CN110157804A - 用于肺癌诊断、疗效预测或预后的甲基化位点、检测引物及试剂盒 - Google Patents

用于肺癌诊断、疗效预测或预后的甲基化位点、检测引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于肺癌诊断、疗效预测或预后的甲基化位点、检测引物及试剂盒。本发明提供了用于肺癌诊断、疗效预测的15个甲基化以及用于肺癌预后的10个甲基化位点，采用其中的一个或多个甲基化位点的组合作为标志物，通过测定受试者血样中甲基化位点的甲基化水平的改变能够准确诊断早期肺癌、预测肺癌疗效或预后。本发明还提供了采用这些甲基化位点为靶标所设计的特异性检测引物和探针。本发明进一步提供了采用这些引物和探针构建得到的用于肺癌诊断、预测或预后的试剂盒。采用本发明试剂盒进行肺癌诊断、预测或预后，具有特异性强、灵敏度强和准确性高等优点。

Description

用于肺癌诊断、疗效预测或预后的甲基化位点、检测引物及试 剂盒
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断、疗效预测或预后的基因标志物，尤其涉及用于肺癌诊断、疗效预测或预后的甲基化位点以及检测引物，本发明进一步涉及用于诊断诊断、疗效预测或预后的试剂盒，属于肺癌诊断、疗效预测或预后领域。
背景技术
肺癌(Lung Cancer,LUNC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一。与其他许多癌症类似，早期治疗的肺癌患者其预后与晚期患者相比有很大程度的改善，这部分归因于局部治疗与全身治疗相比，其治疗效果相对较高。因此，癌症的早期筛查具有降低患者死亡率的显著潜力。
正常生理条件下，人体血循环中存在由凋亡和坏死的细胞释放的游离DNA(ce1lfree DNA,cfDNA)，肿瘤患者的血循环中还可检测到游离循环肿瘤DNA(circulating tumorDNA,ctDNA)，由于ctDNA携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，并且能全面的反映患者体内肿瘤细胞的遗传信息和演变进程，可以作为理想的肿瘤标志物，用于肿瘤的诊断、分子分型、疗效评价和追踪以及预后评估。
肿瘤细胞中的遗传学异常表现多样且存在明显的个体性，包括突变(Mutation)、拷贝数变异(Copy-number variation)、微卫星不稳定(Microsatellite Instability)、杂合性缺失(Loss of Heterozygosity)等。这些异常不仅在不同肿瘤之间差异很大，即使在同一肿瘤的不同患者之间也具有高度的个体异质性(Individual heterogeneity)，使得在ctDNA中检测这些改变和结果分析异常复杂。与此相比，在多种肿瘤的ctDNA中可检测到相似的甲基化改变，而同一类型肿瘤ctDNA的甲基化谱则更为稳定和一致。随着甲基化特异性PCR、二代测序(next-generation sequencing,NGS)和数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)等技术的飞速发展,使得高通量、准确、相对廉价的DNA甲基化谱和甲基化位点检测成为可能，也促使ctDNA甲基化-位点的检测日益成为日前液体活检技术的热点之一，可以准确筛査早期或超早期癌症，有助于癌症的早期诊断、早期评估、早期治疗、早期预防。
但是，目前已开发的有效的基于血液的筛查肺癌的方法取得的成功有限，其中许多与肺癌相关的特异性血清生物标志物，尚未进入临床使用。目前，对于鉴定用于肺癌诊断、疗效预测和预后的血清生物标志物并开发相应的试剂盒仍存在迫切需求。
发明内容
本发明的目的之一是提供用于肺癌诊断或预测肺癌术后复发的甲基化位点；
本发明的目的之二是提供肺癌疗效预测或预后的甲基化位点；
本发明的目的之三是提供用于肺癌诊断、疗效预测或预后的特异性引物和探针。
本发明的目的之四提供肺癌诊断、疗效预测或预后的试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了用于早期肺癌的诊断、预测肺癌术后复发的甲基化位点，包括以下所述的任何一种甲基化位点或一种以上的任意组合：1-295864、3-1138223、6-1526223、6-265969、7-14998、7-862737、9-954757、10-1205149、11-646423、12-1222773、13-510867、14-1019927、16-571473、17-732857、19-179828。
本发明通过试验发现，采用1-295864、3-1138223、6-1526223和6-265969的组合作为早期肺癌的诊断标志物，具有较高的特异性和灵敏度，因此，本发明优选采用1-295864、3-1138223、6-1526223和6-265969的组合作为早期肺癌的诊断标志物。
通过测定受试者血样中所述甲基化位点的改变可以准确的诊断早期肺癌或预测肺癌术后复发。
本发明在此基础上进一步提供了一种肺癌早期诊断的检测试剂盒，包括：用于扩增所述甲基化位点的特异性引物和探针，转化液，结合液，洗涤液，纯化液，洗脱液，DNA提取试剂，PCR扩增试剂。
作为参考，所述的转化液可以是亚硫酸氢铵溶液；所述的结合液可以是盐酸胍；所述的洗涤液可以是纯化水；所述的纯化液可以是异丙醇、乙醇或氢氧化钠；所述的洗脱液可以是TE溶液。
所述的DNA提取试剂可以任何一种常规的DNA提取试剂，所述的PCR扩增试剂可以是任何一种常规的扩增试剂，优选为ddPCR扩增试剂。
其中，用于扩增甲基化位点1-295864的引物组(包括探针)由SEQ ID No.1-SEQ IDNo.4所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点3-1138223的引物组(包括探针)由SEQ IDNo.5-SEQ ID No.8所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点6-1526223的引物组由SEQID No.9-SEQ ID No.12所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点6-265969的引物组(包括探针)由SEQ ID No.13-SEQ ID No.16所述的引物序列组成；用于扩增7-14998的引物组(包括探针)由SEQ ID No.17-SEQ ID No.20所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点7-862737的引物组(包括探针)由SEQ ID No.21-SEQ ID No.24所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点9-954757的引物组(包括探针)由SEQ ID No.25-SEQ ID No.28所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点10-1205149的引物组(包括探针)由SEQ ID No.29-SEQ IDNo.32所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点11-646423的引物组(包括探针)由SEQ IDNo.33-SEQ ID No.36所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点12-1222773的引物组(包括探针)由SEQ ID No.37-SEQ ID No.40所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点13-510867的引物组(包括探针)由SEQ ID No.41-SEQ ID No.44所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点14-1019927的引物组(包括探针)由SEQ ID No.45-SEQ ID No.48所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点16-571473的引物组(包括探针)由SEQ ID No.49-SEQ IDNo.52所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点17-732857的引物组(包括探针)由SEQ IDNo.53-SEQ ID No.56所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点19-179828的引物组(包括探针)由SEQ ID No.57-SEQ ID No.60所述的引物序列组成；
本发明进一步提供了用于肺癌预后或预测肺癌患者死亡风险的甲基化位点，选自以下甲基化位点中的任何一种或一种以上的任意组合：cg26205771、cg08436738、cg27252696、cg24917945、cg03550506、cg06903569、cg12865837、cg18440897、cg19255783、cg20634573。
通过测定受试者血样中所述甲基化位点的甲基化水平的改变，能够准确的预测肺癌预后或预测肺癌患者死亡风险。
本发明通过试验发现，以下三种的甲基化位点进行组合能够非常显著的提高肺癌预后或预测肺癌患者死亡风险的准确性：(1)cg26205771，cg08436738和cg27252696；(2)cg24917945，cg11252953，cg03550506和cg06903569；(3)cg12865837，cg18440897，cg19255783和cg20634573。
本发明进一步提供了用于肺癌预后或预测肺癌患者死亡风险的试剂盒，包括：用于扩增所述甲基化位点的特异性引物和探针，转化液，结合液，洗涤液，纯化液，洗脱液，DNA提取试剂，PCR扩增试剂。
其中，用于扩增cg26205771的引物组由SEQ ID No.61-SEQ ID No.64所述的引物序列组成；用于扩增cg08436738的引物组(包括探针)由SEQ ID No.65-SEQ ID No.68所述的引物序列组成；用于扩增cg27252696的引物组(包括探针)由SEQ ID No.69-SEQ IDNo.72所述的引物序列组成；用于扩增cg24917945的引物组(包括探针)由SEQ ID No.73-SEQ ID No.76所述的引物序列组成；用于扩增cg03550506的引物组(包括探针)由SEQ IDNo.77-SEQ ID No.80所述的引物序列组成；用于扩增cg06903569的引物组(包括探针)由SEQ ID No.81-SEQ ID No.84所述的引物序列组成；用于扩增cg12865837的引物组(包括探针)由SEQ ID No.85-SEQ ID No.88所述的引物序列组成；用于扩增cg18440897的引物组(包括探针)由SEQ ID No.89-SEQ ID No.92所述的引物序列组成；用于扩增cg19255783的引物组(包括探针)由SEQ ID No.93-SEQ ID No.96所述的引物序列组成；用于扩增cg20634573的引物组(包括探针)由SEQ ID No.97-SEQ ID No.100所述的引物序列组成。
作为参考，所述的转化液可以是亚硫酸氢铵溶液；所述的结合液可以是盐酸胍；所述的洗涤液可以是纯化水；所述的纯化液可以是异丙醇、乙醇或氢氧化钠；所述的洗脱液可以是TE溶液。
所述的DNA提取试剂可以任何一种常规的DNA提取试剂，所述的PCR扩增试剂可以是任何一种常规的扩增试剂，优选为ddPCR扩增试剂。
本发明所使用的“试剂”可以是能够用于检测甲基化水平的任何形式的制剂，包括但不限于有机试剂、无机试剂、探针、引物、芯片等。
在知晓如本文公开的用于肺癌诊断、疗效预测或预后的甲基化位点的情况下，本领域技术人员可以利用常规技术设计、合成相应探针或引物来检测这些甲基化位点的甲基化水平。在需要时，还可以设计成芯片的形式。
本发明提供的甲基化位点以及相应的制品或试剂盒能够基于患者的血液诊断肺癌、疗效预测或预测预后。相比于肿瘤活检，利用本发明的甲基化位点的诊断或预后方法对患者的侵入性小；并且由于可以在治疗期间的任何时期获取血液，因此其允许肿瘤相关分子变化的实时监测；此外，其可以检测通过成像手段不明显或不确定的肿瘤。此外，利用本发明的甲基化位点的诊断或预后方法提高了肺癌患者诊断和预后预测的准确性。
附图说明
图1显示了用于诊断肺癌、预测肺癌的治疗疗效、预测肺癌复发，或者预测肺癌患者的预后和死亡风险的甲基化位点的检测方法的示意图；上下分别表示：通过t检验(A)或LASSO(B)分别筛选出适于肺癌诊断、预测或预后评估的特异性甲基化位点，然后根据ddPCR技术检测甲基化率来建立诊断和预后评估的工作流程示意图。
图2显示了本发明的诊断预测模型诊断肺癌的准确性。A.在训练群组中使用cfDNA甲基化率分析的ROC曲线和诊断预测模型，相关的曲线下面积(AUC)；B.与正常对照组相比，肺癌(LUNC)患者的甲基化率框图，该图表示来自训练群组的数据，其中得分来自多类分类器；C.在验证群组中使用cfDNA甲基化受试者分析曲线(ROC)和甲基化率的相关的曲线下面积(AUC)；D.用于对正常、LUNC或HCC患者进行分类的甲基化率的框图，该图表示来自验证群组的数据。
