体干扰和妨碍，可自然地与现行生物活性检测和药物分析方法和规范对接。

2)本装置、***针对中药及天然产物等成分复杂、含量悬殊的特点，以Snyder提出的8类溶剂制备样本提取物，在综合考察生物活性检测灵敏度、平面色谱的分离度及容量的基础上，对样品成分的浓度比例做了优化调制，制备出能从化学成分特性和生物活性两方面整体反映中药及天然产物分子多样性及其差异特征的二维平面色谱成分微阵列样本，有利于微阵列样本的代表性和筛选的灵敏度，样本具有整体性、重复性和再现性，保证了同源平行样本的可扩增性。

3)在装置、***的平面色谱成分-微阵列样本上可开展生物活性试验、活性成分追踪分析和色谱行为考察，把色谱斑点形状和位置分布不规则的平面色谱成分特性以阵列方式进行数字化，构建起一个色谱分离、生物活性检测和化学分析相结合的高通量筛选平台。

4)本装置、***在具有分子多样性差异分布的平面色谱成分-微阵列样本开展生物活性检测，在生物活性示踪下将筛选目标从庞大而复杂的天然产物中迅速聚焦到稀缺的生物活性成分上，有的放矢地对活性热点及毗邻阵列单元区域进行精细的质谱分析；

5)本装置、***以微阵列单元的生物活性强度和质谱准分子离子峰强度这些特有属性的阵列分布作为活性成分的色谱行为进行关联分析，以平面色谱微阵列样本中生物活性强度与质谱准分子离子峰强度相互依赖、色谱行为耦合的化合物分子作为药效物质基础的筛选指征，并对阵列单元中归属于相同分子的生物活性归一化作为该分子的活性贡献度纳入遴选考量，实现了色谱分离、生物活性检测和ESI-MS分析三者在生物活性成分遴选中的联用。

6)本***基于平面色谱成分微阵列构建的“谱-效”相关的中药及天然产物平面色谱指纹图，将中药及天然产物的中药效物质基础特征以平面色谱图、活性热点图和药效化合物分子标识以及它们之间的对应关系直观形象、量化可比地表达出来，不再是与生物活性脱节、单一反映化学成分特征的平面色谱指纹图。

综上所述，本***将整体反映复杂成分分子多样性及其差异特征的平面色谱制备成“平面色谱成分微阵列”样本，以该样本开展生物活性试验、聚焦到显著生物活性阵列单元开展质谱分析；以具有显著生物活性阵列单元上的生物活性强度与相应阵列单元的质谱准分子离子峰强度之间的依赖关系及它们的色谱行为耦合度为指征，从成分复杂、含量悬殊的天然产物中解析生物活性成分，发挥了色谱分离、生物活性检测和质谱分析联用甄别和筛选生物活性成分的优势，提高了筛选的灵敏度和选择性。由此，本发明不要求预先对化学成分逐一分离纯化、不需全面的化学分析检测，也不依赖分子多样性化合物库、特异的生物活性反应或专用设备。本***具有样本可平行扩增、兼容性好、高通量、数字化的特点，在微量/半微量水平上实现了生物活性指导下的中药及天然产物生物活性成分的高通量筛选，极大地提高了筛选效率，减少了工作量和成本。

附图说明

图1平面色谱成分微阵列筛选流程示意图。

图2为二维薄层色谱指纹图谱。

图3为金属网格接口示意图。

图4为铝基薄层色谱硅胶板的阵列划分与剥离效果图；图4a和图4b为薄铝板的正反面，图4c为被剥离并贴附在PVDF膜上的薄层硅胶方形片状阵列，图4d为被剥离薄层硅胶方形片状。

图5为凝胶电泳片的阵列划分效果图。

图6为PVDF膜的阵列划分效果图；图6a为平压后掀去薄铅板后嵌在钴铬合金阵列网框中的PVDF膜，图6b为从网格推出的PVDF膜。

图7为硅胶层按384孔微孔板阵列格式被划分并整体剥落至384孔过滤板相应的微孔池中的效果图。

图8为在平面色谱成分微阵列样本上开展的细胞生存率试验取像及由细胞生存率试验结果绘制的生物活性热点图；图8a,A549肺癌细胞生存率检测微阵列样本取像，图8b.HepG2

肝癌细胞的生存率检测微阵列样本取像，图8c A549肺癌细胞的生存率检测微阵列样本的生物活性热点图，图8d.HepG2肝癌细胞的生存率检测微阵列样本的生物活性热点图。

图9a为图8c方框标示区域中生物活性最强阵列单元的ESI-MS质谱图，图9b为图8d方框标示区域2中生物活性最强阵列单元的ESI-MS质谱图。

图10a为实施例9中薄层色谱成分微阵列样本的G‐四链体配体筛选实验取像。

图10b为实施例9中用阵列格式数字化表达平面色谱相应区域的生物活性(以方框圈出)。

图11为被配体活性实验筛选的准分子离子峰最强阵列单元的ESI-MS质谱图。

图12为基于在平面色谱成分微阵列样本上开展的细胞生存率试验和质谱检测结果，构建起的与抗癌活性相关的高良姜提取物薄层色谱指纹图谱。

图13为本发明实施例3中的生物活性筛选***。

图14为本发明的金属网格接口板实物图，在该示例图中其为四边形网格，但这并非作为限制性的例子；其中a示出了金属网格接口板的第二端平面(宽边面)，b示出了金属网格接口板的第一端平面(锐口面)，这两个面上的网格边框的厚度是不同的，第二端平面的边框厚度厚，并且与微孔板(本图中未示出)的微孔池边的厚度对应、位置匹配；而第一端平面的边款厚度则尽量地薄；由此连通两个开放端的通道型空间为正四棱台。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1

一种样品处理装置

该实施例以跟384孔方口微孔板阵列格式对应的网格板为例，说明该网格板的构造，实际应用过程中，根据微孔板的阵列格式可进行调整。

如图3所示的网格板，该网格板具有多个由网格边框所限定出来的通道型空间(即每一个网格的内部空间)，所述通道型空间具有开放的第一端和第二端，其中在第一端的开放平面上，限定各个通道型空间的网格边框的面积为该通道型空间第一端面积的10％。此时，各网格边框在第一端的边框厚度足够窄，形成锐边，可用于切割平面色谱的色谱薄层，保证所有的色谱薄层均能够被切割分离开来。该通道型空间在第一端平面为正4边形，此时，通道型空间的第一端可以铺满整个平面，保证平面色谱的色谱薄层被完全切割。

所述的样品处理装置还含有微孔板，网格板的阵列格式与384方口微孔板一致，具体为: 4.5mm×4.5mm方格的横24×纵16阵列格式。所述通道型空间的开放第二端用于与微孔板的微孔池对接。

网格板的每个网格内空为正四棱台，网格边框纵截面为高2.5mm的等腰梯形(即网格板水平放置时的高度)、等腰梯形的下底边宽度与384方口微孔板微孔池边厚度相同，具体为0.70mm，下底边所处的平面即为开放型通道的开放的第二端所处的平面，该面用于与微孔板对接；等腰梯形的上底边宽度≤0.15mm的，上底边所处的平面即为开放型通道的开放的第一端所处的平面，上底面网框厚度小于下底面网框厚度，上底面网格边框形成方口锐边，用于切割平面色谱的色谱薄层。该网格板采用钴铬合金3D打印制备，也可以采用其他硬质、有韧性材料制备。

实施例2一种制备平面色谱微阵列的装置

该装置含有阵列格式一一对应的平面色谱、网格板、微孔过滤板、微孔板。以及生物活性检测单元和质谱分析单元。

平面色谱用于构建待筛选样本的平面色谱指纹图；网格板用于将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离；微孔过滤板用于将网格接口划分和剥离的色谱薄层定位洗脱到微孔板；微孔板用于定位接收平面色谱的成分，制备成平面色谱成分微阵列样本。

在该实施例中，所述的平面色谱指纹图谱的色谱图展距和通道宽度的微孔板阵列格式对应。具体地，平面色谱的展距和通道宽度为4.5mm的倍数，包含展距9.0cm×通道7.2cm的一维平面色谱和展距7.2cm×通道7.2cm的二维平面色谱。相对应的，所述的微孔板为: 4.5mm×4.5mm方格的横24×纵16阵列格式，其具体结构见实施例1，所述的微孔过滤板为 384微孔过滤板，所述的微孔板为384方口微孔板。如果其中一个结构的阵列格式改变，则相应的，其他结构的阵列格式与需要做出改变。

在该实施例中，所述的平面色谱选自铝基薄层硅胶板时，所述的平面色谱还含有PVDF 膜；还更优选地，所述的平面色谱还含有硅橡胶片和纸片；在该***运行时，硅橡胶片、网格板、PVDF膜、铝基薄层硅胶板和纸片依序由下至上平行层叠放置。

实施例3一种生物活性筛选***

如图13所示的生物活性筛选***，其含有阵列格式一一对应的平面色谱、网格板、微孔过滤板、微孔板，以及生物活性检测单元和质谱分析单元。

平面色谱用于构建待筛选样本的平面色谱指纹图；网格板用于将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离；微孔过滤板用于将网格接口划分和剥离的色谱薄层定位洗脱到微孔板；微孔板用于定位接收平面色谱的成分，制备成平面色谱成分微阵列样本；质谱分析单元用于测定平面色谱成分微阵列样本中的活性成分的质谱信息；生物活性检测单元用于检测平面色谱成分微阵列样本中的生物活性。

