CN110139670B - 具有改善的效力的艾美球虫疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽医寄生虫学和疫苗学的领域；更具体地，本发明涉及包含活艾美球虫卵囊和药学上可接受的载体的组合物。所述组合物的特征在于其包含TLR3激动剂。所述组合物可用于制备针对球虫病的家禽疫苗。所述疫苗可以例如作为粗喷雾应用于日龄雏鸡上。疫苗中的TLR3激动剂允许将艾美球虫卵囊的剂量降低最高达4倍，同时获得与不具有TLR3激动剂的疫苗相同水平的针对攻击的保护。或者，当在疫苗中采用常规剂量的艾美球虫卵囊时，TLR3激动剂引起免疫的较早起效，导致在攻击后肠病变评分的显著降低，其已经在接种疫苗后2周而不是3周。

Description

具有改善的效力的艾美球虫疫苗

本发明涉及兽医寄生虫学和疫苗学的领域；更具体地，本发明涉及包含活艾美球虫卵囊和药学上可接受的载体的组合物，制备所述组合物的方法，所述组合物在针对球虫病的家禽疫苗中的医学用途，以及所述疫苗的方法和用途。

艾美球虫是顶复门(phylum Apicomplexa)和球虫纲(class Coccidia)的原生动物寄生虫，并且在全世界存在。当感染宿主时，它们引起肠疾病-综合征(complex)，称作：球虫病。艾美球虫具有复杂的生命周期，该生命周期具有多个阶段，一些在宿主外发育。艾美球虫感染通过摄入形成孢子的卵囊而发生，并且可以从第一日龄发生。接下来，在肠中，释放子孢子，其随后通过侵入肠上皮细胞而在宿主的一段肠上定植。复制导致裂殖子释放阶段，和来自宿主的肠上皮细胞的破裂。接下来，裂殖子再感染另外的上皮细胞，并且这持续最多另外的四个4-6日的周期。最后，发育至有性阶段，其产生随粪便释放的卵囊。在环境中形成孢子后，重新开始周期(Shirley 等人, 2005, Adv. in Paras., vol. 60, p. 285)。

家禽中艾美球虫感染的症状不同，从食欲不振，到肠炎和血性腹泻(bloodydiarrhoea)，到由于肠中坏死组织的积累导致的器官衰竭，和甚至死亡。结果是饲料转化率的下降、降低的生长速率、降低的蛋产量和对继发性感染的易感性；这些全部都引起受影响的禽类的主要不适和对商业家禽操作的严重经济损害。对于家禽球虫病的概述，参见教科书例如："The Merck veterinary manual" (第10版, 2010, C.M. Kahn编, ISBN:091191093X)，或：Swayne等人，编：“Diseases of Poultry”, 第13版, Wiley-Blackwell,Ames, IA., USA。

艾美球虫感染和球虫病的减少可以通过经由饲料施用抗球虫药物(抑球虫剂)来获得，但抗性的积累和动物产品中药物残留物的存在是持续关注的问题。因此，优选通过接种疫苗来防止家禽中的艾美球虫感染和相关的疾病体征。因为没有有效的亚单位艾美球虫疫苗或基于重组DNA的艾美球虫疫苗可用，对于家禽最多使用的是活疫苗，其包含来自一个或多个艾美球虫物种的形成孢子的卵囊。它们在禽肠道中的天然复制通过免疫***的体液和细胞途径两者诱导强免疫。通常在接种疫苗后约3周达到完全免疫。在早期的单次活卵囊接种疫苗 – 通过后来偶尔的野生型加强感染帮助 - 足以保护禽类一生。

活的疫苗卵囊可以是野生型或减毒的致病型。一类特殊的减毒的艾美球虫是所谓的早熟株。此类减毒株产生更低数目的卵囊排出和/或对接种疫苗的靶标的肠的更少损害。

通常通过用毒性艾美球虫株攻击感染后评价感染和疾病的主要标准确定艾美球虫疫苗的效力，所述标准是：肠病变评分、活体重增加和卵囊排出。描述这些标准用于评价艾美球虫疫苗效力的相关性的文献是：Williams & Catchpole, (2000, Vaccine, vol.18, p. 1178-1185)。

通常，活的禽艾美球虫疫苗一般将含有来自几种艾美球虫物种的形成孢子的卵囊，因为免疫是物种特异性的。此外，不同的艾美球虫物种感染家禽的不同物种，例如鸡和火鸡。用于家禽的一些商业球虫病疫苗的实例是：Coccivac™、Paracox™或Fortegra™(全部MSD Animal Health)；Immucox™ (Ceva)；和Inovocox™ (Huvepharma)。

此类疫苗通常通过大规模接种疫苗(mass vaccination)的方法施用，以便降低成本，例如通过给禽类或饲料喷雾，或经由饮用水。由于从第一日龄开始就存在野外感染(field infection)压力，因此优选向尽可能年幼的禽类应用接种疫苗。这可以通过在孵化场，当小鸡刚刚孵化出来并且放置在敞开的盘中时喷雾施用而方便地完成。该途径到达禽类的身体以及它们的直接环境。然后禽类通过它们啄食小滴和用嘴整理它们的羽毛的倾向性，经由口、鼻和/或眼途径摄入疫苗。为了改善喷雾疫苗的摄入，通常通过添加亮色来增加其可见度。

在欧洲专利申请号EP 15203012中，描述了一种基于凝胶的艾美球虫疫苗，其可通过喷雾的方式递送至禽类。所述凝胶具有约200 mPa.s至约4000 mPa.s的粘度，其由黄原胶提供。由于黄原胶的假塑性特性，可以使用标准喷雾接种疫苗设备。以这种方式，可以生产具有对于禽类啄食有吸引力的大小的凝胶-珠。这导致与先前的艾美球虫喷雾疫苗相比疫苗摄入增强，和免疫的迅速发展。

活艾美球虫卵囊疫苗的商业和大规模生产的主要瓶颈是艾美球虫卵囊本身的产生：因为目前不可能在体外培养艾美球虫的所有发育阶段，因此艾美球虫卵囊需要在供体家禽宿主中产生，并从它们的粪便分离。然后将艾美球虫卵囊纯化，形成孢子并配制成疫苗。此外，由于缺乏有效的交叉保护，可能需要由供体禽类产生兽医重要的最多达14种不同的艾美球虫。

这是迄今为止商业生产不能满足市场对这些疫苗的需求的这种费力且繁琐的疫苗生产方法。因此，从经济观点以及从伦理观点来看，都需要使此类来之不易的活艾美球虫卵囊疫苗的有效性最大化。

可以通过使用佐剂来扩增免疫应答。这可以是单一分子或复杂组合物，并且可以以特异性或非特异性方式刺激靶标的免疫应答。通常，佐剂与灭活疫苗或亚单位疫苗一起应用，因为这些灭活疫苗或亚单位疫苗在没有这种免疫刺激的情况下几乎没有效果，但仅很少用复制型微生物的疫苗。

在许多可能的佐剂中，免疫刺激性寡脱氧核苷酸是一种选项。第一份报告由Krieg等人(1995, Nature, vol. 374, p. 546)描述了使用细菌DNA中存在的非甲基化CpG基序。在随后的二十年中，潜在的机制被揭示为：通过识别在例如入侵微生物的基因组材料中存在的保守的结构基序，所谓的病原体相关分子模式(PAMP)，感测和响应于微生物的入侵的方法。为此目的，先天免疫***使用特定的模式识别受体，例如Toll样受体(TLR)。

TLR是I型跨膜糖蛋白，并且激动配体的结合导致细胞信号传导级联，导致1型干扰素和促炎细胞因子(白介素和肿瘤坏死因子α)的表达。此外，这是刺激继发性、获得性免疫应答的基础。(Kawai & Akira, 2010, Nature Immunol., vol. 11, p. 373)。

在鸡中，已经研究了TLR激动剂的使用的充当佐剂并刺激针对不同微生物(主要是病毒)的免疫的能力(St. Paul等人, 2013, Vet Imm. & Imm. pathol., vol. 152, p.191-199; Gupta等人, 2014, Expert Rev. Vaccines, vol. 13, p. 909-925)。然而，结果充其量是可变的，并且没有单一的TLR激动剂有利地脱颖而出。

在哺乳动物以及禽类中，TLR3通过感测中间体：双链RNA而致力于检测病毒复制。这综述于Chen等人(2013, Vet. Research, vol. 44, p. 82)。在实践中，合成的dsRNA或类似物可以作为TLR3激动剂应用，例如聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I：C)或聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚A：U)的二聚均聚物。已经研究了聚I：C和聚A：U两者在各种感染模型中和甚至在癌症免疫学中的作用。例如：EP 344.808描述了重组艾美球虫蛋白的球虫病疫苗，其中提到聚I：C作为潜在佐剂。然而，其实例使用弗氏完全佐剂中的65 kDa抗原，或者从痘苗病毒载体表达。

WO 2015/042.369描述了一种油-乳剂疫苗，其包含聚I：C和产气荚膜梭菌的重组抗原，以针对巨型艾美球虫感染进行保护。

商业疫苗Evalon™ (Hipra)是用于喷雾的活艾美球虫卵囊疫苗，其用含有矿物油的油性悬浮液Montanide™佐剂化。

因此，本领域中没有关于使用TLR3激动剂与活艾美球虫卵囊的描述或建议。

Sumners等人(2011, Exp. Parasitol., vol. 127, p. 714-718)研究了由早熟艾美球虫感染导致的鸡中的许多TLR和抗微生物肽的表达概况的变化。