图3有肿瘤负荷的患者的cfDNA甲基化率与肿瘤已切除的患者和正常对照组的cfDNA甲基化率。
图4肿瘤不同分期cfDNA甲基化率对比分析。
图5手术后病人较手术前cfDNA甲基化率对比分析。
图6治疗前患者较治疗后cfDNA甲基化率的对比分析。
图7显示了基于cfDNA甲基化分析的LUNC存活预测。A.根据验证群组中的甲基化率评估，具有低或高死亡风险的LUNC患者的总体存活曲线。B.验证群组中具有I/II期和III/IV期的LUNC患者的存活曲线。C.通过甲基化率评估、分期和甲基化率评估与验证群组中的LUNC阶段预测的12个月存活率的ROC。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1用于诊断肺癌、预测肺癌的治疗疗效、预测肺癌复发或者预测肺癌患者的预后和死亡风险的筛选
本实施例通过分析肺癌和正常血样样本，获得用于诊断肺癌、预测肺癌的治疗疗效、预测肺癌复发，或者预测肺癌患者的预后和死亡风险的甲基化位点，具体包括以下步骤：
第一步，使用高效游离DNA提取试剂盒(广州优泽生物技术有限公司；货号：YZ000008)在血样中提取ctDNA；
第二步，对提取的所述ctDNA进行亚硫酸盐转化,使所述ctDNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸盐转化ctDNA；
第三步，用深度测序的方法测定所述亚硫酸盐转化ctDNA的甲基化水平的改变；
第四步，探针的设计和合成；首先，对TCGA(癌症和肿瘤基因图谱)和NCBI GSE数据库里的肺癌组织样本和正常人血样样本的450K基因甲基化芯片数据进行分析，找出甲基化水平明显差异的基因；然后，在同一病人的组织和血样样本中用深度测序的方法测定上一步筛选出的基因的甲基化水平的改变，并筛选出同时能在组织和血样里检测出来且甲基化水平变化一致的基因；用ppDesigner软件设计选出来的甲基化水平变化一致的基因的探针并进行合成，例如应用核酸杂交技术，用单独的寡核苷酸进行探针合成。
第五步，通过所述探针对所述亚硫酸盐转化ctDNA进行捕获；具体是：将10ng亚硫酸盐转化DNA与上述合成的探针按1:20000摩尔比混合于20ul反应缓冲液中形成反应液，反应液上加50ul矿物油以防止液体蒸发。对反应液进行退火和变性，PCR扩增并给每个血样样本附上条码。PCR反应建立文库，并保留有效的捕获,去除空白的捕获。用Illumina公司的适配引物和浓度以PCR方法纯化所建文库，采用Illumina公司的Miseq和Hiseq2500***来进行测序,得到测序结果。
由于测序的原始捕获实验结果(即测序结果)在高效率的探针和低效率的探针中读取的结果有的显著差异,为了改善这种情况,对原始的测序结果进行相对效率计算,混合探针时根据采用调节后的摩尔比率进行混合。
第六步数据的分析和模型的建立
将肺癌血样样本和正常对照的血样样本随机按2:1的比例分为训练集和验证集，选用LASSO和随机森林的方法针对第五步中的测试结果进行基因筛选。
在LASSO方法中，采用二次抽样方法不重复抽样75％的数据集500次，选择现频率超过450次的甲基化基因共30个；
在随机森林的方法中，使用OOB误差最小化准则，通过设置变量每次重复的分数下降0.3的原则进行随机变量的消除，最后筛选出24个甲基化位点；
上述两种方法重叠的甲基化位点有15个，分别为：1-295864、3-1138223、6-1526223、6-265969、7-14998、7-862737、9-954757、10-1205149、11-646423、12-1222773、13-510867、14-1019927、16-571473、17-732857、19-179828(说明：“1-295864”即1号染色体中第295864个核苷酸，其它14个位点也依此类推；这些位点及附近的核酸序列通过UCSC数据库查询获得)。
采用这15个重叠的甲基化位点作为肺癌cfDNA的甲基化诊断标记物，并在验证集中用ddPCR技术进行甲基化率的检测和验证；甲基化率为甲基化探针阳性拷贝数在所有阳性拷贝数中的百分率，分析获得可以作为肺癌诊断的甲基化率阈值。具体的筛选方式参见图1的流程。
通过ddPCR技术检测并验证每个样本的甲基化率，分析获得所筛选得到15个甲基化位点作为早期肺癌诊断的甲基化率阈值并建立诊断模型应用于早期肺癌的诊断，具体见试验例1。
同样，将肺癌血样样本分为训练集和验证集，为方便计算分析：先通过对每一个基因作为协变量建立一个单变量COX比例风险模型,筛选出与患者预后相关(p<0.05)的基因进行下一步分析。
接着，采用LASSO-COX多因素回归分析，最终筛选出10个甲基化位点用于预测肺癌的治疗疗效、预测肺癌复发或者预测肺癌患者的预后和死亡风险的标志物(如表1所示)，这10个甲基化位点如下：cg26205771、cg08436738、cg27252696、cg24917945、cg03550506、cg06903569、cg12865837、cg18440897、cg19255783、cg20634573；
该实验涉及的Infinium 450K甲基化阵列产生的485,000个位点的DNA甲基化数据均获自TCGA和文献公开的(Gregory Hannum et al.Genome-wide methylation profilesreveal quantitative views of human aging rates.Molecular Cell.49,359-367,January 24,2013)(GSE40279)产生的数据集，其中分析了HCC和血液的DNA甲基化谱。
生成甲基化数据的IDAT格式文件，其包含每个扫描磁珠的比率值。使用Bioconductor的minfi包，将这些数据文件转换为分数，称为Beta值。，通过使用分子倒置探针的靶向亚硫酸氢盐测序获得中国群组的甲基化值并进行后续分析。
在肺癌甲基化位点的检测中，通过LASSO-COX多因素回归分析筛选的10个甲基化位点(表2)。
表1 10个甲基化位点
名称 位点
cg26205771 8:53851188
cg08436738 2:235528864
cg27252696 6:100912939
cg24917945 10:120514926
cg03550506 22:32149786
cg06903569 6:28304139
cg12865837 6:100911525
cg18440897 4:46391413
cg19255783 4:84035952
cg20634573 2:96781406
表2通过LASSO-COX多因素回归分析筛选得到的10个甲基化位点