在该实施例中，所述的平面色谱指纹图谱的色谱图展距和通道宽度的微孔板阵列格式对应。具体地，平面色谱的展距和通道宽度为4.5mm的倍数，包含展距9.0cm×通道7.2cm的一维平面色谱和展距7.2cm×通道7.2cm的二维平面色谱。相对应的，所述的微孔板为: 4.5mm×4.5mm方格的横24×纵16阵列格式，其具体结构见实施例1，所述的微孔过滤板为 384微孔过滤板，所述的微孔板为384方口微孔板。如果其中一个结构的阵列格式改变，则相应的，其他结构的阵列格式与需要做出改变。

在该实施例中，还含有数据处理***，用于进行平面色谱成分以阵列方式进行数字化表述，构建生物活性分布图，生物活性强度与质谱信息关联、耦合、归一化分析，活性物质遴选和构建“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱等操作。

实施例4构建充分代表中药及天然产物样本化学组成、反映样本化学成分差异与特征的薄层色谱指纹图谱

1)以60目的高良姜干燥粉末为样品，从Snyder提出的8类溶剂中每类各选一种溶剂，它们是石油醚、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、苯和水；分别以它们为溶剂进行常规超声提取；合并8种溶剂的提取液，按常规方法除溶剂，制得高良姜提取物。遵循相似相溶原理，采用组合溶剂提取样本可使提取物更具有代表性。

2)薄层色谱的展距和通道宽度与384孔方口微孔板阵列(阵列格式为4.5mm见方的横 24×纵16阵列)严格对应，一维薄层色谱的展距和通道宽度设为9.0cm×通道7.2cm，二维薄层色谱的展距和通道宽度设为7.2cm×7.2cm，展距和通道均为4.5mm的倍数。选用氯仿∶甲醇＝98∶2为溶剂***A、石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸＝70∶30∶2为溶剂***B，以0.275g/mL的高良姜提取物甲醇溶液在Merk铝基高效薄层板点样5 μL，构建二维薄层色谱指纹图谱；本发明将整个平面色谱与微孔板微阵列严格对应起来，并保留平面色谱上化学成分色谱行为的整体性，为后续的量-效关系及它们的色谱行为分析奠定基础。发明人的在先专利CN104792914A则强调色谱斑点与阵列单元的映射对应关系，没有规定色谱展开区域与阵列格式的整体对应性，也可认为允许局部取斑点去对准网格，破坏了平面色谱的整体性，也出现当一个微孔池中出现多个组分时无法提供确认生物活性归属化合物依据的问题。而且，先以化学方法定域筛选生物活性成分的方法，容易漏筛。

3)在254nm、365nm紫外光下观察硅胶薄层色谱、以10％的硫酸-香草醛乙醇溶液试剂显色，考察薄层色谱的分离度和浓度分布。通过优化色谱溶剂***，使薄层色谱的分离度和容量得到优化，使高良姜的化学成分差异与特征在薄层色谱指纹图上得到充分反映，结果如图2。

实施例5将记载了平面色谱指纹图的色谱薄层整体按方口微孔板阵列格式划分、剥离和定位洗脱到微孔板对应的微孔池中，制备成平面色谱成分微阵列样本。

1)网格板制备采用钴铬合金3D打印制备，得到与384方口微孔板阵列格式一致、内空为正四棱台的网格板，具体为：4.5mm×4.5mm方格的横24×纵16阵列格式，网格内空为正四棱台，网格边框纵截面为高2.5mm的等腰梯形、等腰梯形的下底边宽度与384方口微孔板微孔池边厚度相同，具体为0.70mm，该面用于与微孔板对接；等腰梯形的上底边宽度≤0.15mm，使等腰梯形尽可能近似于等腰三角形，底面网格边框形成方口锐边，用于切割平面色谱，其示意图如图3；

2)薄层硅胶色谱的阵列划分与剥离将厚度2mm的硅橡胶片、接口板、PVDF膜(Millipore、厚度0.2mm)、铝基薄层硅胶板(干燥)和薄纸片(PVDF膜保护纸) 依序由下至上平行层叠，网格板的锐边面隔着PVDF膜对齐薄层硅胶层色谱区域，一起放置到平行压板上以8×10³KPa压力平压；具有延展性的薄铝板与松脆的薄层硅胶在接口板锐边的压迫下发生不同的变化，薄层硅胶整体有序地***成方形片状阵列，从微有变形的薄铝板上剥离并贴附在微嵌在接口中的PVDF膜上，效果如图 4。图4a和图4b为薄铝板的正反面，图4c为被剥离并贴附在PVDF膜上的薄层硅胶方形片状阵列，图4d为被剥离薄层硅胶方形片状。