发现结果不同，并且对于Ch TLR3不一致，因为这在一个实验中上调，但在使用较高的感染剂量的另一个实验中下调。Sumner建议包括早熟艾美球虫作为疫苗组分，但不建议使用任何特定因子作为佐剂。

因此，本发明的一个目的是克服现有技术中的缺点，并通过提供更有效的艾美球虫疫苗来满足本领域的需求。

令人惊讶地发现，通过向包含活艾美球虫卵囊的组合物中添加黄原胶和TLR3激动剂，可以满足该目的，并因此可以克服现有技术的一个或多个缺点。然后该组合物可用于制备针对球虫病的家禽疫苗；所述疫苗可以通过喷雾施用，且然后由家禽摄入。

在所得疫苗中，TLR3激动剂可以允许将艾美球虫卵囊的剂量降低最高达4倍，同时获得与来自不具有TLR3激动剂的疫苗相同水平的针对攻击的保护。或者，当在疫苗中采用常规剂量的艾美球虫卵囊时，TLR3激动剂引起免疫的较早起效，导致在攻击后肠病变评分的显著降低，其已经在接种疫苗后2周而不是3周。这两种效果在经济上都非常重要。

这根本不是直截了当的，因为当选择使艾美球虫接种疫苗更有效的方式时，发明人失去了选择：选择添加佐剂仅仅是替代物中的一种选项，例如改进制剂本身，或剂量，方法或施用途径等。而且，佐剂不是活疫苗的常用成分。进一步，当从许多可能的佐剂中选择合适且有效的佐剂以考虑，特别是用于家禽中时，PAMP不是最有希望的候选物。并且最后，当从可能的PAMP中选择时，TLR激动剂只是许多选项之一，并且同样，TLR3只是从中选择的许多TLR之一，并且当然不是对于证明效力脱颖而出的TLR。

因此，发明人惊讶地发现TLR3激动剂对于这种类型的疫苗是如此成功的。例如，没有关于针对活的复制寄生虫的免疫刺激的信息，并且尤其没有关于TLR3激动剂对肠道免疫的刺激的信息。发现这种刺激对于活的和复制的艾美球虫寄生虫是有效的。进一步，非常出乎意料的是，TLR3激动剂完全可以经由口服途径和通过肠道在摄入后完好。

尽管发明人不希望受可能解释这些发现的任何理论或模型约束，但他们推测TLR3激动剂能够刺激针对复制的艾美球虫的肠免疫应答。这可能导致更早和/或更强的接种疫苗应答。在所得的疫苗中，黄原胶在喷雾施用后便于由疫苗形成小滴，并且在摄入这些凝胶-小滴后，黄原胶可以在递送至肠期间参与TLR3激动剂的保护。

这也是令人惊讶的，因为先前使用TLR3激动剂作为佐剂的研究已显示，这不能通过口服途径施用。因此，甚至当考虑使用TLR3激动剂作为疫苗佐剂时，也没有迹象表明是否以及如何将此与口服疫苗结合递送至相关作用部位：禽肠道。

事实上，肠道内的条件以及胃的酸性环境将有利于任何形式的RNA的快速水解。只有通过局部的RNA酶以及肠道微生物组的细菌分泌或释放的RNA酶的存在才加剧这一点。因此，任何裸RNA或RNA类似物，例如在本发明中使用的任何裸RNA或RNA类似物，易于在曾到达所需作用部位之前立即降解。这也描述于Zhou等人(2007, J. of Immunol., vol. 178,p. 4548-4556)，其发现在由TLR-3活化导致的在腹膜内施用dsRNA后观察到的粘膜损伤，在口服施用dsRNA后未观察到。

类似地，Lantier等人 (2014, J. of Inf. Dis., vol. 209, p. 457–467)描述了聚I：C的施用有助于在小鼠中诱导针对隐孢子虫的保护。然而，这只是当施用时通过i.p.途径，因为口服施用未能显示任何可测量的应答。

Zhou和Lantier两者表明这种作用是由于RNA或类似物的降解。

因此，发明人已发现了通过将TLR3激动剂并入包含黄原胶的口服疫苗中，将免疫活性量的TLR3激动剂递送至禽靶标的肠中的作用部位，同时仅使用相对低浓度的激动剂的方式。

因此发现与黄原胶的组合保护dsRNA的类似物，使得它现在可以通过口服途径以相对低的浓度施用，并且仍然在禽肠中诱导，对在家禽的口服艾美球虫接种疫苗后获得的保护性应答的可检测的临床改善。

因此，在一个方面，本发明涉及包含活艾美球虫卵囊和药学上可接受的载体的组合物，其特征在于所述组合物包含约0.3 % w/v至约5 % w/v黄原胶和TLR3激动剂。

根据本发明的组合物可用于制备针对球虫病的家禽疫苗。下文将描述球虫病疫苗、其制造及其用途的细节和优选项。

如本文所用的术语“包含(comprising)”(以及变型例如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”)意欲指使用该术语的文本部分、段落、权利要求书等所涵盖或包括的所有要素，以及可为本发明想到的任何可能的组合，即使没有特意提到所此类要素或组合；并且不排除任何此类要素或组合。

因此，任何这种文本部分、段落、权利要求书等也可以涉及一个或多个实施方案，其中术语“包含”(或其变型)被术语例如“由…组成(consist of)”、“由…组成(consistingof)”或“基本由…组成”代替。

“卵囊”是众所周知的微生物，其是顶复门寄生虫例如艾美球虫的生命周期阶段之一。

当卵囊能够在适当的条件下，例如在禽的肠中起始艾美球虫复制周期时，它们是“活的”。

“艾美球虫”在本领域中众所周知为属于艾美球虫科的寄生虫。这些寄生虫和它们诱导的疾病描述于众所周知的教科书(上文)。艾美球虫展示其分类群-成员的特征性特征，例如形态学、基因组和生物化学特征，以及生物学特征，例如生理学、免疫学或病理学行为。

如本领域中已知的，将微生物分类为特定“物种”基于此类特征的组合。因此，本发明也包括以任何方式由其亚分类为例如亚种、株、分离物、基因型、变体、亚型或亚组等的艾美球虫。

用于本发明的艾美球虫可以在家禽物种中复制，并且例如包括以下艾美球虫物种：堆型艾美球虫(E. acervulina)、柔嫩艾美球虫(E. tenella)、巨型艾美球虫(E.maxima)、布氏艾美球虫(E. brunetti)、和缓艾美球虫(E. mitis)、变位艾美球虫(E.mivati)、毒害艾美球虫(E. necatrix)、早熟艾美球虫(E. praecox)、哈氏艾美球虫(E.hagani)、E. meleagrimitis (1型或2型)、腺样艾美球虫(E. adenoides)、E.gallopavonis、分散艾美球虫(E. dispersa)、无毒艾美球虫(E. innocua)、亚圆艾美球虫(E. subrotunda)或珠鸡艾美球虫(E. meleagridis)。

对技术人员将会显而易见的是，尽管用于本发明的特定艾美球虫目前可能分配到特定种和属，但那是可能适时改变的分类学类别，因为新的见解可导致重新分类到新的或不同的分类群。但是，因为这不会改变微生物自身或其抗原所有组成成分，而是仅仅改变其科学命名或分类，此类重新分类的微生物保留在本发明的范围内。

可以从多种来源获得用于本发明的艾美球虫寄生虫，例如作为来自家禽舍或来自多个实验室、(保藏)机构或(兽医)大学的野外分离物。

“药学上可接受的载体”是具有高级别纯度并且优选无菌的水性液体，例如：水、生理盐溶液或磷酸盐缓冲盐溶液。所述载体可以包含另外的赋形剂，例如稳定剂或防腐剂。

“黄原胶”是众所周知的高分子量多糖，CAS nr. 11138-66-2，并且通常可以以几种质量和纯度商业获得的，例如作为Keltrol™、Xantural™或Kelzan™从CP Kelco获得。黄原胶的细节和特性描述于例如‘Xanthan book’, 第8版, 2008, cpkelco.com。

对于本发明，“约”表示数字可以在其指定值左右的± 25 %之间改变。

对于本发明，‘% w/v’是指每体积的重量百分比。对于本发明的该方面，其是指根据本发明的组合物的体积。

“TLR3激动剂”是可以活化TLR3 (toll样受体，3型)，即可以诱导由TLR信号转导途径介导的信号传导事件的任何化合物或物质。在这个意义上，激动剂可以是直接结合TLR3的结合部分或配体，或者通过产生内源或外源配体，活化可以是间接的。

TLR3分子以及其活化和所得的细胞级联都已在本领域中描述。TLR3激动剂是例如：天然存在的双链RNA (dsRNA)；合成的ds RNA；和合成的dsRNA类似物(参见，例如，Alexopoulou等人, 2001, Nature vol. 413, p. 732-738)。合适的TLR3激动剂可以以选择性方式活化TLR3，因为它基本上不活化任何其他TLR。

用于本发明的合适TLR3激动剂的实例是合成的ds RNA类似物，例如聚I：C和聚A：U，或变体，例如：聚I：C12U。合成的ds RNA类似物可以具有修饰的骨架，例如通过以下修饰的骨架：硫代磷酸酯修饰，卤化，烷基化(例如乙基-或甲基-修饰)和/或磷酸二酯修饰。