最后，通过ddPCR技术检测并验证每个样本的甲基化率，分析获得所筛选得到12个甲基化位点作为作为肺癌预后评估的甲基化率阈值并建立预测模型应用于肺癌预后的预测，具体方法及结果见试验例4。
试验例1采用筛选到的15个甲基化位点建立早期肺癌诊断的模型并应用于肺癌诊断预测
一、预测诊断模型的建立
通过逻辑回归方法，将所筛选到的15个甲基化位点(1-295864、3-1138223、6-1526223、6-265969、7-14998、7-862737、9-954757、10-1205149、11-646423、12-1222773、13-510867、14-1019927、16-571473、17-732857、19-179828)构建了一个诊断预测模型。
具体方法如下：
(一)位点与引物探针序列
1-295864
F:GAGGTGGAGGGATGG(SEQ ID No.1)
R:CTTCCCAAACAATTTACAC(SEQ ID No.2)
M:FAM/GAATGGGTCGGGATGGG/BHQ1(SEQ ID No.3)
NM:HEX/GAATGGGTTGGGATGGG/BHQ1(SEQ ID No.4)
3-1138223
F:TTTTATATTTTTTATATTTAAAT(SEQ ID No.5)
R:TTCATTCAAATAACAAACA(SEQ ID No.6)
M:FAM/AATTTTAATTGACAAATTGGTTATT/BHQ1(SEQ ID No.7)
NM:HEX/AATTTTAATTGATAAATTGGTTATT/BHQ1(SEQ ID No.8)
6-1526223
F:GGGTATAGGGTTTTGTATT(SEQ ID No.9)
R:TATTCTCCCAAAACAACA(SEQ ID No.10)
M:FAM/TTGTTTGTTTTCGGTAGAATATT/BHQ1(SEQ ID No.11)
NM:HEX/TTGTTTGTTTTTGGTAGAATATT/BHQ1(SEQ ID No.12)
6-265969
F:TTTTATTTTAATGATTGTATTT(SEQ ID No.13)
R:ACAAACCTAATAACACCTAA(SEQ ID No.14)
M:FAM/TTTATAGTTTTCAGTGGGTTATTG/BHQ1(SEQ ID No.15)
NM:HEX/TTTATAGTTTTTAGTGGGTTATTG/BHQ1(SEQ ID No.16)
7-14998
F:TTATTATATTATAAATTTGAGTT(SEQ ID No.17)
R:ATACAAACTATATCAAACATAA(SEQ ID No.18)
M:FAM/GTGTGGTAAATTACTATGTATGG/BHQ1(SEQ ID No.19)
NM:HEX/GTGTGGTAAATTATTATGTATGG/BHQ1(SEQ ID No.20)
7-862737
F:TAGAGAGTGGTGGAGATTG(SEQ ID No.21)
R:ACCACACACCCTACTCAC(SEQ ID No.22)
M:FAM/GAGGATTGTTAGCTTAGTGGTAA/BHQ1(SEQ ID No.23)
NM:HEX/GAGGATTGTTAGTTTAGTGGTAA/BHQ1(SEQ ID No.24)
9-954757
F:TGTGTTTTTTAGGTTTAAGT(SEQ ID No.25)
R:ACACCTATAATCCCAACTA(SEQ ID No.26)
M:FAM/ATTTTTTTGTTTCAGTTTTTTTAG/BHQ1(SEQ ID No.27)
NM:HEX/ATTTTTTTGTTTTAGTTTTTTTAG/BHQ1(SEQ ID No.28)
10-1205149
F:TAGTGTGGTTGTTAAGGTT(SEQ ID No.29)
R:ACCAACAACTAAATATTTCA(SEQ ID No.30)
M:FAM/TTGTATTATTTCAAAGTGGGTGA/BHQ1(SEQ ID No.31)
NM:HEX/TTGTATTATTTTAAAGTGGGTGA/BHQ1(SEQ ID No.32)
11-646423
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14-1019927
F:GTTTGAAATGTTGTAAAATAT(SEQ ID No.45)
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NM:HEX/TTTATTTTAGTTGTTTTAGTTGAA/BHQ1(SEQ ID No.48)
16-571473
F:TTGGTGTGTTTTTTAGTTT(SEQ ID No.49)
R:TAAAATAACCACATCTAACTA(SEQ ID No.50)
M:FAM/TTATGTTGTTCGGGTTATTGT/BHQ1(SEQ ID No.51)
NM:HEX/TTATGTTGTTTGGGTTATTGT/BHQ1(SEQ ID No.52)
17-732857
F:GTTTTGTATGTATTAGGTATTT(SEQ ID No.53)
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19-179828
F:GGATTTTATTTTAGTTGTTAT(SEQ ID No.57)
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M:FAM/GAAATATGTTTGTCGATAATTTGA/BHQ1(SEQ ID No.59)
NM:HEX/GAAATATGTTTGTTGATAATTTGA/BHQ1(SEQ ID No.60)
(二)PCR扩增所用到的试剂和扩增条件
1、PCR扩增所用到的试剂
表3 PCR扩增所用到的试剂
组分名称 试剂组分
转化液 亚硫酸氢铵溶液
结合液 盐酸胍
洗涤液 纯化水
纯化液 异丙醇、乙醇、氢氧化钠
洗脱液 TE溶液
2、PCR扩增条件
1-295864
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
52℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
3-1138223
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
46℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
6-1526223