3)制备型薄层硅胶色谱的阵列划分与剥离在硅胶厚度为2.0mm的制备型薄层硅胶色谱板(Merck，PLC Silica gel 60F_254+366，2mm玻璃板)制备高良姜的一维薄层色谱，展距和通道宽度设为9.0cm×通道7.2cm，以0.275g/mL的高良姜提取物甲醇溶液条带点样200μL；将接口板的锐边面朝取干燥的、薄层色谱板的固定相并对齐薄层色谱展开区域，接口的另一面垫上厚度2mm的硅橡胶片，平行层叠在一起放置到平行压板上平压，压至整个薄层色谱层分割成方形阵列并嵌在接口板的方格阵列中；然后释放压力至玻璃板在平行压板与接口板间刚刚可以平行滑动，侧向磕击玻璃板使之左右、前后各平行位移至少一个阵列单元，致玻璃板与硅胶层完全剥离，效果如图4。

4)凝胶电泳片的阵列划分将活化的凝胶电泳片平行夹在网格板与硅橡胶板之间，接口板的锐边面朝凝胶电泳片并对齐色谱展开区域，放置到平行压板上平压，把整个凝胶电泳片分割成方形阵列并嵌在金属网格接口中，微干后凝胶电泳方形阵列即可脱离金属网格接口，效果如图5。

5)PVDF膜的阵列划分将PVDF膜平行夹在0.50mm的薄铅板与钴铬合金网格板之间，接口板的锐边面朝聚合物膜，放置到平行压板上，以15×10³KPa压力平压，把聚合物膜分割成方形阵列并嵌在接口中后，掀去薄铅板即可，效果如图6。以上2)-5)具体示例了几种类型的平面色谱的色谱薄层划分和剥离方法，实际应用过程根据平面色谱的类型选择一种相应的方法即可，或者其他能够实现色谱薄层划分剥离的方法也可以。

6)薄层色谱成分微阵列样本制备在高效薄层硅胶色谱板(Merck，HPTLC Silicagel 60F254，Aluminum sheets)上制备高良姜提取物的二维薄层色谱：展距和通道宽度设为7.2cm×通道7.2cm，以0.275g/ml的高良姜提取物甲醇溶液点样5μl，以氯仿∶甲醇＝97∶3为溶剂***A、石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸＝70∶30∶2为溶剂***B 二维展开，制得高良姜二维薄层色谱；参照实施例5中薄层硅胶色谱的阵列划分与剥离方法，获得整体有序被剥离并贴附在微嵌在网格接口中PVDF膜上的薄层硅胶方片；将384方口微孔过滤板(Pall，规格5072)口对齐网格接口并对接，用16道移液枪圆口(不装枪头)从网格接口的另一面轻触PVDF膜，使贴附在PVDF膜上的硅胶层落入384孔过滤板相应的微孔池中，效果如图7；微孔过滤板中的硅胶薄层(如图7)以甲醇(15μL/孔)润湿、离心(269×g、1min)，重复5次，将其中的色谱成分定位洗入384孔微孔板相应的微孔池中；盛有洗脱成分的384孔微孔板在真空离心浓缩仪上浓缩至干(269×g、50℃、减压80.0KPa、1.5h)，制备成薄层色谱成分微阵列样本。

该微阵列样本既保留了平面色谱的分离特性，又与色谱基体彻底分离，微阵列单元间相互分隔，排除了毛细扩散、吸附干扰、背景噪音等色谱基体干扰和妨碍，可自然地与现行生物活性检测和药物分析方法和规范对接。

实施例6在薄层色谱成分微阵列样本上开展细胞生存率试验

在如实施例5方法制得的高良姜二维薄层色谱成分微阵列样本上，按阵列坐标分取试液到384孔方口微孔板(Corning 3701)相应的反应池里分别进行Alamar Blue法人肺癌细胞 A549细胞和HepG2肝癌细胞生存率检测，以5-Fu(五氟脲嘧啶)作为阳性对照，检测高良姜薄层色谱成分对A549肺癌细胞和HepG2肝癌细胞的抑制作用。参照Invitrogen阿尔玛蓝试剂盒说明书与常规实验方法，每孔加入30μL细胞悬液(对数生长期细胞，1000个/孔)，置入37℃二氧化碳细胞培养箱；加药后培养48h检测，Alamar Blue于检测前12h加入；测定波长570nm，参比波长600nm，以5-Fu作为阳性对照，分别计算高良姜二维薄层色谱成分微阵列样本单元人肺腺癌A549细胞株和HepG2肝癌细胞株的生长抑制率。A549肺癌细胞和HepG2肝癌细胞的生存率检测微阵列样本取像分别为图8a和图8c。

实施例7将色谱斑点形状和位置分布不规则的高良姜薄层色谱成分特性用阵列进行数字化表述、采用计算机数据处理，构建生物活性热点图

将实施例5在薄层色谱成分微阵列样本的各阵列单元的细胞生存率检测结果以阵列格式数字化表达平面色谱相应区域色谱成分的细胞活性，以EXCEL构建生物活性热点图。A549 肺癌细胞和HepG2肝癌细胞的生存率检测微阵列样本的生物活性热点图，分别为图8b和图8d。

