CN110129228B - 诺卡氏菌感受态细胞的制备方法与诺卡氏菌基因编辑方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种诺卡氏菌感受态细胞的制备方法与诺卡氏菌基因编辑方法。本发明的诺卡氏菌感受态细胞的制备方法采用溶菌酶对诺卡氏菌进行处理，从而降低了诺卡氏菌细胞壁的厚度，最终制备出容易接受外源DNA的诺卡氏菌感受态细胞，该方法操作简便快捷，具有较高的应用价值。本发明的诺卡氏菌基因编辑方法首次将CRISPR/Cas9***运用到诺卡氏菌中，构建了CRISPR/Cas9基因编辑质粒并将其转化进入诺卡氏菌对目的基因进行编辑，该方法操作简便快捷，具有较高的应用价值，为研究诺卡氏菌基因功能、构建诺卡氏菌基因缺失株以及制备诺卡氏菌基因缺失株疫苗奠定了基础。

Description

诺卡氏菌感受态细胞的制备方法与诺卡氏菌基因编辑方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种诺卡氏菌感受态细胞的制备方法与诺卡氏菌基因编辑方法。
背景技术
鰤鱼诺卡氏菌是水产养殖诺卡氏菌病的主要致病菌，当鱼类免疫力低下时，可通过饵料、鳃或伤口感染。鰤鱼诺卡氏菌在分类学上属放线菌目、诺卡氏菌科、诺卡氏菌属，为革兰氏阳性菌。鰤鱼诺卡氏菌是一种兼性胞内寄生菌，在其感染过程中，菌体会被鱼体吞噬细胞，主要是巨噬细胞吞噬。鰤鱼诺卡氏菌能在巨噬细胞内存活，并可随着巨噬细胞的迁移而扩散感染到鱼体的各个器官。该菌主要能引起鱼体内脏产生白色的结节，导致鱼类运动迟缓，食欲下降，免疫力低下，进而导致死亡。鰤鱼诺卡氏菌可感染乌鳢、卵形鲳鲹、大黄鱼等20多种海、淡水鱼类，导致鱼类慢性死亡，或由于引发体表溃疡而降低成鱼商品价值，给水产养殖业带来巨大的损失，加之发病率逐年增加，对鱼类养殖业危害越来越严重，因此亟需通过分子生物学手段研究诺卡氏菌基因的功能并深入了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理。
诺卡氏菌的细胞壁主要由肽聚糖、脂磷壁酸和细胞壁蛋白质等组成，细胞壁较厚，目前制备感受态细胞的常用方法主要有氯化钙法、甘油-聚乙二醇法、氯化铷法等，但是这些方法对于诺卡氏菌基本不起作用，也即是说，采用这些方法根本无法制备能够有效吸收外源DNA的诺卡氏菌感受态细胞。
CRISPR(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Respeats，CRISPR)是广泛存在于细菌和古细菌中的一种生物防御***，是细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。CRISPR***分为I型***、II型***和III型***，CRISPR***需要CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，其中经过改造的II型***CRISPR/Cas9成为现在广泛使用的基因改造工具，CRISPR/Cas9由单一引导RNA(single guide RNA，sgRNA)介导，sgRNA包括两部分，一部分是sgRNA锚定序列，sgRNA锚定序列可以根据不同的目的基因以及位点设计，另一部分是固有序列，固有序列通常为设计在质粒上的sgRNA-tracr序列，Cas9蛋白识别基因组上PAM(protospacer adjacent motif，PAM)及其上游20bp序列，并在PAM上游的sgRNA锚定序列位置产生双链切口，从而达到基因编辑的目的，研究基因功能。然而，目前尚未有相关研究将CRISPR/Cas9技术应用到诺卡氏菌中。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种诺卡氏菌感受态细胞的制备方法，能够制备出容易接受外源DNA的诺卡氏菌感受态细胞，该方法操作简便快捷，具有较高的应用价值。
本发明的目的还在于提供一种诺卡氏菌基因编辑方法，该方法操作简便快捷，具有较高的应用价值，同时为研究诺卡氏菌基因功能、构建诺卡氏菌基因缺失株以及制备诺卡氏菌基因缺失株疫苗奠定基础。
为实现以上目的，本发明首先提供一种诺卡氏菌感受态细胞的制备方法，包括：
取处于对数生长期的诺卡氏菌菌液于离心管中，第一次离心收集诺卡氏菌的菌体，采用无菌水或无菌水溶液洗涤所述菌体后，再采用无菌水或无菌水溶液第一次重悬所述菌体，然后在重悬的菌体中加入溶菌酶进行处理，处理后第二次离心收集诺卡氏菌的菌体，采用无菌水或无菌水溶液对所述菌体进行第二次重悬，得到诺卡氏菌感受态细胞。
可选的，在重悬的菌体中加入溶菌酶后中，溶菌酶的最终质量浓度为100μg/ml-300mg/ml。
可选的，在重悬的菌体中加入溶菌酶后处理的时间为0.3-5小时。
本发明还提供一种诺卡氏菌基因编辑方法，包括：
步骤a.确定诺卡氏菌中需要被编辑的目的基因，获取所述目的基因的sgRNA锚定序列，提供Cas9载体，在所述Cas9载体中***所述sgRNA锚定序列，获得CRISPR/Cas9基因编辑质粒；
