CN110129387A - 复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种烟酰胺的制备方法，特别涉及一种复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，属于生物技术领域。该方法是先将聚乙烯醇、聚乙二醇加水混合加热后搅拌使其充分溶解得到PVA‑PEG水凝胶，再依次加入硅藻土、活性炭充分搅拌后冷却至室温，得到固定化用复合材料；然后将待固定化菌体（湿菌体）加入到固定化用复合材料中，制备PVA‑PEG小圆滴，经过烘干、Na2SO4溶液中复膨，收集固定化小圆片，清水洗净，低温保存；加底物3‑氰基吡啶，反应后得到产物烟酰胺。本发明的方法对微生物损伤小、固定化细胞机械强度高，使用寿命长；环境污染小、分离提纯简单、产品纯度高，宜于规模型工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种烟酰胺的制备方法，特别涉及一种复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，属于生物技术领域。
背景技术
烟酰胺又称尼克酰胺（Nicotinamide），为白色结晶性粉末，无臭，带苦味，干燥状态50℃以下极稳定，与无机酸和碱一起加热，则会水解成烟酸。烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ等的组成部分之一，参与机体多种氧化还原反应。主要作为饲料的营养性添加剂（水溶性维生素），也用于食品、医药、染料的中间体，同时用作电镀液的添加剂和生化试剂。目前烟酰胺生产工艺有两大类，一类是化学法，另外一类是生物合成法。化学法主要是采用3-甲基吡啶、2-甲基-1,5-戊二胺、2-甲基-5-乙基吡啶等为初始原料，通过氧化剂直接氧化或催化氧化生成3-氰基吡啶，再经过碱液水解生产烟酰胺。化学法工艺比较成熟，但需加催化剂、高温、多步反应，且催化剂价格昂贵，反应后所得的反应液含量不高，组分不纯，不利于提取，对环境的污染很大。生物催化法是采用腈水合酶转化3-氰基吡啶生成烟酰胺。微生物法生产烟酰胺具有反应条件温和，成本低，产物产率和纯度高，环境友好等优点，这些都是化学合成法所不可比拟的。其中生物法又可分为游离细胞催化及固定化细胞催化。
腈类物质对于产腈水合酶菌株都会有或强或弱的毒性。微生物细胞经过固定化后，被包埋在生物材料里面，避免了与腈类化合物的直接接触，减弱了腈类化合物毒性对微生物的伤害，使微生物细胞能够长时间的保存转化能力。产腈水解酶的微生物在固定化以后，能够增强对产物和底物的耐受性，提高持续转化能力。
现有的固定化方法有物理吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。包埋法反应条件温和，有较高的包埋量、能较好维持酶的构象和活力，还有助于提高酶的稳定性。虽然固定化细胞有利于大规模的生物转化过程的连续化，简化产物的分离纯化，降低生产成本。但传统固定化细胞形式一般采用小球形式，固定化小球内部与底物交换不完全，传质受阻，影响反应速率。
发明内容
本发明提供一种复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，该方法工艺简单，适合大规模生产，产物转化率高，纯度高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，该方法包括如下步骤：
1）丙酸棒杆菌的固定化：
（1）固定化用复合材料：
固定化用复合材料以质量百分含量计的配方为：
聚乙烯醇（PVA）5％～20％，
聚乙二醇（PEG）3％～10％，
硅藻土0.1％～2％，
活性炭0.1％～1％，
余量为水，以上组分质量总计为100%；