实施例8

1)色谱分离、生物活性检测和ESI-MS分析联用甄别和筛选生物活性成分

a)在实施例4-7的基础上，依据生物活性热点图，针对性地选取二维薄层色谱微阵列样本上具有显著细胞活性的阵列单元及其毗邻阵列单元进行ESI-MS分析。A549细胞活性热点阵列单元如图8c中框线圈出区域，最高生物活性阵列单元的ESI-MS质谱图如图9a；HepG2细胞活性热点阵列单元如图8d中框线圈出区域1和区域2，区域2最高生物活性阵列单元的ESI-MS质谱图如图9b。

b)将热点阵列单元的ESI-MS质谱图中共存的各主要准分子离子峰的峰强度作为阵列单元数据Array1、其相应阵列单元的细胞增殖抑制率作为阵列单元数据Array2，采用Excel的统计函数CORREL(array1,array2)进行相关分析。

c)相关分析结果表明：

■图8c中所示的A549细胞活性热点阵列单元相关的主要准分子离子峰为327[M-H]^-、255[M-H]^-和283[M-H]^-，它们的准分子离子峰的峰高数据阵列(Array1) 与相应阵列单元细胞增殖抑制率数据阵列(Array2)的相关系数分别为0.827、- 0.256和-0.224。计算结果列于表1。

表1

■图8d所示的HepG2细胞活性热点区域1相关的主要准分子离子峰327[M-H]^-、255[M-H]^-和283[M-H]^-，它们的准分子离子峰的峰高数据阵列(Array1)与相应阵列单元细胞增殖抑制率数据阵列(Array2)的相关系数分别为0.712、-0.288和-0.268。计算结果列于表2。

表2

■图8d所示HepG2细胞活性实验热点区域2相关的主要准分子离子峰为269[M-H]^-、255[M-H]^-和283[M-H]^-的，它们的准分子离子峰的峰高数据阵列(Array1) 与相应阵列单元细胞增殖抑制率数据阵列(Array2)的相关系数分别为0.560、 0.454和0.305；进一步地，考察了阵列中间行的相关性，它们的相关系数分别为 0.600、0.334和-0.376，相应的结果列于表3。

表3

d)依计算出的相关系数，327[M-H]^-和269[M-H]^-被遴选为质谱准分子离子峰强度与生物活性强度相互依赖、色谱行为耦合的生物活性归属化合物的准分子离子。

对同一阵列区域的阵列单元中归属于相同分子离子峰的活性，作为该分子的活性贡献度归一化纳入筛选考量。

该实施例中，依据生物活性热点图，有的放矢地选取二维薄层色谱微阵列样本上具有显著细胞活性的阵列单元及其毗邻阵列单元进行ESI-MS分析，建立起生物活性热点阵列单元区域与相应阵列单元质谱图的对应关系。基于对应关系，得以在计算机上展开生物活性强度与质谱准分子离子峰强度相互依赖、色谱行为耦合等相关分析，实现了将色谱斑点形状和位置分布不规则的平面色谱成分特性以阵列方式数字化和计算机处理，高效简捷，极大地提高了筛选效率。

传统的方法是将平面色谱显影或显色、取像，获得图像文件，然后对图形进行扫描、峰识别、再转化为数字进行数据处理。对于不能在平面色谱原位进行的生物活性反应和化学分析，依据显色图形将色谱层取出、将色谱成分洗脱出来进行实验。这样做一方面是由于色谱斑点形状和位置分布不规则带来的困难和庞大的工作量；另一方面是至今尚无通用、无损的平面色谱原位检测方法，不同检测方法的灵敏度和适用的化合物不同、得到的图形也不尽相同，更重要的是化学分析检测和生物活性反应检测得到的图形之间差异更大、且难以对应；所以先以化学方法定位薄层斑点的筛选生物活性成分的方法，有可能导致漏筛！还有，不规则地将色谱层取出会破坏平面色谱的完整性，其中大量对生物活性成分筛选有用的信息也就被破坏了。在生物活性阵列单元的化学成分非单一化合物时，不能简单地以化合物含量高低来判断生物活性归属，对它们的甄别和遴选要有科学依据。本实验以具有显著生物活性阵列单元区域上的生物活性强度与相应阵列单元的质谱准分子离子峰强度之间的依赖关系及它们的色谱行为耦合度为指征，通过相关分析给出筛选依据，从共存的化学成分中指证生物活性化学成分，展示出色谱分离、生物活性检测和质谱分析联用甄别和筛选生物活性成分的优势。

图8d1和图8d2所示的热点区域单个阵列单元的生物活性不太高，但对同一阵列区域的阵列单元中归属于相同分子离子峰的活性，作为该分子的活性贡献度归一化纳入筛选考量，就可使其生物活性整体地展现出来。这有益于平面色谱斑点不是正好落入单一阵列单元的生物活性成分的筛选。