步骤b.按照如上文所述的诺卡氏菌感受态细胞的制备方法制备诺卡氏菌感受态细胞；
步骤c.将所述CRISPR/Cas9基因编辑质粒转化进入所述诺卡氏菌感受态细胞中，对转化后的所述诺卡氏菌感受态细胞进行复苏培养，将复苏培养后的菌液涂布到含有抗生素的固体培养基表面进行培养，筛选阳性克隆子。
可选的，所述转化的方法为电转化。
可选的，所述电转化的参数为：电压150-300V，脉冲间隔时间600-1500ms，脉冲持续时间60-150μs，方波20-40个。
可选的，所述步骤a还包括：在所述Cas9载体中***从所述目的基因的sgRNA锚定序列和相应PAM位点的上下游分别扩增的同源臂片段。
可选的，借助CRISPR在线设计工具设计得到所述目的基因的sgRNA锚定序列。
可选的，所述Cas9载体为pCRISPomyces-2质粒。
本发明还提供一种上述诺卡氏菌基因编辑方法在研究诺卡氏菌基因功能、构建诺卡氏菌基因缺失株以及制备诺卡氏菌基因缺失株疫苗中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的诺卡氏菌感受态细胞的制备方法采用溶菌酶对诺卡氏菌进行处理，从而降低了诺卡氏菌细胞壁的厚度，最终制备出容易接受外源DNA的诺卡氏菌感受态细胞，该方法操作简便快捷，具有较高的应用价值。
本发明的诺卡氏菌基因编辑方法首次将CRISPR/Cas9***运用到诺卡氏菌中，首先制备出CRISPR/Cas9基因编辑质粒，将其导入采用上述方法制备的诺卡氏菌感受态细胞中，实现对目的基因进行编辑，该方法操作简便快捷，具有较高的应用价值，为进一步研究诺卡氏菌的基因功能、构建诺卡氏菌基因缺失株、制备诺卡氏菌基因缺失株疫苗提供了技术基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明实施例使用的pCRISPomyces-2质粒图谱；
图2示出了本发明实施例的同源重组修复流程；
图3A示出了本发明实施例获得的敲除2816基因的阳性克隆子菌落；
图3B示出了本发明实施例获得的敲除3141基因的阳性克隆子菌落；
图3C示出了本发明实施例获得的阴性对照空白平板；
图4示出了本发明实施例的鉴定阳性克隆子是否为诺卡氏菌的PCR鉴定结果；
图5示出了本发明实施例的鉴定阳性克隆子是否转入质粒的PCR鉴定结果；
图6A示出了本发明实施例的敲除2816基因的阳性克隆子的测序结果；
图6B示出了本发明实施例的敲除3141基因的阳性克隆子的测序结果。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
本发明首先提供一种诺卡氏菌感受态细胞的制备方法，包括：
取处于对数生长期的诺卡氏菌菌液于离心管中，第一次离心收集诺卡氏菌的菌体，采用无菌水或无菌水溶液洗涤所述菌体后，再采用无菌水或无菌水溶液第一次重悬所述菌体，然后在重悬的菌体中加入溶菌酶进行处理，处理后第二次离心收集诺卡氏菌的菌体，采用无菌水或无菌水溶液对所述菌体进行第二次重悬，得到诺卡氏菌感受态细胞。
优选的，在第一次离心收集诺卡氏菌的菌体后，采用无菌水洗涤所述菌体多次，再采用无菌水第一次重悬所述菌体。
可选的，在第二次离心收集诺卡氏菌的菌体后，采用无菌水溶液对所述菌体进行第二次重悬，所述无菌水溶液为甘油水溶液，所述甘油水溶液中甘油的质量百分比为5％-20％。
具体的，所述处于对数生长期的诺卡氏菌菌液的培养方法为：将诺卡氏菌接种至固体培养基表面，待长出单菌落后，挑取单菌落至液体培养基中，培养至对数生长期。优选的，将诺卡氏菌接种至固体培养基表面的方法为划线接种法。
优选的，对所述菌体进行第二次重悬后，将制得的诺卡氏菌感受态细胞分装到1.5ml离心管中，每管装500微升。
优选的，所述第一次离心与所述第二次离心的温度均为2℃-6℃。
优选的，在重悬的菌体中加入溶菌酶后中，溶菌酶的最终质量浓度为100μg/ml-300mg/ml(例如100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml)，在重悬的菌体中加入溶菌酶后处理的时间为0.3-5小时，期间每隔10-30分钟轻摇盛装所述菌体的容器(例如离心管)。
具体的，所述固体培养基可以为脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)。
具体的，所述液体培养基可以为BHI液体培养基。
本发明的诺卡氏菌感受态细胞的制备方法通过采用溶菌酶处理诺卡氏菌，降低了诺卡氏菌细胞壁的厚度，同时通过摸索溶菌酶的处理时间以及处理浓度，最终制备成容易接受外源DNA的诺卡氏菌感受态细胞。
基于上述诺卡氏菌感受态细胞的制备方法，本发明还提供一种诺卡氏菌基因编辑方法，包括：
步骤a.确定诺卡氏菌中需要被编辑的目的基因，获取所述目的基因的sgRNA锚定序列，提供Cas9载体，在所述Cas9载体中***所述sgRNA锚定序列，获得CRISPR/Cas9基因编辑质粒。
具体的，可以借助CRISPR在线设计工具设计得到所述目的基因的sgRNA锚定序列，根据所述sgRNA锚定序列合成寡聚核苷酸片段，将所述寡聚核苷酸片段***Cas9载体，获得CRISPR/Cas9基因编辑质粒。
