CN110132919A - 一种二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置 - Google Patents

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李成章
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Abstract

本发明提供了一种二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，包括激光器、样品池、光学元件、分束器和信号采集单元，光学元件包括带通滤光片和窄带滤光片，激光器与样品池相连，样品池与分束器相连，分束器分别与带通滤光片、窄带滤光片相连，信号采集单元分别与带通滤光片、窄带滤光片相连，样品池用于放置样品，由激光器输出的信号光，聚焦在样品上，经分束器分光后，分别进行二次谐波和双光子荧光的同时原位测量。本发明的有益效果是：本发明对分子在膜表面吸附与跨膜传输动力学行为探测，具有良好的灵敏性、精确性和时间分辨能力等优良性能，为从分子层次理解膜表面吸附传输的机理提供了一种简便、灵敏的方法。

Description

一种二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置
技术领域
本发明涉及光学技术领域，尤其涉及一种二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置。
背景技术
细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障，保证了细胞内环境的相对稳定，从而使各种生化反应能够有序运行。囊泡作为两亲性磷脂分子分散于水中自组装形成的一类具有封闭双层结构的分子有序组合体，在模拟生物膜、作为药物的载体以及为一些生物化学反应提供适宜的微环境等方面具有重要应用。磷脂膜上药物分子的动力学行为及其与磷脂分子的相互作用研究是脂质体药物开发和治疗应用研究的重要基础。
在目前针对药物或染料分子在脂质体表面的吸附与跨膜传输动力学行为的研究中，主要使用化学分离和吸收光谱、拉曼光谱、荧光光谱等技术途径，对脂质体内外以及膜上的药物分子进行测量分析，以及模拟计算的方法对分子与磷脂膜的作用进行理解。上述提及的方法有的虽然可以通过测试体相物质的浓度实现对分子在磷脂膜上的传输行为的间接探测，但由于其自身原理的局限性，它们主要集中于对药物或者染料分子在生物体中传输的分钟、小时或更长时间后产生的累积结果或者生物效应进行观测，不能直接对相关分子在生物膜上的内外位置和具体结构等进行细致探测。因此，此类研究的灵敏性、精确性和时间分辨能力等还值得进一步提高。
二次谐波技术由于其表界面选择性和灵敏性的特点，成为研究分子在表界面行为强有力的方法。二次谐波是通过界面薄层产生非线性信号的过程，因此可以检测到很弱的信号且有较高的信噪比。二次谐波光谱技术在中心对称的体相中时是电偶禁阻的，因为在体相中，每一个不同取向的分子周围一定会有一个相反取向的分子，具有相反取向的分子诱导产生的二阶极化具有相反相位，使产生的信号互相抵消，因此在体相中不会检测到SHG信号。而在界面上，分子由于受到不对称力的作用形成非中心对称的排列方式，激光作用在界面上将会产生极化作用，这就是二次谐波的界面选择性。利用二次谐波光谱技术可以得到很多有用的界面信息，如饱和吸附量、吸附自由能、带电粒子的表面电势等。
双光子荧光技术不具有表界面特性，探测到是界面和体相的全部信息，但由于此方法比单光子荧光灵敏，并且在某些情况下可以获得更多的信息，而线性光学无法探测到，因此双光子荧光技术被广泛应用于有机分子激发态的机理性研究。利用荧光活性分子的双光子荧光信号随分子化学环境变化发生显著变化的特性，可以对不同药物分子在界面的富集比率进行分析。
发明内容
本发明提供了一种二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，包括激光器、样品池、光学元件、分束器和信号采集单元，所述光学元件包括带通滤光片和窄带滤光片，所述激光器与所述样品池相连，所述样品池与所述分束器相连，所述分束器分别与所述带通滤光片、所述窄带滤光片相连，所述信号采集单元分别与所述带通滤光片、所述窄带滤光片相连，所述样品池用于放置样品，由所述激光器输出的信号光，聚焦在所述样品上，经分束器分光后，分别进行二次谐波和双光子荧光的同时原位测量。
