CN110152019A - 仿生双模态相变型纳米级超声造影剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿生双模态相变型纳米级超声造影剂，制剂为球体状核壳结构，平均粒径200～300nm，壳膜内包覆液态氟碳，壳膜由携载近红外荧光染料IR‑780的红细胞膜组成。同时公开其制备方法，采集动物全血并经分离提取获得红细胞膜，后者经高速旋切后与IR‑780混合静置并得到携载IR‑780的红细胞膜，将其与液态氟碳混合后经超声乳化得到该新型造影剂。结果显示本发明制备的造影剂为粒径均一的纳米级，性质稳定，同时保留了红细胞膜的功能，能够实现高效免疫逃逸，有望使更多的超声造影剂靶向聚集于肿瘤组织，进行肿瘤分子靶向双模态优势互补显像，进一步介导有效的肿瘤靶向光热消融，为实现肿瘤的高效无创精准探查及靶向光热治疗开辟了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于造影剂及其制备技术领域，具体涉及仿生双模态相变型纳米级超声造影剂及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁着当代人的生命和健康，对恶性肿瘤进行早期诊断和有效靶向治疗，能改善患者的预后及生存率。目前，超声分子影像研究迅速发展，肿瘤的诊断与治疗已经从传统模式跨入到分子领域。超声影像技术具有便捷、无放射性、可实时动态检测等优点。性能优良的超声造影剂是实施这一技术的关键。然而，由于传统超声造影剂粒径都在微米级以上，不易穿透肿瘤血管内皮间隙直接到达肿瘤组织，探索开发一种粒径较小、具有高效肿瘤靶向性的超声造影剂已迫在眉睫。
近年来研究发现，粒径小于传统超声造影剂的纳米微泡由于其尺寸的优势，可利用高通透性及滞留效应(EPR效应)通过380-780nm的肿瘤血管内皮间隙聚集在肿瘤部位发挥作用。但这种纳米微泡稳定性较差，且随着其粒径的减小，回声增强效应减弱，超声成像能力降低，难以获得满意的成像效果。因此，以液态氟碳为核心的纳米级超声造影剂最近几年被开发出来，其稳定性较前者得到改善，并可以透过肿瘤血管，在超声或激光作用下发生液-气相变产生大量的微米级气泡，从而增强超声造影图像的清晰度。但组成纳米液滴的不同壳膜成分进入体内易被网状内皮***(RES)识别并吞噬，随后真正到达肿瘤组织的量会大大减少，严重影响其在病变部位发挥作用。红细胞膜(RBCM)包裹纳米微粒载药***逃避免疫吞噬、延长体内循环时间从而实施肿瘤高靶向给药的研究在近几年成果突出。但红细胞膜包裹液态氟碳作为超声造影剂尚无明确报道。
进一步，近红外荧光染料IR-780因具有肿瘤组织特异靶向性及低生物毒性的特点，近年来作为分子探针在肿瘤研究领域备受关注。IR-780可进行近红外成像，结合超声造影剂的声学显像能力实现病变部位的双模态诊断；同时，还能通过介导光热、光动力效应实现肿瘤靶向治疗。但IR-780难溶于水，难以单独发挥作用，将其携载于有效纳米载体上是解决这一问题的关键。
综上所述，制备一种红细胞膜包裹液态氟碳、携载近红外荧光染料IR-780的仿生双模态相变型纳米液滴作为肿瘤分子靶向超声造影剂目前尚无相关研究报道。
发明内容
为了解决了现有技术中存在的问题，本发明公开仿生双模态相变型纳米级超声造影剂及其制备方法，能使红细胞膜形成壳膜并携载IR-780，壳膜中包覆液态氟碳，能够用于肿瘤的早期精准探查与靶向治疗。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是，仿生双模态相变型纳米级超声造影剂，制剂为核壳结构，呈球体状，其平均粒径为200～300nm；壳膜内包覆液态氟碳，壳膜由成熟的红细胞膜组成，所述壳膜上携载近红外荧光染料IR-780。
壳膜原料为哺乳动物的红细胞膜，所述红细胞膜采用鼠红细胞膜、兔红细胞膜、狗红细胞膜、猪红细胞膜或人红细胞膜。
液态氟碳为全氟己烷、全氟戊烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、或全氟萘烷。
优选的，壳膜原料采用鼠红细胞膜；液态氟碳采用全氟己烷。
仿生双模态相变型纳米级超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：
S1，采集成熟的动物全血并贮存在装有抗凝剂的封闭容器中；
S2，将S1所贮存的动物全血离心处理后，去掉其中的上清液后用缓冲液洗涤；
S3，重复S2数次，将上层血浆和其余血细胞去除，收集纯红细胞；
