CN110129258B - 一种含有紫云英苷的组合物及其应用 - Google Patents
一种含有紫云英苷的组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是一种改善人***受精能力和顶体反应的含有紫云英苷的组合物，该组合物包括缓冲液和紫云英苷。对离体后纯化的人***进行培养，除了维持***运动还能显著提高正常人***的受精能力和顶体反应，为改进辅助生育技术提供了有意义的参考。在缓冲液中加入紫云英苷，能够显著提高临床弱***症患者***的受精能力，在重度弱***症时受精能力改善程度最为明显，并且使部分培养的***受精能力达到正常***受精能力范围，其中对重度弱***症改善程度最为明显，同时，显著提高***顶体反应。这充分说明紫云英苷的使用能够改善弱精症患者***的受精能力低下。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有紫云英苷的组合物，具体涉及一种提高体外培养***受精能力的组合物及其应用。
背景技术
世界卫生组织80年代中末期组织的一次有关***症调查表明，***率发达国家为5%～8%，发展中国家的某些地方甚至达到30%。据不完全统计，中国育龄夫妇中***症患者约占2%～6%，且还有逐渐增加的趋势。人类辅助生殖技术出现，逐步解决了困扰医学界多年的***不育难题，给无数家庭带来了喜悦。人类辅助生殖技术是指利用处理卵子、***、受精卵以及胚胎以治愈不能怀孕症状的技术。目前主要包括宫内受精、体外受精－胚胎移植、人工授精、卵子体外成熟、卵胞浆单***注射、卵子、***以及胚胎冻融技术、移植前遗传学诊断等。然而，这些技术均涉及到***的体外培养和操作，在体外培养和操作的过程中，维持甚至提高***的功能对于提高辅助生殖的成功率有着重要的作用。
体外授精－胚胎移植技术 （in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）目前已广泛应用于***不育的治疗，其中胚胎培养对胚胎生长与妊娠结局有重要影响。早期胚胎的体外培养受许多因素的影响,主要影响因素有配子因素、控制性超促***方案及药物剂量、实验室操作环境、培养***等。而培养液不同营养成分和pH值变化等可对配子、体外受精和胚胎培养结局产生不同影响。目前商品化的培养基主要有Vtrolife、Cook、Quinn’s 和 HTF等。目前已有比较各种商业化的成品培养基、半成品培养基和改良培养基对胚胎生长和妊娠结局影响的报道。IVF过程中存在受精失败的风险，尤其是在少弱精患者当中。提高受精能力培养基暂时还没有成熟产品。
***的各种功能状态反应了***的受精能力。***活力是指***群体运动状态与寿命长短，是反映***质量的重要指标。***活力的评价是研究***生理特性、***受精、***保存等的基础。***活力与受精率呈正相关，活力越高***受精能力越强。目前，临床上主要依据***浓度、活力、形态等参数来初步判断男性的生育能力。早有学者提出人类***的顶体形态及功能与临床妊娠率相关。顶体是一个膜包裹的细胞器，储存着顶体反应的各种酶。顶体反应是***与卵透明带结合之后，顶体破裂，释放一系列***的过程。顶体反应是受精的先决条件，只有完成顶体反应的***才能与***融合，实现受精。因此，本发明使用计算机辅助***分析仪CASA，对***活力进行评估；使用FITC-PSA染色对***顶体的完整性进行评估，以***活力和***顶体反应作为评价***受精能力的指标。
紫云英苷（Astragalin）是一种天然黄酮醇苷类化合物，具有利胆、利尿、抗氧化的的作用。研究发现菟丝子的水提取物具有抗氧自由基活性; 对羟自由基及超氧阴离子自由基均有良好的清除作用，可能抑制***尾部膜脂质过氧化反应，可能对***膜结构和功能起保护作用，菟丝子可能有益于治疗男性不育，并可能有助于提高人工授精的成功率。但是，由于菟丝子水提取物成分复杂，菟丝子水提物含有蒽醌、香豆素、黄酮、甙类、甾醇、鞣酸、糖类等，难以受到国际认可，因此，寻求成分单一、功效明确的化合物用于改善***活力和提高人***顶体反应是本领域需要解决的技术难题。