作为本发明的进一步改进，所述信号采集单元包括单色仪、光电倍增管、稳压电源、前置放大器、单光子计数器，所述单色仪一端与所述光电倍增管相连，所述单色仪另一端与所述光学元件相连，所述前置放大器一端与所述单光子计数器相连，所述前置放大器另一端与所述光电倍增管相连，所述稳压电源与所述光电倍增管相连。
作为本发明的进一步改进，所述单色仪包括第一单色仪、第二单色仪，所述光电倍增管包括第一光电倍增管、第二光电倍增管，所述第一单色仪一端与所述带通滤光片相连，所述第一单色仪另一端与所述第一光电倍增管相连，所述第二单色仪一端与所述窄带滤光片相连，所述第二单色仪另一端与所述第二光电倍增管相连，所述稳压电源安装在所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管之间，所述前置放大器分别与所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管相连，所述单光子计数器与所述前置放大器相连。
作为本发明的进一步改进，所述分束器将信号光分成两束光后，其中一束信号光经过所述带通滤光片，挑选出双光子荧光信号，然后通过安装在所述第一单色仪上的所述第一光电倍增管探测，另一束信号光经过所述窄带滤光片，挑选出二次谐波信号，然后通过安装在第二单色仪上的第二光电倍增管探测。
作为本发明的进一步改进，该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜，所述第一反射镜安装在所述激光器与所述样品池之间，所述第二反射镜安装在所述样品池与所述可见光分束器之间，所述第三反射镜安装在所述窄带滤光片和所述可见光分束器之间。
作为本发明的进一步改进，该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括可变中性密度滤光片，所述可变中性密度滤光片安装在所述激光器与所述第一反射镜之间，所述可变中性密度滤光片用于衰减所述激光器输出的功率，使输入到所述样品的光功率不至于损坏样品。
作为本发明的进一步改进，该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括高通滤光片，所述高通滤光片安装在所述第一反射镜与所述样品池之间，所述高通滤光片过滤所述激光器产生的高频光。
作为本发明的进一步改进，该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括透镜，所述透镜安装在所述高通滤光片与所述样品池之间。
作为本发明的进一步改进，该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括透镜组，所述透镜组安装在所述样品池与所述第二反射镜之间。
作为本发明的进一步改进，该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括计算机，所述单光子计数器与所述计算机相连，所述单光子计数器采集的信号最终由所述计算机程序导出；所述激光器为超短脉冲激光器；所述样品池为带有搅拌装置的圆柱形全内反射构型石英样品池；所述可见光分束器为起始波长490nm的长波通二向色镜。
本发明的有益效果是：本发明对分子在膜表面吸附与跨膜传输动力学行为探测，具有良好的灵敏性、精确性和时间分辨能力等优良性能，为从分子层次理解膜表面吸附传输的机理提供了一种简便、灵敏的方法。
附图说明
图1是本发明二次谐波和双光子荧光同时原位测量***装置示意图；
图2是本发明探测抗肿瘤药物分子DOX(多柔比星)在DOPG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰-rac-(1-甘油)钠盐)囊泡膜表面吸附与跨膜传输动力学行为的研究结果图；
图3是本发明探测染料分子D289(4-(4-二乙氨基苯乙烯基)-1-甲基碘化吡啶)在DOPG囊泡膜表面吸附与跨膜传输动力学行为的研究结果图。
具体实施方式
如图1所示，本发明公开了一种二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，作为本发明的实施1，该装置包括激光器101、样品池106、光学元件、分束器109和信号采集单元，所述光学元件包括带通滤光片111和窄带滤光片112，所述激光器101与所述样品池106相连，所述样品池106与所述分束器109相连，所述分束器109分别与所述带通滤光片111、所述窄带滤光片112相连，所述信号采集单元分别与所述带通滤光片111、所述窄带滤光片112相连，所述样品池106用于放置样品，由所述激光器101输出的信号光，聚焦在所述样品上，经分束器109分光后，分别进行二次谐波和双光子荧光的同时原位测量。