在本领域中，替代符号也用于描述这些类似物；例如聚I：C也写成：聚I∙C；聚-IC；聚I-聚C；聚I：聚C等。所有这些都在本发明的范围内。

如所述，黄原胶允许可以由根据本发明的组合物制备的疫苗通过大规模接种疫苗方法、例如通过喷雾有效地施用。一个实例是如EP 15203012中所述的基于凝胶的喷雾疫苗。为了制备这种疫苗，所述组合物中黄原胶的量将取决于组合物将用于制备预期疫苗的比率。

如EP 15203012中所述的基于凝胶的喷雾疫苗包含黄原胶，其量为约0.3 % w/v至约1.5 % w/v黄原胶，其中在该情况下的% w/v表示每体积疫苗的重量百分比。

仍然可以方便地处理的黄原胶量的上限为约5% w/v。为了使根据本发明的组合物稀释最多达约4倍，因此所述组合物可以包含(组合物的)0.3 % w/v至5% w/v黄原胶。

优选地，根据本发明的组合物几乎基本上用于制备基于凝胶的喷雾疫苗，例如EP15203012中所述。在该情况下，所述组合物本身包含(组合物的)约0.3 % w/v至约1.5% w/v黄原胶。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，所述组合物包含约0.3 % w/v至约1.5% w/v黄原胶。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含(组合物的)0.4 % w/v-1.2% w/v黄原胶。优选地，该组合物包含0.5 % w/v - 1 % w/v黄原胶、0.5 % w/v - 0.9 % w/v、0.5 %w/v - 0.8 % w/v，或甚至0.5 % w/v - 0.7 % w/v黄原胶，依次更优选。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含(该组合物的)约0.6 % w/v黄原胶。

优选地，“约”意指其值左右± 20 %，更优选地，“约”意指其值左右± 15、12、10、8、6、5、4、3、2 %，或甚至“约”意指其值左右± 1 %，依次更优选。

在比较实验中，发明人已发现，在由根据本发明的组合物制备的疫苗中，聚A：U在家禽中，且特别是在鸡中，在刺激针对艾美球虫的肠道免疫方面比聚I：C更有效。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，TLR3激动剂是聚A：U。

合成的dsRNA类似物例如聚I：C或聚A：U可商业得自精细化学品的供应商，例如作为来自Sigma-Aldrich, CAS编号24936-38-7的冻干的钠盐。

待用于根据本发明的组合物中的TLR3激动剂的量根据组合物待用于制备如本文所述的针对球虫病的家禽疫苗的比率和每个靶标家禽待应用的疫苗的量来确定。

如技术人员将理解，根据本发明的组合物或其部分可以以更浓缩的形式(例如，浓缩2、3或更多倍)生产、销售或储存。然后在进一步使用(例如用于制造如本文所述的针对球虫病的家禽疫苗)前稀释浓缩物。在那些情况下，所述组合物可以包含更高量的TLR3激动剂，以在所得疫苗中达到TLR3激动剂的优选量。

技术人员完全能够优化这些量，例如对于基于肠病变评分的针对攻击的保护。

优选地，根据本发明的组合物包含每毫升约5微克至约1000微克的TLR3激动剂。

该范围允许将所述组合物稀释至疫苗中最多达4倍，以使疫苗中TLR3激动剂的量达到每毫升疫苗约5至约250的TLR3激动剂。当所述疫苗以每只禽约0.2 ml疫苗施用时，这递送每动物剂量约1微克至约50微克TLR3激动剂。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，所述TLR3激动剂以每毫升组合物约5微克至约1000微克的量存在。

优选地，根据本发明的组合物几乎基本上用于制备针对球虫病的家禽疫苗。在该情况下，所述组合物本身包含每毫升组合物约5微克至约250微克的TLR3激动剂。

术语‘几乎基本上’是指这样的情况：在从根据本发明的组合物制备疫苗时没有或仅有少量进一步添加；例如少于疫苗体积的10%。

因此，在一个优选实施方案中，根据本发明的组合物包含每毫升组合物5微克-250微克的TLR3激动剂。

可以通过如下在供体家禽动物中以工业规模生产用于本发明中的卵囊：通过众所周知技术例如盐浮集法从它们的粪便分离，随后形成孢子和灭菌，并最后通过光学显微镜术计数。可以例如使用重铬酸钾进行孢子形成，并且可以使用次氯酸钠或β-丙内酯进行灭菌。所有这些在本领域中是众所周知的。

孢子形成确保在家禽肠中快速建立保护性感染。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，活艾美球虫卵囊是形成孢子的卵囊。

为了诱导有效水平的肠道免疫，可以由根据本发明的组合物制备的选择用于疫苗中的艾美球虫卵囊可以具有特定水平的毒力，例如野生型或减毒的。对于本发明，‘毒力’是指艾美球虫的方面，其决定其病理学，主要是其复制速率，对受感染禽的肠道造成的损伤水平，对生长速率的影响，和***水平以及通过群体传播。所有这些都可以使用众所周知的方法和参数(例如肠病变评分、活体重增加和卵囊排出数)进行评价。

病变评分优选如欧洲药典专著2326中所述进行。简而言之: 在尸检时，将评分指定至肠内球虫病的症状，其中0的评分意指无严重病变，且1-4的评分意指肠壁增厚的严重程度增加、血液量增加和正常粪便量减少。在4的病变评分时，可能存在死亡病例。

技术人员可以评价何时应用具有何种类型的毒力的艾美球虫；例如，在高野外感染压力的条件下，具有较高毒力的艾美球虫株例如野生型株在由根据本发明的组合物产生的疫苗中代替减毒株可能是有利的。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，活艾美球虫卵囊中的至少一种来自艾美球虫的减毒株。

“减毒艾美球虫”被定义为与具有较高毒力的相同物种的艾美球虫相比，引起较少的肠病变和/或在接种疫苗的动物的粪便中产生较低的卵囊排出；例如，少至少10%的肠病变评分，和/或较低的卵囊排出；更优选少至少20%、30%、40%或甚至至少50%的肠病变评分，和/或较低的卵囊排出，依次更优选。

艾美球虫的减毒可以在体外获得，例如通过经由实验动物传代和选择，或经由重组DNA技术，所有都是本领域中众所周知的。

减毒艾美球虫的一种形式是早熟的艾美球虫。

因此，在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，减毒的艾美球虫中的至少一种是早熟的。

“早熟”的艾美球虫株是这样的株，-与其野生型对应物相比- 在靶标动物中以较少轮次的无性复制完成它们的完整生命周期。例如，对于相同物种的野生型株，3轮或4轮而不是正常的4轮或5轮。这为它们提供了减毒的毒力。

在根据本发明的组合物的一个实施方案中，活艾美球虫卵囊中的至少一种来自艾美球虫的野生型株。

对于本发明，“野生型”是指在体外未减毒并且不早熟的艾美球虫。野生型株可以例如分离自自然界中受感染的家禽或未针对艾美球虫接种疫苗的家禽舍。

在一个优选实施方案中，根据本发明的组合物包含减毒的活艾美球虫卵囊和具有野生型毒力的活艾美球虫卵囊。

根据本发明的组合物将含有至少一种物种的艾美球虫的卵囊。优选地，所述组合物将包含多于一种物种的艾美球虫卵囊，以允许制造提供广泛免疫保护的疫苗。进一步，所述组合物可以包含多于一株特定艾美球虫物种，以提供甚至更广泛的免疫保护。

在根据本发明的组合物的一个实施方案中，所述组合物包含多于一种物种的活艾美球虫卵囊。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，所述组合物包含来自相同物种的多于一株的活艾美球虫卵囊。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，所述组合物包含多于一种物种的活艾美球虫卵囊，并且来自那些物种中的至少一种的卵囊包含来自该物种的多于一株的活艾美球虫卵囊。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，所述组合物包含来自相同物种的多于一株的活艾美球虫卵囊，其中那些株中的至少一种是减毒的，并且那些株中的至少一种具有野生型毒力。

在根据本发明的组合物的一个实施方案中，所述活艾美球虫卵囊是选自以下的一种或多种：柔嫩艾美球虫、堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫、布氏艾美球虫、早熟艾美球虫、变位艾美球虫、哈氏艾美球虫、E. meleagrimitis 1、E.meleagrimitis 2、腺样艾美球虫、E. gallopavonis和分散艾美球虫。

可以通过本领域中众所周知的许多方式鉴定和区分艾美球虫的这些不同物种。经典方法是通过经由光学显微镜评价其卵囊的大小和外观。替代方案是例如通过血清学标志物或通过PCR进行分类。此外，当在体内测试时，不同的艾美球虫物种特征性地定殖在禽肠道的不同区域。