本发明公开了紫云英苷的新医药用途，还提供了一种含有紫云英苷的组合物及其应用。在缓冲液中加入紫云英苷，能够显著提高临床弱***症患者***的受精能力，尤其是重度弱***症患者的***受精能力改善程度最为明显，并且使部分培养的***受精能力达到正常***受精范围，同时，显著提高***顶体反应。这充分说明紫云英苷的使用能够改善弱精症患者***的受精能力低下的作用。因此开发一种能显著提高***受精能力的含有紫云英苷的组合物，显著增加受精率、优质胚胎率和IVF成功率，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是发现了紫云英苷的新医药用途。
本发明还提供了一种提高体外培养***受精能力的含有紫云英苷的组合物及其应用，对不同运动能力的人类***培养结果表明，***顶体反应与运动能力均有显著的提高，即***受精能力有显著提高。
一种含有紫云英苷的组合物，该组合物包括紫云英苷和缓冲液。
优选地，所述缓冲液是pH在7.0以上的多种缓冲溶液：磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硫酸钠缓冲溶液、PBS缓冲溶液、hepes缓冲溶液等，也可以是商品化的IVF培养基。
优选地，所述缓冲液由以下组分组成：NaCl，NaHCO3，KCl，MgSO4·7(H2O)，KH2PO4，丙酮酸钠，乳酸钠和CaCl2·2(H2O)。
优选地，每升缓冲液由以下重量份配比的组分组成：5.5-6.0gNaCl, 2.0-2.5gNaHCO3, 0.3-0.4gKCl, 0.04-0.06g MgSO4·7(H2O), 0.04-0.06g KH2PO4，0.035-0.04g丙酮酸钠，3.8-4.0g乳酸钠，0.28-0.35g CaCl2·2(H2O)和0.045g/L的紫云英苷，余量用超纯水定容至1000mL。
本发明也公开了含有紫云英苷的组合物在制备提高***活力和提高人***顶体反应的人***保护剂中的应用。
本发明公开了含有紫云英苷的组合物在制备提高弱***症患者的***活力的人***保护剂中的应用。
本发明公开了紫云英苷在制备提高***活力和提高人***顶体反应的人***保护剂中的应用。
本发明公开了紫云英苷在制备提高弱***症患者的***活力的人***保护剂中的应用。
本发明公开了紫云英苷在制备提供弱***症患者的***活力的IVF培养基中的应用。体外受精时，弱***症患者IVF体外受精可能失败。因此，在IVF培养基中加入紫云英苷提高IVF时受精率。
本发明公开了紫云英苷在制备提高***活力和提高人***顶体反应的药物中的应用。
优选地，添加紫云英苷的组合物培养时间在1-3h。
优选地，所用***为离体之后去除***的人***。
有益效果：
1．本发明改善人***受精能力的一种添加紫云英苷的组合物，所述中药单体是紫云英苷，在缓冲液中添加紫云英苷，对离体后的人***进行培养，能够改善***顶体反应与运动能力继而显著提高人***受精能力，为改进辅助生育技术提供了有意义的参考，可有有效的降低IVF过程中受精失败的风险，提高IVF成功率。
2.本发明中的紫云英苷是直接用缓冲液进行稀释和培养的，不涉及乙醇等有机溶剂，避免了乙醇对***的毒害作用。
3.本发明中，在缓冲液中加入的紫云英苷，能够显著提高临床弱***症患者***的受精能力，在重度弱***症时受精能力改善最为明显，并且使部分培养的***受精能力达到正常***受精能力范围，其中对重度弱***症改善程度最为明显，同时***的顶体反应也有显著提高。这充分说明紫云英苷的使用具有改善弱***症患者***受精能力低下的作用。
与现有技术相比，本发明将紫云英苷添加到缓冲液中并筛选出紫云英苷与缓冲液的配比关系，制备出性能优异的组合物，该组合物可以有效改善***活力，提高***顶体反应。该组合物能够显著提高临床弱***症患者***的受精能力，在重度弱***症时受精能力改善最为明显，并且使部分培养的***受精能力达到正常***受精能力范围，其中对重度弱***症改善程度最为明显。
本发明还发现了紫云英苷的新医药用途，即紫云英苷可以有效改善***活力，提高***顶体反应，能显著提高临床弱***症患者***的受精能力，其中对重度弱***症改善程度最为明显。
附图说明
图1是F10-含有紫云英苷的组合物对重度弱***症的***活力的作用图
