CN110129269B - 一种rff2细胞的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开提供了一种RFF2细胞的构建方法，属于生物技术领域。本发明公开用于构建一种攻防兼顾、具有特异性杀伤作用的特异性T细胞，即一种用于细胞免疫治疗的RFF2细胞，精准性好、杀伤率高。所述构建方法包括以下步骤：PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；冲击后扩大培养，以得到FF细胞；以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激该FF细胞以筛选精准多肽；以精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，用精准多肽进行多次冲击；冲击后继续培养，得到RFF细胞；用PD1等抗体对所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子体外封闭，以得到RFF2细胞。所述构建方法可用于细胞免疫治疗技术。

Description

一种RFF2细胞的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RFF2细胞的构建方法。

背景技术

肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，它从病人体内采集免疫细胞，然后进行体外培养和扩增，再回输到病人体内，来激发以及增强机体的自身免疫功能以***。肿瘤细胞免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。

正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以替代受损细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。

生物工程改造过的细胞用特殊方法在体外培养过程中加以改造，可提高其杀伤性，有效杀除患者体内肿瘤细胞。如，中国专利申请CN201210194280.5提供了一种人细胞因子诱导的杀伤细胞。中国专利申请CN201510034781.0提供一种肿瘤细胞特异性多克隆T细胞。中国专利申请CN201510013987.5提供一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。中国专利申请CN201711060030.1提供一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR-T细胞及其制备方法和应用。中国专利申请CN201610824893.0提供一种抗体调控的双抗原特异性T细胞及其制备方法和应用。

发明内容

本发明旨在提供一种RFF2细胞的构建方法，以便构建一种新的用于细胞免疫治疗的特异性T细胞(命名为RFF2细胞)。通过联合多肽冲击和细胞体外扩增、体外封闭，提供一种具有特异性杀伤作用、攻防一体的T细胞，解决了免疫细胞在细胞免疫治疗中攻防不能兼顾的问题，精准性好、杀伤率高。

本发明提供一种RFF2细胞的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；

S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；

S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；

S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次冲击；

S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；

S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。

进一步地，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，得到FF细胞包括：将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；

培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；

培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。

进一步地，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。

进一步地，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。

进一步地，步骤S4中，将负载精准多肽后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用所得精准多肽进行多肽冲击，冲击时间1～4h；

转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置(培养板或培养瓶)中继续培养，每隔3～4天再次用所确定的精准多肽进行多肽冲击，冲击时间1～4h。

进一步地，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：

1)外显子测序

对肿瘤细胞进行全外显子测序；

将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；

2)抗原表位预测

以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，得到一段21个氨基酸的多肽，以此作为潜在抗原表位；

IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；

3)合成多肽

采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。

进一步地，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323 B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子***细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。

进一步地，步骤S6中，将步骤S5所得RFF细胞以OKM-200+5％FBS进行重悬，而后加入终浓度为50～200μg/mL的单抗药，对RFF细胞的免疫抑制性信号分子进行封闭。

进一步地，步骤S6中，将步骤S5所得RFF细胞先用磷酸盐缓冲液洗一次，1000rpm离心5min，而后以OKM-200+5％FBS进行重悬。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供一种新的用于细胞免疫治疗的特异性T细胞，即RFF2细胞，是一种攻防兼备的超级T细胞。本发明通过筛选出有效的精准多肽并将其对PBMC细胞进行二次多肽冲击，得到更有特异杀伤作用、攻防一体的T细胞。

现有技术中，一般是通过DC细胞递呈T细胞，产生特异杀伤的T细胞；或者用病毒做为载体，通过慢病毒转染技术诱导T细胞的特异性杀伤。在本发明中，通过二次多肽冲击技术诱导T细胞的特异性杀伤。首先第一次多肽冲击，用混合多肽直接刺激PBMC细胞；而后筛选精准多肽；再以精准多肽刺激PBMC，并在共培养过程中对PBMC细胞进行多次刺激。通过多次刺激将普通T细胞改造成为具有更精准的杀伤能力的超级T细胞。相比慢病毒转染，简单方便、安全性高。在本申请中，联合多肽冲击和体外扩增，提高T细胞对复杂的肿瘤微环境的适应力。本申请中，联合抗体药物体外封闭防护技术对免疫抑制性信号分子进行体外封闭，在不降低T细胞杀伤力的基础上提高了其自身防护能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了本发明实施例所述RFF2细胞的构建方法的流程示意图；

