CN110144369A - 一种制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，将大豆磷脂溶解于水或氯化钙溶液中，加入磷脂酶进行酶解反应；酶解反应产物经过预处理后转移至硅胶柱中，并以多卤代低碳烷烃‑低碳醇‑水为洗脱剂进行多次洗脱，收集目标物的溶液，浓缩干燥后得到高纯度溶血磷脂酰胆碱产品。本发明以普通大豆磷脂为原料，通过酶解反应，酶解后预处理及柱层析提纯工艺制备高纯度溶血磷脂酰胆碱，具有原材料廉价易得、工艺简单、可操作性强、产品收率高等特点，适合于工业化生产，生产的溶血磷脂酰胆碱纯度高、副产物少，产品质量稳定。
Description
技术领域
本发明涉及磷脂代谢产物的制备方法，具体的说，是涉及一种制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法。
背景技术
溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，简称LPC）是磷脂的代谢产物之一，亦称溶血卵磷脂，是磷脂酰胆碱脱去一条脂肪酸链后形成的产物。溶血磷脂酰胆碱的乳化能力，乳化稳定性等均优于普通磷脂产品；此外溶血磷脂酰胆碱还具有独特的生理活性，抑菌活性和抗氧化性能。因此溶血磷脂酰胆碱在食品工业，医药工业，化妆品工业及饲料工业中可以作为添加剂、医药中间体、药物载体及高效乳化剂使用。
例如，在医药领域中，高纯度溶血磷脂酰胆碱是靶向制剂的关键辅料之一，其也可以作为一类优良的抗癫痫药物的原料；因为溶血磷脂酰胆碱主要在肝脏代谢，在肝脏疾病和肝毒性中可发现明显含量变化，具体表现为溶血磷脂酰胆碱含量明显高于正常人，因此溶血磷脂酰胆碱也常被应用于肝脏病理研究用作标志物，另外溶血磷脂酰胆碱与糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常等代谢性疾病及心血管病密切相关，因此高纯度的溶血磷脂酰胆碱直接作为药物中间体，标志物或作为医药辅料使用的应用前景广阔。
制备溶血磷脂酰胆碱的方法主要有化学合成、酸碱水解、酶解、物理分离及柱层析等方法。这些方法各有优势，但又各有不足。例如化学合成法使用的原料毒性大，应用范围受到限制；酸碱水解法的水解反应程度难以控制；各种物理分离方法在目标产物的纯化上都遇到了难以克服的困难，且存在收率低、设备投资大、成本高等问题；酶解法容易出现各种副反应，难以直接实现高纯度溶血磷脂酰胆碱的制备；柱层析法严重依赖于初始原料的纯度，且过程中所选择的洗脱剂的种类、比例及用量等与最终分离效果有直接关系，不同的待分离物通常对应的是独特的固定相和洗脱剂及洗脱剂比例。
目前，制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的通行做法，是从高纯度的磷脂酰胆碱（PC）原料出发来获得目标产物。而这种做法存在着严重的原材料依赖性，所使用的原材料为高纯度磷脂酰胆碱（PC），该物质需要通过合成或复杂的提取手段获得，成本高昂，不容易得到。
在以普通大豆磷脂为起始原材料制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方向上，日本专利JP63091306A公开了一种以大豆磷脂为原料的制备方法，经过丙酮脱油，磷脂酶A2水解，硅胶柱层析，乙醇-水洗脱，最终得到溶血磷脂酰胆碱含量为87%，溶血磷脂酰乙醇胺含量为6%的产品；该专利技术所述的技术仍然存在所得产物纯度有限、难以彻底除掉其它结构相似组分（如溶血磷脂酰乙醇胺等）的问题。此外，专利CN104558021A公开了一种从大豆或蛋黄磷脂出发，直接采用多卤代烷烃-低碳醇-水混合洗脱剂直接进行柱层析，最终得到高纯度天然溶血磷脂酰胆碱的制备方法；但是，受限于起始原材料中溶血磷脂酰胆碱的极低含量（例如大豆磷脂中天然溶血磷脂酰胆碱的总含量通常约1%左右），该技术所描述的方法或存在着产品收率不高，提取效率有限，综合制备成本高的问题。
以上缺陷，值得解决。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法。
本发明技术方案如下所述：
一种制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，在磷脂酶存在下，对大豆磷脂进行酶解反应，酶解反应产物经过预处理后转移至硅胶柱中，并以多卤代低碳烷烃-低碳醇-水为洗脱剂进行多次洗脱，收集目标物的溶液，浓缩干燥后得到高纯度溶血磷脂酰胆碱产品。
根据上述方案的本发明，其特征在于，所述大豆磷脂溶解于水溶液，并选用磷脂酶A1进行酶解反应。
根据上述方案的本发明，其特征在于，所述大豆磷脂溶解于氯化钙溶液，并选用磷脂酶A2进行酶解反应。
根据上述方案的本发明，其特征在于，酶解反应产物进行预处理的过程具体包括以下步骤：先向酶解反应产物中加入丙酮，搅拌溶解后过滤分离得到固体沉淀物；该固体沉淀物溶解于多卤代低碳烷烃中得到溶液；该溶液倒入低碳一元醇中析出固体物质，过滤除掉析出固体物质并收集滤液；收集的滤液进行浓缩。
根据上述方案的本发明，其特征在于，所述多卤代低碳烷烃包括二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷。
根据上述方案的本发明，其特征在于，所述低碳醇为低碳一元醇。
进一步的，所述低碳一元醇包括甲醇、乙醇、异丙醇。
根据上述方案的本发明，其特征在于，依次用多卤代低碳烷烃、多卤代低碳烷烃/低碳醇、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水逐步进行多次洗脱。
进一步的，在多次洗脱过程中，洗脱剂的极性逐渐增大。
更进一步的，在第二次洗脱过程中，多卤代低碳烷烃/低碳醇的体积比为5：1；在第三次洗脱过程中，多卤代烷烃/低碳醇/水的体积比为5：1：0.1；在第四次洗脱过程中，多卤代烷烃/低碳醇/水的体积比为3：1：0.1；在第五次洗脱过程中，多卤代烷烃/低碳醇/水的体积比为1：1：0.1。
根据上述方案的本发明，其有益效果在于：本发明直接以普通大豆磷脂为原料，经过酶解反应、酶解后预处理过程及柱层析，制备出高纯度溶血磷脂酰胆碱产物，其制备过程操作简单，原材料廉价易得，反应条件温和可控，生产周期短，容易实现工业化，可降低高纯度磷脂酰胆碱产品的生产成本；本发明的洗脱过程可以实现溶血磷脂酰胆碱的高效分离，生产的溶血磷脂酰胆碱纯度高，生产效率高，目标产物的产率高，整个制备过程的综合成本低廉。
附图说明
图1为本发明的制备流程图。
图2为本发明中制备得到的高纯度溶血磷脂酰胆碱的核磁磷谱图。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明进行进一步的描述：