图2是F10-含有紫云英苷的组合物对轻度弱***症的***活力的作用图
图3是 F10-含有紫云英苷的组合物对正常***的***活力的作用图
图4是F10-含有紫云英苷的组合物对不同运动能力的***顶体反应的作用图
图示说明：X-轴是缓冲液（C）和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物；Y-轴是***的活力（Progressive motility,以百分比计数）和***顶体反应（Acrosomereaction, 以百分比计数）。*表示p< 0.05，F10-含有紫云英苷的组合物培养后的***活力与缓冲液相比，有显著性差异，具有统计学意义。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所使用的试剂和材料均购于上海榕柏生物技术有限公司。
实施例1 F10-含有紫云英苷的组合物对重度弱***症的***活动力的提高效果评估
样品制备
选择重度弱***症患者的***样本进行实验。***法***，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的***样本。将样本水浴保持22-33℃，液化后的***，根据WHO1999年的评价标准，使用电脑辅助***分析仪CASA，对***参数（体积，***计数，活力和运动特性的百分比）进行评估。弱***症被定义为A级***数目＜25%或A+B＜50%，（世界卫生组织，1999年），而所有其他参数都是正常。根据形态学观察排除含白细胞或者体细胞污染的标本。重度弱***症***的运动参数为（a+b）级＜25%，其中a级***＜5%。
2.***体外培养
（1）密度梯度离心从***当中分选***
在试管内放置1mL 60% （v/v）的Percoll分离液，在其上铺上1mL -1.5mL的***，300g的离心力下离心5-10分钟，弃去上清液。重悬***悬液于2mL HTF-S培养液，300g离心5-10分钟，重复该步骤一次。将***悬液轻轻转移到实验所用到各种***培养液中。
（2）***培养
合适数量的***（5×106左右）转移到各种***培养液中之后，置于37℃，5%CO2的培养箱中1-3小时。
| 组分 | g/L |
| NaCl | 5.9 |
| NaHCO<sub>3</sub> | 2.1 |
| KCl | 0.35 |
| MgSO<sub>4</sub>7(H<sub>2</sub>O) | 0.05 |
| KH<sub>2</sub>PO4 | 0.05 |
| 丙酮酸钠 | 0.036 |
| 乳酸钠 | 3.998 |
| CaCl<sub>2</sub>2(H<sub>2</sub>O) | 0.294 |
| 紫云英苷 | 0.045 |
3.***活动力检测
根据WHO1999年的评价标准，使用计算机辅助***分析仪CASA，对***活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的***数目不小于500个。
最终结果：本发明中重度弱***症患者的***样本分别在对照组-F10缓冲液（C）和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中培养后，测定***活力发现，在不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中的***活力均显著高于对照组，这表明在缓冲液中添加紫云英苷能有效提高重度弱***症的***活力，这也表明F10-含有紫云英苷的组合物中的***受精能力要显著高于对照组（图1）。
实施例2 F10-含有紫云英苷的组合物对中轻度弱***症的***活动力的提高效果评估
1. 样品准备
选择中轻度弱***症患者的***样本进行实验。***法***，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的***样本。将样本水浴保持22-33℃，液化后的***，根据WHO1999年的评价标准，使用电脑辅助***分析仪CASA，对***参数（体积，***计数，活力和运动特性的百分比）进行评估。弱***症被定义为A级***数目＜25%或A+B＜50%，（世界卫生组织，1999年），而所有其他参数都是正常。根据形态学观察排除含白细胞或者体细胞污染的标本。重度弱***症***的运动参数为（a+b）级＜25%，其中a级***＜5%。