在一个优选实施方案中，根据本发明的组合物包含来自与现有商业活艾美球虫卵囊疫苗中存在的相同的艾美球虫物种的活卵囊。更优选：与商业艾美球虫疫苗(：Coccivac、Paracox和Fortegra)中的一种或多种中相同的卵囊物种和株。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，活艾美球虫卵囊来自4种艾美球虫物种：堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和柔嫩艾美球虫，其中存在2株巨型艾美球虫。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，活艾美球虫卵囊来自4种艾美球虫物种：堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、变位艾美球虫和柔嫩艾美球虫，其中存在2株巨型艾美球虫。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，活艾美球虫卵囊来自7种艾美球虫物种：堆型艾美球虫、布氏艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫和柔嫩艾美球虫，其中存在2株巨型艾美球虫。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，活艾美球虫卵囊来自6种艾美球虫物种：堆型艾美球虫、布氏艾美球虫、巨型艾美球虫、变位艾美球虫、毒害艾美球虫和柔嫩艾美球虫。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，活艾美球虫卵囊来自4种艾美球虫物种：堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、变位艾美球虫和柔嫩艾美球虫，其中存在2株巨型艾美球虫。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，活艾美球虫卵囊来自5种艾美球虫物种：腺样艾美球虫、分散艾美球虫、E. gallopavonis、E. meleagrimitis 1和E.meleagrimitis 2。

待用于根据本发明的组合物中的活艾美球虫卵囊的量可以由本领域技术人员基于以下容易地确定：针对球虫病的家禽疫苗中包含组合物的比率；每只靶标家禽的疫苗体积；和期望的接种疫苗效力。

一种指标可以是长时间可用的商业疫苗中使用的活艾美球虫卵囊的数目。通常，每种艾美球虫物种使用的卵囊数目不同。例如，Paracox 5每动物剂量含有：约500个堆型艾美球虫的卵囊，分别约100个和约200个2株巨型艾美球虫的卵囊，约1000个和缓艾美球虫的卵囊，和约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。

在根据本发明的组合物的制备中，其各种成分可以以例如考虑到制造效力方便的顺序组合。例如，对用作组合物的组分的某些溶液进行灭菌可能是有利的；当然，此类溶液当时还不包含活卵囊。

这种灭菌可以以不同的方式进行，例如，化学灭菌，例如使用β-丙内酯；或物理灭菌，例如通过辐射或微过滤。然而，当通过加热进行包含黄原胶的溶液的灭菌时，则必需通过添加一定量的金属盐来稳定黄原胶。没有盐的情况下，热处理将破坏黄原胶提供期望粘度的能力。

如EP 15203012中所述，盐的量以两种方式受到限制：在下侧，其被限制为(组合物的)约0.1% w/v金属盐，这是稳定最小量的黄原胶所需的最小量。在上侧，通过从根据本发明的组合物制备的预期疫苗的适口性，盐的量被限制为(疫苗的)约0.4% w/v。在这种情况下，味道是相关的，因为靶标家禽应当愿意摄入疫苗。

有效地，这意味着，当组合这些限制并且允许将根据本发明的组合物稀释最多达4倍时，则该组合物可以包含(组合物的)约0.1 % w/v至约1.6% w/v金属盐。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，所述组合物包含约0.1 % w/v至约1.6 % w/v的金属盐。

优选地，根据本发明的组合物包含(组合物的)0.1% w/v-1.2% w/v的金属盐，更优选(组合物的)0.1%-0.8%，或甚至(组合物的)0.1% w/v-0.4% w/v的金属盐，依次更优选。

以这种方式，根据本发明的组合物的包含黄原胶的部分可以进行热灭菌，而不会损害胶的粘度改性特性。对于本发明，“热灭菌”涉及在至少100℃下孵育至少15分钟。

金属盐原则上可以是任何金属盐，但优选地，金属盐是来自一价或二价金属阳离子的盐。更优选地，阳离子是碱金属。

金属盐的阴离子优选是卤素、硫酸根、磷酸根、硝酸根或醋酸根。更优选氯离子。

甚至更优选的，金属盐是碱金属的卤化物盐(halogen salt)；甚至更优选是钠或钾的卤化物盐；甚至更优选地，金属盐是氯化钠或氯化钾。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，所述金属盐是氯化钠或氯化钾。

为了刺激从根据本发明的组合物制备的疫苗的摄入，可以添加着色剂。这在禽类啄食和摄入此类颜色鲜艳的小滴的自然倾向方面将有吸引力。因此，着色剂可以包含在根据本发明的组合物中。当然，着色剂不应负面干扰根据本发明的组合物的其他组分，特别是：活卵囊的活力或稳定性。而且，着色剂作为疫苗的成分应当是药学上可接受的。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的着色剂。

“药学上可接受的着色剂”的实例是：例如绿色(例如叶绿素，E140)，红色(例如胭脂红，E120)或蓝色(例如亮蓝，FD&C蓝色编号1，E133)。所有都是容易商业可得的。

着色剂以适合于以适当的强度为由该组合物制备的疫苗提供颜色的量存在于根据本发明的组合物中。使根据本发明的组合物稀释最多达4倍，所述组合物包含(组合物的)约0.05% w/v至约4% w/v着色剂。

红色(胭脂红)着色剂被证明在刺激包含艾美球虫卵囊的基于凝胶的喷雾家禽疫苗的摄入方面高度有效。

因此，在根据本发明的组合物的一个实施方案中，药学上可接受的着色剂是胭脂红。

在一个优选实施方案中，胭脂红以(组合物的)0.1% w/v-0.2% w/v的量存在于根据本发明的组合物中。

在根据本发明的组合物的一个实施方案中，选自以下的条件中的一种或多种或全部适用：

- 所述组合物包含(组合物的)约0.3 % w/v至约1.5% w/v黄原胶；优选地，所述组合物包含约0.6% w/v黄原胶；

- 所述TLR3激动剂是聚I：C或聚A：U，优选聚A：U；

- 所述TLR3激动剂以每毫升组合物5微克至1000微克的量存在；优选地，所述组合物包含每毫升5微克-250微克的TLR3激动剂；

- 所述活艾美球虫卵囊是形成孢子的卵囊；

- 所述活艾美球虫卵囊来自艾美球虫的减毒株，优选地，减毒的艾美球虫是早熟的；

- 所述活艾美球虫卵囊来自艾美球虫的野生型株；

- 所述组合物包含来自相同物种的多于一株的活艾美球虫卵囊；

- 所述活艾美球虫卵囊是选自以下的一种或多种：柔嫩艾美球虫、堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫、布氏艾美球虫、早熟艾美球虫、变位艾美球虫、哈氏艾美球虫、E. meleagrimitis 1、E. meleagrimitis 2、腺样艾美球虫、E.gallopavonis和分散艾美球虫；

- 所述组合物包含多于一种物种的活艾美球虫卵囊，且那些物种中的至少一种包含来自该物种的多于一株的活艾美球虫卵囊；优选地，其中那些株中的至少一种是减毒的，并且那些株中的至少一种是野生型；

- 所述组合物包含(组合物的)约0.1 % w/v至约1.6 % w/v的金属盐；优选地，所述组合物包含约0.1 % w/v至约0.4 % w/v的金属盐；

- 所述金属盐是氯化钠或氯化钾；

- 所述组合物包含药学上可接受的着色剂；优选地，所述药学上可接受的着色剂是胭脂红；且

- 所述药学上可接受的着色剂以(组合物的)0.05 % w/v至4 % w/v的量存在于所述组合物中。

在根据本发明的组合物的一个优选实施方案中，TLR3激动剂是聚A：U；所述TLR3激动剂以每毫升组合物5微克 - 1000微克的量存在；活艾美球虫卵囊是形成孢子的卵囊；所述卵囊是堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和柔嫩艾美球虫；巨型艾美球虫的卵囊来自两个株；所述组合物包含(组合物的)约0.1 % w/v至约1.6 % w/v的金属盐；所述金属盐是氯化钠或氯化钾；所述组合物包含(组合物的)0.05 % w/v - 4 % w/v的量的药学上可接受的着色剂；且药学上可接受的着色剂是胭脂红。

通过应用如上文所述的各种选项和优选项，技术人员能够制备根据本发明的组合物。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于制备根据本发明的组合物的方法，所述方法包括将活艾美球虫卵囊和药学上可接受的载体与TLR3激动剂混合。

进行这种混合的方法是本领域中众所周知的，并且可以以方便或可行的任何规模应用。例如，当作为粉末获得TLR3激动剂时，可将其直接溶解于含有活艾美球虫卵囊和药学上可接受的载体的溶液中。或者，TLR3激动剂可以在其自身的溶液中，然后其可以以液体形式添加。

如所述，根据本发明的组合物可用于制备针对球虫病的家禽疫苗，其比常规的活艾美球虫卵囊疫苗更有效。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及根据本发明的组合物用于制造针对球虫病的家禽疫苗的用途。

下文将描述用于本发明的针对球虫病的家禽疫苗的细节和优选项。

根据本发明的用途，针对球虫病的家禽疫苗的“制造”可以使用本领域技术人员众所周知且容易应用的方法进行。例如，将根据本发明的包含活艾美球虫卵囊和药学上可接受的载体和TLR3激动剂的组合物混合，任选地可以添加另外的赋形剂，并将所得疫苗分配至合适大小的容器中并包装。

通过足够的测试，例如通过对卵囊或任何其他添加的抗原的质量和数目的免疫学测试；通过对无菌性(当然排除活卵囊)和缺乏外来病原体的微生物学测试；通过对生物和化学稳定性的测试；以及最终通过体外或体内实验来测定疫苗效力和疫苗安全性，监测制造过程的各个阶段。所有这些都是技术人员众所周知的，并且在政府规章例如药典以及在手册例如 “Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot,USA, ISBN: 683306472)和 “Veterinary vaccinology” (P. Pastoret等人编, 1997,Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)中规定。

