CN110124093A - 一种带负电荷可注射型明胶微球基凝胶止血材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种带负电荷可注射型明胶微球基凝胶止血材料的制备方法。该明胶微球基凝胶止血材料通过明胶微球与水发生水合作用制成明胶微球基凝胶，赋予其可注射性，通过普通注射器就能进行注射；满足在深出血点和腔内出血时达到将止血凝胶准确快速送达止血点的要求；同时基于明胶自身吸水膨胀和可被吸收降解的特性，注入的止血凝胶吸收血液膨胀压迫创口血管，实现血流量减少达到止血，且止血凝胶不必取出，从而减少对患者的二次伤害。

Description

一种带负电荷可注射型明胶微球基凝胶止血材料的制备方法

(本申请是对申请号为2018112910557，申请日为2018年10月31日的发明专利提出的分案申请)

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种用于临床手术中深部及腔内出血的带负电荷可注射型明胶微球基凝胶止血材料的制备方法。

背景技术

在外科手术过程中，对患者出血部位快速有效的止血，有利于缩短手术时间推进手术顺利进行提高手术成功率，从而挽救更多的生命。目前，可用于外伤止血的材料主要包括无机止血材料和有机止血材料。

无机止血材料主要有沸石和高岭土等。沸石有良好的止血性能，能明显的缩短止血时间和减少出血量。沸石在止血过程中能迅速吸收血液从而凝聚血小板和凝血因子，达到快速止血的目的。美军装备的止血敷料，其主要成分就是沸石，由于其优良的止血效果，止血敷料在***和阿富汗战争中挽救了许多伤员的性命。但是沸石在止血过程中会释放大量的热，这有可能灼伤组织，从而导致炎症。高岭土有着和沸石相近的止血功能。2008年，高岭土止血纱布入选美军“十大顶尖陆军装备”，成为不可多得的作战首选止血产品。但是高岭土不具备生物可降解性，需要在止血后移除，这有可能对受损组织带来二次伤害和二次出血。

有机止血材料主要有壳聚糖、海藻酸盐、纤维蛋白胶和明胶等。壳聚糖在止血过程中能聚集血小板和红细胞，同时壳聚糖还能抑制机体内纤维蛋白溶解酶的活性，从而使得形成的血栓更加的牢固。目前被美国FDA批准的壳聚糖类止血敷料有Clo-Sur和壳聚糖绷带。但是有报道称由于这两种止血敷料成片状，所以用于腔内和深部伤口止血时效果不明显。海藻酸盐类止血材料(如：Comfeel)有较强的吸水能力，止血过程中能快速聚集血小板和凝血因子，同时被体液中的钠离子交换出的钙离子能迅速参与凝血。但单一的海藻酸盐类止血材料粘附性较差，使用时需要其他的敷料固定。纤维蛋白胶类止血材料如纤维蛋白胶泡沫，是一种喷剂，对表面创伤止血有较好的效果，但是有相关研究表明，由于其较差的分散性和较弱粘附能力，因此对腔内止血效果并不理想。明胶类止血材料具有很强的亲水性，吸水后自身膨胀压迫受损血管达到止血的目的，同时明胶还能聚集血清蛋白和血小板并激活血小板释放凝血因子，目前应用与临床上的产品大多数是明胶止血海绵(如：和)，这类止血材料适用于手术中开放性伤口止血以及术后封闭防渗液，无法应用于腔内和深部伤口止血。

由于目前的止血材料要么生物相容性和生物降解性差，要么应用于腔内和深部伤口止血效果不理想。因此亟需开发一种生物相容性良好，具有生物降解性能，且用于临床手术中深部及腔内出血的止血材料。

发明内容

本发明的目的是制备一种拥有优良止血性能的适用于深部和腔内出血的带负电荷可注射型明胶微球基凝胶止血材料，同时该明胶微球基凝胶止血材料具有良好的生物相容性和生物可吸收降解性能，止血后可留在体内不必取出。