聚乙烯醇、聚乙二醇加水混合加热后搅拌使其充分溶解得到PVA-PEG水凝胶，再依次加入硅藻土、活性炭充分搅拌后冷却至室温，得到固定化用复合材料；
（2）将经过液体培养得到的待固定化菌体与固定化用复合材料混合，充分搅拌，使菌体与固定化用复合材料混合均匀；
（3）将步骤（2）得到的混合物滴到PE板上，形成直径3～6mm的点矩阵；
（4）将步骤（3）得到的滴有小圆片的PE板放入烘箱中，使其含水率降至10%～25%；
（5）将步骤（4）得到的PE板置于Na2SO4水溶液中，使PE板上的小圆片在Na2SO4水溶液中浸没；
（6）收集制备的PVA-PEG小圆片，洗净后低温保存；
2）烟酰胺的制备：
在质量浓度为10～30% 的3-氰基吡啶溶液中加入上述步骤得到的固定化小圆片，固定化小圆片的加入量为10-30%，反应时间60～240min后得到烟酰胺。采用HPLC检测3-氰基吡啶的残留量和烟酰胺的生成量。
本发明采用PVA-PEG等复合材料固定化丙酸棒杆菌，制备扁平型的固定化小圆片，传统包埋法制备固定化细胞多采用海藻酸钠、聚乙烯醇、丙烯酰胺、明胶、壳聚糖及羧甲基纤维素等材料做单一包埋或采用两种、多种材料的组合做符合包埋，复合包埋技术采用不同的材料混合，集合不同材料的优势，弥补单一材料的不足。上述几种材料中属海藻酸钠和聚乙烯醇符合包埋技术为研究者采用较多的方案，其制备的固定化小球具有较好的机械强度，可实现多批次的套用，但由于聚乙烯醇在固化过程中会形成致密的凝胶网络，不利于传质的快速进行。本发明中引入聚乙二醇材料，有利于加强传质效果，弥补了传统固定化小球与游离细胞相比活力低的缺点。同时制得的固定化小圆片具有更高的机械强度，实验室应用中制得的固定化细胞可实现不低于40批次的水解套用。该固定化方法和形式用于固定丙酸棒杆菌并用于腈类化合物的生物转化，具有很高的工业应用价值。
作为优选，步骤(2)中，菌体的液体培养基组成为：葡萄糖10～40g，酵母膏5～20g，尿素2～10g，磷酸二氢钾1～5g，磷酸氢二钾1～5g，硫酸镁1～5g，谷氨酸钠2～6g，氯化钴0.001～0.01g，加水至1L，pH值为6.8～7.5。培养条件为：250ml三角瓶装10～30%的培养基，灭菌后加入1～10%的菌种，于摇床上以100～300rpm 恒温振荡培养，培养温度25～35℃，培养时间36～108h。
作为优选，步骤(2)中，菌体与固定化用复合材料的质量比为0.1～1:10。
作为优选，步骤(4)中使PVA-PEG小圆片含水率下降的烘箱温度设置在20-50℃，烘干时间为30-120min。
作为优选，步骤(5)中，Na2SO4的质量百分含量为1～20%，小圆片的浸泡时间为20～40min。
作为优选，步骤(6)中保存温度为2～10℃。
作为优选，所述的聚乙二醇是聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000中的任意一种；所述的聚乙烯醇是聚乙烯醇1799、聚乙烯醇1788中的一种。
由于传统固定化细胞形式一般采用小球形式，固定化小球内部与底物交换不完全，传质受阻，影响反应速率；包埋法是细胞或酶固定化的常用方法，其中凝胶包埋法应用较为广泛，聚乙烯醇作为凝胶包埋中一种常用材料，传统的应用方式是采用饱和的硼酸溶液作为交联剂形成致密的凝胶网络。结构式为。致密的凝胶网络结构虽能保证固定化细胞具有较好的弹性及机械强度的，但对于底物产物传质具有较大的影响，成为制约酶催化反应高效进行的因素。
本发明采用聚乙烯醇作为固定化凝胶材料，并引入聚乙二醇作为致孔剂，得到具有合适凝胶网络结构的固定化细胞，在保证其良好的机械强度情况下加强其传质性能。固定化小圆片的结构式为。本发明采用PVA-PEG等复合材料固定化丙酸棒杆菌，制备扁平型的固定化小圆片，使固定化小圆片既有较高的机械强度，也弥补了固定化小球与游离细胞相比活力低的缺点。该固定化方法和形式用于固定丙酸棒杆菌并用于腈类化合物的生物转化，具有很高的工业应用价值。