针对球虫病的家禽疫苗的制造还包括这样的实施方案，其中根据本发明的组合物或其部分以或多或少浓缩的形式使用。例如，所述卵囊可以在使用前以这样的形式制备和储存，其中艾美球虫卵囊的数目远高于它们意欲在由其制备的疫苗中的数目。此外，所述组合物的其他部分可以以浓缩形式(例如包含黄原胶、金属盐和/或着色剂的溶液)制备和储存。这些中的任何一种都可以以在制造过程期间方便的任何方式用作其他中的任一种的稀释剂。技术人员完全能够计算应用的稀释倍数，以达到所得疫苗中活性剂或赋形剂的期望的最终量或浓度。

如所述，可以使用根据本发明的组合物制备的疫苗比常规的活艾美球虫卵囊疫苗更有效。这通过添加TLR3激动剂来实现。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及根据本发明的组合物，其用作针对球虫病的家禽疫苗。

而且，在一个进一步方面，本发明涉及针对球虫病的家禽疫苗，所述疫苗包含根据本发明的组合物。

“疫苗”众所周知为一种具有医学效果的组合物。疫苗包含免疫学活性组分和药学上可接受的载体。‘免疫学活性组分’是一种或多种抗原性分子(本文是活艾美球虫卵囊)，其被靶标家禽的免疫***识别，并且诱导保护性免疫应答。该应答可以源于目标的先天免疫***和/或源于获得性免疫***，并且可以是细胞型的和/或体液型的。

例如通过在宿主动物中降低寄生虫载量或缩短寄生虫的复制的持续时间，疫苗通常可有效降低感染的水平或程度。

另外，或可能作为其结果，疫苗通常有效减轻或改善可能由这种感染或复制引起，或由动物对该感染或复制的响应引起的疾病的(临床)症状。

根据本发明的针对球虫病的疫苗的作用是在家禽中预防或减轻艾美球虫感染和/或与这种感染或复制相关的球虫病的一种或多种体征。本文中此类(临床)体征是：肠病变评分、活体重增加和卵囊排出。

如此的球虫病疫苗也可以通俗地称作‘针对’艾美球虫或‘针对’球虫病的疫苗，或称作‘艾美球虫疫苗’。

将在下文描述根据本发明的球虫病疫苗的细节和优选项。

“家禽”是指具有农业相关性的禽类，例如：鸡、火鸡、鸭、鹅、山鹑、孔雀、鹌鹑、鸽子、野鸡、珍珠鸡或鸵鸟。优选地，家禽是鸡、火鸡、鸭或鹅。更优选地，所述家禽是鸡或火鸡。最优选地，所述家禽是鸡。

靶标家禽可以是任何类型，例如产蛋禽(layers)、种禽(breeders)、肉禽(broilers)、组合种禽( combination breeds)、或任何此类种禽的亲本系。优选的家禽类型是肉禽。

“球虫病”众所周知为由球虫寄生虫、例如艾美球虫引起的肠疾病复合症。

在一个实施方案中，根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗包含每毫升疫苗约5微克至约250微克的TLR3激动剂。

根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗可以以包含如本文所述用于根据本发明的组合物的任何实施方案(优选的或非优选的)或根据本发明的组合物的那些实施方案中的两个或更多个的任何组合的形式提供。

当作为如EP 15203012中所述的基于凝胶的喷雾疫苗应用时，根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗是最有效的。因此，所述疫苗包含黄原胶，其有助于形成更容易摄入的小滴，并且还有助于向禽类的肠递送TLR3激动剂。

当喷雾根据本发明的疫苗时形成的凝胶-小滴的优选大小在直径为约1 mm和约4mm之间。为了达到这一点，所述疫苗需要具有约200 mPa.s至约4000 mPa.s的相对高的粘度。该粘度可以通过在根据本发明的疫苗中包含约0.3 % w/v至约1.5% w/v的量的黄原胶来实现；其中在这种情况下，“w/v”是指疫苗的体积。

因此，在根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的实施方案中，所述疫苗包含0.3%w/v-1.5% w/v黄原胶，并且具有200 mPa.s-4000 mPa.s的粘度。

使用旋转主轴技术测定本发明的“粘度”，其中当在恒定温度下平衡时测量样品。具体地：根据制造商的说明用Brookfield™旋转粘度计进行粘度测量。所述测量使用以100rpm旋转的LV4型主轴，并将样品在25℃下在水浴中平衡。

在一个实施方案中，根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗是口服疫苗。

术语“口服”是指经由口腔摄入的方式。对于本发明，这是指禽类啄食疫苗的凝胶-小滴并吞咽它们。

如上所述，根据本发明的疫苗可以以不同方式(包括将包含黄原胶的组合物的部分进行灭菌)由根据本发明的组合物制造。这种灭菌可以以不同的方式实现；在通过加热对含有黄原胶的溶液进行灭菌的情况下，则需要通过添加金属盐来保护黄原胶。还如本文所述，存在待使用的金属盐的量的上限和下限。

因此，当从通过加热灭菌的黄原胶的溶液制备根据本发明的疫苗时，则所述疫苗将含有(疫苗的)约0.1% w/v至约0.4% w/v金属盐。

因此，在根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的实施方案中，所述疫苗包含0.1 %w/v - 0.4 % w/v金属盐。

优选地，所述金属盐是氯化钠或氯化钾。

在根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗中，每剂量艾美球虫卵囊的精确量不是非常关键，因为卵囊将容易地复制并且在宿主肠中定植。疫苗剂量只需要够以起始这种生产性感染。更高的接种物剂量几乎不缩短其达到宿主中的最优定植所花费的时间；并且，非常高的剂量由于经济原因是没有吸引力的。此外，太高剂量的疫苗卵囊可能通过它们自身引起一些病理。显然，太低的剂量，尽管可能能够建立艾美球虫感染，对于免疫的适当起效可能花费太多时间。

因此，优选的接种物剂量是每动物剂量约10至约1x10^5个艾美球虫物种的形成孢子的卵囊，更优选每剂量100至1x10^4个卵囊、100至5000个，或甚至100至1000个卵囊/动物剂量，依次更优选。

如技术人员将显而易见的，活艾美球虫卵囊的最优疫苗剂量将取决于例如靶标动物物种，以及取决于使用的艾美球虫株的物种和毒力，并且因此在一种联合疫苗中的多种艾美球虫物种之间可以是不同的。

定量艾美球虫卵囊用于根据本发明的球虫病疫苗中的方法是本领域中众所周知的。

可以根据预期的应用途径优化每动物剂量的根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的体积，例如，对于喷雾接种疫苗，剂量可以是每只禽约10 µl至约1 ml。优选地，喷雾疫苗的体积是每只禽0.1 ml至0.5 ml，更优选是每只禽0.1 ml至0.3 ml。

最优选地，喷雾疫苗的体积为每只禽约0.2 ml。

或者，疫苗可以通过喷雾施用至饲料上，或作为液体施用至饮用水。在这些情况下，剂量/禽可以针对食用饲料的量或饮用水的量进行优化。这在技术人员的能力之内。

通过确定什么是每动物剂量根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的免疫有效量的艾美球虫卵囊来发现多种施用途径的最优体积和剂量，完全在技术人员的常规能力之内。这可以例如通过如下来进行：在接种疫苗后或攻击感染后监测免疫应答，例如监测靶标的疾病体征和临床评分，最显著地：肠病变评分。其他标准可以是活体重增加、血清学参数或重新分离病原体来测定卵囊排出。可以例如将这些结果与如模拟接种疫苗的动物中看到的接种疫苗-攻击应答进行比较。

尽管有利的是将健康的靶标接种疫苗，并且尽可能早地接种疫苗以预防致病性艾美球虫的早期感染(的后果)，但根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的靶标家禽的年龄、重量、性别、免疫学状态和其他参数不是关键的。

因此，优选在孵出当天(即，在一日龄)施用根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗。

当有利时，可以在生命的以后阶段向家禽给予加强接种疫苗。

如技术人员将理解，应小心地应用使用用于接受根据本发明的针对球虫病的疫苗的家禽的含药饲料。在约计划接种疫苗期间，禽类不应接受含有抗球虫药的饲料；或者至少不接受含有抗球虫药的饲料，所述疫苗中的艾美球虫卵囊对所述抗球虫药是敏感的。

高度有效的是将根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗配制为联合疫苗，因为以此方式多种免疫剂可以一次施用，其减少对靶标禽类的不适，并且降低人工成本。基于根据本发明的疫苗的联合疫苗另外包含另一免疫学活性化合物。原则上，这可以是任何活的或杀死的微生物或其部分；同时维持活艾美球虫卵囊的稳定性和复制能力。同样，另外的免疫活性组分必须在待摄入的疫苗中相容且有效。

另外的免疫活性化合物可以是抗原、免疫增强物质和/或疫苗。或者，根据本发明的疫苗自身可以被添加至疫苗中。

制备用于本发明的这种联合疫苗的方法在技术人员的常规能力之内。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的特征在于该疫苗包含一种或多种另外的免疫活性组分。

在一个实施方案中，根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗是联合疫苗，其包含至少一种另外的抗原，所述另外的抗原源自对家禽致病的微生物。所述另外的抗原可以是活的、活的减毒的、或杀死的微生物或其部分。