所述光学元件方面根据样品特性选用合适的带通滤光片和窄带滤光片，挑选特定波长范围的光，阻挡其它不需要的光。
所述信号采集单元包括单色仪、光电倍增管、稳压电源118、前置放大器117、单光子计数器119，所述单色仪一端与所述光电倍增管相连，所述单色仪另一端与所述光学元件相连，所述前置放大器117一端与所述单光子计数器119相连，所述前置放大器117另一端与所述光电倍增管相连，所述稳压电源118与所述光电倍增管相连。
本发明采用的是不同中心波长和半高宽的带通滤光片，分别挑选出二次谐波信号和双光子荧光信号；本发明采用的是高灵敏度的光电倍增管作为二次谐波与双光子荧光的探测装置。
所述单色仪包括第一单色仪113、第二单色仪114，所述光电倍增管包括第一光电倍增管115、第二光电倍增管116，所述第一单色仪113一端与所述带通滤光片111相连，所述第一单色仪113另一端与所述第一光电倍增管115相连，所述第二单色仪114一端与所述窄带滤光片112相连，所述第二单色仪114另一端与所述第二光电倍增管116相连，所述稳压电源118安装在所述第一光电倍增管115、所述第二光电倍增管116之间，所述前置放大器117分别与所述第一光电倍增管115、所述第二光电倍增管116相连，所述单光子计数器119与所述前置放大器117相连。
所述分束器109将信号光分成两束光后，其中一束信号光经过所述带通滤光片111，挑选出双光子荧光信号，然后通过安装在所述第一单色仪113上的所述第一光电倍增管115探测，另一束信号光经过所述窄带滤光片112，挑选出二次谐波信号，然后通过安装在第二单色仪114上的第二光电倍增管116探测，再使用稳压电源118对第一光电倍增管115、第二光电倍增管116施加工作电压，信号经前置放大器117放大5倍后，用单光子计数器119采集。
该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括第一反射镜103、第二反射镜108、第三反射镜110，所述第一反射镜103安装在所述激光器101与所述样品池106之间，所述第二反射镜108安装在所述样品池106与所述可见光分束器109之间，所述第三反射镜110安装在所述窄带滤光片112和所述可见光分束器109之间，所述第一反射镜103、所述第二反射镜108、所述第三反射镜110为改变光路方向的反射镜。
该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括可变中性密度滤光片102，所述可变中性密度滤光片102安装在所述激光器101与所述第一反射镜103之间，所述可变中性密度滤光片102用于衰减所述激光器101输出的功率，使输入到所述样品的光功率不至于损坏样品。
该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括高通滤光片104，所述高通滤光片104安装在所述第一反射镜103与所述样品池106之间，由激光器101输出的近红外超短脉冲经可变中性密度滤光片102衰减后，所述高通滤光片104过滤所述激光器101产生的高频光，避免激光器101产生的高频光影响二次谐波或双光子荧光信号的采集。
该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括透镜105，所述透镜105安装在所述高通滤光片104与所述样品池106之间，所述经高通滤光片104滤除杂散的高频光，经透镜105后聚焦在样品上，样品产生的散射信号在空间角度约40°的前向被收集，包括二次谐波信号和双光子荧光信号。
该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括透镜组107，所述透镜组107安装在所述样品池106与所述第二反射镜108之间，信号光经透镜组107聚焦。
该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括计算机120，所述单光子计数器119与所述计算机120相连，所述单光子计数器119采集的信号最终由所述计算机120程序导出；所述激光器101为高重复频率超短脉冲激光器,如钛宝石锁模飞秒激光器或其它高重复频率飞秒激光器作为二次谐波与双光子荧光测量***的激发光源，激光波长在690-1020nm范围内可调，根据不同样品特点选择合适波长进行检测；所述样品池106为带有搅拌装置的圆柱形全内反射构型石英样品池，通过搅拌来减少激光对样品的损害，搅拌速度不宜过快，防止产生气泡导致光路发生散射；所述可见光分束器109为起始波长490nm的长波通二向色镜，将信号光一分为二，分别进行二次谐波和双光子荧光的原位测量。