S4，向S3所得纯红细胞中依次加入预冷后的蒸馏水和10×PBS，混合均匀后进行离心处理，再去掉上清液，得到红细胞膜；
S5，重复S4数次，收集红细胞膜，用预冷的1×PBS缓冲液将红细胞膜悬浮，得到红细胞膜的混悬液；
S6，向S5所得红细胞膜的混悬液中加入甘油配置成水合液；
S7，在冰水浴条件下，对S6所得产物进行剪切，得到纳米级红细胞膜混悬液；
S8，在避光条件下，取近红外荧光染料IR-780，配制近红外荧光染料IR-780溶液；
S9，将S7所得纳米级红细胞膜混悬液与S8所得近红外荧光染料IR-780溶液混合，然后静置得到携载近红外荧光染料IR-780的纳米级红细胞膜混悬液；
S10，将S9所得产物与液态氟碳混合，在冰水浴条件下，进行超声乳化至乳状混悬液，得到仿生双模态相变型纳米级超声造影剂。
S8中，近红外荧光染料IR-780溶液的浓度为1.0mg/mL～2.0mg/mL，近红外荧光染料IR-780溶液的溶剂为二甲基亚砜或氯仿。
S1所取动物全血、S8所得近红外荧光染料IR-780溶液以及液态氟碳的体积比为24:0.6:(3-4)。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明制备所需的红细胞来源于哺乳动物自体成熟红细胞，在血液中红细胞的含量最为丰富，便于在实验过程中提取，红细胞作为壳膜的超声造影剂进入人体后可生物降解，能够减少毒副作用；
本发明所述仿生双模态相变型纳米级超声造影剂壳膜为红细胞膜，能够减少网状内皮***的摄取，抑制巨噬细胞的吞噬作用，延长超声造影剂在体内的循环时间，增加在肿瘤部位的聚集，同时这种超声造影剂在保留红细胞膜功能的同时，还具备超声造影剂的声学特性，有效提高肿瘤诊断与治疗的能力；
本发明所述仿生双模态相变型纳米级超声造影剂核心为液态氟碳，液态氟碳性质稳定，液态氟碳相变成气泡后，能增强肿瘤浸润边缘与转移病灶的超声显影效果，还可以通过空化效应对肿瘤进行机械性损伤；
本发明所述仿生双模态相变型纳米级超声造影剂表面携带的近红外荧光染料IR-780具有近红外成像能力，能够协同超声造影进行双模态成像，同时又能够靶向聚集在肿瘤组织上，通过介导光热和光动力治疗，实现肿瘤的高效靶向消融，在提高疗效的同时减少对人体正常组织的损伤。
附图说明
图1为制备IR780-RBCM@Nds的结构示意图；
图2为IR780-RBCM@Nds的粒径分布图；
图3为激光共聚焦荧光显微镜下观察IR780-RBCM@Nds(×100油镜)；
图4为IR780-RBCM@Nds的扫描电镜图；
图5为37℃下体外观察IR780-RBCM@Nds的稳定性；
图6为体外观察超声辐照前后IR780-RBCM@Nds的相变及超声造影效果；
图7为激光共聚焦荧光显微镜观察IR780-RBCM@Nds表面免疫逃避蛋白CD47被异硫氰酸荧光素偶联的抗小鼠CD47单克隆抗体标记；
图8为实时动态活细胞成像仪体外观察巨噬细胞吞噬IR780-RBCM@Nds。
具体实施方式
下面结合实施例以及附图对本发明进行详细阐释。
实施例1
IR780-RBCM@Nds的制备
S1，取8只裸鼠，裸鼠来自中国人民解放军空军军医大学实验动物中心，体重20～25g，6～8周龄，分别用剂量为100μL的1％戊巴比妥钠(50mg/kg)进行腹腔内麻醉，经颈动脉取血，总共采集的4mL全血并贮存在含肝素钠的采血管中；
S2，将S1所贮存的全血使用离心机(德国艾本德)以3000r/min，在4℃温度条件下离心10分钟，弃上清液，然后用预冷的1×PBS(美国通用)缓冲液反复洗涤，
S3，重复S2五次，直至去除上层血浆及其余血细胞，收集2mL纯红细胞；
S4，向S3所得纯红细胞中加入80mL预冷的蒸馏水，再加入80mL预冷的10×PBS，10×PBS为1×PBS与蒸馏水按照体积比为1:9混合，混合均匀，以12000r/min的离心转速在4℃温度条件下离心15分钟，弃上清液，得到红细胞膜；
S5，重复S4五次，收集红细胞膜，用3.6mL预冷的1×PBS缓冲液悬浮所述红细胞膜，得到红细胞膜混悬液；
S6，向S5所得红细胞膜混悬液中加入400μL甘油(西安科昊)配置成4mL悬浮红细胞膜的水合液(1×PBS：甘油＝9:1，体积比)；
S7，在冰水浴条件下，将手持式高速匀浆机(上海净信)调至10000r/min，对S6所得产物进行高速旋切，时间20min，得到纳米级红细胞膜混悬液；
S8，在避光条件下，称取2.0mg近红外荧光染料IR-780(美国西格玛奥德里奇)，溶于二甲基亚砜(西安科昊)，配置成2mg/mL的IR-780溶液；
