CN110121352B - Gold优化的car t-细胞 - Google Patents

Gold优化的car t-细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN110121352B
CN110121352B CN201780053381.1A CN201780053381A CN110121352B CN 110121352 B CN110121352 B CN 110121352B CN 201780053381 A CN201780053381 A CN 201780053381A CN 110121352 B CN110121352 B CN 110121352B
Authority
CN
China
Prior art keywords
car
rde
cells
cell
smart
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780053381.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110121352A (zh
Inventor
B·王
G·兹纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chimera Bioengineering Inc
Original Assignee
Chimera Bioengineering Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chimera Bioengineering Inc filed Critical Chimera Bioengineering Inc
Priority to CN202011246069.4A priority Critical patent/CN112481217A/zh
Publication of CN110121352A publication Critical patent/CN110121352A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110121352B publication Critical patent/CN110121352B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01012—Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (phosphorylating) (1.2.1.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination

Abstract

本发明公开了控制装置，包括RNA去稳定元件(RDE)、RNA控制装置和去稳定元件(DE)，与真核细胞中的嵌合抗原受体(CAR)或其它转基因结合。本发明还公开了多顺反子载体，用于在控制装置的控制下工程化具有CAR和转基因的宿主真核细胞。这些控制装置可用于优化真核细胞中CAR的表达，以便例如优化效应物功能。还可以将CAR和转基因有效负载工程化到真核细胞中，以便在真核细胞上刺激CAR后表达并递送转基因有效负载。

Description

GOLD优化的CAR T-细胞
参考序列表、表格或计算机程序
序列表的正式文本以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与本说明书同时提交，其文件名为“CBIO024_ST25.txt”，创建日期为2017年8月28日，大小为9千字节。通过EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并在此以其全文形式被援引加入本文。
背景技术
嵌合抗原受体是人工程受体，其可引导T细胞攻击CAR识别的靶标。例如，已表明CART细胞疗法可有效诱导针对急性淋巴细胞白血病和其它B细胞相关恶性肿瘤的完全应答，并且已经表明可有效实现和维持难治性/复发性急性淋巴细胞白血病的缓解(Maude等人,NEJM,371:1507,2014)。不过，已经在一些患者中观察到与细胞因子释放综合征(CRS)、肿瘤溶解综合征(TLS)、B细胞发育不全和靶向-脱靶毒性(on-tumor,off-targettoxicity)相关的危险副作用。
目前有两种现有的策略来控制CAR技术。第一种是可诱导的“杀伤开关”。在这种方式中，将一个或多个启动凋亡途径的“***”基因整合到CAR构建体中(Budde等人,PLoS1,2013,doi:10.1371/journal.pone.0082742)。这些***基因的激活是通过加入AP1903(也称为rimiducid)来启动的，所述AP1903是脂质渗透性的他克莫司(tacrolimus)类似物，其启动人蛋白FKBP12(Fv)的同源二聚化，其中凋亡诱导蛋白转译融合至AP1903。在理想情况，这些杀伤开关尽力牺牲CAR技术的长期监控益处来防范毒性。不过，在体内，这些***开关不太可能实现这一目标，因为它们针对不响应AP1903的CAR T细胞的强大的选择压力运行，与将稳定的转基因***到患者T细胞中相关联的有害的易错逆转录病毒复制使这种情况恶化。在这种情况下，无响应的CAR T细胞克隆将以抗原依赖性方式继续增殖并杀死靶细胞。因此，杀伤开关技术不太可能提供足够的防范毒性的保护措施。
第二种CAR调节方式是瞬态CAR表达，其可以通过若干种方式实现。在一种方式中，从不相关的供体收获T细胞，通过基因组编辑技术删除HLA基因，并将CAR编码转基因***到这些细胞的基因组中。在过继转移后，这些CAR T细胞会被受体的免疫***识别为外来的并被破坏，因此CAR暴露在该***中是短暂的。在另一种瞬态CAR暴露方式中，将CAR编码基因的mRNA引入收获的患者T细胞中(Beatty,GL 2014.Cancer Immunology Research 2(2):112-20.doi:10.1158/2326-6066.CIR-13-0170)。因为mRNA具有短的半衰期并且不在细胞中被复制或稳定维持，所以不存在CAR表达T细胞的永久性改变，因此CAR表达和活性将是在短时间内。不过，与杀伤开关方式一样，这些瞬态CAR暴露方式牺牲了CAR的监控益处。此外，具有这些瞬态***，急性毒性可能难以控制。
发明内容
在一个方面，说明书披露了真核细胞，具有CAR、T细胞受体或其它靶向多肽和转基因在RNA去稳定元件(RDE)的控制下。所述RDE可控制多个转基因，或者多个RDE可控制多个转基因。多个转基因可以连续和/或作为串联体和/或以其它排列方式排列。多个RDE可用于调节转基因，并且这些多个RDE可被组织为串联体，散布在转录物的区域内，或者位于转录物的不同部分中。多个转基因可以通过RDE或RDE的组合来调节。RDE可以位于3'-UTR、5'-UTR和/或内含子中。在一个方面，可以工程化RDE以增加或降低与RDE相互作用的RNA结合蛋白的结合亲和力。改变RNA结合蛋白的亲和力可以改变由RNA结合蛋白调节的转基因表达的时序和响应。在一个方面，结合在RDE的RNA结合蛋白被细胞的代谢状态改变，并且改变RDE对RNA结合蛋白的结合亲和力改变了细胞的代谢状态对转基因表达的响应和/或时序。在一个方面，结合在RDE的RNA结合蛋白被细胞的氧化还原状态改变，并且改变RDE对RNA结合蛋白的结合亲和力改变了细胞的氧化还原状态对转基因表达的响应和/或时序。
在一个方面，CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体或其它靶向受体或靶向多肽识别靶位点处的抗原(例如，肿瘤细胞或其它患病组织/细胞)，并且这激活细胞。转基因可以是识别靶位点处的第二抗原的另一CAR，并且第一CAR、T细胞受体或其它靶向多肽对细胞的激活诱导第二CAR，允许真核细胞通过第二抗原识别靶位点。在一个方面，真核细胞具有识别靶位点处的抗原的第一CAR，并且这激活编码直接或间接降低细胞活化状态的多肽的转基因(通过RDE)。例如，转基因可能编码识别健康组织上的抗原的第二CAR，使得当第一CAR与非靶细胞处的抗原反应时，真核细胞将通过第二CAR与健康细胞抗原的相互作用而被去活化(不存在或在靶位点处以减少的量存在)。
在一些方面，真核细胞是免疫细胞，例如T细胞、天然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞或其它抗原呈递细胞。在这些方面，CAR激活细胞或以其它方式改变免疫细胞的代谢状态可通过RDE诱导转基因的表达。控制转基因的RDE可以具有microRNA结合位点，并且可被工程化以去除这些microRNA结合位点中的一个或多个。RDE可以被Hu蛋白R(HuR)结合。不希望受理论束缚，预期HuR可以与一些RDE结合，并起到稳定mRNA的作用，导致转译增强。一些RDE可以通过酶甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、其它脱氢酶、其它氧化还原酶或其它糖酵解酶与真核细胞的糖酵解状态相关联，当真核细胞未被激活(低糖酵解活性)、静止或静息时可以与RDE结合。当GAPDH或其它酶与RDE结合时，这可以减少具有RDE的RNA的半衰期。在这方面，真核细胞(例如，T淋巴细胞)的CAR活化可以诱导细胞中的糖酵解，这降低了RNA的GAPDH结合，增加了RNA的半衰期，这导致RNA中编码并由RDE控制的转基因的表达增加。不希望受理论束缚，因为GAPDH腾出RDE，HuR或其它RDE结合蛋白可能随后结合相同的RDE或先前难以接近的RDE(由于存在GAPDH而在空间上受阻)，进一步稳定mRNA，增加mRNA的半衰期，并且导致由RNA编码并由所述RDE控制的转基因的进一步表达增加。因此，CAR活化可以诱导转基因的表达。在其它方面，免疫细胞的其它活化可以引起GAPDH参与糖酵解，从而在RDE的控制下诱导转基因的表达。
来自带RDE的转录物的表达可以响应细胞的代谢状态。例如，RDE可以被代谢或糖酵解酶结合，通过这些代谢或糖酵解酶将转基因的表达与细胞的活化状态偶联。一些代谢或糖酵解酶与转录物中的RDE结合并降解或靶向降解转录物。当那些代谢或糖酵解酶变得活跃时，酶不再与RDE结合，转录物在更长的时间段内稳定，并且转录物可以在这更长的时间段内转译。在所述RDE控制下表达转基因的细胞也可以被工程化以表达CAR，其可以在希望的时间改变细胞的代谢状态，导致在希望时间的转基因的表达。可替换地，可以使用其它刺激来改变真核细胞的代谢状态，导致转基因的表达。例如，可以改变细胞的代谢状态以通过刺激引起转基因表达(或抑制表达)，所述刺激包括例如小分子(例如，PMA/离子霉素)，细胞因子、TCR和与配体结合的共刺激结构域、氧气水平、细胞应激、温度或光/辐射。