本发明通过光路***、机械***以及电子学***的特殊设计，将二次谐波技术与双光子荧光技术相耦合，实现了二次谐波和双光子荧光的同时原位测量；利用光电倍增管将微弱光信号转换成电信号并使用单光子计数器采集信号；采用计算机处理与控制***记录光谱数据。
本发明结合二次谐波与双光子荧光技术，可对药物分子在磷脂膜表面的吸附与跨膜传输动力学过程进行深入探测，有望在药物开发与负载等应用研究中发挥巨大作用。
实施例2是在实施例1的基础上进一步改进，***实际应用于抗肿瘤药物分子DOX在DOPG囊泡膜表面吸附与跨膜传输动力学行为的探测，具体如下：
1.所述激光器101的中心波长设置为810nm，功率由可变中性密度滤光片102衰减至300mW；
2.双光子荧光部分的带通滤光片111选用335-610nm有色玻璃带通滤光片，第一单色仪113中心波长设置为555nm；
3.二次谐波部分窄带滤光片112选用中心波长405nm，半高宽10nm的介质膜带通滤光片,第二单色仪114中心波长设置为405nm；
4.第一光电倍增管115、第二光电倍增管116外加工作电压为900V；
5.单光子计数器119每1秒采集一次数据；
6.DOPG囊泡由水合超声法制备，尺寸范围105±29nm，多分散系数PDI为0.33；
7.在样品池106中加入浓度为40μmol/L的DOX 2mL并开始采集信号，于225s时加入浓度为0.5mmol/L的DOPG 2mL；结果如图2所示，二次谐波的场强与吸附在囊泡膜表面的分子数量成正比，场强信号越大，表明膜表面吸附的DOX分子数量越多，饱和吸附量可用修正的Langmuir公式进行拟合。同时，DOPG加入后高密度的表面吸附量使DOX的双光子荧光快速猝灭。结合二次谐波和双光子荧光光谱数据，可对DOX在DOPG囊泡膜表面吸附与跨膜传输动力学行为做进一步分析。
实施例3是在实施例1的基础上进一步改进，***实际应用于染料分子D289在DOPG囊泡膜表面吸附与跨膜传输动力学行为的探测，具体如下：
1.激光器101的中心波长设置为810nm，功率由可变中性密度滤光片102衰减至300mW；
2.双光子荧光部分的带通滤光片111选用335-610nm有色玻璃带通滤光片，第一单色仪113中心波长设置为565nm；
3.二次谐波部分窄带滤光片112选用中心波长405nm，半高宽10nm的介质膜带通滤光片,第二单色仪114中心波长设置为405nm；
4.第一光电倍增管115、第二光电倍增管116外加工作电压为900V；
5.单光子计数器119每1秒采集一次数据；
6.DOPG囊泡由挤出法制备，尺寸范围135±21nm，多分散系数PDI为0.13。在样品池106中加入浓度为0.5mmol/L的DOPG 2mL并开始采集信号，于720s时加入浓度为40μmol/L的D289 2mL；结果如图3所示，加入D289后，二次谐波信号首先有一个快速的上升过程，表明D289分子迅速吸附在DOPG囊泡表面，随后有一个快速的下降过程，表明D289分子在DOPG囊泡表面发生了翻转。最后的缓慢下降过程，说明D289分子缓慢传输进入DOPG囊泡内部。加入D289后，样品的双光子荧光信号迅速增强，这是因为D289分子迅速吸附在DOPG囊泡表面，它们之间的静电吸附相互作用增强了荧光。
本发明的有益效果是：本发明对分子在膜表面吸附与跨膜传输动力学行为探测，具有良好的灵敏性、精确性和时间分辨能力等优良性能，为从分子层次理解膜表面吸附传输的机理提供了一种简便、灵敏的方法。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：包括激光器(101)、样品池(106)、光学元件、分束器(109)和信号采集单元，所述光学元件包括带通滤光片(111)和窄带滤光片(112)，所述激光器(101)与所述样品池(106)相连，所述样品池(106)与所述分束器(109)相连，所述分束器(109)分别与所述带通滤光片(111)、所述窄带滤光片(112)相连，所述信号采集单元分别与所述带通滤光片(111)、所述窄带滤光片(112)相连，所述样品池(106)用于放置样品，由所述激光器(101)输出的信号光，聚焦在所述样品上，经分束器(109)分光后，分别进行二次谐波和双光子荧光的同时原位测量。