S9，向S7所得纳米级红细胞膜中加入100μL的S8所得IR-780溶液，常温下静置30分钟，得到携载近红外荧光染料IR-780的纳米级红细胞膜混悬液；
S10，向S9所得产物中加入667μL的全氟己烷(PFH，西安瑞喜)，在冰水浴条件下，用超声波细胞粉碎仪(科尔帕默4710系列，美国)以最大输出功率振荡130s，获得IR780-RBCM@Nds：仿生双模态相变型纳米级超声造影剂。
本实施例中，预冷温度和冰水温度均为4℃。
实施例2
IR780-RBCM@Nds的制备
S1，取8只裸鼠，裸鼠来自中国人民解放军空军军医大学实验动物中心，体重20～25g，6～8周龄，分别用剂量为100μL的1％戊巴比妥钠(50mg/kg)进行腹腔内麻醉，经颈动脉取血，总共采集的4mL全血并贮存在含肝素钠的采血管中；
S2，将S1所贮存的全血使用离心机以3000r/min，在4℃温度条件下离心10分钟，弃上清液，然后用预冷的1×PBS缓冲液反复洗涤，
S3，重复S2五次，直至去除上层血浆及其余血细胞，收集2mL纯红细胞；
S4，向S3所得纯红细胞中加入80mL预冷的蒸馏水，再加入80mL预冷的10×PBS，10×PBS为1×PBS与蒸馏水按照体积比为1:9混合，混合均匀，以12000r/min的离心转速在4℃温度条件下离心15分钟，弃上清液，得到红细胞膜；
S5，重复S4五次，收集红细胞膜，用3.6mL预冷的1×PBS缓冲液悬浮所述红细胞膜，得到红细胞膜混悬液；
S6，向S5所得红细胞膜混悬液中加入400μL甘油(西安科昊)配置成4mL悬浮红细胞膜的水合液(1×PBS：甘油＝9:1，体积比)；
S7，在冰水浴条件下，将手持式高速匀浆机(上海净信)调至10000r/min，对S6所得产物进行高速旋切，时间20min，得到纳米级红细胞膜混悬液；
S8，在避光条件下，称取1.5mg近红外荧光染料IR-780(美国西格玛奥德里奇)，溶于二甲基亚砜(西安科昊)，配置成1.5mg/mL的IR-780溶液；
S9，向S7所得纳米级红细胞膜中加入100μL的S8所得IR-780溶液，常温下静置30分钟，得到携载近红外荧光染料IR-780的纳米级红细胞膜混悬液；
S10，向S9所得产物中加入571μL的全氟正戊烷(PFP，西安瑞喜)，在冰水浴条件下，用超声波细胞粉碎仪(科尔帕默4710系列，美国)以最大输出功率振荡130s，获得IR780-RBCM@Nds：仿生双模态相变型纳米级超声造影剂。
本实施例中，预冷温度和冰水温度均为4℃。
实施例3
IR780-RBCM@Nds的制备
S1，取8只裸鼠，裸鼠来自中国人民解放军空军军医大学实验动物中心，体重20～25g，6～8周龄，分别用剂量为100μL的1％戊巴比妥钠(50mg/kg)进行腹腔内麻醉，经颈动脉取血，总共采集的4mL全血并贮存在含肝素钠的采血管中；
S2，将S1所贮存的全血使用离心机以3000r/min，在4℃温度条件下离心10分钟，弃上清液，然后用预冷的1×PBS缓冲液反复洗涤，
S3，重复S2五次，直至去除上层血浆及其余血细胞，收集2mL纯红细胞；
S4，向S3所得纯红细胞中加入80mL预冷的蒸馏水，再加入80mL预冷的10×PBS，10×PBS为1×PBS与蒸馏水按照体积比为1:9混合，混合均匀，以12000r/min的离心转速在4℃温度条件下离心15分钟，弃上清液，得到红细胞膜；
S5，重复S4五次，收集红细胞膜，用3.6mL预冷的1×PBS缓冲液悬浮所述红细胞膜，得到红细胞膜混悬液；
S6，向S5所得红细胞膜混悬液中加入400μL甘油(西安科昊)配置成4mL悬浮红细胞膜的水合液(1×PBS：甘油＝9:1，体积比)；
S7，在冰水浴条件下，将手持式高速匀浆机(上海净信)调至10000r/min，对S6所得产物进行高速旋切，时间20min，得到纳米级红细胞膜混悬液；
S8，在避光条件下，称取1.0mg近红外荧光染料IR-780(美国西格玛奥德里奇)，溶于氯仿(西安科昊)，配置成1.0mg/mL的IR-780溶液；
S9，向S7所得纳米级红细胞膜中加入100μL的S8所得IR-780溶液，常温下静置30分钟，得到携载近红外荧光染料IR-780的纳米级红细胞膜混悬液；
S10，向S9所得产物中加入500μL的全氟庚烷(PFH，西安瑞喜)，在冰水浴条件下，用超声波细胞粉碎仪(科尔帕默4710系列，美国)以最大输出功率振荡130s，获得IR780-RBCM@Nds：仿生双模态相变型纳米级超声造影剂。
本实施例中，预冷温度和冰水温度均为4℃。
IR780-RBCM@Nds的结构