具体的，所述CRISPR在线设计工具的网址为http://www.e-crisp.org/E-CRISP/。根据CRISPR在线设计工具找出目的基因的合适的PAM位点，根据PAM位点设计合适的sgRNA锚定序列，该sgRNA锚定序列包括PAM位点以及其上游17-22b p序列。已知PAM为目的基因的5’-NGG序列，CRISPR靶向特异性是由两部分决定的，一部分是sgRNA锚定序列和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和PAM，Cas9蛋白对目的基因的剪切发生在PAM上游17-22bp个碱基的位置。
CRISPR/Cas9成功与否的关键在于sgRNA锚定序列的设计，sgRNA锚定序列与非目标区域过多的非特异性结合导致脱靶效率较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的基因有高同源性。
在本申请的一实施例中，根据设计好的sgRNA锚定序列合成21-26bp的寡聚核苷酸片段，合成的寡聚核苷酸片段包含上游的ACGC粘性末端和下游的AAAC粘性末端。将合成的寡聚核苷酸片段通过金门法则(Golden Gate Assembly)***Cas9载体，所述Cas9载体为原始pCRISPomyces-2质粒(购自美国Addgene公司)，所述pCRISPomyces-2质粒的图谱如图1所示，将合成的21-26bp的寡聚核苷酸片段连接到pCRISPomyces-2质粒中sgRNA-tracr前面的两个Bbsl酶切形成的酶切位点处，sgRNA-tracr就是sgRNA的固有序列，在pCRISPomyces-2质粒上构建形成sgRNA。金门法则反应体系见表1，金门法则反应程序见表2。
表1金门法则体系
Figure BDA0002062309380000061
表2金门法则反应程序
Figure BDA0002062309380000071
具体的，为确保基因编辑是通过同源重组方式修复，所述步骤a还包括：在所述Cas9载体中***从所述目的基因的sgRNA锚定序列和相应PAM位点的上下游分别扩增的同源臂片段。
具体的，可以从目的基因的sgRNA锚定序列和相应的PAM位点的上下游各扩增0.3-1.5kb序列的同源臂，分别为上游同源臂(Up-Arm)和下游同源臂(Dn-Arm)，将所述上游同源臂和下游同源臂通过重叠PCR连接在一起并***到pCRI SPomyces-2质粒的单一XbaI位点处，构建成完整的CRISPR/Cas9基因编辑质粒。在目的基因被剪切后，CRISPR/Cas9基因编辑质粒携带的上游同源臂和下游同源臂序列通过同源重组的方式对目的基因进行修复，具体如图2所示。
步骤b.按照如上文所述的诺卡氏菌感受态细胞的制备方法制备诺卡氏菌感受态细胞。
具体的，步骤a与步骤b可以同时进行或者按照任意顺序进行。
步骤c.将所述CRISPR/Cas9基因编辑质粒转化进入所述诺卡氏菌感受态细胞中，对转化后的所述诺卡氏菌感受态细胞进行复苏培养，将复苏培养后的菌液涂布到含有抗生素的固体培养基表面进行培养，筛选阳性克隆子。
具体的，取一管经过步骤b获得的诺卡氏菌感受态细胞，加入适量体积的步骤a改造得到的pCRISPomyces-2质粒于离心管中，进行转化。
具体的，所述转化的方法为电转化，所述电转化使用的电转仪无需专用的电转杯，使用方便，并且具有高密度矩阵针电极，使其在较低电压下即能产生高度均匀、足够强度的电场，实现高转染率。设置电转仪参数：电压150-300V，脉冲间隔时间600-1500ms，脉冲持续时间60-150μs，方波20-40个。将诺卡氏菌感受态细胞与pCRISPomyces-2质粒混合物加入到96孔板中，每孔80-150微升，然后进行电转化。电转化结束后，在96孔板中每孔加入80-150μl、26-30℃预热的0.1mM-1mM蔗糖/BHI溶液，轻轻混合。将加了培养液的96孔板放在生化培养箱中，复苏12小时。
吸取80-120μl复苏12小时后的诺卡氏菌菌液涂布到含有安普霉素(Apramycin，Apr)的BHI固体培养基表面，筛选阳性克隆子。安普霉素又叫安普拉霉素，其硫酸盐为白色或类白色结晶性粉末，易溶于水。其抗菌谱广，对多数革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、变形杆菌、克雷白杆菌、绿脓杆菌、布鲁氏杆菌等有较强作用；对某些革兰氏阳性菌、密螺旋体和某些支原体等有较强的抗菌活性。安普霉素对诺卡氏菌具有较强的作用，pCRISPomyces-2质粒带有安普霉素抗性，成功转化pCRISPomyces-2质粒的诺卡氏菌才能在含有安普霉素(Apramycin，Apr)的BHI固体培养基表面生长。
优选的，另外取80-120μl没有经过电转化，且没有混合pCRISPomyces-2质粒的诺卡氏菌涂布到含有安普霉素的BHI固体培养基表面，作为阴性对照。
进一步的，在含有安普霉素的BHI固体培养基表面获得阳性克隆子之后还设有对阳性克隆子进行鉴定的步骤。