通过向细胞中引入抑制糖酵解的小分子，例如雷帕霉素、2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸(bromophyruvic acid)、碘乙酸、氟化物、草氨酸、吡格列酮(ploglitazone)、二氯乙酸，或其它代谢抑制剂，例如脱氢表雄酮，可以增加GAPDH与RDE的结合。其它小分子可用于减少GAPDH与RDE的结合。这样的小分子可能阻碍GAPDH的RDE结合位点，包括例如CGP 3466B马来酸盐或Heptelidic酸(均由Santa Cruz Biotechnology,Inc.销售)、戊丙酯菌素或3-溴丙酮酸。其它小分子可用于类似地抑制其它酶或多肽与RDE的结合。其它小分子可用于改变GAPDH的氧化还原状态，导致GAPDH对RDE的亲和力改变。
在一个方面，免疫细胞的激活诱导转基因的表达，所述转基因可以编码在靶(激活)位点待递送的有效负载。转基因可以编码在CAR激活和/或免疫细胞激活的位点处递送的有效负载。有效负载可以是细胞因子、抗体、报道子(例如，用于成像)、受体(例如CAR)或可以在靶位点具有期望效果的其它多肽。有效负载可以保留在细胞中，也可以保留在细胞表面来修饰细胞的行为。有效负载可以是细胞内蛋白质，例如激酶、磷酸酶、代谢酶、表观遗传修饰酶、基因编辑酶等。有效负载可以是基因调节RNA，例如microRNA、反义RNA、核酶等，或用于CRISPR***的向导RNA。有效负载还可以是膜结合蛋白例如GPCR、转运蛋白等。有效负载可以是显像剂，其允许靶位点成像(靶位点具有由CAR结合的期望量的靶抗原)。有效负载可以是检查点抑制剂，并且CAR和/或其它结合蛋白(例如，T细胞受体、抗体或先天免疫受体)可以识别肿瘤相关抗原，因此真核细胞优先在肿瘤处递送检查点抑制剂。有效负载可以是细胞毒性化合物，包括例如颗粒酶、细胞凋亡诱导剂、细胞毒性小分子或补体。在一些方面，CAR的表达处于诱导型启动子、RNA控制装置、DE、Side-CAR和/或RDE的控制之下。细胞表面上的CAR的量可以使真核细胞在肿瘤部位而不是在正常组织被优先激活，因为肿瘤显示出更高量的靶抗原(例如，可以调节CAR的量以增加在肿瘤部位vs.健康组织的亲合力)。此外，CAR表达的这种调节控制为真核细胞及其有效负载的递送提供了另一种水平的控制。在一个方面，有效负载可以保留在细胞中或细胞表面上(而不是分泌到靶标)，以修饰细胞的行为。
在一些方面，CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的表达至少部分地由与具有RDE结合活性的糖酵解酶(例如GAPDH)相互作用的RDE控制。糖酵解酶可以与RDE结合并减少CAR、DE-CAR、Side-CAR多肽和/或其它转基因产物的产生。这种多肽产生的减少可以发生是因为转译的抑制和/或mRNA降解速率的增加(RDE结合可以缩短mRNA的半衰期)。一些RDE结合蛋白可以减少转译并增强RNA的降解以降低制备的多肽的水平。RDE可以是来自转录物(例如，编码IL-2或IFN-γ的转录物)的3'UTR的富含AU的元件，或者可以是经修饰的3'UTR，其已经被工程化以去除一个或多个microRNA位点(例如，IL-2或IFN-γ的修饰的3'-UTR)。在一个方面，通过增加进行糖酵解的酶的活性来增加在由糖酵解酶(例如GAPDH)结合的RDE控制下的转基因、CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的表达。通过在细胞培养基中为细胞提供增加的葡萄糖，增加细胞中的丙糖异构酶活性，或为细胞提供增加细胞中糖酵解的化合物，例如它莫昔芬或葡萄糖，可以增加糖酵解中酶的活性。RDE可以与Hu蛋白R(HuR)结合。不希望受理论束缚，预期HuR结合一些富含AU的RDE和富含U的RDE，并且可以起到稳定mRNA的作用，导致转译增强。因此，导致HuR表达增加的细胞条件可以通过合适的富含AU的元件和/或富含U的元件增加转基因的表达，并且降低HuR表达的条件可以降低这些转基因的表达。通过表达含有HuR结合位点的重组转录物也可以改变HuR与转基因(或天然基因)的3'UTR的相互作用。这些转录物的表达将减少可用于结合转基因转录物或天然HuR调节的转录物的HuR的量，并减少这些转录物的半衰期，导致表达降低。
在一个方面，双顺反子(或多顺反子)载体用于引入两个或更多个转基因-RDE构建体。这些双顺反子构建体可以源自慢病毒。两个转基因可以在与位于编码两个转基因的核酸之间的控制区的相反链上以相反方向表达。当将超过两个转基因置于构建体(多顺反子构建体)中时，第三(和另外)转基因可以与以相反方向表达的一个或两个转基因串联放置。这些另外的转基因可以从相同的控制区表达，或者可以具有单独的控制区。一个转基因可能编码CAR，而其它转基因可能编码当CAR被激活时待递送的有效负载。编码多顺反子或双顺反子构建体中的有效负载的核酸可以通过响应细胞的糖酵解或能量状态的RDE来控制。编码CAR的转基因可以与具有高转录活性水平、低转录水平和/或是诱导型启动子的控制区域可操作地连接，并且编码有效负载的转基因可以与具有较低转录活性水平、较高转录水平和/或是可诱导的控制区域可操作地连接。CAR可以与具有较高转录水平(和/或是可诱导的)的控制区域可操作地连接，并且编码有效负载的转基因可以与具有较低转录水平(和/或是可诱导的)的控制区域可操作地连接。CAR还可以与具有较低转录水平(和/或是可诱导的)的控制区域可操作地连接，并且编码有效负载的转基因可以与具有较高转录水平(和/或是可诱导的)的控制区域可操作地连接。
在一个方面，核酸可用于在刺激免疫细胞时促进免疫细胞的应答。例如，免疫细胞可以产生更高量的免疫多肽(更大的Cmax)，具有更快的生产动力学。免疫多肽可以包括例如细胞因子、穿孔素、颗粒酶、诱导凋亡的多肽等。促进免疫应答的核酸可以包括控制区域，其可操作地连接至编码RDE的核酸，用于选定的RDE结合蛋白，使得在核酸表达为RNA时，RNA中的RDE结合抑制多肽(例如，细胞因子、穿孔素、颗粒酶和其它免疫多肽)表达的RDE结合蛋白。具有RDE的RNA的表达可以使真核细胞平衡用于由RDE控制的多肽的表达。例如，可以在免疫细胞中进行具有RDE的RNA的表达，以在刺激免疫细胞时使细胞平衡用于免疫多肽的表达。
某些RDE可能与受试者的某些疾病状态有关。通过比较来自正常细胞(组织)的转录物中的RDE与来自患病或异常细胞(组织)的转录物中的RDE，可以发现一些与疾病相关的RDE。通过使用Castello等人，Molc.Cell 63：696-710(2016)(该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)中描述的方法诱捕RDE及其RNA结合蛋白，可以将来自正常(健康)细胞的RDE及其相应的RNA结合蛋白与患病或异常细胞中的那些进行比较。与RNA结合蛋白具有异常相互作用的RDE可以与疾病状态相关联，并且基因中的RDE或来自个体的转录物的测序可能显示对疾病的易感性和/或受试者的疾病状态。
可以通过对真核细胞的代谢状态应答的RDE来控制CAR、转基因有效负载和/或转基因的RDE控制。例如，RDE可以被糖酵解酶或其它代谢酶结合，并且可以通过改变真核细胞的代谢状态来抑制CAR、转基因有效负载和/或转基因的表达。RDE可以被GAPDH结合，并且通过关闭细胞中的糖酵解(例如，使用糖酵解的抑制剂)，可以抑制CAR、转基因有效负载和/或转基因的表达。这种表达抑制可用于减少由CAR、转基因有效负载和/或转基因的表达引起的不良事件。
在一个方面，CAR、DE-CAR、Side-CAR多肽和/或其它受体可针对在急性骨髓性白血病(AML)细胞上发现的抗原，包括例如CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD64、CD66、CD123、CD133、CD157、CLL-1、CXCR4、LeY、PR1、RHAMM(CD168)、TIM-3和/或WT1。单克隆抗体293C3-SDIE可用作CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的细胞外元件(Rothfelder等人，2015，at ash.confex.com/ash/2015/webprogram/Paper81121.html，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。用于AML的其它抗原是本领域已知的，并且可能是CAR、DE-CAR、Side-CAR和/或其它受体的靶标。在一个方面，CAR、DE-CAR、Side-CAR多肽和/或其它受体可以针对在弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞上发现的抗原，包括例如CD19、CD20、CD22、CD79a、CD5、CD10和CD43。用于DLBCL的其它抗原是本领域已知的，并且可能是CAR、DE-CAR、Side-CAR和/或其它受体的靶标。
在一个方面，希望量的CAR表达可能考虑靶细胞浓度、靶细胞上靶抗原的密度、细胞外元件(抗原结合元件)对靶抗原的结合亲和力(Kd)、具有CAR的真核细胞的浓度。这些参数和其它参数可用于在真核细胞上达到希望的CAR密度，这将限定希望的CAR表达水平。希望量的CAR表达还可考虑在真核细胞上表达的抑制性受体(IR)的量，以及在靶(和其它)细胞上表达的抑制性受体配体(IRL)的量。可以至少部分应用以下公式来得到希望量的CAR多肽：
细胞活性＝[靶细胞][靶抗原密度][Kd][真核细胞] I
细胞活性＝[靶细胞][靶抗原密度][Kd][真核细胞] II
[IR][IRL]
希望量的CAR表达可以在真核细胞表面产生希望数量的CAR。希望量的CAR表达可以在真核细胞表面产生2-100,000个CAR(或DE-CAR或Side-CAR)。真核细胞可以是T淋巴细胞，并且T淋巴细胞表面的CAR(或DE-CAR或Side-CAR)的数量可以是2-100,000。CAR、DE-CAR和/或Side-CAR可以以微摩尔(μM)范围的亲和力结合到靶配体上，并且T淋巴细胞或自然杀伤细胞表面的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的希望数量可以是100-500,000。CAR、DE-CAR和/或Side-CAR可以以纳摩尔(nM)范围的亲和力结合到靶配体上，并且T淋巴细胞或自然杀伤细胞表面的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的希望数量可以是2-100,000。
编码具有选定的RDE的转录物的核酸构建体可以在免疫细胞中表达，例如T淋巴细胞。具有选定的RDE的重组转录物可以结合并消耗T淋巴细胞中RDE结合蛋白的水平，使得编码由耗尽的RDE结合蛋白调节的多肽的转录物在对其它细胞信号激活的不同阈值点表达。RDE构建体的使用可以增加表达的动力学和/或其表达受RDE控制的多肽的表达的Cmax。