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
50℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
6-265969
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
50℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
7-14998
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
48℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
7-862737
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
55℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
9-954757
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
51℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
10-1205149
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
53℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
11-646423
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
50℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
12-1222773
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
48℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
13-510867
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
51℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
14-1019927
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
50℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
16-571473
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
50℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
17-732857
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
52℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
19-179828
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
47℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
(三)15个甲基化位点的癌症患者与正常患者的cfDNA甲基化比例的确定结果
测定结果见表4。特异性和灵敏性结果见表5。
表4 15个甲基化位点的癌症患者与正常患者的cfDNA甲基化比例
M：甲基化，nM：非甲基化，通过计算M/(M+NM)M+nM的甲基化比值。
表5 15个甲基化位点诊断早期肺癌的灵敏度以及特异性结果
根据表5的试验结果可见，这15个甲基化位点用于诊断早期肺癌均有较高的灵敏度和特异性；其中将1-295864、3-1138223、6-1526223以及6-265969这四个位点组合在一起具有较高的灵敏度和特异性；因此，在用于早期肺癌的诊断时，优先采用1-295864、3-1138223、6-1526223以及6-265969这四个位点的组合作为诊断标志物。
(四)诊断预测分析的建立
cfDNA可以分两种方式进行检测分析：
第一种检测分析：首先检测样本中1-295864、3-1138223、6-1526223和6-265969这四个甲基化位点的甲基化率；如果样本检测结果显示这4个位点的甲基化率均小于或等于正常对照cfDNA甲基化率，则表明患癌风险较低；如果有2个或2个以上位点的甲基化率大于或等于表中的癌症患者cfDN甲基化率，则表明具较大的患癌风险。
第二种检测分析：如果这4个位点(1-295864、3-1138223、6-1526223和6-265969)中只有1个位点的甲基化率大于或等于表3中相对应的癌症患者cfDN甲基化率，或有1个或1个以上位点的甲基化率介于正常对照和癌症患者cfDNA甲基化率之间，则检测全部的12个甲基化位点的甲基化率并计算平均值。如果甲基化率的平均值小于或等于16.90％，表明具有较低的患癌风险；如果甲基化率的平均值大于或等于46.93％，表明具有较高的患癌风险；如果甲基化率的平均值介于两者之间，则需要用其它临床方法做进一步诊断。
二、应用所建立的诊断预测模型在验证群组中进行验证
应用上述建立的诊断预测模型诊断肺癌，在验证群组的敏感性为86.7％，特异性为91.0％(见表6)。且由图2(A-E)所示结果可见，这个模型可以非常好的在训练数据集和验证数据集中区分肺癌与正常对照组，其中如图2-A所示，在训练数据集中肺癌组的AUC＝0.937，如图2-C所示，在验证数据集中，肺癌的AUC＝0.911。诊断结果证实本申请所筛选到的15个甲基化位点可以用于准确的区分肺癌和正常对照。
表6在验证群组中基于cfDNA甲基化率诊断在正常和肺癌之间的二元分类诊断列联表
试验例2采用筛选到的15个甲基化位点建立的诊断模型应用于肺癌治疗疗效的判断、预测肿瘤的复发
采用试验例1所建立的诊断预测模型，计算出每个样本的甲基化率，采用这个甲基化率预测肺癌患者的治疗疗效和肿瘤复发的结果如图3-图6所示。
根据图3可见，有肿瘤负荷的患者(56.3％±13.8)的cfDNA甲基化率明显高于肿瘤已切除的患者(11.2％±5.7)和正常对照组(9.7％±4.3)(p<0.01，图3)。