本发明的方法对微生物损伤小、固定化细胞机械强度高，使用寿命长；环境污染小、分离提纯简单、产品纯度高，宜于规模型工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
丙酸棒杆菌，购自上海市农药研究所有限公司。
实施例1
一种复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，该方法步骤具体是：
1）本实施例采用腈水合酶产生菌——丙酸棒杆菌菌体作为固定化菌体，丙酸棒杆菌通过液体培养获得菌液，经过离心分离获得湿菌体。
液体培养基为：葡萄糖20g，酵母膏10 g，尿素5 g，磷酸二氢钾1 g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁1 g，谷氨酸钠3.5 g，氯化钴0.003 g，加水至1000ml，调pH值至7.0。
培养条件为：从茄子瓶的斜面菌种挑取丙酸棒杆菌，接种于摇瓶培养基中。250ml三角瓶装50ml培养基，于摇床上以200rpm 恒温振荡培养，培养温度30℃，培养时间48h。
将1000ml发酵液进行离心处理，去除上清液，获得湿的产腈水合酶的细胞。将菌体重悬于去离子水溶液中，充分搅拌成浓度为50g/L的产腈水合酶的细胞悬浊液。
2）丙酸棒杆菌的固定化：
（1）固定化用复合材料：
固定化用复合材料以质量百分含量计的配方为：
聚乙烯醇1799（PVA 1799）5％，
聚乙二醇200（PEG 200）3％，
硅藻土0.1％，
活性炭0.1％，
余量为水，以上组分质量总计为100%；
聚乙烯醇、聚乙二醇加水混合加热后搅拌使其充分溶解得到PVA-PEG水凝胶，搅拌速率控制在300～500rpm范围内，再依次加入硅藻土、活性炭充分搅拌后冷却至室温（25～30℃），得到固定化用复合材料；
（2）将经过液体培养得到的待固定化菌体（湿菌体）与固定化用复合材料混合，充分搅拌，使菌体与水凝胶混合均匀；为了防止气泡的产生，搅拌速率不能过快，控制在50～150rpm范围内；
（3）利用点滴机沾取混合均匀的混合液，将步骤（2）得到的混合物滴到PE板上，形成直径3～6mm的点矩阵；
（4）将步骤（3）得到的滴有小圆片的PE板放入烘箱中30℃烘干60min，使其含水率降至25%；
（5）将步骤（4）得到的PE板置于5% Na2SO4水溶液中，使PE板上的小圆片在Na2SO4水溶液中浸没20min；
（6）收集制备的PVA-PEG小圆片，清水漂洗，放置于2～10℃保存；
3）烟酰胺的制备：
于1000ml玻璃反应釜，加入500g水，加入固定化小圆片50g，开启搅拌并通过夹套控温22℃，连续流加熔融态的3-氰基吡啶使最终体系的浓度为21.4%，流加完成后继续反应60min取样检测体系中3-氰基吡啶的残留量，完全反应后放料。固定化细胞留于反应釜中继续进行下一批次反应。采用HPLC检测3-氰基吡啶的残留量和烟酰胺的生成量。
实验结果：水解得到25%浓度的烟酰胺溶液，固定化细胞经过40批次的套用后仍能实现完全转化，并且固定化细胞本身仍保持良好的机械性能，无破损溶胀现象。
实施例2
一种复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，该方法步骤具体是：
1）本实施例采用腈水合酶产生菌——丙酸棒杆菌菌体作为固定化菌体，
液体培养基为：葡萄糖30g，酵母膏15 g，尿素7.5 g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5 g，谷氨酸钠3.5 g，氯化钴0.005 g，加水至1000ml，调pH值至6.8。
培养条件为：从茄子瓶的斜面菌种挑取丙酸棒杆菌，接种于摇瓶培养基中。250ml三角瓶装50ml培养基，于摇床上以240rpm 恒温振荡培养，培养温度28℃，培养时间96h。