如图1所示，一种制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，在磷脂酶存在下，以大豆磷脂为原料进行酶解反应，酶解反应产物经过酶解后预处理过程并进行柱层析，得到高纯度溶血磷脂酰胆碱的溶液，以多卤代低碳烷烃-低碳醇-水为洗脱剂进行多次洗脱，脱去溶剂并真空干燥后得到高纯度溶血磷脂酰胆碱产物。
在本发明中，大豆磷脂为市售的液体大豆磷脂或粉末大豆磷脂，该原料易得且成本低，大大降低了高成本原料的依赖程度。
本发明的具体技术方案如下：
1、酶解过程
在酶解反应过程中，将大豆磷脂进行溶解，并选用磷脂酶A1或磷脂酶A2进行酶解。具体的：当选用磷脂酶A1时，大豆磷脂充分溶解于水溶液中；当选用磷脂酶A2时，大豆磷脂充分溶解于氯化钙溶液中，保证提高磷脂酶A2的稳定性。
优选的，酶解反应时控制反应温度为40～80°C之间，使得磷脂酶的活性更高，通过控制反应时间来提高转化率并减少反应物残留，因为反应物的残留会加大提纯的难度。磷脂酶的用量为：每100g大豆磷脂中加入0.1～2.0毫升磷脂酶酶液，既能保证大豆磷脂进行充分的酶解反应，进而保证反应产物溶血磷脂酰胆碱的收率，同时降低了原料的消耗。
2、酶解后预处理过程
酶解后的一系列预处理过程对于得到高纯度的溶血磷脂酰胆碱至关重要，其包括了多次的溶解、过滤及浓缩的过程。具体的：
（1）先向酶解反应产物中加入丙酮，过滤分离得到固体沉淀物；
（2）该固体沉淀物溶解于多卤代低碳烷烃（例如二氯甲烷）中得到溶液；
（3）该溶液倒入低碳一元醇（例如乙醇）中析出固体物质，过滤除掉所析出的固体物质并收集滤液；
（4）收集的滤液进行浓缩。
优选的，步骤（1）中丙酮的体积为酶解反应产物体积的3～5倍，以保证酶解反应物溶解的速度及效率；步骤（2）中多卤代低碳烷烃的用量为：每10克固体反应物溶解于10～30毫升多卤代低碳烷烃中，以保证固体沉淀物的溶解效果；步骤（3）中的低碳一元醇的体积是步骤（2）中多卤代低碳烷烃体积的3～5倍，以保证酶解后处理过程成分更容易洗脱。
3、柱层析过程
制备硅胶柱，浓缩后的溶液移至硅胶柱中，后以多卤代低碳烷烃-低碳醇-水为洗脱剂进行多次洗脱，收集目标物的溶液，浓缩干燥后得到高纯度溶血磷脂酰胆碱产品。具体的，随着洗脱次数的增加，洗脱剂的极性逐渐增大，避免极性成分在后面析出时受到硅胶的吸附作用而影响洗脱速度。
本发明中以多卤代低碳烷烃-低碳醇-水为洗脱剂进行多次洗脱（本实施例中为五次），既能充分析出固体物质，且不会增加洗脱过程的成本。在各个洗脱过程中分别用多卤代低碳烷烃、多卤代低碳烷烃/低碳醇（体积比为5：1）、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水（体积比为5：1：0.1）、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水（3：1：0.1）、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水（1：1：0.1）逐步进行处理。
本发明采用减压蒸馏的方法（如旋转蒸发仪）脱去溶剂，或者采用真空减压釜脱去溶剂。由于待分离的物质是混合物，各种组分的极性不一样，对应的在各种配比的洗脱剂中的洗脱速度不一样，因此，随着柱层析的进行不断变换三种洗脱剂组成物质的比例，以便实现不同组分的高效分离。本发明通过上述洗脱剂成分及比例的选择来保证良好的组分分离效果。
优选的，多卤代低碳烷烃包括二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷；低碳醇为低碳一元醇（包括甲醇、乙醇、异丙醇）。进一步的，选用甲醇或乙醇作为低碳一元醇，其成本低廉，同时相较于其他醇类更容易除去，进而保证最终产物的纯度。
下面列举几个制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的实施例。
实施例1
本实施例以20克粉末大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量23%）为原料，制得1.26克、纯度为99.6%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的250毫升圆底反应瓶中加入该粉末大豆磷脂和38克水，在50℃下搅拌30分钟，得到大豆磷脂的乳状液；0.04克磷脂酶A1溶于2克水中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应3小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入200毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升三氯甲烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升甲醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长、30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用二氯甲烷（300毫升）、二氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后，在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例2
本实施例以20克液体大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量11%）为原料，制得0.54克、纯度为99.1%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的250毫升圆底反应瓶中加入该液体大豆磷脂和38克水，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.04克磷脂酶A1溶于2克水中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应2小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入200毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升二氯乙烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升异丙醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用三氯甲烷（300毫升）、三氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、三氯甲烷/乙醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、三氯甲烷/乙醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、三氯甲烷/乙醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例3