优选地，所述来自对家禽致病的微生物的另外的抗原是选自下组的一种或多种：

- 病毒：传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、腺病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性法氏囊病病毒(IBDV) (即干保罗城病毒)、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒(TRT)、鸭瘟病毒(鸭病毒性肠炎)、鸽痘病毒、马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽肺炎病毒、禽流感病毒(AIV)和呼肠孤病毒；

- 细菌：大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、Ornitobacteriumrhinotracheale、Haemophilis paragallinarum、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、Erysipelas、枝原体属(Mycoplasma)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)和梭菌属(Clostridium)；

- 寄生虫：组织滴虫属(Histomonas)、等孢球虫属(Isospora)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)和皮刺螨属(Dermanyssus)；以及

- 真菌：曲霉属(Aspergillus)。

更优选的另外的抗原选自以下的一种或多种：IBV、NDV、IBDV、ILTV、TRT、AIV、MDV、枝原体属和沙门氏菌属。

根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗可以有利地与药物组分，例如抗生素、激素和/或抗炎药物组合。甚至抗球虫化合物的使用也是可能的，条件是疫苗中的艾美球虫卵囊对该特定药物是不敏感的。

根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗可以含有一种或多种有助于用于本发明中的活艾美球虫卵囊的活力和质量的组分，由此促进在靶标家禽的肠中的生产性复制和定植。

在一个实施方案中，添加剂是稳定剂，用于在配制、储存、处理、施用或摄入期间稳定用于本发明的艾美球虫卵囊的数量和质量。也可以添加合适的防腐剂，例如硫汞撒、硫柳汞、酚类化合物或庆大霉素。

根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗可以用作预防性处理或用作治疗性处理或两者，因为它干扰致病性艾美球虫导致的感染的建立和感染的进展两者。

取决于根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的施用情况，例如，野外条件或靶标家禽物种，可能有利地进一步优化该疫苗。这完全在技术人员的能力之内，并且通常涉及疫苗效力或安全性的微调。这可以通过选择使用的艾美球虫株，通过调整疫苗剂量、数量、频率或途径，或通过调整或添加疫苗的其他成分(例如稳定剂、载体、稀释剂等)来完成。

在根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的优选实施方案中，TLR3激动剂是聚A：U；所述TLR3激动剂以每毫升疫苗5微克 - 250微克的量存在；活艾美球虫卵囊是形成孢子的卵囊；所述卵囊是堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和柔嫩艾美球虫；巨型艾美球虫的卵囊来自两株；所述疫苗包含(疫苗的)约0.3 % w/v至约1.5% w/v黄原胶；所述疫苗具有约200 mPa.s至约4000 mPa.s的粘度；且所述组合物包含(疫苗的)0.1 % w/v - 0.2 %w/v的量的胭脂红。

在一个进一步方面，本发明涉及针对球虫病将家禽接种疫苗的方法，其特征在于所述方法包括将根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗施用于所述家禽。

如所述，根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗优选通过大规模施用的方法施用，使得摄入所述疫苗，导致针对致病性艾美球虫的有效免疫。

根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗的大规模施用的优选方法通过喷雾在禽类上的方式。这可以使用水性介质作为粗喷雾进行，其中产生的小滴通常为直径大于50μm的大小。

当免疫孵化盘中的一日龄小鸡时，可以例如使用孵化场喷雾器应用这种粗喷雾，或当免疫地面围栏(floor pen)环境中的日龄更大的禽类时，可以例如使用背包型喷雾器应用这种粗喷雾。喷雾的疫苗被禽类从羽毛或地面快速摄入。

因此，在根据本发明的针对球虫病将家禽接种疫苗的方法的一个实施方案中，所述方法包括通过粗喷雾在家禽上和/或其周围环境上施用疫苗。

疫苗被“喷雾在家禽上”的指标不要求所有或大部分疫苗到达禽类的身体。相反，这表明身体的任何特定部位都不需要专门靶向。当包含黄原胶时，疫苗小滴将变得有些粘稠，并且当作为粗喷雾递送时，倾向于在一定程度上粘附至禽类的羽毛。然而，疫苗的一部分不会落在或停留在禽类的身体上，但最终落在容纳禽类的容器的地面上或底部上。这是好的，因为禽类将快速开始啄食此类小滴并摄入它们。

在根据本发明通过粗喷雾针对球虫病将家禽接种疫苗的方法的优选实施方案中，疫苗小滴大小为直径约1 mm至约4 mm。

可以使用标准喷雾接种疫苗设备，并且通过选择适当的条件，例如所用的喷嘴和压力，技术人员可以方便地达到此类大小的小滴。由于黄原胶的假塑性特性，不需要增加压力，或使用特殊的高压喷雾喷嘴。

根据本发明的方法向靶标家禽接种疫苗的施用方案可以是以单个剂量或多个剂量，以与疫苗制剂和与动物畜牧业的实际方面相容的方式。

优选地，用于根据本发明针对球虫病将家禽接种疫苗的方法的方案被整合至靶标家禽可能接受的其他疫苗的现有接种疫苗时间表中，以减少动物的应激并且减少人工成本。这些其他疫苗可以以与它们的注册用途相容的方式，以同步、同时或依次方式施用。

因此，在根据本发明针对球虫病将家禽接种疫苗的方法的一个实施方案中，疫苗与另一家禽疫苗组合施用。

根据本发明针对球虫病将家禽接种疫苗的这些方法在针对艾美球虫感染和/或针对与这种感染相关的疾病的(临床)体征保护家禽方面非常有效。具体而言，这防止家禽的痛苦和不适，并且防止对商业家禽操作的显著经济损害。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于减少家禽中的艾美球虫感染或疾病相关体征的方法，其特征在于所述方法包括向所述家禽施用根据本发明的针对球虫病的家禽疫苗。

鉴于通过将dsRNA的类似物与黄原胶组合来保护dsRNA的类似物的令人惊讶的效果，使得它现在可以通过口服途径以相对低的浓度施用，并且仍然在禽肠中诱导，以得到对家禽的口服艾美球虫接种疫苗后获得的保护性应答的可检测的临床改进，本发明涉及在口服递送期间保护TLR3激动剂的方法。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于通过口服途径将TLR3激动剂递送至禽肠的方法，其特征在于将所述TLR3激动剂与黄原胶混合。

TLR3激动剂本身可以具有药物作用，和/或可以(也)发挥功能以辅助另一种化合物的免疫学或药学作用。

优选地，用于与TLR3激动剂混合的黄原胶如在如本文所述的方面及其各个实施方案和优选项中的一个或多个中所述。

现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

1. TLR3激动剂对艾美球虫疫苗效力的影响；免疫的较早起效

1.1. 实验概述

该实验通过添加TLR3激动剂测试对Paracox™ 8疫苗的免疫起效的影响。对TLR3激动剂进行剂量滴定。将结果与仅用Paracox 8接种疫苗的禽进行直接比较。

将110只一日龄的禽分成7组，每组30只禽。组1-5中的所有禽都用Paracox疫苗接种疫苗，所述Paracox疫苗稀释于0.6%黄原胶中，其含有0.1%胭脂红；通过口服强饲0.5 ml疫苗。组1-4各自接受不同量的TLR3激动剂。组5中的禽仅用Paracox 8接种疫苗，且组6和7中的禽未接种疫苗(参见表1)。在接种疫苗后(PV)，所有禽在分开的围栏中保持在它们的组中14天。在第7、14和19天从对照禽(组6和7)收集粪便样品以监测球虫病感染。在攻击前PV第13天，通过编号标签独特地标识所有禽，然后在PV第14天，组1-6中的每只禽用15.000个柔嫩艾美球虫野生型的卵囊攻击。尽管该攻击日期对于正常的Paracox接种疫苗太早，无法达到完全保护，但它允许检测到免疫起效的任何增强。

在攻击后第5天，所有受攻击的禽和组7中的那些进行安乐死并在死后检查与柔嫩艾美球虫感染相关的病变。在整个研究中每天观察禽的可能与艾美球虫物种感染相关的任何临床体征。

表 1：实施例1的接种疫苗和攻击的时间表

1.2. 材料和方法

使用Paracox 8疫苗的商业批次，将其重悬浮以得到每0.5ml一个完全剂量。将疫苗用稀释剂的2x浓缩的储备物1：1稀释，所述储备物含有75 mM NaCl(即0.44% w/v)中的1.2%黄原胶溶液并含有0.2 % w/v胭脂红(E 120)。所述稀释剂储备物通过在115℃下高压灭菌30分钟进行灭菌。

Paracox 8疫苗稀释液在安全柜中制备。对于每组制备100 ml疫苗(含有200个剂量)；摇动两个1000剂量小袋的疫苗并剧烈按摩1分钟以确保卵囊的再悬浮。将小袋的内容物合并在合适的容器中。对于每种疫苗，将21 ml纯合并的Paracox 8疫苗添加至无菌玻璃Duran瓶(用组号适当标记)中。将10 mg/ml的TLR3激动剂储备溶液快速解冻，且然后将适当体积的激动剂和水添加至疫苗中并充分混合。接下来，将50 ml 2x稀释剂储备物添加至每个Duran瓶中(取决于组)。然后将所有制剂在使用前通过摇动来充分混合至少10分钟。

在疫苗样品中，组1-4接受10 mg/ml的量的TLR3激动剂储备物，以达到预期量的激动剂；组1：100 µl，组2：200 µl，等；所有这些体积都用无菌水补足直至29 ml。