具体的，挑取阳性克隆子至0.8-1.2mL含有安普拉霉素抗性的BHI液体培养基的1.5mL离心管中扩大培养。吸取80-120μL菌液涂布到含有安普拉霉素的BHI固体培养基表面，重复筛选传代至5-10代左右，以筛选出能够稳定遗传的转化体。
为了证明所挑取的阳性克隆子为诺卡氏菌，进行诺卡氏菌的16S rRNA鉴定，实验过程如下：以阳性克隆子和野生型诺卡氏菌的菌液为模板，以诺卡氏菌16S rRNA-F和16SrRNA-R作为引物来进行PCR扩增得到诺卡氏菌的16S rRNA片段。扩增得到的阳性克隆子和野生型诺卡氏菌的16S rRNA片段的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。阳性克隆子和野生型诺卡氏菌的16S rRNA片段的PCR产物送测序后进行序列比对，证明阳性克隆子为诺卡氏菌。
为了证明构建的pCRISPomyces-2质粒已成功转入诺卡氏菌，分别以阳性克隆子的菌液、野生型诺卡氏菌的菌液以及pCRISPomyces-2质粒作为模板，设计pCR ISPomyces-2质粒上的引物进行PCR扩增，引物序列为引物F：CATTCAGGCTGC GCAACTG；引物R：CGTTTTACAACGTCGTGACTGG。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，如果阳性克隆子的菌液和pCRISPomyces-2质粒为模板均能扩增出相同大小的DNA片段，而野生型诺卡氏菌的菌液为模板不能扩增得到DNA片段，可以证明阳性克隆子中成功转入pCRISPomyces-2质粒。
为了验证目的基因设计的基因编辑位点发生了基因编辑，分别以阳性克隆子和野生型诺卡氏菌的菌液作为模板，引物为扩增目的基因开放阅读框的引物，扩增得到目的基因的PCR产物。
纯化目的基因的PCR产物，按照表3的TA克隆反应体系，26-30℃孵育0.5-3h，连接到pMD18T上。将连接后的产物转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基表面。
表3 TA克隆反应体系
Figure BDA0002062309380000091
挑取LB固体培养基表面的单菌落至含有氨苄青霉素的液体LB培养基中扩大培养。培养至对数生长期，将菌液送出测序，测序引物为pMD18T的通用引物，根据测序结果判断目的基因的编辑效果。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例选取鰤鱼诺卡氏菌基因组中的两个目的基因作为靶向序列，用于设计sgRNA锚定序列并构建CRISPR/Cas9基因编辑质粒。两个目的基因的编号分别为2816和3141，2816基因和3141基因的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9。在前期的研究中发现这两个基因编码的蛋白都为分泌蛋白，且推测其为毒力因子，对鰤鱼诺卡氏菌的致病性具有重要作用，本发明实施例通过敲除鰤鱼诺卡氏菌中的2816基因和3141基因，为进一步研究诺卡氏菌基因功能、构建诺卡氏菌基因缺失株、制备诺卡氏菌基因缺失株疫苗奠定基础。
实施例1
pCRISPomyces-2质粒改造
步骤一、借助CRISPR在线设计工具(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)，找出在鰤鱼诺卡氏菌基因组中2816和3141基因的合适的作用位点PAM位点，根据P AM位点设计出合适的sgRNA锚定序列，该sgRNA锚定序列为PAM位点上游20bp序列。根据本步骤设计的2816基因的sgRNA锚定序列可以为SEQ ID NO.2-8中的任一种，在本发明实施例中使用的为SEQID NO.2；3141基因的sgRNA锚定序列可以为SEQ ID NO.10-17中的任一种，在本发明实施例中使用的为SEQ I D NO.10。
步骤二、根据设计好的sgRNA锚定序列合成24bp的寡聚核苷酸片段，合成寡聚核苷酸片段的引物(由广州艾基生物公司合成)包含上游的ACGC粘性末端和下游的AAAC粘性末端。2816和3141两个基因的合成寡聚核苷酸片段的引物序列见表4。
表4合成寡聚核苷酸片段的引物序列
Figure BDA0002062309380000101
步骤三、将合成的24bp寡聚核苷酸片段通过金门法则分别***原始pCRISPomyces-2质粒(购自美国Addgene公司)，所述pCRISPomyces-2质粒的图谱见图1所示，将合成的24bp寡聚核苷酸片段通过酶切连接到pCRISPomyces-2质粒中sgRNA-tracr前面的两个Bbsl酶切形成的酶切位点处。所述金门法则反应体系见表1，所述金门法则反应程序见表2。
步骤四、为确保基因编辑是通过同源重组方式修复，分别从2816和3141基因的sgRNA锚定序列和相应的PAM位点的上下游各扩增1kb序列的上游同源臂和下游同源臂，扩增同源臂的引物序列如表5与表6所示。将上游同源臂片段和下游同源臂片段分别通过重叠PCR一起连接到pCRISPomyces-2质粒的单一XbaI位点处，构建成完整的CRISPR/Cas9基因编辑***的2816-pCRISPomyces-2和31 41-pCRISPomyces-2质粒。