图2示出了抗原负载效率检测；

图3示出了精准多肽筛选结果；

图4示出了流式检测特异性T细胞比例；

图5示出了免疫抑制性信号分子封闭情况；

图6示出了RFF2细胞对肿瘤的杀伤能力；

图7示出了RFF2细胞对细胞因子IFN-γ的释放；

图8示出了荷瘤小鼠生存曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明实施例提供一种RFF2细胞的构建方法，用于构建一种用于细胞免疫治疗的特异性T细胞，命名为RFF2细胞。所述方法包括以下步骤：

S1)PBMC细胞(peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞)负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；

S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；

S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；

S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次多肽冲击；

S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；

S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGHT、2B4(CD244)。

本文中，“RFF2”细胞为本发明实施例最终所要获得的细胞，即通过联合混合多肽技术、精准多肽二次冲击技术、抗体药物体外封闭防护技术(RFF2方案)由普通T细胞改造得到的攻防兼备、具有特异性杀伤作用的特异性T细胞。“FF”细胞表示由FF方案(没有经过精准多肽二次刺激)得到的T细胞。“RFF”细胞表示由RFF方案(联合混合多肽技术和精准多肽二次冲击技术)得到的T细胞。其中，“R”代表多肽二次冲击技术；“FF”代表混合多肽技术，“2”表示体外封闭防护技术。

本发明实施例提供了细胞构建方法，构建了一种用于细胞免疫治疗的T细胞，筛选出了真正有效的精准多肽，并用其对PBMC细胞进行二次多肽冲击，得到了攻防兼备、具有特异性杀伤作用的特异性T细胞。

在步骤S1之前，所述致肿瘤突变的多肽可以由以下方法合成得到：对肿瘤细胞进行全外显子测序，将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；

以突变的氨基酸位点为中心预测抗原表位；

采用多肽固相合成法合成突变多肽。

进一步地，所述抗原表位的预测是以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，以一段21个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位作为潜在抗原表位。

具体地，所述致肿瘤突变的多肽的合成方法可以包括以下3步：1)外显子测序；2)抗原表位预测；3)合成多肽。

1)外显子测序

使用肿瘤细胞进行全外显子测序，而后利用软件对测序信息进行分析，一方面得到MHC类型信息；另一方面，将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点。

肿瘤细胞可以来源于工程细胞系，也可以来源于患者外周血。

工程细胞系可以包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子***细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。

2)抗原表位预测

在抗原表位预测中，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”。使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan 3.0、PickPocket、artificial neural networks(ANN))。若IC50＜1000nM则将此潜在抗原表位认定为“抗原表位”。

3)合成多肽

采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。

在步骤S1中，用致肿瘤突变的多肽对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击，直接刺激负载多肽后的PBMC细胞，进行第一次刺激。

具体地，PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击具体可以为：

以RPMI 1640+10％FBS(胎牛血清)或OKM100+12％FBS溶解混合多肽，多肽的终浓度为10～100μg/mL，优选50μg/mL，以此进行多肽冲击。

进一步地，多肽冲击的时间可以为1～4h，例如可以1h、3h、或4h，优选可以为4h。

在步骤S2中，冲击后扩大培养以得到FF细胞。将多肽冲击后的PBMC细胞与细胞刺激因子OKM-25共培，以得到FF细胞。

步骤S2具体可以为：

将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；

培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；

培养一段时间后再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。

具体而言，扩大培养后可得到FF细胞组合物。通过离心可从所述FF细胞组合物中分离提取T细胞(即FF细胞)。

步骤S3中，以多肽作为抗原直接刺激T细胞以筛选精准多肽。

精准多肽的筛选标准为：

以FF细胞作为基线；两个独立重复，检测值高的为高基线，低的为低基线；

两个基线的差异为***误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+***误差的，分别进行标注；检测值>高基线+***误差即为有效的精准多肽。

步骤S3具体可以包括：

1)离心所获得的FF细胞组合物，1500rpm离心5min收集T细胞，加入10mL PBS重悬细胞并计数，1500rpm离心5min，收集T细胞以1640+10％FBS+200U/mL IL2重悬，计数调整至1×10⁶个/mL；

2)以排枪将T细胞分至96孔平底板中，200μL/孔，细胞数为2×10⁵个；再分别加入1mg/mL的突变多肽10μL，终浓度为50μg/mL，每条多肽设置3复孔；