附图说明
图1提供了嵌合抗原受体-RNA控制装置(Smart CAR)的示意图。
图2提供了嵌合抗原受体-去稳定元件(DE-CAR)的示意图。
图3提供了嵌合抗原受体-去稳定元件-RNA控制装置(Smart-DE-CAR)的示意图。
图4提供了图表，示出多个CAR受体随时间推移的效应物功能(E)、激活信号传递(NA)和抑制信号传递(NI)。
图5提供了图表，示出接受连续抗原刺激的CD8+T细胞随时间推移的效应物功能、T细胞能力和T细胞衰竭(或功能障碍)。
图6提供了在不同浓度的茶碱(RNA控制装置的配体)存在下抗CD19CAR、CD8+T细胞随时间推移的细胞杀伤活性的图表。
图7提供了CAR T淋巴细胞的图表，示出了时间vs.效应物功能(E)、靶细胞数量(nT)、CAR受体数量(nR)和CAR受体-靶细胞相互作用数量(nRT)。
图8示出了最佳CAR活性的图，其中三个变量是CAR拷贝数、靶表位拷贝数和CAR结合亲和力。
图9示出了新的四环素RNA控制装置(SEQ ID NO：1)。
图10示出了可替换的新的四环素RNA控制装置(SEQ ID NO：2)。
图11示出了结合6R-亚叶酸的适配体(SEQ ID NO：3)。
图12示出了结合6R-亚叶酸的可替换适配体(SEQ ID NO：4)。
图13示出了新的6R亚叶酸RNA控制装置(SEQ ID NO：5)。
图14示出了可替换的6R亚叶酸RNA控制装置(SEQ ID NO：6)。
图15示出了另一可替换的6R亚叶酸RNA控制装置(SEQ ID NO：7)。
图16示出了与静息时T细胞的生物发光相比，通过Raji靶细胞(激活CAR)或通过CD3/CD28珠(激活TCR)激活T细胞后，具有由RDE控制的荧光素酶的T细胞的生物发光的图表。
图17示出了与静息时T细胞的生物发光相比，通过Raji靶细胞(激活CAR)激活T细胞后，具有由RDE Gold1、Gold2或Gold3控制的荧光素酶的T细胞的生物发光的图表。
图18示出了与静息时T细胞的IL-12表达相比，通过Raji靶细胞(激活CAR)激活T细胞后，具有由RDE控制的IL-12表达的T细胞的IL-12表达的图表。
具体实施方式
在描述不同的实施例之前，应当理解，本公开内容的教导不限于所述的特定实施例，并且照此当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制，因为本教导的范围将仅由所附权利要求限定。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本文所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于本教导的实施或测试中，现在描述的是一些示例性方法和材料。
必须指出，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数的所指对象，除非上下文另有明确指示。还应当指出，权利要求可被撰写成排除任何可选的要素。同样的，本声明旨在作为使用结合记载的权利要求要素的排他性术语例如“仅/仅仅/单独(solely)”、“仅/仅仅(only)”等或使用“否定”限定的在先基础。除非上下文另有明确规定，否则关于物质的浓度或水平所给出的数值限制旨在为近似值。因此，当浓度表示为(例如)10μg时，意图将浓度理解为至少近似或大约10μg。
本领域技术人员在阅读本文后将显而易见的是，本文描述和示出的各个实施例中的每一个具有分离的组成部分和特征，其可以容易地与其它几个实施例中的任何一个的特征分离或组合而不偏离本教导的范围或精神。任何记载的方法可按照所记载的事件的顺序或以逻辑上可行的任何其它顺序进行。
定义
参见本公开内容，除非另外具体定义，否则本文描述中所用的技术和科学术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。因此，下列术语旨在具有以下含义。
如本文所使用的，“致动器元件(actuator element)”被定义为编码RNA控制装置的***控制功能的结构域。致动器结构域可任选地编码基因调节功能。
如本文所使用的，“抗体”被定义为一种蛋白质，其在功能上被定义为配体结合蛋白，并且在结构上被定义为包含本领域技术人员识别为来源于免疫球蛋白的可变区的氨基酸序列。抗体可由一种或多种多肽组成，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因、免疫球蛋白基因片段、杂交免疫球蛋白基因(通过组合来自不同动物的遗传信息而制备)或合成的免疫球蛋白基因编码。识别的天然免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数个免疫球蛋白可变区基因和多个D区段和J区段。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，依次分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体作为完整的免疫球蛋白，作为通过用多种肽酶消化产生的多个良好表征的片段，或作为通过重组DNA技术制备的多种片段而存在。抗体可以来源于很多不同的物种(例如，兔、绵羊、骆驼、人或啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，或者可以是合成的。抗体可以是嵌合的、人源化的或人工程化的。抗体可以是单克隆或多克隆的、多链或单链的、片段或完整的免疫球蛋白。
如本文所使用的，“抗体片段”被定义为完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指抗原结合结构域，例如完整抗体的抗原决定可变区，其足够赋予抗体片段对靶标(例如抗原)的识别和特异性结合。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体例如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”被定义为包含至少一个含轻链可变区的抗体片段和至少一个含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接并且能够被表达为单链多肽，并且其中scFv保留其所起源的完整抗体的特异性。除非另有说明，如本文所使用的，scFv可按任一顺序具有VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。
如本文所使用的，“抗原”被定义为引发免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化，或两者兼有。技术人员将会理解，包括但不限于几乎所有蛋白质或肽的任何大分子，包括糖基化多肽、磷酸化多肽和其它转译后修饰的多肽(包括用脂质修饰的多肽)，可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。技术人员将会理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将会理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发希望免疫应答的多肽。此外，技术人员将会理解，抗原完全不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以被合成或可以来源于生物样品，或者可以是除多肽以外的大分子。这种生物样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或具有其它生物组分的流体。
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”和术语“CAR”可互换使用。如本文所使用的，“CAR”被定义为包含抗原识别部分和细胞活化元件的融合蛋白。
如本文所使用的，“CAR T细胞”或“CAR T淋巴细胞”可互换使用，并且被定义为含有产生CAR多肽的能力而不管实际表达水平的T细胞。例如，能够表达CAR的细胞是含有用于在细胞中表达CAR的核酸序列的T细胞。
如本文所使用的，“共刺激元件”或“共刺激信号传递结构域”或“共刺激多肽”被定义为共刺激多肽的细胞内部分。共刺激多肽可呈现在以下蛋白质家族中：TNF受体蛋白、类免疫球蛋白蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传递淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化天然杀伤细胞受体。所述多肽的示例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、MyD88等。
如本文所使用的，“Cmax”被定义为表示在细胞被刺激或活化以产生多肽后由细胞产生的多肽的最大浓度。
如本文所使用的，“细胞因子Cmax”被定义为表示在刺激或活化以产生细胞因子后由免疫细胞产生的细胞因子的最大浓度。
如本文所使用的，“细胞毒性多肽Cmax”被定义为表示在刺激或活化以产生细胞毒性多肽后由免疫细胞产生的细胞毒性多肽的最大浓度。
如本文所使用的，“去稳定元件”或“DE”或“降解决定子(Degron)”可互换使用，并被定义为通过添加或减去配体而在细胞环境中可被诱导抗降解或易降解的多肽序列，并且将这种稳定性调节赋予以顺式融合到其上的共转译多肽。
如本文所使用的，“有效量”或“治疗有效量”可互换使用，并被定义为如本文所述的有效实现特定生物学效果的化合物、配方、材料/物质或组合物的量。
如本文所使用的，“表位”被定义为能够引发免疫应答的抗原的部分，或结合抗体的抗原的部分。表位可以是被抗体识别的蛋白质序列或子序列。
如本文所使用的，“表达载体”和“表达构建体”可互换使用，并且均被定义为设计用于细胞中蛋白质表达的质粒、病毒或其它核酸。载体或构建体用于将基因导入宿主细胞，由此载体将与细胞中的聚合酶相互作用以表达在载体/构建体中编码的蛋白质。表达载体和/或表达构建体可存在于细胞染色体外或整合到染色体中。当整合到染色体中时，包含表达载体或表达构建体的核酸将是表达载体或表达构建体。
如本文所使用的，“细胞外元件”被定义为嵌合抗原受体的抗原结合或识别元件。
如本文所使用的，“造血细胞”被定义为由造血干细胞产生的细胞。这包括但不限于骨髓祖细胞、淋巴祖细胞、巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成髓细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、血小板、单核细胞、天然杀伤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和浆细胞。