2)从庞大而复杂的中药及天然药物中高通量筛选生物活性成分

高良姜提取物中准分子离子峰327[M-H]^-和269[M-H]^-的归属化合物的确定，参考文献(卜宪章，肖桂武，古练权，张敏.高良姜化学成分研究.中药材,2000,23(2):84-87)，推测327[M-H]^-归属的化合物为二苯基庚烷A[1-苯基-7-(3’-甲氧基-4’-羟基)苯基-5-醇-3-庚酮]，269[M-H]^-归属的化合物为高良姜素。

3)遴选成分的生物活性评价

以5-氟尿嘧啶为阳性对照，对遴选出来的两个化合物的标准对照品与实施例6同法进行药效活性评价。将它们的细胞生长抑制曲线数据代入SPSS18.0软件，得到二苯基庚烷 A、高良姜素和5-氟尿嘧啶的对肺癌细胞A549的IC50分别为0.247、0.089、0.023mol.L-1，对肝癌细胞HepG2的IC50分别为0.259、0.085、0.092mol.L-1。

实施例9在薄层色谱成分微阵列样本上筛选G‐四链体配体

1)实验原理

G‐四链体(G‐quadruplex)是通过四个鸟嘌呤相互连接构成的一种四链DNA螺旋结构，它的形成能够有效地抑制端粒酶活性以及端粒的延长,进而遏制肿瘤细胞的大量增殖。以G‐四链体为靶点，筛选可与G‐四链体特异性识别并结合、具有稳定G‐四链体结构或促进G‐四链体的形成进而抑制癌细胞的增殖的配体，为发现潜在抗癌药物的有效途径。

本实验以纳米金(GNPs)作为比色探针,基于单链DNA和G‐四链体与GNPs之间的差异,采用比色法筛选G‐四链体配体。具体地，单链的G‐DNA可以吸附在胶体金纳米颗粒(GNPs) 表面，使胶体金能够在一定的盐(如NaCl)浓度下仍能呈红色的分散状态；但配体可诱导 GDNA形成G‐四链体结构使之从GNPs表面脱落，导致胶体金呈蓝色的聚集状态。通过加入药物前后GNPs溶液颜色的变化可以快速的筛选G‐四链体配体。

2)G‐四链体配体筛选实验

在如实施例5方法制得的高良姜二维薄层色谱成分微阵列样本上，按阵列坐标分取试液到384孔圆口微孔板相应的反应池里开展G-四链体配体筛选试验。

将GNPs(柠檬酸钠还原氯金酸法制得，粒径为12nm、浓度为9.45nM)与1.0μΜ的 G-DNA(序列为5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGG-3'，由上海生物工程有限公司合成，订单号300064096)按1∶150摩尔比加入，25℃下反应16h，制备成为GNPs-GDNA探针；按60μL/孔将GNPs-GDNA探针加入到薄层色谱成分微阵列样本上，在25℃下反应3h；加入0.106M的NaCl，25℃下反应30min；上述步骤加液后均作离心除气泡(1400rpm、1min) 处理。

在酶标仪上检测薄层色谱成分微阵列样本各孔的吸收光谱(400～850nm)，计算670nm 处吸光度与520nm处吸光度的比值λ_670/520、观察颜色变化并取像，考察薄层色谱成分微阵列样本各阵列单元成分对GNPs‐GDNA探针抗NaCl导致的聚集能力变化。

薄层色谱成分微阵列样本的G‐四链体配体筛选实验取像如图10a。

3)色谱分离、生物活性检测和ESI‐MS分析联用甄别和筛选生物活性成分

a)将G‐四链体配体筛选实验在薄层色谱成分微阵列样本的各阵列单元的λ_670/520作为配体活性值，将其以EXCEL构建生物活性热点图，用阵列格式数字化表达平面色谱相应区域的生物活性，如图10b。

b)依据生物活性热点图，针对性地选取二维薄层色谱微阵列样本上具有显著配体活性的阵列单元及其毗邻阵列单元进行ESI‐MS分析。配体活性热点阵列单元及其比邻区域在图10b中以方框圈出。

c)ESI‐MS分析表明，活性热点阵列单元相关的主要准分子离子峰为269[M‐H]^‐、255[M‐H]^‐和283[M‐H]^‐。图11列出生物活性热点阵列单元相应的ESI‐MS质谱图。

d)将热点阵列单元的ESI‐MS质谱图中共存的各主要准分子离子峰的峰强度作为阵列单元数据Array1、反映其相应阵列单元配体活性的λ_670/520作为阵列单元数据Array2，采用Excel 的统计函数CORREL(array1,array2)进行阵列相关分析。

e)表1列出热点阵列单元的配体活性值和相应的ESI‐MS质谱图中共存的各主要准分子离子峰的峰强度数据阵列。相关分析结果表明，活性热点阵列单元相关的主要准分子离子峰 269[M‐H]‐、255[M‐H]‐和283[M‐H]‐的准分子离子峰的峰高数据阵列(Array1)与相应阵列单元配体活性数据阵列(Array2)的相关系数分别为0.758、0.411和0.209，计算结果列于表4。