根据图4可见，cfDNA甲基化率的值与肿瘤分期相关。早期患者(I，II期)的cfDNA甲基化率(36.3％±10.4)明显高于正常对照组(9.7％±4.3)，而明显低于晚期(III，V期)(65.7％±12.6)患者(p<0.05，图4)。
根据图5可见，手术后病人的cfDNA甲基化率(11.2％±5.7)较手术前(56.3％±13.8)明显降低，患者术后出现肿瘤(46.3％±14.3)复发，cfDNA甲基化率则会再度升高(p＝0.002，图5)。
根据图6可见，治疗前患者(56.3％±9.8)cfDNA甲基化率明显高于治疗后(14.3％±8.1)有效的患者，而治疗无效肿瘤进展的患者(60.7％±11.5)cfDNA甲基化率会进一步升高(p<0.001，图6)。
上述试验结果说明根据这15个甲基化位点所建立的诊断模型可用于肺癌的早期诊断、治疗疗效的判断、预测肿瘤复发。
试验例3应用甲基化位点对肺癌患者预后的预测试验
通过拟合多变量Cox比例风险模型，用所筛选得到的10个甲基化位点(cg26205771、cg08436738、cg27252696、cg24917945、cg03550506、cg06903569、cg12865837、cg18440897、cg19255783、cg20634573)构建了一个预后风险模型，并计算出每个样本的预后评分指数(指定为cp-score)。
选取-0.24为截断值，将肺癌患者分为低风险组和高风险组。
根据预测结果可见，无论在训练集还是验证集，低风险组患者的生存均明显优于高风险组(如图7所示)。多元变量分析表明，cp-score与死亡风险显著相关，并且cp-score的生存是一个独立的危险因素。分期也是肺癌患者的独立危险因素，而联合cp-score和分期，可进一步改进对肺癌患者预后的预测能力(图7)。
试验例4应用10个甲基化位点建立肺癌预后的预测模型以及应用该预测模型对肺癌患者预后进行预测试验
一、肺癌预后的预测模型的建立
微滴式数字PCR技术具有诸如以下的优点：绝对定量，不依赖Ct值，无需标准曲线；超高灵敏度，适用于稀有序列及稀有突变的检测；精准的定量结果和极佳的重复性；适用复杂样品检测，不易受PCR抑制物影响；兼容染料法和探针法，同时满足科学研究和临床检测要求。
在临床上，ddPCR技术用于cfDNA检测一致性高，可用于肿瘤的早期筛查，临床分期，个体化用药指导，药效评估及耐药分析，预后评估以及复发转移监测。文献报道ddPCR用于肝细胞癌甲基化位点检测，其中ddPCR联合肝组织特异性DNA甲基化位点检测肝组织来源cfDNA分子数可诊断肠癌肝转移，这表明利用ddPCR技术检测组织特异性甲基化生物学标志物定量各组织cfDNA分子数的方法具有诊断肿瘤转移的应用潜能。此外，利用ddPCR检测循环肿瘤ctDNA监测复发，能比CT扫描平均早10个月发现复发的征兆。
利用所筛选出的肺癌甲基化位点，通过生物学常规技术设计、合成相应探针和引物，通过ddPCR技术在受试者血样样品中检测甲基化水平的改变，从而来无创、早期诊断肺癌。
在本试验例中，利用微滴式数字定量PCR技术定量检测方法如下：
首先，从接受手术切除肿瘤的患者获得肿瘤和相应的血样样品；
其次，将样品冷冻并保存在-80℃直至使用；
最后，从中分离DNA和RNA分别使用AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒和cfDNA提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行样品提取。
基本原理：
通过配制反应体系稀释分离单个分子使之分配到不同微滴，并通过PCR单独扩增；通过荧光探针分别检测微滴的荧光信号值从而分析每种产物。在受试者血样经过以上两步处理后获得的cf DNA进行后续的ddPCR实验，其步骤如下：
工作流程：
第一步ddPCR反应体系配制：将DNA/RNA样品、引物和探针/EvaGreen染料与ddPCR预混液混合(20ul)；
第二步微滴制备：首先将ddPCR反应体系添加至微滴发生器芯片的小孔中，微滴发生器每次运行最多可以产生8*20000个油包水的微滴，目标核酸和背景核酸随机分布于微滴中；
第三步微滴PCR：将微滴转移至96孔PCR反应板中，并密封进行微滴PCR；
第四步微滴分析：PCR反应后，将96孔PCR反应板转移至微滴分析仪上，分析每个样品的微滴的荧光信号，软件根据阴性微滴的比例，结合泊松分布原理，定量DNA/RNA浓度(copies/ul)。
有关引物和探针序列、PCR扩增的具体反应条件以及所用到的试剂组分如下：
1、位点与引物探针序列：
cg26205771
cg08436738
cg27252696
cg24917945
cg03550506
cg06903569
cg12865837
cg18440897
cg19255783
cg20634573
2.试剂组分
表6 PCR扩增所用到的试剂
组分名称 试剂组分
转化液 亚硫酸氢铵溶液
结合液 盐酸胍
洗涤液 纯化水
纯化液 异丙醇、乙醇、氢氧化钠
洗脱液 TE溶液
3、PCR扩增的具体条件
cg26205771
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
53℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg08436738
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
53℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg01604601
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
51℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg27252696
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
47℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg24917945
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
51℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg11252953
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
51℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg03550506
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