如本文所使用的，“异源”被定义为表示核酸和/或多肽与宿主细胞是不同源的。例如，如果构建体含有以未在宿主细胞中发现的方式排列的一些同源序列和/或构建体含有未在宿主细胞中发现的一些异源序列，则构建体对宿主细胞是异源的。
如本文所使用的，“细胞内元件”被定义为嵌合抗原受体的一部分，其位于真核细胞的细胞质膜的细胞质侧，并将信号传递到真核细胞中。“细胞内信号传递元件”是细胞内元件的一部分，其转导指导真核细胞执行特定功能的效应物功能信号。
如本文所使用的，“RNA去稳定元件”或“RDE”可互换使用，并且均都被定义为RNA中的核酸序列，其被蛋白质结合并且蛋白质结合改变了RNA的稳定性和/或转译。RDE的示例包括I类富含AU的元件(ARE)、II类ARE、III类ARE、富含U的元件、富含GU的元件和茎环去稳定元件(SLDE)。不希望受理论束缚，RDE还可能结合RNA稳定化多肽如HuR。
如本文所使用的，“RNase III底物”被定义为RNA序列基序，其被RNase III家族的核糖核酸内切酶识别和切割。
如本文所使用的，“RNAi底物”被定义为由短干扰RNA(siRNA)结合和/或切割的RNA序列，所述短干扰RNA与Argonaute家族的效应物核酸内切酶复合。
如本文所使用的，“单链抗体”(scFv)被定义为具有抗原结合活性功能的免疫球蛋白分子。scFv(单链片段可变)形式的抗体由重链(VH)和轻链(VL)的可变区组成，它们通过柔性的肽接头连接在一起。
如本文所使用的，“T淋巴细胞”或“T细胞”被定义为通常在胸腺中发育的造血细胞。T淋巴细胞或T细胞包括但不限于天然杀伤T细胞、调节T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、γδT细胞和粘膜不变T细胞。
如本文所使用的，“转染的”或“转化的”或“转导的”被定义为将外源核酸转入或导入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原始受试细胞及其后代。
如本文所使用的，“跨膜元件”被定义为细胞外元件和细胞内元件之间的元件。跨膜元件的一部分存在于细胞膜内。
去稳定元件
去稳定元件(DE)是能够与小分子配体相互作用的影响稳定性的多肽，利用配体的存在、不存在或数量来调节感兴趣的DE-多肽的稳定性。感兴趣的多肽可以是免疫调节多肽。感兴趣的多肽还可以是CAR。通过DE-CAR结合配体可以降低真核细胞中DE-CAR多肽的降解速率。通过DE-CAR结合配体还可以提高真核细胞中DE-CAR的降解速率。
示例性的去稳定元件或DE披露于2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文。例如，USSN 15/070,352描述了来源于FKBP蛋白的变体、DHFR蛋白的变体、变体***受体结合结构域(ERBD)和燕麦的变体向光素1(AsLOV2)的DE。变体FKBP核酸和多肽的其它示例披露于2012年7月12日公开的美国公开专利申请20120178168A1中，该专利申请出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文。变体DHFR核酸和多肽的其它示例披露于2012年7月12日公开的美国公开专利申请20120178168Al中，该专利申请出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文。变体ERBD核酸、多肽和配体的其它示例披露于公开的美国专利申请20140255361中，该专利申请出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文。变体AsLOV2DE的其它示例披露于Bonger等人，ACSChem.Biol.2014，vol.9，pp.111-115，和Usherenko等人，BMC Systems Biology 2014，vol.8，pp.128-143中，所述文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
其它DE可以来源于如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中描述的其它配体结合多肽，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
可以制备变体用作DE的其它配体结合多肽包括例如酶、抗体或抗体片段或通过重组DNA方法使其工程化具有可变结构域的抗体片段、配体结合受体、或其它蛋白质。酶的示例包括含溴区结构域的蛋白质、FKBP变体或原核DHFR变体。可用于制备DE的受体元件的示例包括：变体ERBD、或具有对哺乳动物尤其是人类无毒的配体的其它受体。
可以选择DE的配体以优化治疗吸引力的某些属性，例如，如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中所述，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
RNA控制装置
本文公开的核糖核酸(RNA)控制装置可展现出基因表达、设计模块性和靶特异性的可调谐调节。RNA控制装置可起重新布线通过细胞网络的信息流并重新编程细胞行为的作用以响应细胞环境的变化。在调节多肽表达方面，RNA控制装置可充当合成细胞传感器以监测不同输入分子水平的时间和空间波动。RNA控制装置代表用于构建配体控制的基因调控***的强大工具，定制以调节本发明的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的表达，来响应特定的效应物分子，使多种生命***中靶CAR、DE-CAR和/或Side-CAR构建体的RNA调节成为可能。
本文公开的RNA控制装置包括调节元件和传感器元件。本文公开的RNA控制装置可包括具有调节和传感功能的单个元件。本文公开的RNA控制装置可包括调节功能和传感功能。本文公开的RNA控制装置可包括调节元件、传感器元件和功能上耦合调节元件和传感器元件的信息传输元件(ITE)。ITE可以基于例如链置换机制、静电相互作用、构象变化或空间效应。RNA控制装置的传感功能导致RNA控制装置的结构变化，导致作用功能的活性改变。可以发生这些结构变化的一些机制包括空间效应、疏水性驱动效应(log p)、静电驱动效应、核苷酸修饰效应(例如甲基化、假尿苷修饰(pseudouradination)等)、次级配体相互作用效应和其它效应。链置换机制可以利用两个核酸序列(例如，竞争链和RNA控制装置链)与RNA控制装置的一般传递区域(例如，适体的基干)的竞争性结合，以引起调节元件的破坏或恢复，来响应配体与传感器元件的结合。
RNA控制装置可包括传感器元件和调节元件。传感器元件可以是RNA适体。RNA控制装置可具有多于一个的传感器元件。在一些方面，调节元件可以是核酶。核酶可以是锤头状核酶。核酶还可以是发夹状核酶、或肝炎δ病毒(HDV)核酶、或Varkud卫星状(VS)核酶、glmS核酶、和/或本领域已知的其它核酶。
RNA控制装置可以嵌入DNA序列中。可以将RNA控制装置编码在信使RNA中。多个RNA控制装置可以与转基因编码的mRNA顺式编码。多个RNA控制装置可以是相同的和/或重复的不同RNA控制装置的混合物。可以重复用于编码RNA控制装置的核酸。通过包括多个RNA控制装置，可以定制或优化灵敏度和剂量反应。多个RNA控制装置各自可以对于不同的配体是特异性的。这可以减轻由于与传感器元件相互作用的内源产生的配体的无意识表达。
RNA控制装置：传感器元件
示例性传感器元件披露于2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。传感器元件可以来源于适体。“适体”是能够通过高亲和力和特异性与特定分子结合的核酸分子，例如RNA或DNA，(Ellington等人，Nature 346，818-22(1990)；和Tuerk等人，Science 249，505-10(1990)，所述文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)。关于识别小分子的适体的综述，参见Famulok，Science 9：324-9(1999)，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文。
适体对其配体的结合亲和力必须足够强，并且当与其配体结合时由适体形成的结构必须足够显著，以便使本发明的RNA控制装置在“打开”和“关闭”状态之间切换。适体和相关配体的结合常数使得配体与适体结合并且在向受试者施用配体时获得的配体浓度具有期望的效果。对于体内应用，例如，结合常数应使得结合发生在远低于血清或其它组织中可达到的配体浓度，或远低于可在细胞内实现的配体浓度，因为细胞膜可能不能充分渗透以使细胞内配体浓度接近血清或细胞外环境中的水平。用于体内应用的所需配体浓度还可低于可能对受试者具有不良影响的浓度。
RNA控制装置的配体
可以通过添加外源配体或合成(或添加)内源配体(具有希望的结合特性、动力学、生物利用度等)来控制RNA控制装置，例如，如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中所述，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
配体可以是天然存在的分泌代谢物。例如，由肿瘤独特产生或存在于肿瘤微环境中的配体是传感器元件的配体，并且该配体与传感器元件的结合改变了RNA控制装置的活性。因此，控制装置通过化学信号传递或接近肿瘤来响应和受控制。
可以根据其药效学或ADME行为选择配体。例如，配体可以优先定位于人体解剖学和生理学的特定部分。例如，某些分子优先在肠道、肝脏、肾脏等中被吸收或代谢。可以选择配体以证实在特定器官中的优先药效学行为。例如，使配体优先定位于结肠用于结肠直肠癌会是有用的，以便配体的峰值浓度在所需位点，而身体其余部分中的浓度最小化，防止不希望的非特异性毒性。可以选择配体以证明非优先的药效学行为。例如，对于像血液恶性肿瘤这样的播散性肿瘤，使非变量浓度的配体贯穿身体会是有用的。
RNA控制装置(或DE)的配体可以是亚叶酸、S-亚叶酸、R-亚叶酸、维生素C(抗坏血酸)、阿昔洛韦等。
RNA控制装置：调节元件
调节元件可包括核酶，或反义核酸，或产生siRNA或miRNA的RNAi序列或前体，或shRNA或其前体，或RNAse III底物，或可替换的剪接元件，或转录终止子，或核糖体结合位点，或IRES，或polyA位点。可用于本发明的调节元件，例如，披露于2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