TLR3激动剂：

使用的TLR3激动剂是聚A：U，双链均聚物(Sigma Aldrich)。将其从冻干的钠盐溶解至10 mg/ml储备溶液，并储存在-70℃直至使用。

攻击材料：

攻击材料是柔嫩艾美球虫野生型、无菌形成孢子的卵囊的批次，其储存在2-8℃直至使用。使用改良的Fuchs-Rosenthal计数室测定攻击材料中卵囊的浓度。由此制备稀释液，以得到每0.5 ml攻击剂量15.000个卵囊。

测试动物：

实验动物是混合性别、接种疫苗时一日龄的Lohmann SPF小鸡。在单独围栏中将禽随机置于30只的组中。

在接种疫苗后第13天，用快速标签单独标记禽。

将禽通过经由口服强饲法每只禽施用0.5 ml适当的疫苗制剂来接种疫苗。

通过口服强饲法，用每只0.5 ml的柔嫩艾美球虫野生型制剂对小鸡进行攻击，所有都在彼此在1小时内。

在整个实验中，每天观察所有禽的球虫感染的临床体征，例如腹泻或便血、抑郁或食欲不振。没有观察到特别的发现。3只小鸡死于与实验无关的原因：1只来自组1，且2只来自组2。

在攻击后第5天，将所有禽安乐死，并送去尸检。在死后，检查来自每组的所有禽的与柔嫩艾美球虫相关的肠病变。

为了检查疫苗或攻击操作的目的，在接种疫苗后第7、14和19天，从对照禽(组6和7)的围栏的地面进行粪便收集。从围栏中的幼崽取出每个样品，样品为近似10-20克并且代表整个围栏，例如从4个角落和围栏中间收集；所述样品是都新鲜的并且含有尽可能最少量的幼崽。每个样品用双袋装，标记，并储存在2-8℃下直至处理。根据标准实践检测卵囊，并使用改良的McMaster计数技术计算数目。

1.3. 结果

通过尸检在攻击后5天测定与柔嫩艾美球虫相关的肠病变评分。除了对照组6和7，关于处理组不知情地实施病变评价。组1-7的病变评分结果作为展现特定评分的动物的百分比分别概述于图1、小图A至G中。除了偶尔的死亡，对于这些组，n=30。

病变评分结果如对于对照组所预期；组7中的未受攻击的禽都具有0的病变评分，而组6的未接种疫苗、受攻击的禽具有3或4的高评分，类似于未处理(naive)禽的病变评分概况。

组5中的禽(仅Paracox 8疫苗)的评分加权至评分范围的较高末端。这不是出乎意料的，因为当该疫苗通常仅提供部分保护时，在接种疫苗后14天攻击禽。然而，这便于观察是否由于添加TLR3激动剂而存在免疫的较早起效。

组1和2中接受低剂量的TLR3激动剂(分别为5或10μg/禽)的禽显示完全范围的病变评分，其中较低病变评分的比例明显增加。在组3和4中，在禽接受较高两个剂量水平的TLR3激动剂(分别为20或40μg/禽)的情况下，与仅用Paracox 8接种疫苗的禽(组5)相比，病变评分曲线概况没有非常不同 。

粪便收集物显示在采集的任何粪便样品中都没有检测到卵囊。这表明组7中的禽在整个研究中保持未感染。对于组6，在最终收集物中也没有检测到卵囊，然而，这可能与这些禽的严重疾病有关，如它们的肠病变评分所证明，从而防止正常粪便形成。

1.4. 结论

在测试的所有TLR3激动剂量中，接受较低剂量的每只动物5或10μg的禽具有最好的病变评分结果，具有较大的评分范围，并且明显倾向于较低的病变评分。这是诱导免疫的较早起效的令人信服的证据。

在该实验中，较高量的TLR3激动剂/动物未呈现明显的免疫学增强。这可能表明存在TLR3激动剂的剂量-效应的最佳概况。然而，在另一次接种疫苗-攻击实验(实施例2)中，与仅Paracox 8疫苗组相比，较高剂量的TLR3激动剂/动物确实显示明显的益处。

2. TLR3激动剂对艾美球虫疫苗效力的影响；免疫的较早起效2

在具有与实施例1中描述的大致相同的设置和程序的实验中，测试10或20微克/禽的量的TLR3激动剂的对免疫起效的增强的影响。

使用20只鸡的组，其接受如表2中所展现的处理。

表 2：实施例2的接种疫苗和攻击的时间表

2.1. 结果

对于组1-5，该实验的病变评分结果分别呈现于图2、小图A至E中。

结果如对于对照组如预期：组5的未接种疫苗 - 未攻击的禽都具有0的病变评分，而未接种疫苗 – 攻击的禽具有3或4的评分，表明这些没有针对该攻击的保护。攻击严重程度似乎略低于实施例1中所应用的程度。

仅接受Paracox 8疫苗的禽，组3，具有一系列评分，但加权至评分范围的较高末端。与实施例1中一样，这是预期的，这是因为接种疫苗后的攻击日早(2周)。

处理组1和2具有广泛病变评分概况，其中较低病变评分的比例高于疫苗组3中的禽，表明TLR3激动剂确实在疫苗诱导的免疫起效方面增强疫苗的免疫。

在该实验中，较高量的TLR3激动剂(20μg/禽)似乎比较低量(10μg/禽)在诱导免疫的较早起效方面更有效。

3. TLR3激动剂对艾美球虫疫苗效力的影响；每剂量的卵囊数的减少

进行进一步的实验以测试TLR3激动剂对活艾美球虫卵囊接种疫苗的效力的影响。在该实验中，处理许多大组，以评价TLR3激动剂对疫苗剂量的影响。本质上的设置和性能与实施例1和2中的实验的设置和性能相同，除了：鸡是商业产蛋鸡类型的；使用的疫苗是Paracox™ 5，TLR3激动剂/禽的剂量固定在7.5μg，接种疫苗通过粗喷雾以0.2ml/禽来施用，且攻击在接种疫苗后第21天并用4个单独株进行。

3.1. 实验概述

将1125只1日龄雏鸡分成9组，每组125只动物；一组保持未接种疫苗，其他8组接受不同剂量的Paracox 5疫苗，并且有或没有TLR3激动剂，参见表3。疫苗含有黄原胶，并使用标准孵化场喷雾施用器作为粗喷雾施用。

在接种疫苗后第21天，将来自每个处理组的80只禽分配至四种攻击类型之一，每个物种攻击亚组留下20只禽。向总共720只禽给予四种艾美球虫物种攻击之一的0.5 ml口服强饲。来自对照组1的5只禽未受攻击并保持在其原始围栏中，用于评价在p.v.第28天的基线尸检评价。

所有禽都在p.v.第20天单独称重，然后分配至攻击类型，并在p.v.第28天再次进行，然后尸检，以测定活体重增加。从p.v.第21天至第25天以及p.v.第25天至第28天从所有围栏收集散装的粪便样品，用于卵囊排出计数。将堆型艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫攻击类型的每个攻击处理组的10只禽进行尸检以评价肠病变。由于和缓艾美球虫没有产生特异病征性肠病变，因此将用和缓艾美球虫攻击的来自组1(对照)的10只禽针对寄生虫状态进行尸检，以证实攻击的摄入。

3.2. 材料和方法

测试动物：

Hyline™棕色，商业产蛋鸡。在雄性中，编号单独标记。所有小鸡都在接种疫苗当天为1日龄。在气候和控制条件下，在刨花的垫料上将禽保持在适当的围栏中。饲料未用药治疗。

在整个研究中密切监测小鸡；7只禽在接种疫苗后的第一周内死于与处理无关的原因，这些来自不同的组。

表 3：实施例3的接种疫苗和攻击的时间表

疫苗：

将总共11.000剂量的Paracox 5的小袋彻底摇动，在水中的相应稀释液中分成各组，在需要时与TLR3激动剂混合，并将所有疫苗与如所述含有黄原胶(1.2%)、NaCl(75 mM)和胭脂红(0.2%)的稀释液的无菌2x储备物1：1混合。

组8和9的‘完全’剂量疫苗中的卵囊的量为每剂量：堆型艾美球虫：500个卵囊；巨型艾美球虫，株CP：200个卵囊；巨型艾美球虫，株MFP：100个卵囊；和缓艾美球虫：1000个卵囊；和柔嫩艾美球虫：500个卵囊。

使用的TLR3激动剂是聚A：U，剂量为每只禽7.5μg。

根据制造商的说明，使用Spraycox™ II机器作为粗喷雾施用疫苗：在使用前校准体积和压力设置；疫苗在使用前充分摇动；以最低至最高剂量施用疫苗，并且首先是没有激动剂的组，然后是有激动剂的组，并进行中间清洗。疫苗体积设定为每100只禽20 ml。一旦接种疫苗，将禽保持在托盘中，其中在灯光明亮和温暖的区域向它们接种疫苗至少30分钟，然后转移至容纳围栏。

攻击材料：

所有攻击材料都是来自4种不同物种的形成孢子的卵囊的液体悬浮液：堆型艾美球虫(Ea)、柔嫩艾美球虫(Et)、和缓艾美球虫(Emit)或巨型艾美球虫(Emax)。使用改良的Fuchs-Rosenthal计数室测定预期的卵囊数，分别为：Ea: 1 ml中的1x10^6/禽；Et: 0.5 ml中的3x10^4/禽；Emit: 1 ml中的3x10^5/禽；Emax: 0.5 ml中的1x10^4/禽。

