CN110129328B - ltk基因在制备日本青鳉无背景荧光透明品系中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及ltk基因在制备日本青鳉无背景荧光透明品系中的应用，利用本领域的常规方式以ltk基因为目的基因进行缺失或突变，可获得无背景荧光的日本青鳉，利用基因突变的方法获得青鳉无背景荧光透明品系比传统方法，存活率高、育种时间短（孵出后一周内可看到表型以便后续筛选）、成本低等优点，具有科学研究的基础价值和应用价值。该方法可以成为一种快速获得青鳉无背景荧光透明品系的新技术，并可用于动物色素发育机理研究，且为建立观赏鱼类或者其他鱼类基因突变获得稳定品系提供方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及ltk基因在制备日本青鳉无背景荧光透明品系中的应用，以本发明提供的日本青鳉ltk基因为靶序列，可通过表型筛选快速且高效地获得可稳定遗传的日本青鳉无背景荧光透明品系。
背景技术
青鳉是一种小型的卵生淡水鱼类，具有雌雄易区分、盐度和温度(10～40℃)耐受范围广、生长发育迅速、容易饲养及抗病性强等特点，是发育生物学、细胞生物学、免疫学及毒理学等诸多领域的重要模式生物(Wittbrodt,Shima et al.2002,Furutani-Seiki andWittbrodt 2004)。青鳉的基因组及转录组等数据已较完善(Kasahara,Naruse etal.2007)，一系列细胞系也已被分离鉴定，如：单倍体胚胎干细胞(Yi,Hong et al.2010)、***系(Hong,Liu et al.2004)、胚胎干细胞系(Hong and Schartl 2006)等。青鳉产卵时间可控、量大且易于收集、胚胎透明且便于进行显微操作，现已成功建立了半克隆青鳉(Yi,Hong et al.2009)，实现了基因敲除(Ansai and Kinoshita 2014)和基因敲降(Li,Zhu et al.2016)。因此，青鳉为色素细胞的研究提供了独特的优势，不管是自身还是与其他物种如斑马鱼相比较(Furutani-Seiki and Wittbrodt 2004)。
许多动物的色素结构是由于不同色素细胞的排列产生的。哺乳动物只有一种色素细胞，即黑色素细胞(蓝色、棕色、红色和黄色)，而鱼类有6种不同的色素细胞。其中5种类型的色素细胞广泛分布于鱼体，包括黑色素细胞(melanophores)(黑色或灰色)、黄色素细胞(xanthophores)(黄色或橙色)、红色素细胞(erythrophores)(红色)、虹彩细胞(iridophores)(彩色：蓝色、银色或金色)和白色素细胞(leucophores)(暗色和白色)，而蓝色素细胞(cyanophores)(铁蓝色)在***发育上限制了它们在机体上的分布(Kelsh2010)。在成年青鳉中，4种类型的色素细胞主要分布在鳞片中以及鳞片下方，腹膜和眼睛中以及脑和脊柱的周围，这些色素细胞的不同排列及分布使青鳉呈现出色彩斑斓的体色(Lynn Lamoreux,Kelsh et al.2005)。
色素是植物和动物的着色材料。在许多生物结构中，例如皮肤、眼睛和毛发等都含有色素(如：黑色素)。生物体中的色素沉着用于许多生物学目的，包括伪装，模仿，警戒作用，择偶和其他形式的信号传导，如在植物中的光合作用，以及基本的物理目的，例如防晒。大多数脊椎动物具有背腹色素模式，色素细胞为有机体提供了保护层，其可以在一定程度上抵御太阳光中的紫外辐射。虽然色素对于生物体有诸多好处，但是其对某些实验动物在科研中的应用却形成了一定的障碍。在一些生物体的某些组织中存在自发荧光的现象，例如鱼球虫(fishcoccidia)，斑马鱼(zebrafish)，青鳉(medaka)等(Davies and Stewart2000,Loire,Barbeau et al.2013,Granneman,Kimler et al.2017)。而在鱼类胚胎中，各个胚胎发育时期的自发荧光似乎主要来自某些组织和一些色素细胞(例如：黑色素细胞、黄色素细胞、白色素细胞和虹彩细胞)(Wakamatsu,Ju et al.2001,Braasch,Brunet etal.2009,Granneman,Kimler et al.2017)。青鳉是基因敲除和转基因等实验的重要模式生物，但是在涉及红绿荧光的实验中，其内源蛋白的荧光信号对外援蛋白荧光信号的读取产生了干扰，自发荧光这一现象的存在严重干扰了实验结果(Fang,Chen et al.2018,Ishikawa,Ansai et al.2018,Watakabe,Hashimoto et al.2018)。然而，到目前为止，大多数关于鱼体自发荧光的报道，都是致力于优化荧光蛋白的选择或怎么去减少内源荧光的干扰等方面的研究，而关于由哪些基因导致自发荧光及通过基因敲除的方法去除背景荧光的案例还未曾报道(Loire,Barbeau et al.2013)。