已经综述了构建可用于反义技术的寡聚体的一般方法，例如，参见van der Krol等人(1988)Biotechniques 6：958-976；和Stein等人(1988)Cancer Res 48：2659-2668，上述文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文。可用于本发明的某些miRNA披露于Brennecke等人，Genome Biology4：228(2003)；Kim等人，Mol.Cells.19：1-15(2005)，上述文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文。
RNA控制装置可具有多个调节元件和/或多个传感器元件。多个传感器元件可以识别相同或不同的配体。多个传感器元件可以对调节元件具有不同的(例如，增量的、附加的或协同的)效应。
RNA去稳定元件
RNA去稳定元件(RDE)是影响或维持RNA分子的稳定性或RNA分子的转译动力学的核酸。一些RDE与使RNA不稳定(例如，切割)或阻止转译的多肽结合，导致RNA的功能丧失。一些RDE结合多肽稳定RNA，增加RNA的半衰期。RDE可用于控制转基因的表达，例如编码嵌合抗原受体的转基因。RDE可与RNA控制装置、DE和/或Side CAR一起使用以调节转基因的表达。RDE还可用于控制编码除CAR之外的多肽的转基因的表达。其它转基因可以编码，例如，细胞因子、抗体、检查点抑制剂、颗粒酶、细胞凋亡诱导剂、补体、细胞毒性小分子、其它细胞毒性化合物、用于成像的多肽、或可以具有希望效应的其它多肽。RDE可以控制转基因有效负载的传送。RDE的示例包括例如富含AU的元件、富含U的元件、富含GU的元件和某些茎环元件。示例性RDE披露于Kovarik等人，Cytokine 89：21-26(2017)；Ray等人，Nature 499：172-177(2013)；Castello等人，Cell 149：1393-1406(2012)；Vlasova等人，Molc.Cell.29：263-270(2008)；Barreau等人，Nucl.Acids Res.vol 33，doi：10.1093/nar/gki1012(2006)；Meisner等人，ChemBioChem 5：1432-1447(2004)；Guhaniyogi等人，Gene 265：11-23(2001)，所有文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
RDE可以是I类富含AU的元件(富含U的环境中的分散的AUUUA(SEQ ID NO：8))、II类富含AU的元件(重叠(AUUUA)n)、III类富含AU的元件(富含U的伸展(stretch))、茎环去稳定元件(SLDE)、细胞因子3'UTR(例如，INF-γ、IL-2、T细胞受体α链、TNFα、IL-6、IL-8、GM-CSF、G-CSF等)和AUUUAUUUAUUUA序列(SEQ ID NO：9)。Khabar，WIREs RNA 2016，doi：10.1002/wrna.l368(2016)；Palanisamy等人，J.Dent.Res.91：651-658(2012)，两篇文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。RDE也可以是由例如UUGUU(SEQ ID NO：10)、UGGGGAU(SEQ ID NO：11)或GUUUG(SEQ ID NO：12)中的一种或多种组成的富含GU的元件。RDE可以是由例如UUUGUUU(SEQ ID NO：13)、NNUUNNUUU(SEQ ID NO：14)、UUUAUUU(SEQ IDNO：15)、UUUUUUU(SEQ ID NO：16)、UUAGA(SEQ ID NO：17)或AGUUU(SEQ ID NO：18)中的一种或多种组成的富含U的元件。在一些方面，可以组合多个RDE以制备调节单元，例如，具有相同序列的多个RDE可以排列在多联体中，或者可以在一些或所有RDE之间以间插序列排列。可以修饰RDE序列以增加或降低RNA结合蛋白对RDE的亲和力。例如，可以改变富含AU的RDE以改变磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对RDE的亲和力。亲和力的这种改变可以改变由与GAPDH结合的RDE调节的转基因表达的GAPDH激活阈值。
RDE可以来自编码例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、G-CSF、VEG F、PGE2、COX-2、MMP(基质金属蛋白酶)、bFGF、c-myc、c-fos、betal-AR、PTH、干扰素-γ、MyoD、p21、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、PAI-2、NOS HANOS、TNF-α、干扰素-α，bcl-2、干扰素-β、c-jun、GLUT1、p53、肌细胞生成素、NF-M、或GAP-43、淋巴细胞抗原96、SUPV3L1、SFtPA2、BLOC1S2、OR10A6、OR8D1、TRPT1、CIP29、EP400、PLE2、H3ST3A1、ZNF571、PPP1R14A、SPAG4L、OR10A6和KIR3DL的基因的3’UTR。其它RDE发现于例如来自GLMN、AMY2B、AMY2A、AMY2A、AMY1A、TRIM33、TRIM33、TRIM33、CSRP1、PPP1R12B、KCNH1、Reticulon_4、MRPL30、Nav1.2、组织因子路径抑制剂、EEF1B2、CRYGB、ARMC9、RPL15、EAF2、MRPS22、MRPS22、COPB2、PDCD10、RE1-沉默转录因子、双调蛋白、AP1AR、TLR3、SKP2、肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶、TNFAIP8、白细胞介素9、PCDHA2、PCDHA12、醛脱氢酶5家族、构件Al、KCNQ5、COX7A2、单羧酸转运蛋白10、MLLT4、PHF10、PTPN12、MRNA(鸟嘌呤-N7-)-甲基转移酶、WHSC1L1、Tricho-rhino-phalangeal综合征类型1、干扰素α-1、ZCCHC6、色素性视网膜炎GTP酶调节物、MED14、CLCN5、DNA2L、OR52D1、NELL1、SLC22A25、SLC22A10、TRPC6、CACNA2D4、EPS8、CT2(基因)、线粒体核糖体蛋白L42、TAOK3、NUPL1、内皮素受体B型、存活的运动神经元蛋白-相互作用蛋白1、POLE2、肝脂肪酶、TPSG1、TRAP1、RPS15A、HS3ST3A1、CROP(基因)、载脂蛋白H、GRB2、CEP76、VPS4B、白细胞介素28B、IZUMO1、FGF21、PPP1R15A、LIN7B和CDC45相关蛋白的3'UTR。
还有其它RDE可以发现于例如SCFD1、MAL2、KHSRP、IQCB1、CAMP反应元件调节剂、MFAP5、SBF2、FKBP2、PDCD10、UBE2V2、NDUFAB1、含有卷曲螺旋结构域的蛋白质、ALG13、TPTE、Enaptin、胸腺生成素、类δ_l、C11orf30、辅肌动蛋白α4、TMEM59、SP110、Dicer、TARDBP、IFNA17、IFNA16、IFNA14、ZMYM3、I型白细胞介素9、OPN1SW、THSD1、ERGIC2、CAMK2B、WDR8、FXR1、胸腺嘧啶-DNA糖基化酶、甲状旁腺激素相关蛋白、OSBPL3、Ran、GYPE、AKAP4、LOC642658、L2HGDH、AKAP1、锌指蛋白334、TC2N、FKBPL、GRB14、CXorf67、CXorf66、CEP76、Gastricsin、CEP70、CYP26A1、NAA35、芳基碳氢化合物受体细胞核转运蛋白、KLC4、GPR112、LARP4、NOVA1、UBE2D3、ITGA6、GPR18、A型MGST、RE1-沉默转录因子、ASPM、ZNF452、KIR2DS4、AHSA1、TMTC4、VSX1、P16、MRPL19、CCL20、TRPT1、肝脂酶、PDLIM5、CCDC53、'CCDC55、GAPVD1、HOXB2、KCNQ5、BRCC3、GTF2IRD1、CDK5RAP3、转录因子II B、ZEB1、IRGM、SLC39A6、RHEB、PSIP1、RPS6KA5、尿激酶受体、GFM1、DNAJC7、磷酸肌醇依赖性激酶-1、LMOD3、TTC35、RRP12、ATXN2、ACSM3、SOAT1、FGF8、HNRPH3、CTAGE5、POLG2、DYRK3、POLK、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C、CD137、钙调蛋白1、ZNF571、CNOT2、CRYZL1、SMC3、SMC4、SLC36A1、核心蛋白聚糖、HKR1、ERC1、S100A6、RIMS1、TMEM67、线粒体核糖体蛋白L42、MECP2、RNF111、SULT1A1、MYLK3、TINAG、PRKAR1A、RGPD5、UBE2V1、SAR1B、SLC27A6、ZNF638、RAB33A、TRIOBP、MUCL1、CADPS2、MCF2L、TBCA、SLC17A3、LEO1、IFNA21、RUNX1T1、PRKD2、ATP11B、MORC2、RBM6、KLRD1、MED31、PPHLN1、HMGB2、类DNA修复和重组蛋白RAD54、RBM9'、ARL11、HuD、SPEF2、CBLL1、SLC38A1、'半胱天冬酶1'、S100G、CA1、CELA1、PTS、ITM2B、利尿钠肽前体C、TRPP3、IMPDH2、DPYS、CDCA3、EFCAB6、SLIT2、SIPA1L1、FIP1L1、ATP6V1B2、HSD17B4、HSD17B7、NDUFC1、CROP、CD48、APPBP1、CD44、CD46、XI型组蛋白脱乙酰酶2、白细胞介素4、1型Tricho-rhino-phalangeal综合征、SEC61G、TRIP12、PLEKHO1、SEC61B、ST6GALNAC1、CPVL、E2F7、UTP20、E2F5、PARD3、EXOC7、HEXB、含半胱天冬酶募集结构域蛋白8、MBD4、PPP4C、解旋酶、Phosducin、SPG11、CGGBP1、PSKH1、组织蛋白酶S、增食欲素、IMMP2L、C2orf28、层粘连蛋白、EIF3S6、XII型LRRC41、组织蛋白酶C、HPS6、ARAF、含锌指和BTB结构域蛋白16、性激素结合球蛋白、FBLN2、细胞因子信号传递抑制剂l、TMEM126A、DOM3Z、类TSFM