通过口服强饲法单独施用攻击材料。

尸检和病变评分：

进行卵囊计数或病变评分的工作人员对关于处理的信息不知情。病变评分使用标准准则，其对于每种攻击物种(Ea、Et和Emax)是特异性的。

3.3. 结果

接种疫苗和攻击：

组1禽的粪便样品在攻击前保持卵囊计数阴性，表明组1在攻击前没有球虫。从接种疫苗组2至9取出的粪便样品的卵囊计数从p.v.第11天起均为阳性，表明所有接种疫苗组的疫苗卵囊复制是成功的。

用从攻击后三天直至尸检观察到的球虫病的临床症状，攻击操作也是成功的。在p.v.第28天的尸检时，用堆型艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫攻击的禽具有高于0的肠病变评分，并且用和缓艾美球虫攻击的对照禽的所有肠道刮片均为卵囊阳性的，证实攻击是有效的。

活体重增加：

对于不同的攻击亚组，从接种疫苗后第20天至第28天的平均活体重增加(以克计)的结果呈现于表4中。不同亚组的大小为20只动物。

对于堆型艾美球虫，与未接种疫苗-攻击的对照组相比，所有疫苗稀释液都具有显著更好(p<0.01)的平均活体重增加，除了1/20稀释度(组2)，其具有显著更低的平均体重增加。然而，这在TLR3激动剂存在的情况下急剧恢复。

在接受其他攻击物种(柔嫩艾美球虫、和缓艾美球虫或巨型艾美球虫)之一的接种疫苗亚组中的禽中，大多数与其未接种疫苗-攻击组相比具有显著更好的平均活体重增加。然而，不能检测到疫苗稀释或TLR3激动剂的存在的影响。

假设应用的疫苗剂量，甚至在稀释的样品中，仍含有太高剂量的卵囊，不能观察对体重增加的影响。在重复实验中，将使用更高的疫苗稀释度。

表 4：对于不同的攻击亚组，从接种疫苗后第20天至第28天的平均活体重增加(以克计)

组	堆型艾美球虫	柔嫩艾美球虫	和缓艾美球虫	巨型艾美球虫
					1 – 未接种疫苗 – 无TLR3激动剂	63.7	73.3	50.4	53.7
2 - 1/20剂量	36.7	84.0	72.3	92.3
					3 - 1/20剂量 + TLR3激动剂	88.1	84.2	73.1	90.7
4 - 1/10剂量	85.6	77.6	60.2	76.5
					5 - 1/10剂量 + TLR3激动剂	83.5	87.4	72.6	无数据
6 - 1/4剂量	88.8	91.2	70.6	83.4
					7 - 1/4剂量 + TLR3激动剂	93.2	84.2	74.5	81.6
8 – 完全剂量	85.3	84.5	71.5	86.4
					9 - 完全剂量 + TLR3激动剂	93.0	83.0	72.0	82.6

肠病变评分：

通过攻击类型和处理组的平均肠病变评分的结果呈现于表5中。对于这些组，n =20。

用堆型艾美球虫攻击的未接种疫苗的对照禽中的仅50%具有超过2的病变评分。

接种疫苗-攻击的禽在其病变评分的分布上没有显著差异。用巨型艾美球虫攻击的未接种疫苗的对照禽中的80%具有超过2的病变评分。与未接种疫苗的禽(所有p值<0.03)相比，所有接种疫苗的禽(组2-9)的病变分布存在显著(p<0.05)差异，不论疫苗稀释度或TLR3激动剂的存在。用柔嫩艾美球虫攻击的未接种疫苗的对照禽中的90%具有超过2的病变评分。尽管对于TLR3激动剂不存在的情况下的标准疫苗(组8)，具有超过2的病变评分的禽的百分比降低至60%，但总体分布的变化不是统计学显著的(p = 0.07)。然而，用1/4稀释的疫苗的病变评分的分布存在显著减少(组6；p = 0.001)。在疫苗的较高稀释度(1/10，组2，和1/20，组4)，70%的禽具有超过2的病变评分，并且分布与未接种疫苗的攻击的对照组没有显著差异。TLR3激动剂的存在将具有超过2的病变评分的禽的百分比分别降低至20%(组5，1/10剂量)和50%(组3，1/20剂量)，导致病变评分分布与组5的对照组统计学显著不同(p =0.003)，并且对于组3是几乎统计学显著的(p = 0.0509)。

3.4. 讨论和结论

在p.v.第20天，对于每个攻击类型，对照和接种疫苗处理组之间的禽体重没有显著差异。来自未接种疫苗的对照(组1)的粪便样品证实组1在攻击前仍然没有球虫。来自从接种疫苗处理组2至9取出的粪便样品的卵囊计数从p.v.第11天起均为阳性，表明所有接种疫苗组的疫苗卵囊摄入和再循环都是成功的。使用的攻击材料的重新计数显示攻击剂量在靶标的±2%之内。

在p.v.第28天的尸检时，用堆型艾美球虫、巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫攻击的未接种疫苗的对照禽分别在50%、80%和90%的禽中具有超过2的肠病变评分。而且，用和缓艾美球虫攻击的对照禽的所有肠道刮片都是卵囊阳性的。

尽管在用堆型艾美球虫攻击后获得的病变评分相对温和，但在未接种疫苗的对照组中观察到高水平的卵囊排出和对体重增加的显著影响，因此证实所有攻击都是有效的。根据攻击物种和所测量参数，疫苗稀释显示对效力的可变影响。最高达1/20的疫苗稀释度对针对巨型艾美球虫或和缓艾美球虫的任何效力参数没有影响，表明这些抗原在Paracox5制剂中显著过量。相反，对于柔嫩艾美球虫，在1/10或更高的疫苗稀释度下观察到在降低卵囊排出和病变评分方面的保护水平降低。类似地，对于堆型艾美球虫，当将疫苗1/20稀释时，未观察到针对体重增加的减少的保护作用。肠病变太轻微，无法证明确切的结果。在其中由于疫苗稀释而观察到保护降低的所有情况下，在疫苗制剂中包括TLR3激动剂是有益的。

总之，这些结果证明在疫苗制剂中包括TLR3激动剂可以在较低抗原剂量下将疫苗效力增加直至4倍，同时获得相同水平的针对攻击的保护。

表 5：通过攻击类型和处理组的平均肠病变评分(n = 20)

组	堆型艾美球虫	柔嫩艾美球虫	巨型艾美球虫
				1 – 未接种疫苗 – 无TLR3激动剂	1.5	2.9	2.1
2 - 1/20剂量	1.5	2.2	0.9
				3 - 1/20剂量 + TLR3激动剂	0.9	1.7	1.2
4 - 1/10剂量	1.0	2.0	1.2
				5 - 1/10剂量 + TLR3激动剂	1.3	1.0	1.0
6 - 1/4剂量	1.0	0.6	0.8
				7 - 1/4剂量 + TLR3激动剂	1.4	0.3	1.2
8 – 完全剂量	1.5	2.0	0.9
				9 - 完全剂量 + TLR3激动剂	1.1	0.2	0.9

附图说明

图1

图1展现实施例1中描述的接种疫苗-攻击实验的结果。小图A至G分别呈现对于组1-7的接种疫苗-攻击处理后的病变评分。

横轴呈现病变评分数0-4，且纵轴呈现在该组中展现病变评分的禽的百分比。对于这些组，n=30。

图2

由实施例2的接种疫苗-攻击实验产生的病变评分的结果。小图A-E分别描绘组1-5的结果。使用的轴与图1中相同。对于这些组，n=20。

Claims (14)

1.包含活艾美球虫卵囊和药学上可接受的载体的组合物，其特征在于所述组合物包含0.3 % w/v至5 % w/v黄原胶和TLR3激动剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述TLR3激动剂是聚A：U。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于所述活艾美球虫卵囊是形成孢子的卵囊。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述活艾美球虫卵囊是选自以下的一种或多种：柔嫩艾美球虫、堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫、毒害艾美球虫、布氏艾美球虫、早熟艾美球虫、变位艾美球虫、哈氏艾美球虫、E. meleagrimitis 1、E.meleagrimitis 2、腺样艾美球虫、E. gallopavonis和分散艾美球虫。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物包含0.1 % w/v至1.6 % w/v的金属盐。

6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述组合物包含药学上可接受的着色剂。

7.用于制备根据权利要求1-6中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括将活艾美球虫卵囊和药学上可接受的载体与TLR3激动剂混合。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物用于制造针对球虫病的家禽疫苗的用途。

9.针对球虫病的家禽疫苗，所述疫苗包含根据权利要求1-6中任一项所述的组合物。

10.根据权利要求9所述的疫苗，所述疫苗包含0.3-1.5% w/v黄原胶，并且具有200 -4000 mPa.s的粘度。

11.根据权利要求9或10所述的疫苗在制备用于针对球虫病向家禽接种疫苗的药物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述药物是基于凝胶的喷雾疫苗。

13.根据权利要求9或10所述的疫苗在制备用于减少家禽中艾美球虫感染或相关疾病体征的药物中的用途。

14.黄原胶用于制备药物的用途，所述药物用于通过口服途径将TLR3激动剂递送至禽肠以用于减少家禽中艾美球虫感染或相关疾病体征，其特征在于将所述TLR3激动剂与黄原胶混合。