Ltk基因编码一个酪氨酸酶受体蛋白。Krolewski等鉴定了一个推测的全长的人类ltkcDNA，其包含了相对于之前鉴定的cDNA全新的序列信息(Krolewski and Dalla-Favera1991)。这个cDNA编码的100kDa的蛋白产物包含了：一个ATG翻译起始密码子，一个分泌信号序列和一个347个氨基酸的细胞外结构域(也称为跨膜和细胞内激酶结构域)(Krolewskiand Dalla-Favera 1991)。青鳉ltk基因组全长57916bp，其mRNA全长为5484bp，编码1505个氨基酸。通过结构域预测发现，Ltk蛋白包含了一个277个氨基酸的PTKc_ALK_LTK结构域，两个157个氨基酸的MAM(Meprin,A5protein,and protein tyrosine phosphatase Mu(MAM)domain)结构域和一个低密度脂蛋白受体结构域(Low-density lipoprotein receptordomain class A，LDLa)。在分化为虹彩细胞系之前，ltk在一群神经鞘细胞中表达(Lopes,Yang et al.2008)。Ltk特异性地调控虹彩细胞地形成、增殖和存活。自发荧光的存在对荧光特异性表达的转基因鱼的构建产生了严重干扰。
发明内容
本发明的目的在于提供了ltk基因在制备日本青鳉无背景荧光透明品系中的应用，所述的ltk基因的NCBI号为：(GeneBankAccessionNumber：NC_019880.2)以该基因为目的基因，进行基因突变或缺失，可以快速获得无背景荧光透明的日本青鳉，方法易行，操作简单。为了达到上述目的，本发明采取了以下措施：
Ltk基因在制备日本青鳉无背景荧光透明品系中的应用，可以利用本领域的常规方式以ltk基因为目的基因进行缺失或突变，可获得无背景荧光的日本青鳉。
以上所述的应用中，优选的，采取CRISPR/Cas9的方式，以SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示序列为靶位点进行基因编辑。
以上所述的应用中，优选的，获得的无背景荧光透明品系中，包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的基因序列。
以上所述的应用中，获得的无背景荧光透明品系亲本，通过F0突变体杂交产生F1代胚胎，筛选出无背景荧光并腹部透明的小鱼继续培养，可获得无背景荧光并腹部透明稳定遗传的日本青鳉。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的方法可用于快速建立青鳉无背景荧光透明品系。该方法易行，操作简单，不需要进行大量的PCR筛选，可以直接通过表型观测，快速且高效地获得无背景荧光透明品系。利用基因突变的方法获得青鳉无背景荧光透明品系比传统方法，存活率高、育种时间短(孵出后一周内可看到表型以便后续筛选)、成本低等优点，具有科学研究地基础价值和应用价值。该方法可以成为一种快速获得青鳉无背景荧光透明品系的新技术，并可用于动物色素发育机理研究，且为建立观赏鱼类或者其他鱼类基因突变获得稳定品系提供方法。
附图说明
图1为青鳉ltk基因的突变设计和F0靶位点的序列分析示意图；
确定靶位获得了序列的突变而导致了无背景荧光且腹部透明。
图2野生青鳉成鱼与获得的无背景荧光透明青鳉成鱼F1
其中，A为野生青鳉的成鱼(WT)；B为使用CRISPR/Cas9对ltk基因在靶序列突变后获得的可稳定遗传的无背景荧光透明青鳉成鱼F1(MT)。
具体实施方法
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
通过基因敲除获得无背景荧光透明的青鳉品系的方法:
1.1实验材料
野生型日本青鳉饲养于华中农业大学水产学院鱼房，水温28℃，光照周期亮：暗＝14:10。青鳉显微注射所用的胚胎由雌雄青鳉自然产卵获得。
1.2实验方法
确定青鳉ltk基因的sgRNA靶位点：
确定sgRNA靶位点1为：5’-TCACGGTGAATGCGAGATCAAGG-3’。
确定sgRNA靶位点2为：5’-GGGAGAGATGTCCACACCCTTGG-3’。
1.2.1体外合成sgRNA
以pMD19-T gRNA(Chang et al.2013)为模板，以带有T7启动子和特异性靶位点序列的上游引物(ltk_sgRNA1F 5’-TGTAATACGACTCACTATAGGtcacggtgaatgcgagatcaGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’)或(ltk_sgRNA2F 5’-TGTAATACGACTCACTATAGGgggagagatgtccacaccctGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’)与下游通用引物(sgRNA R 5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’)进行PCR扩增。PCR体系为：2×Power Taq PCR MasterMix(Bioteke，北京)10μL，上下游引物各1μL，pMD19-T gRNA模板1μL，无菌水7μL。反应条件为：94℃预变性3min，30个循环(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s)，72℃再延伸5min。吸取5μL PCR产物，用2％琼脂糖凝胶进行电泳。确认条带大小正确后，用OMEGA Gel Extraction Kit D2500胶回收试剂盒(Omega Bio-tek，美国)纯化回收PCR产物，并用Nanodrop 2000测定浓度(Thermo Scientific，美国)。使用TranscriptAid T7High Yield Transcription kit(Thermo Scientific，美国)试剂盒转录sgRNA，然后使用氯化锂沉淀法纯化回收sgRNA，具体操作如下：在转录后的样品中加入30μL氯化锂和30μL RNasefree H2O，充分混匀后置于-20℃过夜。4℃，20000g离心15min后移去上清，加入1mL70％乙醇(RNase free water配制)，重复一次。移去上清，小心吸取微量残夜，待干燥后加入约20μLRNase free water溶解。取出1μL测定RNA浓度，并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量后，分装置于-80℃保存待用，即为ltk_sgRNA1和ltk_sgRNA2。