本实施例以20克粉末大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量23%）为原料，制得1.22克、纯度为99.3%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的500毫升圆底反应瓶中加该粉末大豆磷脂和58克水，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.03克磷脂酶A1溶于2克水中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应4小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入300毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升二氯甲烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升乙醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，下用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用二氯甲烷（300毫升）、二氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例4
本实施例以20克液体大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量11%）为原料，制得0.57克、纯度为99.7%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的500毫升圆底反应瓶中加入该液体大豆磷脂和58克水，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.03克磷脂酶A1溶于2克水中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应3小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入300毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升二氯乙烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升甲醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用二氯乙烷（300毫升）、二氯乙烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、二氯乙烷/甲醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、二氯乙烷/甲醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、二氯乙烷/甲醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例5
本实施例以20克粉末大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量23%）为原料，制得1.19克、纯度为99.2%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的500毫升圆底反应瓶中加入该粉末大豆磷脂和78克水，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.02克磷脂酶A1溶于2克水中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应5小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入400毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升三氯甲烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升甲醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用三氯甲烷（300毫升）、三氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、三氯甲烷/甲醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、三氯甲烷/甲醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、三氯甲烷/甲醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例6
本实施例以20克液体大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量11%）为原料，制得0.49克、纯度为99.3%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的500毫升圆底反应瓶中加入该液体大豆磷脂和78克水，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.02克磷脂酶A1溶于2克水中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应4小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入400毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升二氯甲烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升乙醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用二氯甲烷（300毫升）、二氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例7