50.5℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg06903569
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
48℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg12865837
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
52℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg18440897
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
49℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg19255783
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
49℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
cg20634573
PCR扩增条件
第一阶段：95℃，10min，1个循环；
第二阶段：94℃，30s，
51℃，1min，45个循环；
第三阶段：98℃，10min，1个循环；
第四阶段：12℃，30min。
诊断预测分析
cfDNA分三步进行检测分析。
首先分析第一组甲基化位点的cfDNA：若cfDNA 3个位点的甲基化值均小于或等于正常对照cfDNA甲基化率，则为预后低风险；如果有2个或2个以上位点的甲基化率大于或等于表中的癌症患者cfDN甲基化率，则为预后高风险；如果只有1个位点的甲基化率大于或等于表中的癌症患者cfDN甲基化率，或有1个或1个以上位点的甲基化率介于正常对照和癌症患者cfDNA甲基化率之间，则需要计算平均值。如果平均值低于13.83％，表明具有较低的患癌风险；如果平均值大于或等于13.83％，则需要做第二组检测。
若cfDNA第二组4个位点的甲基化值均小于或等于正常对照cfDNA甲基化率，则为预后低风险；如果有1个或1个以上位点的甲基化率大于或等于表中的癌症患者cfDN甲基化率，则为预后高风险；若有1个或1个以上位点的甲基化率介于正常对照和癌症患者cfDNA甲基化率之间，则需要计算平均值。如果平均值低于12.20％，表明具有较低的患癌风险；如果平均值大于或等于12.20％，则需要做第三组检测。
若cfDNA第三组4个位点的甲基化率均小于或等于正常对照cfDNA甲基化率，则可能预后低风险，需要做进一步临床监测；若如果有1个或1个以上位点的甲基化率大于或等于正常对照cfDNA甲基化率，则需要计算平均值。如果平均值低于12.93％，则可能预后低风险，需要做进一步临床监测；如果平均值高于于12.93％，则为预后高风险。测定结果见表7。
表7甲基化标记物的癌症患者cfDNA甲基化比例与正常对照cfDNA甲基化比例
M：甲基化，nM：非甲基化，通过计算M/(M+NM)的甲基化比值。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州优泽生物技术有限公司
<120> 用于肺癌诊断、疗效预测或预后的甲基化位点、检测引物及试剂盒
<130> BJ-4005-190204A
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
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acacctataa tcccaacta 19
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gataygagtt ggtttygagt 20
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gattaggagg aaatggat 18
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tttagtgttt gagggtagg 19
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aggtattttt atggggag 18
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ttcctaacac cttcc 15
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gtagggtata gtatatagaa 20
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ccacttctac taaattact 19
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tagttttaga tgtttttatt gg 22
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ggttaggatg tattaggtt 19
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ttgtattggg ggtgttyg 18

Claims (10)

1.用于肺癌早期诊断、预测肺癌术后复发的甲基化位点，其特征在于，选自以下所述的甲基化位点中的任何一种或一种以上的组合作为诊断标志物：1-295864、3-1138223、6-1526223、6-265969、7-14998、7-862737、9-954757、10-1205149、11-646423、12-1222773、13-510867、14-1019927、16-571473、17-732857、19-179828。
2.按照权利要求1所述的用于肺癌早期诊断、预测肺癌术后复发的甲基化位点，其特征在于，采用1-295864、3-1138223、6-1526223和6-265969的组合作为早期肺癌的诊断标志物。
3.权利要求1所述的甲基化位点在制备诊断早期肺癌或预测肺癌术后复发的试剂中的用途。
4.用于肺癌早期诊断或预测肺癌术后复发的PCR检测试剂盒，包括：扩增权利要求1所述甲基化位点的特异性引物和探针，转化液，结合液，洗涤液，纯化液，洗脱液，DNA提取试剂，PCR扩增试剂。