3)设置阳性对照：T细胞+100ng/mL OKT3(CD3单克隆抗体)；阴性对照：RPMI 1640+10％FBS+200U/mL IL2(白细胞介素2)；两个T细胞对照作为本底释放检测，分别为第一次加T细胞，和最后一次加T细胞；以两个本底释放的差异作为***误差；

4)37℃、5％CO₂刺激24h后，1500rpm离心10min，转移140μL上清至新的96孔板中；

5)再将96孔板进行离心，1500rpm 10min，取样品进行ELISA(酶联免疫吸附测定)检测(或将样品至于-80℃保存)；

6)筛选精准多肽：

多肽作为抗原的以FF细胞作为基线；

每组实验为两个基线，高基线和低基线，两个基线的差异为***误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+***误差的，分别进行标注；检测值>高基线+***误差即为有效的精准多肽。

步骤S4中，以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，用精准多肽进行多次多肽冲击，进行第二次刺激。通过两次刺激将普通T细胞改造成为具有更精准的杀伤能力的超级T细胞。

相比步骤S1，在步骤S4中采用加量的精准多肽冲击。也就是说，在该步骤中对PBMC细胞进行多次多肽冲击刺激。具体可以重复多肽冲击3～4次。

培养过程中，培养方案近似于步骤S2中负载多肽后的PBMC细胞的扩大培养。先在预铺细胞刺激因子OKM-25的装置中培养一段时间，而后依次转移至OKM-100+12％FBS培养基、OKM-200+5％FBS培养基中继续培养。通过联合多肽冲击和体外扩增，提高T细胞对复杂的肿瘤微环境的适应力。

具体可以包括如下步骤：

将负载精准多肽的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用所确定的精准多肽进行多肽冲击，冲击时间可以为1～4h；

转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置(培养板或培养瓶)中继续培养，每隔3～4天再次用所确定的精准多肽进行多肽冲击，冲击时间可以为1～4h。

步骤S5中，冲击后继续培养，得到RFF细胞。适用的培养基可以为OKM200+5％FBS。步骤S4之后，多肽冲击后转移至含有培养液OKM200+5％FBS的装置中继续培养，37℃、5％CO₂下培养。

步骤S6中，用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGHT、2B4(CD244)。

一实施例中，将步骤S5所得RFF细胞以OKM-200+5％FBS重悬，而后加入终浓度为50～200μg/mL、优选50～150μg/mL的单抗药如PD-1抗体等，对RFF细胞的免疫抑制性信号分子进行封闭。

又一实施例中，将步骤S5所得RFF细胞先用PBS(磷酸盐缓冲液)洗一次，1000rpm离心5min，而后以OKM-200+5％FBS进行重悬，可以重悬至1×10⁷个/mL。而后加入终浓度为50～200μg/mL、优选150μg/mL的单抗药，0～37℃封闭1～4h，优选37℃封闭1h。

本发明公开中，在RFF细胞的基础上，采用少量的单抗药进行体外自我封闭操作，在不降低特异性T细胞杀伤力的基础上提高了其自身防护能力。

本发明在体外构建了一种新的RFF2细胞(由普通细胞改造后得到的攻防兼备的超级T细胞)。在本发明方法中，筛选出真正有效的精准多肽并用其对PBMC细胞进行二次冲击，得到更有特异杀伤作用的RFF2细胞，杀伤效率更高。在本发明方法中，通过抗体药物体外封闭防护以及体外扩增，提高了所得RFF2细胞对患者体内的复杂的肿瘤微环境的适应能力。

下文进一步对本发明实施例所述的RFF2细胞的构建方法进行详述。

(一)全外显子测序

1)使用LLC小鼠Lewis肺癌细胞进行全外显子测序；

2)利用软件对测序信息进行分析：一方面得到MHC类型信息；另一方面，将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点。

(二)抗原表位预测

1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；

2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan 3.0、PickPocket、artificial neural networks(ANN))，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为“抗原表位”。