表4

依计算出的相关系数，269[M‐H]^‐被遴选为质谱准分子离子峰强度与生物活性强度相互依赖、色谱行为耦合的准分子离子。对同一阵列区域的阵列单元中归属于相同分子离子峰的活性，作为该分子的活性贡献度归一化纳入筛选考量。

本实验展示了在生物活性阵列单元共存多个化合物、且具有生物活性的准分子离子峰并非其中最高的情况下，以具有显著生物活性阵列单元区域区域上的生物活性强度与相应阵列单元的质谱准分子离子峰强度之间的依赖关系及它们的色谱行为耦合度为指征、通过相关分析给出筛选依据、从共存的化学成分中指证生物活性化学成分的实例。

本实验还表明，对同一阵列区域的阵列单元中归属于相同分子离子峰的活性，作为该分子的活性贡献度归一化纳入筛选考量，可使其生物活性整体地展现出来，避免平面色谱斑点不是正好落入单一阵列单元的生物活性成分被漏筛。

4)从庞大而复杂的中药及天然药物中高通量筛选生物活性成分。

被遴选出的准分子离子269[M‐H]‐，参考实施例8的细胞实验结果和参考文献(卜宪章，肖桂武，古练权，张敏.高良姜化学成分研究.中药材,2000,23(2):84‐87)，推测其归属的化合物为高良姜素。

由G‐四链体配体筛选实验结果、并结合实施例8的细胞生存率实验结果推测，诱导G‐四链体的形成进而抑制癌细胞的增殖可能为高良姜素抗癌活性作用机制之一。

实施例10构建“谱-效”相关的中药及天然产物薄层色谱指纹图谱

将上述实施例中所得到的高良姜薄层色谱指纹图谱、在薄层色谱成分微阵列样本上的 HepG2肝癌细胞株的生长抑制率实验结果和活性筛选化合物对应起来，以薄层色谱成分微阵列样本的阵列格式为X、Y二维坐标，映射到对应的薄层色谱指纹图阵列单元区域，在阵列单元上建立柱状图标示该阵列单元的生物活性值以及对应的化合物成分高良姜素和二苯基庚烷A的结构式，构建起“谱-效”相关的中药及天然产物薄层色谱指纹图谱，如图12。

Claims (35)

1.一种制备平面色谱微阵列的装置，其特征在于，所述的装置含有阵列格式一一对应的平面色谱、网格板、微孔板，

所述网格板具有多个由网格边框所限定出来的通道型空间，所述通道型空间具有开放的第一端和第二端；

所述的网格板的阵列格式与微孔池的阵列格式对应；在网格板第一端的开放平面上，限定各个通道型空间的网格边框的面积小于等于该通道型空间第一端面积的10%；所述通道型空间的开放的第二端用于与微孔板的微孔池对接；在第二端的开放平面上，限定每个通道型空间的网格边框的厚度大于第一端的开放平面上的网格边框厚度，并且与微孔板的微孔池池边厚度相同；

所述的平面色谱用于构建待筛选样本的平面色谱指纹图谱；

所述的网格板用于将平面色谱指纹图谱的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离；

所述的微孔板用于定位接收平面色谱的成分，制备成平面色谱成分微阵列样本；

所述的装置还含有微孔过滤板；所述的微孔过滤板用于将网格接口划分和剥离的色谱薄层定位洗脱到微孔板。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，在网格板第一端的开放平面上，限定各个通道型空间的网格边框的面积小于等于该通道型空间第一端面积的5%。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，在网格板第一端的开放平面上，限定各个通道型空间的网格边框的面积小于等于该通道型空间第一端面积的3%。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的通道型空间在第一端平面为正n边形，且满足n边形内角度数=180(n-2)÷n。

5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述的n为4，所述的网格板的通道型空间为正四棱台。

6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，限定每个通道型空间的网格边框纵截面为等腰梯形，等腰梯形的下底边宽度与微孔板的微孔池池边厚度相同；等腰梯形的上底边宽度≤0.15mm。

7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的网格板的阵列格式与384微孔板阵列格式对应为4.5mm×4.5mm方格的横24×纵16阵列格式。

8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，网格边框纵截面为高2.5mm的等腰梯形，等腰梯形的下底边宽度与384方口微孔板的微孔池池边厚度相同，为0.68-0.72mm；等腰梯形的上底边宽度≤0.15mm。

9.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的网格板通过3D打印制备。

10.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的平面色谱选自无支撑基体的平面色谱和/或有支撑基体的平面色谱。