5.按照权利要求3所述的PCR检测试剂盒，其特征在于：用于扩增权利要求1所述的甲基化位点1-295864的引物组由SEQ ID No.1-SEQ ID No.4所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点3-1138223的引物组由SEQ ID No.5-SEQ ID No.8所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点6-1526223的引物组由SEQ ID No.9-SEQ IDNo.12所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点6-265969的引物组由SEQ ID No.13-SEQ ID No.16所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点7-14998的引物组由SEQ ID No.17-SEQ ID No.20所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点7-862737的引物组由SEQ ID No.21-SEQ ID No.24所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点9-954757的引物组由SEQ ID No.25-SEQ IDNo.28所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点10-1205149的引物组由SEQ ID No.29-SEQ ID No.32所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点11-646423的引物组由SEQ ID No.33-SEQ ID No.36所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点12-1222773的引物组由SEQ ID No.37-SEQ ID No.40所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点13-510867的引物组由SEQ ID No.41-SEQID No.44所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点14-1019927的引物组由SEQ ID No.45-SEQ ID No.48所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点16-571473的引物组由SEQ ID No.49-SEQ ID No.52所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点17-732857的引物组由SEQ ID No.53-SEQ ID No.56所述的引物序列组成；用于扩增权利要求1所述的甲基化位点19-179828的引物组由SEQ ID No.57-SEQID No.60所述的引物序列组成。
6.用于肺癌预后或预测肺癌患者死亡风险的甲基化位点，其特征在于，选自以下甲基化位点中的任何一种或一种以上的任意组合：cg26205771、cg08436738、cg27252696、cg24917945、cg03550506、cg06903569、cg12865837、cg18440897、cg19255783、cg20634573。
7.按照权利要求6所述的甲基化位点，其特征在于，选自以下(1)-(3)组合中的任何一种或多种：(1)cg26205771，cg08436738和cg27252696；(2)cg24917945，cg11252953，cg03550506和cg06903569；(3)cg12865837，cg18440897，cg19255783和cg20634573。
8.权利要求6或7所述的甲基化位点在制备诊断肺癌、肺癌预后或预测肺癌患者死亡风险的试剂中的用途。
9.用于肺癌诊断、预后或预测肺癌患者死亡风险的检测试剂盒，包括：用于扩增权利要求6或7所述甲基化位点的特异性引物和探针，转化液，结合液，洗涤液，纯化液，洗脱液，DNA提取试剂，PCR扩增试剂；优选的，所述的转化液是亚硫酸氢铵溶液；所述的结合液是盐酸胍；所述的洗涤液是纯化水；所述的纯化液是异丙醇、乙醇或氢氧化钠；所述的洗脱液是TE溶液；所述的PCR扩增试剂为ddPCR扩增试剂。
10.按照权利要求 9所述的检测试剂盒，其特征在于，用于扩增甲基化位点cg26205771的引物组由SEQ ID No.61-SEQ ID No.64所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg08436738的引物组由SEQ ID No.65-SEQ ID No.68所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg27252696的引物组由SEQ ID No.69-SEQ ID No.72所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg24917945的引物组由SEQ ID No.73-SEQ ID No.76所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg03550506的引物组由SEQ ID No.77-SEQ ID No.80所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg06903569的引物组由SEQ ID No.81-SEQ ID No.84所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg12865837的引物组由SEQ ID No.85-SEQ ID No.88所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg18440897的引物组由SEQ ID No.89-SEQ IDNo.92所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg19255783的引物组由SEQ ID No.93-SEQ ID No.96所述的引物序列组成；用于扩增甲基化位点cg20634573的引物组由SEQ IDNo.97-SEQ ID No.100所述的引物序列组成。
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