POLQ、DYNLT3、CDH9、EAF2、MIPEP、NDUFA12、HDAC8、MKKS、FGG、IL36G、CDCA7、CRISPLD2、类嗅质蛋白(Olfactomedin)2b、MRPL32、MRPL33、AHI1、SMARCAL1、UTP14A、SSH2、肌张力异常蛋白、接触蛋白6、PPFIBP1、THOC1、CNOT1、RHCE、SLC41A3、SLC2A9、SNAP23、RFX3、GNG4、MRPL40、LSR、血管生成素、TRIP4、VRK1、COUP-TFII、FOXP2、SNX2、核孔蛋白85、RPL37A、RPL27A、SEC62、钙激活钾通道亚单位α-l、SMARCE1、RPL17、CEP104、CEP290、VPS29、ANXA4、锌指蛋白737、DDX59、SAP30、NEK3、外来体组分9、活化C激酶1受体、肽基脯氨酰异构酶A、TINP1、CEACAM1、DISC1、LRRTM1、POP1核纤层蛋白Bl、SREBP切割-激活蛋白、COX6C、TLR1、ARID2、LACTB、MMS22L、UBE2E3、DAP3、ZNF23、SKP2、GPR113、IRF9饥饿激素O-酰基转移酶、NEIL3、EEF1E1、COX17、ESD、牙本质涎磷蛋白、HDAC9、RFC4、CYLD、RPLP0、EIF2B3、UGT2A1、FABP7、TRIP11、PLA2G4A、AKR1C3、INTS12、MYH1、ZBTB17、MYH4、NLRP2、MECOM、MYH8、产热素(Thermogenin)受体2、IFI16、THYN1、RAB17、ETFA、囊性纤维化跨膜传导调节因子、F13B、RAB6A、ST8SIA1、SATB2、SATB1、HMG20B、UHRF1、CNOT3、***素EP2受体、FAM65B、过氧化物酶体增殖物活化受体γ、KvLQT2、GRIK5、SHOC2、皮动蛋白、FANCI、KIAA1199、犬尿氨酸酶、Decoy受体1、NEU3、PHF10、甲基-CpG-结合结构域蛋白2、RABGAP1、CEP55、SF3B1、MSH5、MSH6、CREB-结合蛋白、LIMS1、SLC5A4、CCNB1IP1、RNF34、SORBS2、UIMC1、SOX5、YWHAZ、ICOSLG、NOP58、锌指蛋白679、PHKB、MED13、ABCB7、COQ9、C14orf104、锌指蛋白530、KLRC2、LSM8、NBR1、PRKCD、长链醛脱氢酶、MTSS1、生长抑素、泛素羧基末端水解酶L5、WDR72、FERMT3、核受体相关-1蛋白、柠檬酸合成酶、VPS11、KIZ、ZFYVE27、BCKDHB、下视丘分泌素、CACNG2、PTCH1、碳酸酐酶4、核孔蛋白107、LDL受体、LEKTI、FBXO11、NDUFB3、FCHO2、CEP78、RAPGEF6、PPIL3、NIN、RAPGEF2、生长激素l、生长激素2、MNAT1、Nav1、MAP3K8、SUGT1、LAIR1、透明质酸介导的运动受体、MAP3K2、MPP2、TFB2M、CRB3、MPP5、CACNA1G、DLGAP2、INHBA、MAGI2、CIP29、SETDB1、细胞色素b5、TRPV2、白细胞介素1受体、HOXD8、TIMM10、ATXN2L、CLCN2、CREB1、TNIP1、CBLB、因子V、USP33、SON、RBBP8、SLC22A18、PTPN12、ADCY8、MYLK、KIF23、REXO2、BST1、TOP3B、COPB1、AXIN2、COPB2、TNRC6B、胍基乙酸N-甲基转移酶、酰基辅酶A硫酯酶9、C4orf21、TSHB、FRS3、EPB41、细胞周期蛋白T2、LAIR2、核孔蛋白43、APLP2、TNFRSF19、死亡相关蛋白6、上皮细胞粘附分子、CLEC7A、桥尾蛋白、CLDND1、VPS37A、PCDHAC2、骨形态发生蛋白4、NVL、RBM33、RNF139、***相关抗原5、PLCB1、衍生自神经胶质细胞系的神经营养因子、PARP4、PARP1、MAN2A1、骨形态发生蛋白1、PAX4、BCCIP、MMP7、Decoy受体3、RAMP2、NCAPD3、LRRC37A、RWDD3、UBE2A、UBE2C、SLC3A1、MRPS22、CDC14A、ITSN1、POLE2、MYC诱导的核抗原、TMLHE、谷氨酸羧肽酶II、GPR177、PPP2R5C、KIAA1333、RPP38、MYO1F、法尼醇X受体、钙调结合蛋白、FBXO4、FBXO5、OPN1MW、PIGN、ARNTL2、BCAS3、C6orf58、PHTF2、SEC23A、NUFIP2、OAZ1、骨保护素、ANAPC4、ATP6V0A2、SPAM1、PSMA6、TAS2R30、RABEP1、DPM3、SLC6A15、RPS26、RPS27、RPS24、RPS20、RPS21、ARHGAP24、儿茶酚-O-甲基转移酶、ERCC5、转录起始蛋白SPT3同源物、OR1E1、ZNRF1、GMEB1、CCT2GNAQ、粘蛋白6、粘蛋白4、LRP5、PDE9A、C2orf3、EZH2、表皮生长因子受体、TMTC2、PDE4A、EPH受体A4、PPIB、DENND4A、ANTXR1、ANTXR2、核孔蛋白88、SLCO1B3、COG8、RBMS1、MAP7、HIST2H2BE、AEBP2、DCLRE1A、RPL24、HNRPA2B1、RPL21、RPL23、MAPKAP1、NIPBL、ATG7、SERPINI2、GYLTL1B、ATP5G2、DIP2A、AMY2A、CEP63、TDRD7、PIEZO1、CLDN20、GRXCR1、PMEL、NIF3L1、MCC、PCNX、TMBIM4、DUSP12、ZMYND8、GOSR1、干扰素γ受体1、LDB3、PON3、C1D、ABCC8、COQ7、COQ6、AMELY、HAVCR1、PICALM、Sjogren综合征抗原B、PLK4、HBB、AKT1、PCDHGB7、C6orf10、UBR1、类视网膜母细胞瘤蛋白1、GRK6、WWC2、GRK4、INPP4B、SLC34A1、GOLGA2、MYCBP2、PTP4A2、NUCB2、MAGOH、RPP40、α-2A肾上腺素受体、SPAG11B、核孔蛋白205、COG1、活动***结构域包含3、KCNMB3、活动***结构域包含l、KLHL7、KCNN2、TSPAN8、GPR21、转运蛋白、HNRNPLL、ABHD5、CAB39L、双调蛋白、GPR1、白细胞介素18、EIF4G3、白细胞介素15、CCDC80、CD2AP、NFS1、GRB2、ULBP2、血管内皮生长因子C、RPS3、TLR8、BCL2相关蛋白Al、RHOT1、胶原蛋白、着丝粒蛋白E、STMN2、HESX1、RPL7、钾蛋白(Kalirin)、PCMT1、HLA-F、SUMO2、NOX3、EP400、DNM3、EED、NGLY1、NPRL2、PLAC1、含有杆状病毒IAP重复的蛋白3、C7orf31、TUBA1C、HAUS3、IFNA10、MYST4、DCHS1、SIRT4、EFEMP1、ARPC2、MED30、IFT74、PAK1IP1、DYNC1LI2、POLR2B、POLR2H、KIF3A、PRDM16、PLSCR5、PEX5、甲状旁腺激素l受体、CDC23、RBPMS、MAST1、NRD1、BAT5、BAT2、Dock11、GCSH、POF1B、USP15、POT1、MUTYH、CYP2E1、FAM122C、Al多肽、含有黄素的单加氧酶3、HPGD、LGALS13、MTHFD2L、生存运动神经元结构域含有1、PSMA3、MRPS35、MHC类别I多肽相关序列A、SGCE、REPS1、PPP1R12A、PPP1R12B、PABPC1、MAPK8、PDCD5、磷酸葡萄糖变位酶3、泛素C、GABPB2、线粒体转译释放因子1、PFDN4、NUB1、SLC13A3、ZFP36L1、半乳糖凝集素-3、CC2D2A、GCA、组织因子途径抑制剂、UCKL1、ITFG3、SOS1、WWTR1、GPR84、HSPA14、GJC3、TCF7L1、基质金属肽酶12、ISG20、LILRA3、血清白蛋白、类光传感因子、RPS13、UTP6、HP1BP3、IL12A、HtrA丝氨酸肽酶2、LATS1、BMF、胸腺素β-4、B细胞接头、BCL2L11、凝血因子XIII、BCL2L12、PRPF19、SFRS5、白细胞介素23亚基α、NRAP、60S核糖体蛋白L14、C9orf64、Testin、VPS13A、DGKD、PTPRB、ATP5C1、KCNJ16、KARS、GTF2H2、AMBN、USP13、ADAMTSL1、TRO、RTF1、ATP6V1C2、SSBP1、SNRPN上游读码框蛋白、RPS29、SNRPG、ABCC10、PTPRU、APPL1、TINF2、TMEM22、UNC45A、RPL30、PCDH7、半乳糖胺-6硫酸酯酶、UPF3A、ACTL6A、ACTL6B、IL3RA、SDHB、组织蛋白酶L2、TAS2R7、组织蛋白酶L1、垂体腺苷酸环化酶激活肽、RPN2、DYNLL1、KLK13、NDUFB3、PRPF8、SPINT2、AHSA1、谷氨酸羧肽酶II、DRAP1、RNASE1、类嗅质蛋白2b、VRK1、IKK2、ERGIC2、TAS2R16、CAMK2G、CAMK2B、***受体β、NADH脱氢酶、RPL19、NUCB2、KCTD13、泛醌、H2AFY、CEP290、PABPC1、HLA-F、DHX38、KIAA0922、MPHOSPH8、DDX59、MIB2、ZBP1、C16orf84、UACA、C6orf142、MRPL39、细胞周期蛋白依赖性激酶7、Far上游元件结合蛋白l、SGOL1、GTF2IRD1、ATG10、皮离蛋白、EPS8L2、核心蛋白聚糖、烟酰胺磷酸核糖转移酶、CDC20、MYB、WNT5A、RBPJ、DEFB103A、RPS15A、ATP5H、RPS3、FABP1、SLC4A8、血清淀粉样蛋白P组分、ALAS1、MAPK1、PDCD5、SULT1A1、CHRNA3、ATXN10、MNAT1、ALG13、Ataxin3、LRRC39、ADH7、δ-肌聚糖、TACC1、IFNA4、胸腺基质淋巴细胞生成素、LGTN、KIAA1333、MSH6、MYOT、RIPK5、BCL2L11、RPL27、Rnd1、血小板因子4、HSD17B7、LSM8、CEP63、INTS8、CTNS、ASAHL、CELA3A、SMARCAL1、HEXB、SLC16A5、MAP3K12、FRMD6的3'UTR。