将1000ml发酵液进行离心处理，去除上清液，获得湿的产腈水合酶的细胞。将菌体重悬于去离子水溶液中，充分搅拌成浓度为75g/L的产腈水合酶的细胞悬浊液。
2）丙酸棒杆菌的固定化：
（1）固定化用复合材料：
固定化用复合材料以质量百分含量计的配方为：
聚乙烯醇1788（PVA 1788）8％，
聚乙二醇400（PEG 400）5％，
硅藻土0.1％，
活性炭0.1％，
余量为水，以上组分质量总计为100%；
聚乙烯醇、聚乙二醇加水混合加热后搅拌使其充分溶解得到PVA-PEG水凝胶，再依次加入硅藻土、活性炭充分搅拌后冷却至室温，得到固定化用复合材料；
（2）将经过液体培养得到的待固定化菌体与固定化用复合材料混合，充分搅拌，使菌体与水凝胶混合均匀；
（3）将步骤（2）得到的混合物滴到PE板上，形成直径3～6mm的点矩阵；
（4）将步骤（3）得到的滴有小圆片的PE板放入烘箱中28℃烘干30min，使其含水率降至30%；
（5）将步骤（4）得到的PE板置于8%Na2SO4水溶液中，使PE板上的小圆片在Na2SO4水溶液中浸没30min；
（6）收集制备的PVA-PEG小圆片，清水漂洗，放置于2～10℃保存；
3）烟酰胺的制备：
于1000ml玻璃反应釜，加入500g水，加入固定化小圆片50g，开启搅拌并通过夹套控温22℃，连续流加熔融态的3-氰基吡啶使最终体系的浓度为21.4%，流加完成后继续反应60min取样检测体系中3-氰基吡啶的残留量，完全反应后放料。固定化细胞留于反应釜中继续进行下一批次反应。采用HPLC检测3-氰基吡啶的残留量和烟酰胺的生成量。
实验结果：水解得到25%浓度的烟酰胺溶液，固定化细胞经过45批次的套用后仍能实现完全转化，并且固定化细胞本身仍保持良好的机械性能，无破损溶胀现象。
实施例3
一种复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，该方法步骤具体是：
1）本实施例采用腈水合酶产生菌——丙酸棒杆菌菌体作为固定化菌体，
液体培养基为：葡萄糖25g，酵母膏7.5 g，尿素3.5 g，磷酸二氢钾0.75 g，磷酸氢二钾0.75 g，硫酸镁0.75 g，谷氨酸钠3 g，氯化钴0.002 g，加水至1000ml，调pH值至7.2。
培养条件为：从茄子瓶的斜面菌种挑取丙酸棒杆菌，接种于摇瓶培养基中。250ml三角瓶装50ml培养基，于摇床上以220rpm 恒温振荡培养，培养温度30℃，培养时间72h。
将1000ml发酵液进行离心处理，去除上清液，获得湿的产腈水合酶的细胞。将菌体重悬于去离子水溶液中，充分搅拌成浓度为50g/L的产腈水合酶的细胞悬浊液。
2）丙酸棒杆菌的固定化：
（1）固定化用复合材料：
固定化用复合材料以质量百分含量计的配方为：
聚乙烯醇1788（PVA 1788）10％，
聚乙二醇1000（PEG 1000）8％，
硅藻土0.1％，
活性炭0.1％，
余量为水，以上组分质量总计为100%；
聚乙烯醇、聚乙二醇加水混合加热后搅拌使其充分溶解得到PVA-PEG水凝胶，再依次加入硅藻土、活性炭充分搅拌后冷却至室温，得到固定化用复合材料；
（2）将经过液体培养得到的待固定化菌体与固定化用复合材料混合，充分搅拌，使菌体与水凝胶混合均匀；
（3）将步骤（2）得到的混合物滴到PE板上，形成直径3～6mm的点矩阵；
（4）将步骤（3）得到的滴有小圆片的PE板放入烘箱中25℃烘干120min，使其含水率降至20%；
（5）将步骤（4）得到的PE板置于10%Na2SO4水溶液中，使PE板上的小圆片在Na2SO4水溶液中浸没40min；
（6）收集制备的PVA-PEG小圆片，清水漂洗，放置于2～10℃保存；
3）烟酰胺的制备：
于1000ml玻璃反应釜，加入500g水，加入固定化小圆片50g，开启搅拌并通过夹套控温22℃，连续流加熔融态的3-氰基吡啶使最终体系的浓度为21.4%，流加完成后继续反应60min取样检测体系中3-氰基吡啶的残留量，完全反应后放料。固定化细胞留于反应釜中继续进行下一批次反应。采用HPLC检测3-氰基吡啶的残留量和烟酰胺的生成量。