本发明一种用于临床手术中深部及腔内出血的带负电荷可注射型明胶微球基凝胶止血材料：

它是将明胶微球与水合剂通过物理混合后发生水合作用而得；

其中，所述水合剂为去离子水，磷酸盐缓冲液，模拟体液，生理盐水中的一种或多种组成的混合物；所述明胶微球粒径为1～500μm。

水合作用的实质是水分子整体进入矿物晶格，从而使矿物体积增大的作用。而在本发明中水合作用是指水分子进入明胶微球内部后，使明胶微球体积增大的作用。

磷酸盐缓冲是常用于生物学研究的一个缓冲溶液，其渗透压和离子浓度通常与人体pH相近，配制方法如下：1L去离子水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g磷酸氢二钠和0.24g磷酸二氢钾，用HCl调节溶液pH值至7.4。

模拟体液是模拟人体体液的组分和pH值的一种溶液。配制方法如下：1L去离子水中按顺序溶解8.035g NaCl，0.355g NaHCO₃，0.225g KCl，0.231g K₂HPO₄.3H₂O，0.311gMgCl₂.6H₂O，39mL1.0M HCl，0.292g CaCl₂，0.072g Na₂SO₄，6.118g Tris，0～5mL1.0M HCl调节pH至7.4。

进一步地，所述明胶微球与水合剂的配比为1:2～1:3(g/mL)。

进一步地，所述明胶微球基凝胶止血材料的制备方法包括以下步骤：

(1)将油相和0.01～0.1倍油相体积的乳化剂混合，加热至40～60℃，机械搅拌均匀后缓慢加入0.01～0.02倍油相体积的浓度为5wt％～40wt％的明胶溶液，再通过机械搅拌乳化，机械搅拌速度300～5000rpm，机械搅拌时间15～120min；

(2)将搅拌后的整个体系放入冰水中进行冰浴10～60min，之后加入0.05～0.5倍明胶溶液体积的1～5％的戊二醛溶液交联0.5～5h，交联结束后加入脱水剂并使乳液中的明胶微球沉淀；

(3)对乳液进行过滤，再用清洗剂清洗明胶微球数次，以除去油相及未反应的戊二醛，室温下干燥处理，得到明胶微球。

进一步地，所述步骤(1)中，油相为植物油类、动物脂肪油和液体石蜡中的一种或多种组成的混合油；其中，植物油类为菜籽油，花生油，大豆油，橄榄油，蓖麻油中的一种或多种；动物脂肪油为猪油和/或牛油；

所述步骤(1)中，所述乳化剂的亲水亲油平衡值为3～6；其中亲水亲油平衡值为3～6的乳化剂为司班-80和/或司班-60；

所述步骤(1)中，明胶溶液为A型明胶，B型明胶或两种明胶组成的混合明胶在40～60℃下溶于去离子水中得到；

所述步骤(2)中，脱水剂为乙醇，丙酮，异丙醇，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种组成的混合物；

所述步骤(3)中，清洗剂为乙醇，丙酮，异丙醇，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种组成的混合物。

本发明提供了一种制备前述明胶微球基凝胶止血材料的方法，它包括以下步骤：

将明胶微球与水合剂物理混合发生水合作用，即得。

本发明还提供了前述的明胶微球基凝胶作为止血材料的应用。

进一步地，所述止血材料可用普通注射器进行注射。

进一步地，所述止血材料是临床手术中深部及腔内出血的止血材料。

本发明具有以下突出特点：

1)将明胶制备成微球，增加比表面积，增加材料与血液的接触面积；同时增加材料的吸水能力，使得在止血过程中材料能迅速吸收血液中的水，聚集血小板浓缩血液形成物理性封堵基质，实现快速止血。

2)通过化学交联的方法改性明胶，提高明胶的热稳定性，使之能用于人体体温环境；同时通过改性使明胶微球表面带负电荷，表面负电荷能激活凝血因子XII，产生凝血酶并激活内源性凝血通路，达到快速而有效的止血的目的。

3)通过明胶微球与水发生水合作用制成明胶微球基凝胶，赋予其可注射性，通过普通注射器就能进行注射；满足在深出血点和腔内出血时达到将止血凝胶准确快速送达止血点的要求；同时基于明胶自身吸水膨胀和可被吸收降解的特性，注入的止血凝胶吸收血液膨胀压迫创口血管，实现血流量减少达到止血，且止血凝胶不必取出，从而减少对患者的二次伤害。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例1所制得的明胶微球的扫描电镜图，图中的放大倍数为200倍。