表5 2816基因扩增同源臂的引物序列
Figure BDA0002062309380000111
表6 3141基因扩增同源臂的引物序列
Figure BDA0002062309380000112
实施例2
鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞的制备
步骤1、将保存的鰤鱼诺卡氏菌无菌操作划线接种到BHI固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，28℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单菌落至50ml BHI液体培养基中，28℃，130rpm培养至对数生长期。
步骤2、取达到对数生长期的30ml鰤鱼诺卡氏菌于50ml离心管中，4℃，8000rpm收集细菌菌体；用10ml无菌水分别洗涤菌体两次，再用10ml无菌水重悬细菌菌体，然后向离心管中加入适量溶菌酶(购自广州东盛生物科技有限公司)混合均匀，使溶菌酶的最终质量浓度为5mg/ml；28℃静止孵育1小时，期间每隔20分钟轻摇离心管。
步骤3、于4℃，8000rpm离心收集被溶菌酶处理过的鰤鱼诺卡氏菌，用2ml10％甘油重悬细菌菌体，分装到1.5ml离心管中，每管500微升，制备得到鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞。
实施例3
对感受态细胞和质粒进行电转化
步骤A、取两管经过实施例2制备得到的鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞，于其中一管感受态细胞中加入适量体积的实施例1改造得到的2816-pCRISPomyces-2质粒，于另一管感受态细胞中加入适量体积的实施例1改造得到的3141-pCRISPomyces-2质粒，使pCRISPomyces-2质粒终浓度为2μg/ml，冰浴半小时。
步骤B、将鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞与pCRISPomyces-2质粒混合物加入96孔板中，每孔100微升；设置电转仪(购自苏州壹达生物科技有限公司)参数：电压200V，脉冲间隔时间1000ms，脉冲持续时间100μs，方波30个，进行电转化。
步骤C、电转结束后，每孔加入100μl，28℃预热的0.3mM蔗糖/BHI溶液，轻轻混合。然后将96孔板放在生化培养箱中，28℃复苏12小时。
步骤D、吸取100μl复苏12小时后的鰤鱼诺卡氏菌菌液涂布到含有安普拉霉素的BHI固体培养基表面，筛选阳性克隆子；另外取100μl没有经过电转，且没有混合pCRISPomyces-2质粒的鰤鱼诺卡氏菌涂布到含有安普拉霉素的BHI固体培养基表面，作为阴性对照。将涂布菌液的含有安普拉霉素的BHI固体培养基于28℃培养，结果如图3A-图3C所示。其中图3A为转化了2816-pCRISPomyces-2质粒的鰤鱼诺卡氏菌Δ2816，图3B为转化了3141-pCRISPomyces-2质粒的鰤鱼诺卡氏菌Δ3141，其中图3A与图3B中圆圈圈中的地方为阳性克隆子，图3C为没有长出菌落的阴性对照，初步证明在鰤鱼诺卡氏菌中构建CRISPR/Cas9***成功。
实施例4
阳性克隆子的鉴定
为了进一步证明实施例3中的阳性克隆子的确由在鰤鱼诺卡氏菌中转化了实施例1中改造后的质粒所得，需要对阳性克隆子进行进一步鉴定。
步骤I、分别挑取阳性克隆子Δ2816和Δ3141至含有1mL安普拉霉素抗性的BHI液体培养基的1.5mL离心管中扩大培养。分别吸取100μL菌液，各自涂布到含有安普拉霉素的BHI固体培养基表面，重复筛选传代至5-10代左右。
步骤II、为了证明所挑取的阳性克隆子为鰤鱼诺卡氏菌，进行鰤鱼诺卡氏菌的16SrRNA鉴定，实验过程如下：以阳性克隆子Δ2816、Δ3141和鰤鱼诺卡氏菌Z J0503的菌液为模板，用引物16S rRNA-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和引物16S rRNA-R：GGTTACCTTCTTACCGACTT来进行PCR扩增得到鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503的16S rRNA片段。PCR反应体系为：1μl菌液，1μl引物16S rRNA-F，1μl引物16S rRNA-R，7μl ddH2O，10μl Taq mix。PCR扩增程序为：95℃5mi n，95℃30s，55℃1min，72℃1min，35个循环，72℃，10min，16℃保存。扩增得到的阳性克隆子Δ2816、Δ3141和鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503的16S rRNA片段的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图4所示。