2. ***体外培养
（1）密度梯度离心从***当中分选***。
在试管内放置1mL 60%（v/v）的Percoll分离液，在其上铺上1mL -1.5mL的***，300g的离心力下离心5-10分钟，弃去上清液。重悬***悬液于2mL HTF-S培养液，300g离心5-10分钟，重复该步骤一次。将***悬液轻轻转移到实验所用到各种***培养液中。
（2）***培养
合适数量的***（5×106左右）转移到各种***培养液中之后，置于37℃，5%CO2的培养箱中1-3小时。
3. ***活动力的检测
根据WHO1999年的评价标准，使用计算机辅助***分析仪CASA，对***活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的***数目不小于500个。
最终结果：本发明中轻度弱***症患者的***样本分别在对照组-F10缓冲液（C）和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中培养后，测定***活力发现，在缓冲液中添加紫云英苷能有效提高中轻度弱***症的***活力，在不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中的***活力均高于对照组，尤其是在浓度为10-4 的培养液的***活力显著高于对照组，表明F10-含有紫云英苷的组合物中的***受精能力要显著高于对照组（图2）。
实施例3 F10-含有紫云英苷的组合物对正常***的***活动力的提高效果评估
1. 样品准备
选择健康男性捐赠的正常***样本进行实验。***法***，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的***样本。将样本水浴保持22-33℃，液化后的***，根据WHO1999年的评价标准，使用电脑辅助***分析仪CASA，对***参数（体积，***计数，活力和运动特性的百分比）进行评估。弱***症被定义为A级***数目＜25%或A+B＜50%，（世界卫生组织，1999年），而所有其他参数都是正常。根据形态学观察排除含白细胞或者体细胞污染的标本。重度弱***症***的运动参数为（a+b）级＜25%，其中a级***＜5%。
2. ***体外培养
（1）密度梯度离心从***当中分选***
在试管内放置1mL 60% （v/v）的Percoll分离液，在其上铺上1mL -1.5mL的***，300g的离心力下离心5-10分钟，弃去上清液。重悬***悬液于2mL HTF-S培养液，300g离心5-10分钟，重复该步骤一次。将***悬液轻轻转移到实验所用到各种***培养液中。
（2）***培养
合适数量的***（5×106左右）转移到各种***培养液中之后，置于37℃，5%CO2的培养箱中1-3小时。
3. ***活动力的检测
根据WHO1999年的评价标准，使用计算机辅助***分析仪CASA，对***活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的***数目不小于500个。
最终结果：本发明正常的***样本分别在对照组-F10缓冲液（C）和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中培养后，测定***活力发现：在缓冲液中添加紫云英苷能有效提高正常***的***活力，在不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中的***活力均高于对照组（图3）。
实施例4 F10-含有紫云英苷的组合物对***顶体反应的提高效果评估
用FITC-PSA染色来评估***顶体的完整性。各类***在不同浓度的培养液中处理后经过干燥、固定等步骤，用FITC-PSA染色，通过在荧光显微镜下观察***的染色情况来观察F10-含有紫云英苷的组合物对***顶体结构的影响。
1. 样品收集
将上述培养后得到的重度弱***症患者的***样本、中轻度弱***症患者的***样本以及正常***样本收集合适数量。