1.2.2体外转录zCas9mRNA
pCMV-T7zCas9质粒(2017113815729)，使用Xba I(NEB，美国)限制性内切酶线性化该质粒并经过1％琼脂糖凝胶电泳确认线性化完全后用OMEGA Gel Extraction Kit(Omega，美国)纯化回收。根据T7mMESSAGEmMACHINE Kit(Ambion，美国)说明书体外转录zCas9mRNA，使用氯化锂沉淀法纯化回收zCas9mRNA，加入无酶水溶解并用Nanodrop 2000(Thermo Scientific，美国)测定浓度，通过1％琼脂糖凝胶电泳确认转录的mRNA质量后，分装置于-80℃保存待用。
1.2.3显微注射
注射前一天晚上，将野生型雌雄青鳉按比例配对并用隔板隔开，次日注射前30min抽出隔板使雌雄混合，自然产卵。20min后收集胚胎并用镊子去除胚胎表面丝状物，清洗后放入显微注射槽待用。将ltk_sgRNA1、ltk_sgRNA2和zCas9mRNA混合，配制注射样品，其中每个sgRNA的终浓度为50ng/μL，zCas9mRNA的终浓度为300ng/μL，并加入终浓度为0.1％的酚红作为指示剂。利用Picoliter Microinjector注射仪(Warner，美国)将实验样品注射到1细胞期的青鳉胚胎中。注射完成后将青鳉胚胎转移至MEM(medakaembryomedium)培养液(Yi,Hong et al.2010)中，置于28℃光照恒温培养箱中培养。
1.2.4检测靶位点突变率
随机选取10颗注射后72h的青鳉胚胎，混合，使用碱裂解法提取基因组DNA。碱裂解法步骤如下：将待裂解的青鳉胚胎置于1.5mL离心管中，用1x PBS洗两次，去除残余PBS，加入100μL溶液I(25mmol/L NaOH+2mmol/L EDTANa2)，将离心管置于95℃水浴锅中孵育30min，再置于冰上加入等体积的溶液II(40mmol/L Tris-HCl)涡旋混匀，10000g离心2min，取上清置于4℃待用。
用突变检测引物(ltk_g1ko F:5’-GCTGCTGATAGTCCTCACATG-3’,ltk_g2ko R:5’-TGCACACAACTGAAGGAGTC-3’)扩增包含两个靶位点的基因组DNA序列，反应体系如下：2×Power Taq PCR MasterMix(Bioteke，北京)10μL，上下游引物各1μL，基因组DNA模板1μL，无菌水7μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min，30个循环(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s)，72℃延伸5min。取3μL PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，条带大小验证正确后，将PCR产物送至公司测序(擎科生物技术有限公司，武汉)。根据PCR产物测序的峰形图PAM序列附近的套峰，初步判断靶点能有效产生突变。
1.2.5 F0突变体的筛选和无荧光背景F1的获得
青鳉胚胎色素形成后，能通过在体式荧光显微镜下观察荧光是否缺失来初步判断ltk基因的突变情况。待无背景荧光的F0青鳉长至2cm左右时，选取4条成鱼，剪取适量尾鳍，置于1.5mL离心管中，通过碱裂解法提取基因组DNA。用突变检测引物扩增包含ltk靶位点的DNA片段并送公司测序(擎科生物技术有限公司，武汉)，测序结果显示4条鱼的基因组在PAM序列附近均有明显的套峰(图1)
将上述PCR产物切胶回收纯化后连入pMD18-T(TaKaRa，中国)载体中，各挑取4个阳性克隆送到公司测序(擎科生物技术有限公司，武汉)。分析每个克隆的序列，与野生正常的基因序列相比较，分析突变后的靶序列附近的实际基因序列，确定ltk基因的突变类型。
对比脑部及体表色素正常的有荧光的野生型胚胎，挑选出无背景荧光的F0代胚胎培养成成鱼亲本，F0代多为杂合子，而且突变体在发育至成鱼时体表色素正常。通过F0代突变体亲本杂交产生F1胚胎。培养观察F1胚胎，其后代均为无背景荧光，但是体表色素的缺失情况有多种类型，筛选出无背景荧光且色素缺失的F1胚胎继续培养(图2)，对比具有背景荧光且色素完整的野生型青鳉成鱼。通过以上实验，我们可以确定出ltk基因为显性基因且自然界中存在野生的杂合子，我们通过对野生杂合子的敲除即可获得稳定遗传的后代。通过测序分析，无背景荧光的品系来自两种突变体，与野生型(SEQ ID NO.5)相比，靶序列附近的序列突变为(SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4)所示序列，导致移码突变。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> ltk基因在制备日本青鳉无背景荧光透明品系中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcacggtgaa tgcgagatca agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggagagatg tccacaccct tgg 23