图4中，M泳道代表Marker，1泳道代表模板为鰤鱼诺卡氏菌的16S rRNA，2泳道代表模板为阳性克隆子Δ2816的16S rRNA，3泳道代表模板为阳性克隆子Δ3141的16S rRNA，4泳道代表不含DNA模板的阴性对照。由图4可知，阳性克隆子Δ2816、Δ3141和鰤鱼诺卡氏菌的16S rRNA片段的PCR产物具有相同大小的长度，PCR产物送测序后经序列比对，证明阳性克隆子Δ2816、Δ3141为鰤鱼诺卡氏菌。
步骤III、为了证明实施例1构建的质粒2816-pCRISPomyces-2和3141-pCRISPomyces-2已成功转入鰤鱼诺卡氏菌，分别以阳性克隆子Δ2816、Δ3141和野生株鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503的菌液以及2816-pCRISPomyces-2质粒和3141-pCRISPomyc es-2质粒作为模板，设计pCRISPomyces-2质粒上的引物进行PCR扩增，引物序列分别为引物F：CATTCAGGCTGCGCAACTG；引物R：CGTTTTACAACGTCGTGACTGG。PCR反应体系为：10μl Taq mix，7μl ddH2O，1μl引物F，1μl引物F，1μl菌液。PCR反应程序为：95℃5min，95℃30S，58℃1min，72℃1min，35个循环，72℃5min，16℃保存。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图5所示。
图5中，M泳道代表Marker，1泳道代表模板为野生型鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌液的PCR产物，2泳道代表模板为阳性克隆子△2816菌液的PCR产物，3泳道代表模板为阳性克隆子△3141菌液的PCR产物，4泳道代表模板为2816-pCRISPomyces-2质粒的PCR产物，5泳道代表模板为3141-pCRISPomyces-2质粒的PCR产物。其中，1泳道没有产物，证明使用的PCR引物为pCRISPomyces-2质粒的特异性引物，2泳道和4泳道竖向箭头所指的条带大小相同，证明阳性克隆子△2816转入了质粒2816-pCRISPomyces-2，3泳道和5泳道竖向箭头所指的条带大小相同，证明阳性克隆子△3141转入了质粒3141-pCRISPomyces-2。
步骤Ⅳ、为了验证目的基因设计的基因编辑位点发生基因编辑，对目的基因进行测序鉴定。分别以阳性克隆子Δ2816、Δ3141和野生株鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503的菌液作为模板，引物为扩增目的基因开放阅读框的引物，扩增出目的基因片段，其中Δ2816的扩增引物序列为Δ2816-F:ACCGACGTTGCGTTCAGA，Δ2816-R:TACGAATGATGGTTGGGTG；Δ3141的扩增引物序列为Δ3141-F:TCCGAACAGCGGTTAGAGCG，Δ3141-R：GGCCCAGGTCATCATGTCAGC。PCR反应体系：10μl Taq mix，7μl ddH2O，1μl引物F，1μl引物R，1μl菌液。PCR反应程序：95℃5min，95℃30S，58℃1min，72℃1min，35个循环，72℃5min，16℃保存。分别得到2816基因和3141基因的PCR产物。
分别纯化2816基因和3141基因的PCR产物，按照表3所示的TA克隆反应体系，28℃孵育1h，分别连接到不同的pMD18T上得2816-pMD18T和3141-pMD 18T。将2816-pMD18T和3141-pMD18T分别与50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s后迅速置于冰上2min，加入200μl LB培养基，混匀后37℃，120r/min培养1h后涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基表面。
挑取LB固体培养基表面的单菌落，至含有氨苄青霉素(50mg/ml)的液体LB培养基中扩大培养。培养至细菌生长达到对数生长期，将菌液送出测序。测序引物序列为测序-F：TGTAAAACGACGGCCAGT和测序-R：CAGGAAACAGCTATGACC。
测序结果如图6A和图6B所示，图6A为2816基因的测序结果比对图，其中方框1为2816基因的PAM位点，方框2为sgRNA锚定序列，“...”表示碱基缺失，wt为野生型鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503的2816基因序列，1-4分别为挑选的四个阳性克隆子Δ2816的2816基因序列，从图6A可知，阳性克隆子1-4的sgRNA锚定序列均发生了碱基的缺失，证明2816基因敲除成功。