RDE可以是I类富含AU的元件，其来自编码例如c-myc、c-fos、betal-AR、PTH、干扰素-γ、MyoD、p21、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、PAI-2或NOS HANOS的基因的3'UTR。RDE还可以是II类富含AU的元件，并且来自编码例如GM-CSF、TNF-α、干扰素-α、COX-2、IL-2、IL-3、bcl-2、干扰素-β或VEG-F的基因的3'UTR。RDE可以是III类富含AU的元件，其来自编码例如c-jun、GLUT1、p53、hsp70、肌细胞生成素、NF-M或GAP-43的基因的3'UTR。其它RDE可以从T细胞受体亚基(α、β、γ或δ链)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白(PD-1)、杀伤细胞类免疫球蛋白受体(KIR)和淋巴细胞活化基因3(LAG3)，以及其它检查点抑制剂的3'-UTR获得。还可以从披露于Coppe等人，Ann.Rev.Pathol.5：99-118(2010)中的衰老相关分泌表型基因的3'-UTR获得其它RDE，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文(例如，参见表1)。
RDE可以被某些多肽结合，包括例如ARE poly(U)结合/降解因子(AUF-1)，tristetraprolin(TTP)，人抗原相关蛋白(HuR)，丁酸响应因子1(BRF-1)，丁酸响应因子2(BRF-2)，T细胞限制性细胞内抗原-1(TIA-1)，TIA-1相关蛋白(TIAR)，CUG三联体重复，RNA结合蛋白1(CUGBP-1)，CUG三联体重复，RNA结合蛋白2(CUGBP-2)，人神经元特异性RNA结合蛋白(Hel-N1、Hel-N2)，RNA结合蛋白HuA、HuB和HuC，KH型剪接调节蛋白(KSRP)，3-甲基戊烯二酰辅酶A水合酶(AUH)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，热休克蛋白70(Hsp70)，热休克蛋白10(Hsp10)，异质细胞核核糖核蛋白A1(hnRNPA1)，异质细胞核核糖核蛋白A2(hnRNPA2)，异质细胞核核糖核蛋白A3(hnRNPA3)，异质细胞核核糖核蛋白C(hnRNP C)，异质细胞核核糖核蛋白L(hnRNP L)，Bcl-2富含AU的元件RNA结合蛋白(TINO)，Poly(A)结合蛋白相互作用蛋白2(PAIP2)，IRP1，丙酮酸激酶，乳酸脱氢酶，烯醇酶和醛缩酶。RDE结合蛋白还可以是参与糖酵解或碳水化合物代谢的酶，例如甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇酶(ENO1或ENO3)、磷酸甘油酸激酶(PGK1)、磷酸丙糖异构酶(TPI1)、醛缩酶A(ALDOA)、磷酸甘油酸变位酶(PGAM1)、己糖激酶(HK-2)或乳酸脱氢酶(LDH)。RDE结合蛋白可以是参与戊糖磷酸旁路的酶，包括例如转酮酶(TKT)或磷酸丙糖异构酶(TPI1)。另外的示例性RNA结合蛋白是披露于Castello等人，Molc.Cell 63：696-710(2016)；Kovarik等人，Cytokine 89：21-26(2017)；Ray等人，Nature 499：172-177(2013)；Castello等人，Cell 149：1393-1406(2012)；Vlasova等人，Molc.Cell.29：263-270(2008)；Barreau等人，Nucl.Acids Res.vol 33，doi：10.1093/nar/gki1012(2006)；Meisner等人，ChemBioChem 5：1432-1447(2004)；Guhaniyogi等人，Gene 265：11-23(2001)中的那些，所有这些文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
RDE结合蛋白可以是TTP，其可结合RDE，包括例如UUAUUUAUU(SEQ ID NO：19)和AUUUA(SEQ ID NO：8)中的一种或多种，或结合富含AU的RDE的KSRP，或结合RDE的Aufl，包括例如UUGA(SEQ ID NO：20)、AGUUU(SEQ ID NO：18)或GUUUG(SEQ ID NO：12)中的一种或多种，或结合RDE的CELF-1，包括例如UUGUU(SEQ ID NO：10)中的一种或多种，或结合RDE的HuR，包括例如UUUAUUU(SEQ ID NO：15)、UUUUUUU(SEQ ID NO：16)或UUUGUUU(SEQ ID NO：13)中的一种或多种，或结合RDE的ESRP1或ESRP2，包括例如UGGGGAU(SEQ ID NO：21)中的一种或多种，或结合RDE的ELAV，包括例如UUUGUUU(SEQ ID NO：13)中的一种或多种。RDE结合蛋白可以是参与糖酵解的酶，包括例如结合富含AU的元件的GAPDH，包括例如AUUUA(SEQ IDNO：8)元件中的一种或多种，或结合RDE的ENO3/ENO1，包括例如CUGCUGCUG(SEQ ID NO：22)中的一种或多种，或结合RDE的ALDOA，包括例如AUUGA(SEQ ID NO：23)中的一种或多种。
一些RNA结合蛋白在结合RDE后增加RNA降解的速率。一些RNA结合蛋白在结合RDE后降低RNA降解的速率。不止一种RNA结合蛋白可以与RDE结合。在一些RDE调节单元中，不止一种RNA结合蛋白与多于一种RDE结合。一种或多种RNA结合蛋白与一种或多种RDE的结合可提高RNA的降解速率。一种或多种RNA结合蛋白的结合可降低RNA的降解速率。提高降解的RNA结合蛋白可以与降低降解的RNA结合蛋白竞争结合RDE，使得RNA的稳定性取决于两种RNA结合蛋白的相对结合。其它蛋白质可与RDE结合蛋白结合，并用RDE调节RNA结合蛋白对RNA的影响。蛋白质与RNA结合蛋白的结合可以增加RNA稳定性或降低RNA稳定性。RNA可以具有多个由蛋白质HuR和TTP结合的RDE。HuR蛋白可以稳定RNA，而TTP蛋白可以使RNA不稳定。RNA可以具有至少一个与蛋白质KSRP、TTP和/或HuR相互作用的RDE。KSRP可以使RNA不稳定并与可以稳定RNA的HuR蛋白竞争结合。KSRP蛋白可以与RDE结合并使RNA不稳定，并且TTP蛋白可以与KSRP结合并防止RNA降解。不同的蛋白质可以与相同的转录物结合，并且可能对降解和稳定化速率具有竞争效应。不同的蛋白质可以与相同的转录物结合，并且可以对降解和稳定化速率具有协同效应。不同的蛋白质可以在不同的时间与相同的转录物结合，赋予对降解和稳定化的不同效应。
RDE可以是II类富含AU的元件，而RNA结合蛋白可以是GAPDH。由GAPDH结合的II类富含AU的元件可以是AUUUAUUUAUUUA(SEQ ID NO：9)。II类富含AU的元件和GADPH可用于控制转基因、CAR、Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side-CAR的表达。II类富含AU的元件和GADPH还可用于影响T淋巴细胞中转基因、CAR、Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side-CAR的表达。II类富含AU的元件和GADPH可用于影响CD8+T淋巴细胞中转基因、CAR、Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side-CAR的表达。II类富含AU的元件和GADPH可用于影响CD4+T淋巴细胞中转基因、CAR、Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side-CAR的表达。II类富含AU的元件和GADPH可用于影响天然杀伤细胞中转基因、CAR、Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side-CAR的表达。
RDE可具有microRNA结合位点。可以工程化RDE以去除这些microRNA结合位点中的一个或多个。去除microRNA结合位点可以使具有RDE的构建体的表达增加至少5倍、10倍、15倍、20倍、50倍或100倍。具有microRNA位点的RDE可以是由GAPDH结合的RDE。从由GAPDH结合的RDE去除microRNA位点可以使具有GAPDH敏感性RDE的构建体的表达增加至少5-10倍。通过RDE的这种GAPDH控制可用于在靶位点传送有效负载。GAPDH控制可以通过识别优先在靶位点发现的抗原的CAR活化真核细胞相关联。
RDE可以是IL-2或IFN-γ的3'-UTR，并且microRNA位点的去除可以增加来自具有RDE的转基因RNA的表达速率和/或表达的动态范围。RDE可以是IL-2的3'-UTR，并且去除的microRNA位点可以是MIR-186位点，其缺失增加了表达的动力学并且使表达的动态范围增加约50倍。RDE还可以是IFN-γ的3'-UTR，并且去除的microRNA位点可以是MIR-125位点。
嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(CAR)可以是融合蛋白，包括细胞外抗原结合/识别元件、将受体锚定至细胞膜的跨膜元件和至少一种细胞内元件。这些CAR元件在本领域是已知的，例如如专利申请US20140242701中所述，该专利申请出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。CAR可以是由构建体表达的重组多肽，包括至少细胞外抗原结合元件、跨膜元件和细胞内信号传递元件(包括来源于刺激分子的功能性信号传递元件)。刺激分子可以是与T细胞受体复合物相关的ζ链。细胞质信号传递元件可以进一步包括一种或多种来源于至少一种共刺激分子的功能性信号传递元件。共刺激分子可选自4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。CAR可以是嵌合融合蛋白，包括细胞外抗原识别元件、跨膜元件和细胞内信号传递元件(包括来源于刺激分子的功能性信号传递元件)。CAR可包括嵌合融合蛋白，包括细胞外抗原识别元件、跨膜元件和细胞内信号传递元件(包括来源于共刺激分子的功能性信号传递元件和来源于刺激分子的功能性信号传递元件)。CAR可以是嵌合融合蛋白，包括细胞外抗原识别元件、跨膜元件和细胞内信号传递元件(包括来源于一种或多种共刺激分子的两种功能性信号传递元件和来源于刺激分子的功能性信号传递元件)。CAR可包括嵌合融合蛋白，包括细胞外抗原识别元件、跨膜元件和细胞内信号传递元件(包括来源于一种或多种共刺激分子的至少两种功能性信号传递元件和来源于刺激分子的功能性信号传递元件)。CAR可包括在CAR融合蛋白的氨基末端(N-末端)的可选的前导序列。CAR还可包括在细胞外抗原识别元件的N-末端的前导序列，其中前导序列在细胞加工和CAR向细胞膜定位期间可选地从抗原识别元件(例如，scFv)裂解。
嵌合抗原受体-细胞外元件
可用于制备CAR的示例性细胞外元件披露于例如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