本发明所述IR780-RBCM@Nds的结构示意图，如图1所示，红细胞膜作为壳膜，包裹液态氟碳，表面携载近红外荧光染料IR-780。
所述IR780-RBCM@Nds核心物质为液态氟碳；例如：全氟己烷(Perfluorohexane，PFH)、全氟戊烷(Perfluoropentane，PFP)、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、或全氟萘烷。
所述IR780-RBCM@Nds的壳膜为哺乳动物红细胞膜；例如：鼠红细胞膜、兔红细胞膜、狗红细胞膜、猪红细胞膜、人红细胞膜；本发明优选鼠红细胞膜。
所述IR780-RBCM@Nds的标记，可以无限制地使用能够标记于红细胞膜，并具有肿瘤靶向性和光热特性的物质；例如近红外荧光染料IR-780。
所述IR780-RBCM@Nds：仿生双模态相变型纳米级超声造影剂的粒径小于780nm，优选200～300nm。
IR780-RBCM@Nds的特性
1.粒径、电位及分散性指数
在25℃室温下，用贝克曼zeta电位/纳米粒度分析仪检测IR780-RBCM@Nds粒径分布，表面电位和分散性指数，每个样本重复三次。结果如图2所示，IR780-RBCM@Nds粒径呈单峰状，平均粒径为261.4±58.6nm，它的平均电位为8.51±7.00mV，分散性指数为0.285±0.010。
2.激光共聚焦荧光显微镜表征分析
取一滴用1×PBS缓冲液稀释后浓度为1.2×106个/mL的IR780-RBCM@Nds，滴于载玻片上，盖上盖玻片后用激光共聚焦荧光显微镜高倍油镜观察(激发波长为680nm，发射波长为780nm)，结果如图3所示，IR780-RBCM@Nds呈红色圆球形，分布均匀，大小均一。
3.扫描电镜表征分析
将本发明实施例1所制备的IR780-RBCM@Nds混悬液用1×PBS缓冲液稀释后，滴至铜网上，在室温下进行晾干，制得电镜样品，通过扫描电镜(日立S-4800，日本)观察，结果如图4所示，IR780-RBCM@Nds呈球体结构，形态规则，大小均匀，平均粒径为200～300nm，与粒度分析仪检测的结果相吻合。
IR780-RBCM@Nds在体外的稳定性
模拟体内37℃的体温，通过观察IR780-RBCM@Nds的粒径随时间的改变评估其稳定性。将六组各1mL用1×PBS缓冲液稀释后浓度为1.2×106个/mL的IR780-RBCM@Nds混悬液放入离心管中，置于37℃的水浴锅内(常州国华，中国)，分别在0min、10min、20min、30min、60min、120min时，用贝克曼zeta电位/纳米粒度分析仪检测其粒径；以上实验重复三次，结果如图5所示，IR780-RBCM@Nds的粒径在0min、10min、20min、30min、60min、120min时对应分别为213.4±55.32nm，247.6±65.81nm，247.3±61.22nm，306.4±72.43nm，382.6±87.52nm，553.8±162.04nm，在120min时，IR780-RBCM@Nds的粒径仍小于780nm，能够顺利通过肿瘤血管间隙，研究表明IR780-RBCM@Nds的稳定性能够满足在体内进行肿瘤诊断与治疗的要求。
IR780-RBCM@Nds的体外相变及超声造影成像
在体外实验中，取2mL浓度为2.2×106个/mL的IR780-RBCM@Nds混悬液，装入乳胶手套指端制成的乳胶囊中，将等体积的脱气水作为对照组；体外应用低强度聚焦超声仪(LIFU)垂直辐照实验组与对照组的乳胶囊，将超声成像仪调至二维、造影的双屏显示模式(百盛，意大利)，观察体外超声显影并采集图像，结果如图6所示，低强度聚焦超声以2.5W/cm2辐照5s，IR780-RBCM@Nds相变为气泡，超声显像能力增强。
激光共聚焦荧光显微镜对IR780-RBCM@Nds表面免疫逃避蛋白CD47的检测
取200μL浓度为1.8×106的IR780-RBCM@Nds作为实验组，将等体积等浓度脂质纳米液滴作为对照组，分别加入4μL浓度为0.5mg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗小鼠CD47单克隆抗体，在4℃下结合12h后，用激光共聚焦荧光显微镜观察；IR-780的激发波长为680nm，发射波长为780nm；异硫氰酸荧光素的激发波长为488nm，发射波长为525nm；结果如图7所示，IR780-RBCM@Nds表面显示绿色荧光，而对照组脂质壳膜纳米液滴表面无绿色荧光，研究表明IR780-RBCM@Nds保留了红细胞膜的特性，表面具有免疫逃避蛋白CD47。