图6B为3141基因的测序结果比对图，其中方框3为3141基因的PAM位点，方框4为sgRNA锚定序列，“...”表示碱基缺失，wt为野生型鰤鱼诺卡氏菌的3141基因序列，1-4分别为挑选的四个阳性克隆子Δ3141的3141基因序列，从图6B可知，阳性克隆子1-4的sgRNA锚定序列均发生了碱基的缺失，证明3141基因敲除成功。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 1.广东海洋大学深圳研究院 2.广东海洋大学
3.深圳义海生物科技有限公司
<120> 诺卡氏菌感受态细胞的制备方法与诺卡氏菌基因编辑方法
<130> 2019-04-16
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 624
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 1
gtggctgtct acacgctgcc tgaactcgat tacgactact cggccctgga gcccttcatc 60
tccggccaga tcaacgagat ccaccacacc aagcaccacg ccgcctacgt cgcgggtgtc 120
aacgccgccc tcgagaagct cgaggaggcg cgcgccaagg acgaccacgc cgccatcttc 180
ctgaacgaga agaacctcgc gttccacctc ggcggccacg tcaaccactc catctggtgg 240
aagagcctgt ccaaggacgg cggcgacaag ccggtcggcg acctggccgc cgccgtcgac 300
gaggagttcg gctccttcga caagttcgtc gcgcagttct ccgctgcggc caacggcctg 360
cagggctccg gctgggcctg gctgggctac gacaccctgg gcaacaagct gctcaccttc 420
cagctcaccg accagcaggg caacgtgccg ctgggcatca tcccgctgct cggcctggac 480
atgtgggagc acgccttcta cctgcagtac aagaacgtca aggcggacta cgtcaaggcg 540
ttctggaacg tggtgaactg ggccgaaatc caggagcgct acaccaaggc cgtcaaccag 600
ggcaaaggcc tgatcttcgg ctga 624
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 2
ggctcttcca ccagatggag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 3
gagtagtcgt aatcgagttc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
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<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 5
cgaagatcag gcctttgccc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 6
tacaccaagg ccgtcaacca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 7
aaggccgtca accagggcaa 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 8
tggctgggct acgacaccct 20
<210> 9
<211> 558
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 9
gtgaagctgc tgaacccgcg ggggttcgga ttggtttgcg catccgcggc cgtggcggcg 60
gggttgatgc tggcgggctg cgcgaacacg gtcgagggta ccccgacggt cgatcaggct 120
caggtgacct cgtaccgggc cgaggtgtcc tcgtccgcgg cggccgccag ttcgtccaag 180
gccgcggcgc aggtcgccaa ggccacggcc gacaactgcg atccgttccg caagaccgcc 240
gggaccgcgg tcgaccgcta caacgagttc gtggacgcgc acgacgccag cgccgcggac 300