图2为实施例1制得的明胶微球基凝胶的外观图。

图3为实施例2所制得的B型明胶微球基凝胶用于兔肝脏创口止血实验光学图。

具体实施方式

实施例1本发明止血材料的制备

1、制备方法

采用水油乳化法制备明胶微球。将300mL液体石蜡和9ml乳化剂司班-80(Span-80)加入圆底三颈瓶中加热至45℃，机械搅拌均匀后缓慢加入10mL的B型明胶溶液(10wt％)，1000rpm机械搅拌15min后得到乳化液。随后将整个体系放入冰水中进行冰浴15min，之后加入3mL的2.5％的戊二醛交联2h，交联结束后加入适量乙醇脱水并使乳液中的明胶微球沉淀。对乳液进行过滤，再用丙酮和异丙醇进行交替清洗数次，以除去液体石蜡和未反应的戊二醛，室温下干燥处理，得到B型明胶微球。B型明胶微球与一定量的生理盐水混合(明胶微球：生理盐水＝1:2.5(g/mL))发生水合作用，形成B型明胶微球基凝胶。

2、止血材料的表征结果

将本发明得到的明胶微球进行粒径分析，统计个数300。平均粒径为14.97μm。

将本发明得到的明胶微球进行Zeta电位分析，对照组为可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组为B型明胶原料。本发明得到的明胶微球Zeta电位为-24.8mV，对照组Zeta电位为6.1mV，空白对照组Zeta电位为-0.1mV。说明本发明得到的明胶微球表面带负电荷，可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品带正电荷，B型明胶原料带负电荷，但其电负性低于其制备成的微球。

3、止血材料的止血效果

将本发明得到的B型明胶微球基凝胶(实验组)用于体外凝血时间的测定，实验所用血液为新鲜新西兰大白兔耳动脉血，对照组为等量的可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组为等量的生理盐水。方法：将0.2g实验样品分别装入普通采血管，随后分别加入1mL新鲜新西兰大白兔耳动脉血液，迅速摇匀后计时，每隔15s检查血液凝固情况，待血液完全凝固后记录其凝血时间。实验结果：实验组，对照组，空白对照组的体外凝血时间分别为57.8s，112s，137.6s。

将本发明得到的B型明胶微球基凝胶(实验组)用于兔肝脏深部创口(Φ4*5mm)的测定，对照组为等量的可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组不作任何处理。方法：戊巴比妥钠麻醉剂静脉注射对其麻醉，腹部手术区备皮消毒，沿胸腔下腹中线行5cm左右长切口，暴露肝脏，使用骨科钻头(Φ4)在其肝脏上作一深0.5cm的圆柱形出血点，待其自然出血5s后，注入实验样品并计时，记录其止血时间。同时观察止血后的伤口情况，若伤口保持止血状态超过3min，则认为止血时间有效。实验结果：实验组，对照组，空白对照组的止血时间分别为36.4s，51.5s，309.8s。

实施例2本发明止血材料的制备

1、制备方法

采用水油乳化法制备明胶微球。将300mL液体石蜡和9mL乳化剂Span-80加入圆底三颈瓶中加热至45℃，机械搅拌均匀后缓慢加入10mL的B型明胶溶液(10wt％)，300rpm机械搅拌15min后得到乳化液。随后将整个体系放入冰水中进行冰浴15min，之后加入3mL的2.5％的戊二醛交联2h，交联结束后加入适量乙醇脱水并使乳液中的明胶微球沉淀。对乳液进行过滤，再用丙酮和异丙醇进行交替清洗数次，以除去液体石蜡和未反应的戊二醛，室温下干燥处理，得到B型明胶微球。B型明胶微球与一定量的生理盐水混合(明胶微球：生理盐水＝1:2.5(g/mL))发生水合作用，形成B型明胶微球基凝胶。

2、止血材料的表征结果

将本发明得到的明胶微球进行粒径分析，统计个数300。平均粒径为80.19μm。

将本发明得到的明胶微球进行Zeta电位分析，对照组为可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组为B型明胶原料。本发明得到的明胶微球Zeta电位为-17.5mV，对照组Zeta电位为6.1mV，空白对照组Zeta电位为-0.1mV。说明本发明得到的明胶微球表面带负电荷，可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品带正电荷，B型明胶原料带负电荷，但其电负性低于其制备成的微球。