2. 简单的***洗涤
充分混匀***标本，取0.2ml，用0.9% 的氯化钠溶液稀释至10ml。
以800g 离心10 分钟，弃去上清液，仅留下20～40μl 上清液。轻柔吹打，将***沉淀团重悬于留下的上清液中。重复以上***洗涤操作步骤。
3. 已纯化***的处理
用生理盐水将上游后或经过一次密度梯度离心的***悬液稀释至10ml。以800g离心10分钟。弃去上清液，仅留下20～40μl上清液。轻柔吹打，将***沉淀团重悬于留下的上清液中。
4. ***涂片制备
取5μl ***悬液，制成约1cm长的***涂片，共做2张重复涂片。在400倍相差显微镜下观察湿涂片。确保***均匀分布在玻片上，不聚集。空气中干燥玻片。95%（v/v）乙醇固定30分钟。空气中干燥玻片。
5. PSA-FITC 染色
加10ml PSA-FITC 工作液到垂直染色缸中。将已固定并空气干燥的涂片浸在PSA-FITC 荧光染料中。4℃，染色1小时以上。用纯净水洗涤每张玻片，并且用可溶于乙醇的封片剂封片。
6. 结果评估
用450～490nm激发光，于400倍油镜下观察***涂片。***分类如下：
顶体完整（acrosome-intact，AI）：***头部一半以上荧光染色明亮且均匀；已发生顶体反应（acrosome-reacted，AR）：***仅在赤道带出现荧光带，或者顶体区根本没有荧光染色；顶体异常：除上述两类***外的所有其他***。
7. 已发生顶体反应***的计数
借助实验室计数器，计数每种顶体类型***（AI 和AR）的数目。每张涂片计数200个***，以达到可接受的低取样误差。计算2 张重复涂片已发生顶体反应***百分率的平均值和差异。根据WHO（第5版）来确定差异的可接受性（每个数值显示，预期发生在95%的标本中，仅由于取样误差所致的两个百分率之间的最大差异）。如果两个百分率之间的差异是可接受的，报告已发生顶体反应***的平均百分率。如果差异太大，则重新评估两张涂片。以最接近的整数报告已发生顶体反应***百分率。
实验结果表明：本发明正常的***样本分别在对照组-F10缓冲液（C）和不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中培养后，对已发生顶体反应***进行计数发现：在缓冲液中添加紫云英苷能有效提高正常***的顶体反应，在不同梯度浓度的F10-含有紫云英苷的组合物中的***发生顶体反应的***数目均高于对照组（图4）。
Claims (5)
1.一种含有紫云英苷的组合物在制备提高***活力的人***保护剂中的应用，所述组合物包括紫云英苷和缓冲液，紫云英苷的浓度为10-4-10-8mol/L。
2.如权利要求1所述的一种含有紫云英苷的组合物在制备提高***活力的人***保护剂中的应用，其特征在于，每升缓冲液由以下重量份配比的组分组成：5.5-6.0g NaCl，2.0-2.5g NaHCO3，0.3-0.4g KCl，0.04-0.06g MgSO4·7(H2O)，0.04-0.06g KH2PO4，0.035-0.04g丙酮酸钠，3.8-4.0g乳酸钠，0.28-0.35g CaCl2·2(H2O)；所述紫云英苷的浓度为0.045g/L。
3.一种含有紫云英苷的组合物在制备提高弱精症患者的***活力的人***保护剂中的应用，所述组合物包括紫云英苷和缓冲液，紫云英苷的浓度为10-4-10-8mol/L。
4.如权利要求3所述的一种含有紫云英苷的组合物在制备提高***活力的人***保护剂中的应用，其特征在于，每升缓冲液由以下重量份配比的组分组成：5.5-6.0g NaCl，2.0-2.5g NaHCO3，0.3-0.4g KCl，0.04-0.06g MgSO4·7(H2O)，0.04-0.06g KH2PO4，0.035-0.04g丙酮酸钠，3.8-4.0g乳酸钠，0.28-0.35g CaCl2·2(H2O)；所述紫云英苷的浓度为0.045g/L。
5.紫云英苷在制备提高弱***症患者的***活力的体外受精IVF培养基中的应用，所述紫云英苷的浓度为10-4-10-8mol/L。
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