caagtggcga agcgggacgc ggcggccggg gcgctcgagg acgcggcgaa gacgatcgag 360
accgagttga acgcgacccg ggcggatctg cccgccgatc tcgcgggcaa gctcaccgac 420
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<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
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gcagttgtcg gccgtggcct 20
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<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 11
acctgagcct gatcgaccgt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 12
cacggtcgag ggtaccccga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 13
cacggtcgag ggtaccccga 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 14
aggctcaggt gacctcgtac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 15
ccgcgtcccg cttcgccact 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 16
gcggaacgga tcgcagttgt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Nocardia seriolae
<400> 17
ccgcttcgcc acttggtccg 20

Claims (6)

1.一种诺卡氏菌基因编辑方法，其特征在于，包括：
步骤a.确定诺卡氏菌中需要被编辑的目的基因，获取所述目的基因的sgRNA锚定序列，提供Cas9载体，在所述Cas9载体中***所述sgRNA锚定序列，获得CRISPR/Cas9基因编辑质粒；其中，借助CRISPR在线设计工具设计得到所述目的基因的sgRNA锚定序列；将寡聚核苷酸片段***Cas9载体，获得CRISPR/Cas9基因编辑质粒；
步骤b.制备诺卡氏菌感受态细胞；所述制备方法包括：
取处于对数生长期的诺卡氏菌菌液于离心管中，第一次离心收集诺卡氏菌的菌体，采用无菌水或无菌水溶液洗涤所述菌体后，再采用无菌水或无菌水溶液第一次重悬所述菌体，然后在重悬的菌体中加入溶菌酶进行处理，处理后第二次离心收集诺卡氏菌的菌体，采用无菌水或无菌水溶液对所述菌体进行第二次重悬，得到诺卡氏菌感受态细胞；
所述无菌水溶液为甘油水溶液，所述甘油水溶液中甘油的质量百分比为5％-20％；
所述处于对数生长期的诺卡氏菌菌液的培养方法为：将诺卡氏菌接种至固体培养基表面，待长出单菌落后，挑取单菌落至液体培养基中，培养至对数生长期；其中，将诺卡氏菌接种至固体培养基表面的方法为划线接种法；
在重悬的菌体中加入溶菌酶后中，溶菌酶的最终质量浓度为100μg/ml-300mg/ml；
在重悬的菌体中加入溶菌酶后处理的时间为0.3-5小时，期间每隔10-30分钟摇动盛装所述菌体的容器；
对所述菌体进行第二次重悬后，将制得的诺卡氏菌感受态细胞分装到1.5ml离心管中，每管装500微升；
所述第一次离心与所述第二次离心的温度均为2℃-6℃；
步骤c.将所述CRISPR/Cas9基因编辑质粒转化进入所述诺卡氏菌感受态细胞中，对转化后的所述诺卡氏菌感受态细胞进行复苏培养，将复苏培养后的菌液涂布到含有抗生素的固体培养基表面进行培养，筛选阳性克隆子。
2.如权利要求1所述的诺卡氏菌基因编辑方法，其特征在于，所述转化的方法为电转化。
3.如权利要求2所述的诺卡氏菌基因编辑方法，其特征在于，所述电转化的参数为：电压150-300V，脉冲间隔时间600-1500ms，脉冲持续时间60-150μs，方波20-40个。
4.如权利要求1所述的诺卡氏菌基因编辑方法，其特征在于，所述步骤a还包括：在所述Cas9载体中***从所述目的基因的sgRNA锚定序列和相应PAM位点的上下游分别扩增的同源臂片段。
5.如权利要求1所述的诺卡氏菌基因编辑方法，其特征在于，所述Cas9载体为pCRISPomyces-2质粒。
6.如权利要求1-5任一项所述的诺卡氏菌基因编辑方法在研究诺卡氏菌基因功能、构建诺卡氏菌基因缺失株以及制备诺卡氏菌基因缺失株疫苗中的应用。
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