实验结果：水解得到25%浓度的烟酰胺溶液，固定化细胞经过60批次的套用后仍能实现完全转化，并且固定化细胞本身仍保持良好的机械性能，无破损溶胀现象。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (7)
1.一种复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1）丙酸棒杆菌的固定化：
（1）固定化用复合材料：
固定化用复合材料以质量百分含量计的配方为：
聚乙烯醇（PVA）5％～20％，
聚乙二醇（PEG）3％～10％，
硅藻土0.1％～2％，
活性炭0.1％～1％，
余量为水，以上组分质量总计为100%；
聚乙烯醇、聚乙二醇加水混合加热后搅拌使其充分溶解得到PVA-PEG水凝胶，再依次加入硅藻土、活性炭充分搅拌后冷却至室温，得到固定化用复合材料；
（2）将经过液体培养得到的待固定化菌体与固定化用复合材料混合，充分搅拌，使菌体与固定化用复合材料混合均匀；
（3）将步骤（2）得到的混合物滴到PE板上，形成直径3～6mm的点矩阵；
（4）将步骤（3）得到的滴有小圆片的PE板放入烘箱中，使其含水率降至10%～25%；
（5）将步骤（4）得到的PE板置于Na2SO4水溶液中，使PE板上的小圆片在Na2SO4水溶液中浸没；
（6）收集制备的PVA-PEG小圆片，洗净后低温保存；
2）烟酰胺的制备：
在质量浓度为10～30% 的3-氰基吡啶溶液中加入上述步骤得到的固定化小圆片，固定化小圆片的加入量为10-30%，反应时间60～240min后得到烟酰胺。
2. 根据权利要求1所述的复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，其特征在于：步骤(2)中，菌体的液体培养基组成为：葡萄糖10～40g，酵母膏5～20g，尿素2～10g，磷酸二氢钾1～5g，磷酸氢二钾1～5g，硫酸镁1～5g，谷氨酸钠2～6g，氯化钴0.001～0.01g，加水至1L，pH值为6.8～7.5；培养条件为：250ml三角瓶装10～30%的培养基，灭菌后加入1～10%的菌种，于摇床上以100～300rpm 恒温振荡培养，培养温度25～35℃，培养时间36～108h。
3.根据权利要求1所述的复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，其特征在于：步骤(2)中，菌体与固定化用复合材料的质量比为0.1～1:10。
4.根据权利要求1所述的复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，其特征在于：步骤(4)中使PVA-PEG小圆片含水率下降的烘箱温度设置在20-50℃，烘干时间为30-120min。
5.根据权利要求1所述的复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，其特征在于：步骤(5)中，Na2SO4的质量百分含量为1～20%，小圆片的浸泡时间为20～40min。
6.根据权利要求1所述的复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，其特征在于：步骤(6)中保存温度为2～10℃。
7.根据权利要求1所述的复合材料固定化丙酸棒杆菌制备烟酰胺的方法，其特征在于：所述的聚乙二醇是聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000中的任意一种；所述的聚乙烯醇是聚乙烯醇1799、聚乙烯醇1788中的一种。
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