2.根据权利要求1所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：所述信号采集单元包括单色仪、光电倍增管、稳压电源(118)、前置放大器(117)、单光子计数器(119)，所述单色仪一端与所述光电倍增管相连，所述单色仪另一端与所述光学元件相连，所述前置放大器(117)一端与所述单光子计数器(119)相连，所述前置放大器(117)另一端与所述光电倍增管相连，所述稳压电源(118)与所述光电倍增管相连。
3.根据权利要求2所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：所述单色仪包括第一单色仪(113)、第二单色仪(114)，所述光电倍增管包括第一光电倍增管(115)、第二光电倍增管(116)，所述第一单色仪(113)一端与所述带通滤光片(111)相连，所述第一单色仪(113)另一端与所述第一光电倍增管(115)相连，所述第二单色仪(114)一端与所述窄带滤光片(112)相连，所述第二单色仪(114)另一端与所述第二光电倍增管(116)相连，所述稳压电源(118)安装在所述第一光电倍增管(115)、所述第二光电倍增管(116)之间，所述前置放大器(117)分别与所述第一光电倍增管(115)、所述第二光电倍增管(116)相连，所述单光子计数器(119)与所述前置放大器(117)相连。
4.根据权利要求3所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：所述分束器(109)将信号光分成两束光后，其中一束信号光经过所述带通滤光片(111)，挑选出双光子荧光信号，然后通过安装在所述第一单色仪(113)上的所述第一光电倍增管(115)探测，另一束信号光经过所述窄带滤光片(112)，挑选出二次谐波信号，然后通过安装在第二单色仪(114)上的第二光电倍增管(116)探测。
5.根据权利要求1所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括第一反射镜(103)、第二反射镜(108)、第三反射镜(110)，所述第一反射镜(103)安装在所述激光器(101)与所述样品池(106)之间，所述第二反射镜(108)安装在所述样品池(106)与所述可见光分束器(109)之间，所述第三反射镜(110)安装在所述窄带滤光片(112)和所述可见光分束器(109)之间。
6.根据权利要求5所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括可变中性密度滤光片(102)，所述可变中性密度滤光片(102)安装在所述激光器(101)与所述第一反射镜(103)之间，所述可变中性密度滤光片(102)用于衰减所述激光器(101)输出的功率，使输入到所述样品的光功率不至于损坏样品。
7.根据权利要求5所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括高通滤光片(104)，所述高通滤光片(104)安装在所述第一反射镜(103)与所述样品池(106)之间，所述高通滤光片(104)过滤所述激光器(101)产生的高频光。
8.根据权利要求7所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括透镜(105)，所述透镜(105)安装在所述高通滤光片(104)与所述样品池(106)之间。
9.根据权利要求5所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括透镜组(107)，所述透镜组(107)安装在所述样品池(106)与所述第二反射镜(108)之间。
10.根据权利要求2所述的二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置，其特征在于：该二次谐波和双光子荧光同时原位测量装置包括计算机(120)，所述单光子计数器(119)与所述计算机(120)相连，所述单光子计数器(119)采集的信号最终由所述计算机(120)程序导出；所述激光器(101)为超短脉冲激光器；所述样品池(106)为带有搅拌装置的圆柱形全内反射构型石英样品池；所述可见光分束器(109)为起始波长490nm的长波通二向色镜。
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