3、止血材料的止血效果

将本发明得到的B型明胶微球基凝胶(实验组)用于体外凝血时间的测定，实验所用血液为新鲜新西兰大白兔耳动脉血，对照组为等量的可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组为等量的生理盐水。方法：将0.2g实验样品分别装入普通采血管，随后分别加入1mL新鲜新西兰大白兔耳动脉血液，迅速摇匀后计时，每隔15s检查血液凝固情况，待血液完全凝固后记录其凝血时间。实验结果：实验组，对照组，空白对照组的体外凝血时间分别为50.8s，112s，137.6s。

将本发明得到的B型明胶微球基凝胶(实验组)用于兔肝脏深部创口(Φ4*5mm)的测定，对照组为等量的可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组不作任何处理。方法：戊巴比妥钠麻醉剂静脉注射对其麻醉，腹部手术区备皮消毒，沿胸腔下腹中线行5cm左右长切口，暴露肝脏，使用骨科钻头(Φ4)在其肝脏上作一深0.5cm的圆柱形出血点，待其自然出血5s后，注入实验样品并计时，记录其止血时间。同时观察止血后的伤口情况，若伤口保持止血状态超过3min，则认为止血时间有效。实验结果：实验组，对照组，空白对照组的止血时间分别为32.2s，51.5s，309.8s。

实施例3本发明止血材料的制备

1、制备方法

采用水油乳化法制备明胶微球。将300mL液体石蜡和9mL乳化剂Span-80加入圆底三颈瓶中加热至45℃，机械搅拌均匀后缓慢加入10mL的A型明胶溶液(10wt％)，1000rpm机械搅拌15min后得到乳化液。随后将整个体系放入冰水中进行冰浴15min，之后加入3mL2.5％的戊二醛交联2h，交联结束后加入适量乙醇脱水并使乳液中的明胶微球沉淀。对乳液进行过滤，再用丙酮和异丙醇进行交替清洗数次，以除去液体石蜡和未反应的戊二醛，室温下干燥处理，得到A型明胶微球。A型明胶微球与一定量的生理盐水混合(明胶微球：生理盐水＝1:2.5(g/mL))发生水合作用，形成A型明胶微球基凝胶。

2、止血材料的表征结果

将本发明得到的明胶微球进行粒径分析，统计个数300。平均粒径为23.86μm。

将本发明得到的明胶微球进行Zeta电位分析，对照组为可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组为A型明胶原料。本发明得到的明胶微球Zeta电位为-4.2mV，对照组Zeta电位为6.1mV，空白对照组Zeta电位为5.8mV。说明本发明得到的明胶微球表面带负电荷，可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品带正电荷，A型明胶原料带正电荷。

3、止血材料的止血效果

将本发明得到的A型明胶微球基凝胶(实验组)用于体外凝血时间的测定，实验所用血液为新鲜新西兰大白兔耳动脉血，对照组为等量的可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组为等量的生理盐水。方法：将0.2g实验样品分别装入普通采血管，随后分别加入1mL新鲜新西兰大白兔耳动脉血液，迅速摇匀后计时，每隔15s检查血液凝固情况，待血液完全凝固后记录其凝血时间。实验结果：实验组，对照组，空白对照组的体外凝血时间分别为111.67s，112s，137.6s。

将本发明得到的A型明胶微球基凝胶(实验组)用于兔肝脏深部创口(Φ4*5mm)的测定，对照组为等量的可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组不作任何处理。方法：戊巴比妥钠麻醉剂静脉注射对其麻醉，腹部手术区备皮消毒，沿胸腔下腹中线行5cm左右长切口，暴露肝脏，使用骨科钻头(Φ4)在其肝脏上作一深0.5cm的圆柱形出血点，待其自然出血5s后，注入实验样品并计时，记录其止血时间。同时观察止血后的伤口情况，若伤口保持止血状态超过3min，则认为止血时间有效。实验结果：实验组，对照组，空白对照组的止血时间分别为42.92s，51.5s，309.8s。