本实施例以20克粉末大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量23%）为原料，制得1.24克、纯度为99.0%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的500毫升圆底反应瓶中加入该粉末大豆磷脂和78克0.4mmol/L的CaCl2溶液，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.06克磷脂酶A2溶于2克0.4mmol/L的CaCl2溶液中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应8小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入400毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升三氯甲烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升甲醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用二氯甲烷（300毫升）、二氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例8
本实施例以20克液体大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量11%）为原料，制得0.47克、纯度为99.5%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的500毫升圆底反应瓶中加入该液体大豆磷脂和78克0.4mmol/L的CaCl2溶液，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.06克磷脂酶A2溶于2克0.4mmol/L的CaCl2溶液中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应7小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入400毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升二氯乙烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升乙醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用三氯甲烷（300毫升）、三氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、三氯甲烷/甲醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、三氯甲烷/甲醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、三氯甲烷/甲醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例9
本实施例以20克粉末大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量23%）为原料，制得1.21克、纯度为99.4%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的500毫升圆底反应瓶中加入该粉末大豆磷脂和58克0.4mmol/L的CaCl2溶液，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；）0.05克磷脂酶A2溶于2克0.4mmol/L的CaCl2溶液中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应10小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入300毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升二氯乙烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升乙醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用二氯甲烷（300毫升）、二氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/乙醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例10
本实施例以20克液体大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量11%）为原料，制得0.46克、纯度为99.5%的固体溶血磷脂酰胆碱。具体的：
（1）配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的500毫升圆底反应瓶中加入该液体大豆磷脂和58克0.4mmol/L的CaCl2溶液，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.05克磷脂酶A2溶于2克0.4mmol/L的CaCl2溶液中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应10小时；
（2）降温到室温，在搅拌下加入300毫升丙酮并继续高速搅拌2小时；停止搅拌后过滤分离出固体，该固体溶于60毫升二氯甲烷得到一种溶液；该溶液倒入300毫升甲醇中并剧烈搅拌；过滤除掉所形成的固体不溶物，收集滤液，用旋转蒸发仪浓缩至约30毫升，所得浓缩液用于后续柱色谱分离操作；