IR780-RBCM@Nds的巨噬细胞吞噬实验
在避光条件下，将1mg细胞膜绿色荧光探针(DiO)(杭州碧云天)溶解于1mL二甲基亚砜(DMSO)中制备成1mg/mL的DiO溶液；取以下两种浓度均为4.8×106个/ml的液滴各400μL分别与DiO溶液以40:1的体积比混合：
(1)IR780-RBCM@Nds，(2)脂质壳膜纳米液滴。
400μL PBS内加入以相同比例加入相同体积的DiO溶液作为对照组。在细胞培养箱中将每组以100μL/孔分别与RAW 264.7巨噬细胞在细胞培养箱的96孔板中孵育12小时，每孔5000个RAW 264.7巨噬细胞；使用实时动态活细胞成像仪(森西，美国)拍摄图像，DiO的激发波长为484nm，发射波长为501nm，结果如图8所示，IR780-RBCM@Nds组显示出的绿色荧光少(图)，与对照组没有明显差异；而巨噬细胞积极摄取脂质壳膜纳米液滴，使得巨噬细胞吞噬脂质壳膜纳米液滴后产生大量绿色荧光；红细胞膜将免疫逃逸功能从红细胞易位至新型超声造影剂表面，IR780-RBCM@Nds可以有效地减少网状内皮***的清除。
Claims (8)
1.仿生双模态相变型纳米级超声造影剂，其特征在于，制剂为核壳结构，呈球体状，其平均粒径为200～300nm；壳膜内包覆液态氟碳，壳膜由成熟的红细胞膜组成，所述壳膜上携载近红外荧光染料IR-780。
2.根据权利要求1所述的仿生双模态相变型纳米级超声造影剂，其特征在于，壳膜原料为哺乳动物的红细胞膜，所述红细胞膜采用鼠红细胞膜、兔红细胞膜、狗红细胞膜、猪红细胞膜或人红细胞膜。
3.根据权利要求2所述的仿生双模态相变型纳米级超声造影剂，其特征在于，壳膜原料采用鼠红细胞膜。
4.根据权利要求1所述的仿生双模态相变型纳米级超声造影剂，其特征在于，液态氟碳为全氟己烷、全氟戊烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟溴辛烷、或全氟萘烷。
5.根据权利要求4所述的仿生双模态相变型纳米级超声造影剂，其特征在于，液态氟碳采用全氟己烷。
6.仿生双模态相变型纳米级超声造影剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，采集成熟的动物全血并贮存在装有抗凝剂的封闭容器中；
S2，将S1所贮存的动物全血离心处理后，去掉其中的上清液后用缓冲液洗涤；
S3，重复S2数次，将上层血浆和其余血细胞去除，收集纯红细胞；
S4，向S3所得纯红细胞中依次加入预冷后的蒸馏水和10×PBS，混合均匀后进行离心处理，再去掉上清液，得到红细胞膜；
S5，重复S4数次，收集红细胞膜，用预冷的1×PBS缓冲液将红细胞膜悬浮，得到红细胞膜的混悬液；
S6，向S5所得红细胞膜的混悬液中加入甘油配置成水合液；
S7，在冰水浴条件下，对S6所得产物进行剪切，得到纳米级红细胞膜混悬液；
S8，在避光条件下，取近红外荧光染料IR-780，配制近红外荧光染料IR-780溶液；
S9，将S7所得纳米级红细胞膜混悬液与S8所得近红外荧光染料IR-780溶液混合，然后静置得到携载近红外荧光染料IR-780的纳米级红细胞膜混悬液；
S10，将S9所得产物与液态氟碳混合，在冰水浴条件下，进行超声乳化至乳状混悬液，得到仿生双模态相变型纳米级超声造影剂。
7.根据权利要求6所述的仿生双模态相变型纳米级超声造影剂的制备方法，其特征在于，S8中，近红外荧光染料IR-780溶液的浓度为1.0mg/mL～2.0mg/mL，近红外荧光染料IR-780溶液的溶剂为二甲基亚砜或氯仿。
8.根据权利要求6所述的仿生双模态相变型纳米级超声造影剂的制备方法，其特征在于，S1所取动物全血、S8所得近红外荧光染料IR-780溶液以及液态氟碳的体积比为24:0.6:(3-4)。
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|---|---|
| CN (1) | CN110152019A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110772649A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-02-11 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种多孔高分子超声造影剂及其制备方法 |