(三)合成多肽

抗原表位肽合成方法采用多肽固相合成法

1)锚定：把第一个氨基酸锚定在固相树脂上；

2)去保护：保护的氨基酸使用碱性溶剂去除氨基的保护基团；

3)活化：使用活化剂活化待连接的氨基酸羧基；

4)键联：活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应，形成肽

5)重复步骤2-4，使整条抗原表位肽链完全合成。

(四)PBMC负载突变多肽

1)配制多肽溶液：以1640+10％FBS或OKM100+12％FBS溶解多肽，每条多肽的终浓度为50μg/mL，备用；

2)PBMC提前1天复苏，吹打细胞，吸取15mL，并计数，离心；

3)以配制的多肽溶液将PBMC重悬，并至于细胞培养板中进行冲击；

4)37℃5％CO₂，冲击4h，备用。

(五)PBMC经多肽冲击后的扩大培养

1)刺激因子OKM-25预铺板，40μL OKM-25+4mL PBS，2mL/皿(4.5cm²)室温4h，4℃备用；

2)将冲击后的PBMC转移至预铺OMK25的培养瓶中；

3)晃匀，37℃5％CO₂培养，记为第0天；

4)观察共培养细胞情况，根据细胞密度，在第5天，将细胞转移至大培养瓶中，补新鲜的培养液OKM-100+12％FBS，20mL于75cm²培养瓶中；

5)共培养第7天，再加入20mL新鲜OKM-100+12％FBS；

6)共培养第10天，培养液为OKM-200+5％FBS，将共培养细胞从75cm²瓶中那个转移至175cm²大瓶中；

7)25mL培养液OKM-200+5％FBS吹打，再转入大瓶，重复2次；以培养液OKM-200+5％FBS补足至200mL；

8)培养至14-21天时，即可获得FF细胞组合物。

(六)多肽作为抗原直接刺激T细胞筛选精准多肽：

1)FF细胞组合物中的T细胞即为FF方案得到的T细胞(FF细胞)。离心收集获得的FF细胞组合物，1500rpm离心5min收集T细胞，加入10mL PBS重悬细胞并计数，1500rpm离心5min，收集T-cells以1640+10％FBS+200U/mL IL2重悬，计数调整至1×10⁶cells/mL；

2)以排枪将FF细胞分至96孔平底板中，200μL/孔，细胞数为2×10⁵cells；再分别加入10μL 1mg/mL的突变多肽，终浓度为50μg/mL，每条多肽设置3复孔；

3)设置阳性对照：T细胞+100ng/mL OKT3；阴性对照：1640+10％FBS+200U/mL IL2；两个T细胞对照作为本底释放检测，分别为第一次加T细胞，和最后一次加T细胞；以两个本底释放的差异作为***误差；

4)37℃、5％CO₂刺激24h后，1500rpm离心10min，转移140μL上清至新的96孔板中；

5)再将96孔板进行离心，1500rpm 10min，取样品进行ELISA检测(或将样品至于-80℃保存)。

(七)精准多肽评判标准：

1)阳性对照和阴性对照正常，则说明此数据可信；

2)多肽作为抗原的以T细胞作为基线；

3)每组实验为两个基线，高基线和低基线，两个基线的差异为***误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+***误差的，分别进行标注；检测值>高基线+***误差即为有效的精准多肽。

(八)以筛选的精准多肽制备RFF细胞

1)负载精准多肽的PBMC以FF细胞组合物培养方案进行培养(刺激因子OKM-25预铺板，40μL OKM-25+4mL PBS，2mL/皿(4.5cm²)室温4h，4℃备用；培养条件37℃、5％CO₂)至第2天至第14天时，优选第3天，进行精准多肽的再冲击；

2)取2×10⁷的T细胞，加入终浓度为50μg/mL的多肽，冲击4h；

3)冲击4h后，转入25cm²培养瓶，补OKM100+12％FBS，37℃5％CO₂培养，根据细胞生长情况，转移至75cm²培养瓶中，尽量保持细胞密度在1×10⁶个/mL；

4)在培养第7天、第10天和第14天时，重复精准多肽冲击即重复步骤2)和3)；

5)细胞进入175cm²培养瓶中时，培养基为OKM200+5％FBS，培养10～21天即可得到精准多肽二次冲击得到的T细胞，即RFF细胞。

(九)免疫抑制性信号分子的封闭

1)培养好的RFF细胞，1000rpm离心5min；

2)以PBS洗一次，1000rpm离心5min，以OKM-200+5％FBS重悬TCR-T，并调整至1×10⁷/mL；

3)加入抑制性信号分子的单抗药PD1抗体，终浓度为150μg/mL，37℃封闭1h，得到RFF2细胞。

(十)荷瘤小鼠生存实验

1)取肿瘤细胞系接种NSG小鼠，做异位荷瘤动物模型。将5×10⁵表达特异性抗原的肿瘤细胞悬于100μL生理盐水中，分别皮下注射至30只NSG小鼠的右侧胁肋部皮下，同时对小鼠进行编号。