实施例4本发明止血材料的制备

1、制备方法

采用水油乳化法制备明胶微球。将300mL液体石蜡和9mL乳化剂Span-80加入圆底三颈瓶中加热至45℃，机械搅拌均匀后缓慢加入10mL的A型明胶溶液(10wt％)，300rpm机械搅拌15min后得到乳化液。随后将整个体系放入冰水中进行冰浴15min，之后加入3mL的2.5％的戊二醛交联2h，交联结束后加入适量乙醇脱水并使乳液中的明胶微球沉淀。对乳液进行过滤，再用丙酮和异丙醇进行交替清洗数次，以除去液体石蜡和未反应的戊二醛，室温下干燥处理，得到A型明胶微球。A型明胶微球与一定量的生理盐水混合(明胶微球：生理盐水＝1:2.5(g/mL))发生水合作用，形成A型明胶微球基凝胶。

2、止血材料的表征结果

将本发明得到的明胶微球进行粒径分析，统计个数300。平均粒径为105.03μm。

将本发明得到的明胶微球进行Zeta电位分析，对照组为可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组为A型明胶原料。本发明得到的明胶微球Zeta电位为-0.5mV，对照组Zeta电位为6.1mV，空白对照组Zeta电位为5.8mV。说明本发明得到的明胶微球表面带负电荷，可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品带正电荷，A型明胶原料带正电荷。

3、止血材料的止血效果

将本发明得到的A型明胶微球基凝胶(实验组)用于体外凝血时间的测定，实验所用血液为新鲜新西兰大白兔耳动脉血，对照组为等量的可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组为等量的生理盐水。方法：将0.2g实验样品分别装入普通采血管，随后分别加入1mL新鲜新西兰大白兔耳动脉血液，迅速摇匀后计时，每隔15s检查血液凝固情况，待血液完全凝固后记录其凝血时间。实验结果：实验组，对照组，空白对照组的体外凝血时间分别为107s，112s，137.6s。

将本发明得到的A型明胶微球基凝胶(实验组)用于兔肝脏深部创口(Φ4*5mm)的测定，对照组为等量的可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，空白对照组不作任何处理。方法：戊巴比妥钠麻醉剂静脉注射对其麻醉，腹部手术区备皮消毒，沿胸腔下腹中线行5cm左右长切口，暴露肝脏，使用骨科钻头(Φ4)在其肝脏上作一深0.5cm的圆柱形出血点，待其自然出血5s后，注入实验样品并计时，记录其止血时间。同时观察止血后的伤口情况，若伤口保持止血状态超过3min，则认为止血时间有效。实验结果：实验组，对照组，空白对照组的止血时间分别为51.1s，51.5s，309.8s。

综上，本发明所制备的明胶微球基凝胶的体外凝血性能和肝脏止血性能优于可吸收止血流体明胶SURGIFLO^TM产品，具有良好的止血效果。

Claims (10)

1.一种带负电荷可注射型明胶微球基凝胶止血材料的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：将明胶微球与水合剂物理混合发生水合作用，即得；

所述水合剂为去离子水，磷酸盐缓冲液，模拟体液，生理盐水中的一种或多种组成的混合物；所述明胶微球粒径为1～500μm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述明胶微球与水合剂的配比为1:2～1:3(g/mL)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述明胶微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将油相和0.01～0.1倍油相体积的乳化剂混合，加热至40～60℃，机械搅拌均匀后缓慢加入0.01～0.02倍油相体积的浓度为5wt％～40wt％的明胶溶液，再通过机械搅拌乳化，机械搅拌速度300～5000rpm，机械搅拌时间15～120min；

(2)将搅拌后的整个体系放入冰水中进行冰浴10～60min，之后加入0.05～0.5倍明胶溶液体积的1～5％的戊二醛溶液交联0.5～5h，交联结束后加入脱水剂并使乳液中的明胶微球沉淀；

(3)对乳液进行过滤，再用清洗剂清洗明胶微球数次，以除去油相及未反应的戊二醛，室温下干燥处理，得到明胶微球。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，油相为植物油类、动物脂肪油和液体石蜡中的一种或多种组成的混合油。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述植物油类为菜籽油，花生油，大豆油，橄榄油，蓖麻油中的一种或多种；动物脂肪油为猪油和/或牛油。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述乳化剂的亲水亲油平衡值为3～6。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述亲水亲油平衡值为3～6的乳化剂为司班-80和/或司班-60。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，明胶溶液为A型明胶，B型明胶或两种明胶组成的混合明胶在40～60℃下溶于去离子水中得到。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，脱水剂为乙醇，丙酮，异丙醇，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种组成的混合物。

10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，清洗剂为乙醇，丙酮，异丙醇，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种组成的混合物。