| CN111330025A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-06-26 | 中山大学附属第三医院 | 一种仿生微泡超声造影剂及制备方法 |
| CN111330026A (zh) * | 2020-03-19 | 2020-06-26 | 中南大学湘雅二医院 | 一种仿生相变超声造影剂及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014041150A1 (en) * | 2012-09-14 | 2014-03-20 | Stichting Katholieke Universiteit | Contrast agent and its use for imaging |
| US20160317441A1 (en) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | National Tsing Hua University | Biomembrane phase-change droplets (pcd), drug carrier and use thereof |
| CN106267199A (zh) * | 2016-08-25 | 2017-01-04 | 郑州大学 | 一种超声调控型抗肿瘤药物递送***的制备方法及应用 |
-
2019
- 2019-06-10 CN CN201910498246.9A patent/CN110152019A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014041150A1 (en) * | 2012-09-14 | 2014-03-20 | Stichting Katholieke Universiteit | Contrast agent and its use for imaging |
| US20160317441A1 (en) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | National Tsing Hua University | Biomembrane phase-change droplets (pcd), drug carrier and use thereof |
| CN106267199A (zh) * | 2016-08-25 | 2017-01-04 | 郑州大学 | 一种超声调控型抗肿瘤药物递送***的制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHEN-CHAN HSIEH, ET AL.: "Biomimetic Acoustically-Responsive Vesicles for Theranostic Applications", 《THERANOSTICS》 * |
| 易衡静等: "靶向肿瘤细胞的相变型纳米粒多模态显像及其声动力治疗的体外实验研究", 《解放军医学杂志》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110772649A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-02-11 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种多孔高分子超声造影剂及其制备方法 |
| CN111330025A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-06-26 | 中山大学附属第三医院 | 一种仿生微泡超声造影剂及制备方法 |
| CN111330025B (zh) * | 2020-03-03 | 2022-07-26 | 中山大学附属第三医院 | 一种仿生微泡超声造影剂及制备方法 |
| CN111330026A (zh) * | 2020-03-19 | 2020-06-26 | 中南大学湘雅二医院 | 一种仿生相变超声造影剂及其制备方法 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190823 |
|
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