<210> 3
<211> 473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctgctgata gtcctcacat gaggccattt ttcaggctgt ttttacttca tcaacatgaa 60
atgttttcat aaatacatac attgttcctt tcagcaatgg agggtcacgg tgaatgcgag 120
atcaaggtgc agctcaactg cagccactgt aagacacaaa gctgcaagcg agaagaggag 180
agccacttcc tcctctgcgt ctgtgaagac gatgaattcc tggccagtga caatgtcaca 240
tgcatcagtg ctgcaggtac actactggca ttttgtgatg aacatcagct gcaatgtaat 300
taatacgtct gataagttaa aatctcattt tactcaatgc accttcccaa gctgcacccc 360
caaagggaga gatgtccttg gtcctggccg tcgttgtttc cacggttgtg agcggcgttg 420
ctctcgtctg taccggcatc atcctcagta agagactcct tcagttgtgt gca 473
<210> 4
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctgctgata gtcctcacat gaggtcattt ttcagactgt ttggacatcc tggccgtcgt 60
tgtttccacg gttgcgagcg gcgttgctct cgtctgtacc ggcatcatcc tcagtaagag 120
actccttcag ttgtgtgca 139
<210> 5
<211> 479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgctgata gtcctcacat gaggtcattt ttcagactgt ttttacttca tcaacatgaa 60
atgttttcat taatacatac attgttcctt tcagcaatgg agggtcacgg tgaatgcgag 120
atcaaggtgc agctcaactg cagccactgt aagacacaaa gctgcaagcg agaagaggag 180
agccacttcc tcctctgcgt ctgtgaagac gatgaattcc tggccagtga caatgtcaca 240
tgcatcagtg ctgcaggtac actactggca ttttgtgatg aacatcagct gcaatgtaat 300
taatacgtct gataagttaa aatctcattt tactcaatgc accttcccaa gctgcacccc 360
caaagggaga gatgtccaca cccttggtcc tggccgtcgt tgtttccacg gttgcgagcg 420
gcgttgctct cgtctgtacc ggcatcatcc tcagtaagag actccttcag ttgtgtgca 479
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctgctgata gtcctcacat g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcacacaac tgaaggagtc 20
Claims (1)
1.SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列在制备日本青鳉（ Oryzias latipes ） 无背景荧光透明品系中的应用，其应用包括：采取CRISPR/Cas9的方式，以SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示序列为靶位点对日本青鳉进行基因编辑，获得的无背景荧光透明品系亲本，通过F0突变体杂交产生F1代胚胎，筛选出无背景荧光并腹部透明的小鱼继续培养，获得无背景荧光并腹部透明稳定遗传的日本青鳉，获得的日本青鳉无背景荧光透明品系中含有SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示的基因序列。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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