2)在肿瘤生长至100-120mm³左右时分组回输细胞，根据肿瘤体积大小，将动物模型随机分成三组，每组5只小鼠，一组给予安慰剂生理盐水，一组给予没有进行任何遗传操作的T细胞(对照组)1×10⁷，一组给予RFF2细胞1×10⁷，首次注射细胞7天后进行第二次注射，7天之后第三次注射细胞，连续观察50天，统计存活数据，绘制生存曲线。

实验结果

1.突变位点及抗原表位预测

表1为测序检测到的突变位点及抗原表位预测结果，下划线标出的为突变的氨基酸。

表1抗原表位预测

2.抗原负载效率检测

根据表1合成预测的突变抗原，并进行生物素的标记，抗原负载PBMC后，以PE标记的亲和链霉素检测生物素在细胞表面的分布情况，以检测PBMC提成多肽抗原的效率；结果如图2——抗原负载效率检测所示：a为没有负载标记多肽的检测结果，b为负载生物素多肽的检测结果，结果表明：PBMC的负载效率为70.6％(FL2-H subset 7.06％表示PI染剂所染到的细胞占70.6％)。

3.筛选精准多肽

如图3所示，以12条多肽分别刺激培养的FF细胞，通过检测IFN-γ的分泌，检测有效的多肽，结果如图2所示：2号、6号和12号多肽引起的IFN-γ的释放量>高基线+***误差，属于有效精准多肽。

4.流式检测特异性细胞比例

以筛选的12号多肽，在FF细胞基础上进行多次刺激，培养后，以流式检测对精准多肽特异性的T细胞比例，结果如图4所示，方框内为特异性T细胞。同时以流式细胞仪(FACSCaliburTM(BD Biosciences))进行CD8+IFN-γ+细胞(方框内)的分选。

5.免疫抑制性信号分子封闭效果

如图5所示，99.2％的细胞均可以得到封闭。

6.RFF2细胞对靶细胞的杀伤作用

分别以RFF细胞和RFF2细胞对突变抗原表位来源的靶细胞进行杀伤效率的检测，以无处理的细胞作为对照(Mock)，效应细胞：靶细胞＝40：1；以流式检测细胞凋亡(TransDetect Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒)，结果如图6所示，黑色框内的为凋亡的细胞，与对照组相比，RFF细胞和RFF2细胞对靶细胞均有一定杀伤效果，且RFF2细胞对肿瘤的杀伤作用＞RFF细胞。

7.RFF2细胞释放细胞因子的检测

以多肽刺激效应细胞时，由于效应细胞，可以识别突变抗原，因此，会产生一系列的细胞因子，IFN-γ是抗肿瘤作用中最主要的细胞因子之一，图7为不同培养方式细胞，经多肽刺激后，释放的IFN-γ的检测，结果表明：与效应T细胞自身(T-cell only)产生的IFN-γ相比，RFF细胞和RFF2细胞均可产生大量的IFN-γ，特别是RFF2细胞，效应细胞可释放更多的IFN-γ，此结果与杀伤实验结果一致，说明抑制性靶点的封闭可以更有效的提高抗肿瘤能力。

8.荷瘤小鼠生存实验

结果如图8所示，回输本发明实施例的RFF2细胞对肿瘤荷瘤小鼠的生存改善具有显著影响作用。

9.临床案例

给药过程：

第一疗程：每个月一次RFF2细胞，数量1×10⁹个细胞，共2次；

第二疗程：每半年一次RFF2细胞，数量1×10⁹个细胞，共2次。

表2

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种RFF2细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法用于构建一种用于细胞免疫治疗的RFF2细胞，所述方法包括以下步骤：

S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；

其中，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：

对肿瘤细胞进行全外显子测序；

将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；

以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，以一段21个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位作为潜在抗原表位；

采用多肽固相合成法合成突变多肽；

S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；

S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽，其中，所述精准多肽评判标准为：以FF细胞作为基线，设置两个独立重复，检测值高的为高基线，检测值低的为低基线；两个基线的差异为***误差；检测值>高基线+***误差的实验组即为有效的精准多肽；

S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次多肽冲击；

S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；

S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子的封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。

2.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，步骤S3中，精准多肽的筛选标准为：

以FF细胞作为基线，设置两个独立重复，检测值高的为高基线，低的为低基线；

两个基线的差异为***误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+***误差的，分别进行标注；检测值>高基线+***误差即为有效的精准多肽。

3.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。

4.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。

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