（3）125克干燥硅胶装于500毫米长30毫米直径的硅胶柱中，用沸点为60-90℃的石油醚润湿后备用；将前述浓缩液转移至硅胶柱中，先后用二氯甲烷（300毫升）、二氯甲烷/异丙醇（体积比5：1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比5：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比3：1：0.1，500毫升）、二氯甲烷/甲醇/水（体积比1：1：0.1，1000毫升）逐步洗脱，收集洗脱液并合并相同组分，浓缩除掉有机溶剂后在40℃下真空干燥得固体溶血磷脂酰胆碱。
实施例11
配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的250毫升圆底反应瓶中加入20克粉末大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量23%）和58克水，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.02克磷脂酶A1溶于2克水中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应。
通过高效液相色谱法（HPLC），测定磷脂酰胆碱在酶解反应中不同反应时间下的转化率和反应产物中溶血磷脂酰胆碱（LPC）的含量。
实施例12
配有聚四氟乙烯机械搅拌棒的250毫升圆底反应瓶中加入20克粉末大豆磷脂（磷脂酰胆碱含量23%）和58克0.4mmol/L的CaCl2溶液，在50℃下搅拌30分钟，得到乳状液；0.02克磷脂酶A2溶于2克0.4mmol/L的CaCl2溶液中，然后在两分钟内逐滴加入到磷脂和水的乳状液中，50℃下保温继续搅拌反应。
通过高效液相色谱法（HPLC），测定磷脂酰胆碱在酶解反应中不同反应时间下的转化率和反应产物中溶血磷脂酰胆碱（LPC）的含量。
在实施例11和实施例12中，HPLC法测定转化率：利用高效液相色谱测定酶解反应前后反应体系中磷脂酰胆碱的含量来计算磷脂酰胆碱的转化率，并测定反应产物中溶血磷脂酰胆碱的含量。柱条件：nova-pak@silica柱长15cm，柱径3.9毫米，柱压280psi，流速0.4ml/min。检测波长204mm。流动相：乙腈：甲醇：水=65：21：14(体积比)。
磷脂酰胆碱的转化率=（（反应前PC含量-反应后PC含量）/反应前PC含量）×100%。
根据实施例11和实施例12对磷脂酰胆碱的转化率进行测定，磷脂酰胆碱的转化率为制备过程中的核心监测指标，反应不充分或反应过分都会带来后期提纯工艺上不必要的麻烦。
本发明以普通大豆磷脂为原料，通过酶解反应，酶解后预处理及柱层析提纯工艺制备高纯度溶血磷脂酰胆碱，具有原材料廉价易得、工艺简单、可操作性强、收率高的特点，适合于工业化生产。由图2溶血磷脂酰胆碱的核磁磷谱图可以看出，本发明生产的溶血磷脂酰胆碱纯度高、副产物少，能广泛应用于精细化工、食品、医药、化妆品、保健品、农业产品以及其他磷脂深加工产品领域。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
上面对本发明专利进行了示例性的描述，显然本发明专利的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明专利的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明专利的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，在磷脂酶存在下，对大豆磷脂进行酶解反应，酶解反应产物经过预处理后转移至硅胶柱中，并以多卤代低碳烷烃-低碳醇-水为洗脱剂进行多次洗脱，收集目标物的溶液，浓缩干燥后得到高纯度溶血磷脂酰胆碱产品。
2.根据权利要求1所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述大豆磷脂溶解于水溶液，并选用磷脂酶A1进行酶解反应。
3.根据权利要求1所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述大豆磷脂溶解于氯化钙溶液，并选用磷脂酶A2进行酶解反应。
4.根据权利要求1所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，酶解反应产物进行预处理的过程具体包括以下步骤：先向酶解反应产物中加入丙酮，搅拌溶解后过滤分离得到固体沉淀物；该固体沉淀物溶解于多卤代低碳烷烃中得到溶液；该溶液倒入低碳一元醇中析出固体物质，过滤除掉析出固体物质并收集滤液；收集的滤液进行浓缩。
5.根据权利要求1或4所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述多卤代低碳烷烃包括二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷。
6.根据权利要求1所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述低碳醇为低碳一元醇。
7.根据权利要求4或6所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，所述低碳一元醇包括甲醇、乙醇、异丙醇。
8.根据权利要求1所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，依次用多卤代低碳烷烃、多卤代低碳烷烃/低碳醇、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水、多卤代低碳烷烃/低碳醇/水逐步进行多次洗脱。
9.根据权利要求8所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，在多次洗脱过程中，洗脱剂的极性逐渐增大。
10.根据权利要求9所述的制备高纯度溶血磷脂酰胆碱的方法，其特征在于，在第二次洗脱过程中，多卤代低碳烷烃/低碳醇的体积比为5：1；在第三次洗脱过程中，多卤代烷烃/低碳醇/水的体积比为5：1：0.1；在第四次洗脱过程中，多卤代烷烃/低碳醇/水的体积比为3：1：0.1；在第五次洗脱过程中，多卤代烷烃/低碳醇/水的体积比为1：1：0.1。
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