11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述的无支撑基体的平面色谱选自凝胶电泳、聚合物膜电泳、聚合物膜薄层色谱或电泳条带转膜的聚合物膜。

12.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述的有支撑基体的平面色谱选自玻璃板基体的制备型薄层硅胶色谱板或铝基薄层硅胶板。

13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述的平面色谱选自铝基薄层硅胶板。

14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，当所述的平面色谱选自铝基薄层硅胶板时，所述的平面色谱还含有PVDF膜。

15.根据权利要求14所述的装置，其特征在于，所述的平面色谱还含有硅橡胶片和纸片。

16.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，硅橡胶片、网格板、PVDF膜、铝基薄层硅胶板和纸片依序由下至上平行层叠。

17.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的平面色谱指纹图谱的色谱图展距和通道宽度的微孔板阵列格式对应。

18.根据权利要求17所述的装置，其特征在于，所述的平面色谱的展距和通道宽度为4.5mm的倍数，包含展距9.0cm×通道7.2cm的一维平面色谱和展距7.2cm×通道7.2cm的二维平面色谱。

19.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的微孔板为方口微孔板。

20.根据权利要求19所述的装置，其特征在于，所述的方口微孔板为384孔方口微孔板，其阵列格式为4.5mm见方的横24×纵16阵列。

21.根据权利要求19所述的装置，其特征在于，所述的微孔过滤板为384方口微孔过滤板。

22.根据权利要求21所述的装置，其特征在于，所述的384方口微孔过滤板的型号为Pall No.5072。

23.权利要求1所述的制备平面色谱微阵列的装置的使用方法，其包含以下步骤：

1）用平面色谱构建待筛选样本的平面色谱指纹图谱；

2）采用网格板，将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离、定位洗脱到微孔板的微孔池中，制备成平面色谱成分微阵列样本；

步骤2）中，把剥离并定位于网格板中的色谱薄层先推入微孔过滤板的微孔池中，然后将微孔过滤板对齐接受洗脱液的微孔板，再采用溶剂将色谱固定相上的色谱成分定位洗脱到微孔板中相应的微孔池中。

24.权利要求23所述方法制备的平面色谱微阵列，所述的平面色谱微阵列为微孔板上包含经平面色谱薄层分离，用与微孔板阵列格式对应的网格板划分，去除色谱薄层基质的待筛选生物活性的样本。

25.一种生物活性成分筛选***，其特征在于，所述的***含有权利要求24所述的平面色谱微阵列，以及生物活性检测单元和质谱分析单元；

所述的质谱分析单元用于测定平面色谱成分微阵列样本中的活性成分的质谱信息；

所述生物活性检测单元用于检测平面色谱成分微阵列样本中的生物活性。

26.根据权利要求25所述的***，其特征在于，所述的质谱分析单元选自带有软电离离子源的质谱分析单元。

27.根据权利要求26所述的***，其特征在于，所述的软电离离子源为液相色谱-质谱联用中的电喷雾电离、大气压化学电离、大气压光电离，基质辅助激光解吸电离，或为气相色谱-质谱联用中的化学电离。

28.根据权利要求26所述的***，其特征在于，所述的软电离离子源为电喷雾电离。

29.根据权利要求25所述的***，其特征在于，所述的生物活性检测单元含有酶标仪、多功能微孔板检测***、高通量微孔板检测仪中的一种或几种。

30.根据权利要求25所述的***，其特征在于，所述的***含有数据处理***。

31.根据权利要求30所述的***，其特征在于，所述的数据处理分析用于进行平面色谱成分以阵列方式进行数字化表述，构建生物活性分布图，生物活性强度与质谱信息关联、耦合、归一化分析，活性物质遴选和构建“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱操作中的一种或几种操作。

32.如权利要求25-31任一所述的生物活性成分筛选***的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用平面色谱构建待筛选样本的平面色谱指纹图谱；

2）采用网格板，将平面色谱指纹图的色谱薄层按微孔板阵列格式划分、剥离、定位洗脱到微孔板的微孔池中，制备成平面色谱成分微阵列样本；

3）采用生物活性检测单元，对平面色谱成分微阵列样本进行生物活性检测；

4）采用质谱分析单元，对活性热点阵列单元及其毗邻区阵列单元开展质谱分析。

33.根据权利要求32所述的使用方法，其特征在于，在步骤2）制备成平面色谱成分微阵列样本，采用数据处理***对平面色谱成分以阵列方式进行数字化表述。

34.根据权利要求32所述的使用方法，其特征在于，步骤3）中，生物活性检测完成后，采用数据处理***构建生物活性分布图。

35.根据权利要求32所述的使用方法，其特征在于，步骤4）中，质谱分析后，采用数据处理***对生物活性强度与质谱信息关联、耦合、归一化分析，遴选出活性物质，构建“谱-效”相关的平面色谱指纹图谱。

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