细胞外元件可以从获自对疾病免疫的受试者的免疫细胞中获得的抗体库中获得，例如，如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中所述，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
细胞外元件可以从与配体结合和/或信号转导相关的各种细胞外元件或分泌蛋白中获得，如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352，2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132，美国专利号5,359,046、5,686,281和6,103,521中所述，所有这些专利文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中所述(两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)，提供了能够结合抗原的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR，所述抗原来源于病毒、传染病、细菌、肿瘤相关抗原、炎性疾病相关抗原、与神经元疾病相关的抗原、与糖尿病相关的抗原、与衰老细胞相关的抗原、与心血管疾病相关的抗原、与自身免疫疾病相关的抗原和/或与过敏相关的抗原。可用于这些应用的抗原的示例可见于例如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
细胞内元件
当Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的细胞外元件与抗原结合(相互作用)时，细胞内元件可以是能够将信号传递到细胞中的分子。细胞内信号传递元件一般可以负责激活其中已引入Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CA、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。T细胞的效应物功能例如可能是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传递元件”是指转导效应物功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白质的部分。尽管可以采用整个细胞内信号传递结构域，但在很多情况，细胞内元件或细胞内信号传递元件不需要由整个结构域组成。对于使用细胞内信号传递结构域的截短部分的程度，只要其转导效应物功能信号，这样的截短部分就可以使用。因此，术语细胞内信号传递元件还旨在包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传递结构域的任何截短部分。用于本发明的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的细胞内信号传递元件的示例包括T细胞受体(TCR)和共同受体(协同作用以在抗原受体结合后启动信号转导)的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
细胞内元件和与细胞内元件一起使用或用作细胞内元件的多肽组合披露于例如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
跨膜元件和间隔元件
Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR可能包括跨膜元件。跨膜元件可附接至Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的细胞外元件。跨膜元件可以包括与跨膜区域相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜所衍生的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直到15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白所衍生的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直到15个氨基酸)。跨膜元件可与Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR中使用的其它元件中的一种相关联。可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜元件，以避免这些元件与相同或不同表面膜蛋白的跨膜元件结合，例如，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。跨膜元件能够与细胞表面上的另一Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR同源二聚化。可以修饰或取代跨膜元件的氨基酸序列，以使与相同细胞中存在的天然结合配偶体的结合元件的相互作用最小化。
跨膜元件可以由贡献多特异性细胞外诱导物聚类元件的蛋白质、贡献效应物功能信号传递元件的蛋白质、贡献增殖信号传递部分的蛋白质、或由完全不同的蛋白质贡献。在大多数情况下，使跨膜元件与其中一种元件自然关联将是方便的。在一些情况下，希望使用含有能够二硫键连接的半胱氨酸残基的ζ、η或FcεRlγ链的跨膜元件，以便得到的嵌合蛋白能够与其自身或与ζ、η或FcεRlγ链或相关蛋白质的未修饰的形式形成二硫键连接的二聚体。可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜元件，以避免这些元件与相同或不同表面膜蛋白的跨膜元件结合，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。可以使用ζ、η、FcεRl-γ和-β、MB1(Igα)、B29或CD3-γ、ζ或ε的跨膜元件，以便保持与受体复合物的其它成员的物理关联。
可用于本发明的跨膜元件披露于例如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
嵌合抗原受体与去稳定元件(DE-CAR)相结合
上述的去稳定元件可以与上述的CAR顺式组合，使得真核细胞中CAR多肽的量在DE的控制下。DE-CAR、DE的选择以及一个或多个DE的使用披露于例如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
嵌合抗原受体：Side-CAR
CAR、Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Smart-DE-RDE-CAR可由至少两个部分组成，其相关联以形成功能性CAR或DE-CAR。细胞外抗原结合元件可以表达为与CAR的跨膜元件、可选的间隔区和细胞内元件分开的部分。分开的细胞外结合元件可以与宿主细胞膜相关联(通过除跨膜多肽之外的方式)。细胞内元件可以表达为与细胞外元件、跨膜元件和可选的间隔区分开的部分。细胞外元件和细胞内元件可以分开表达，并且各自可以具有跨膜元件和可选的间隔区。CAR或DE-CAR的每个部分可以具有用于将两个部分结合起来以形成功能性CAR或DE-CAR的关联元件(“Side-CAR”)。
Side CAR、Side CAR的选择以及它们在具有或没有系链的情况下的使用披露于例如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
淋巴细胞扩增分子和其它调节因子
利用DE、RDE和/或RNA控制装置来控制淋巴细胞扩增分子(“LEM”)、IL1、IL2、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL15、GM-CSF、G-CSF、TNFα和/或IFNγ的表达披露于例如2016年3月15日提交的美国专利申请序列号15/070,352和2016年12月5日提交的美国专利申请序列号15/369,132中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
显性负调节器作为CAR关闭开关
控制装置可能调节多肽的表达，所述多肽抑制或降低CAR激活T淋巴细胞或天然杀伤细胞的能力。该多肽可以抑制或减少CAR激活，例如，当在T淋巴细胞中表达时具有显性负效应的ZAP-70突变体。所述ZAP-70突变体可以是ZAP-70的Δ277-619(留下残基1-276)、Y319F或K369A突变体。
在一些方面，显性失活突变体/显性负性突变体用于在希望的时间关闭来自激活的CAR的信号传递。显性失活突变体是破坏来自激活的CAR的细胞内信号传递的多肽。显性失活突变体可以使用来自由CAR激活的信号级联或与CAR激活的信号级联相互作用的多肽。所述突变体可以与一些信号传递组成部分相互作用，但是对于从CAR传播信号是有缺陷的，因此防止CAR进一步激活宿主细胞。显性失活突变体可以来源于ZAP 70蛋白。显性失活突变体可以是ZAP 70的Δ277-619(留下残基1-276)、ZAP 70的Y319F或ZAP 70的K369A。
显性失活突变体的表达可以在RNA控制装置、RDE、去稳定元件(DE)和/或诱导型启动子的诱导控制下。这种诱导型控制允许显性失活突变体在希望的时间表达，从而允许该构建体充当CAR真核细胞的关闭开关。在希望的时间，显性失活突变体响应于诱导刺激而表达，并且显性失活突变体关闭来自CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的信号传递。
上述的Tet RNA控制装置或(6R)-亚叶酸RNA控制装置可用于控制ZAP 70的显性失活突变体(例如，Zap 70的Δ277-619(留下残基1-276)突变体、ZAP 70的Y319F或ZAP 70的K369A)的表达。通过这些构建体，Zap 70的显性失活突变体可以在向培养基中加入四环素或(6R)-亚叶酸后在宿主细胞中表达。这种四环素或(6R)-亚叶酸RNA控制装置提供由四环素或(6R)-亚叶酸诱导的CAR活性的关闭开关。
ZAP-70的显性失活突变体可以置于合适的RDE、DE、RNA控制装置或Side-CAR的控制下。RNA控制装置可以是Tet或(6R)-亚叶酸反应性RNA控制装置，使得当引入控制装置配体(例如，Tet或(6R)-亚叶酸)时，表达显性失活ZAP-70突变体，并且ZAP-70突变体的表达抑制CAR对T淋巴细胞的激活。ZAP-70突变体可以充当Tet控制装置控制下的T淋巴细胞的关闭开关。
受体
CAR可能用作细胞和RDE-转基因的受体。CAR如上文所述。除了CAR之外，可以使用其它受体来激活或以其它方式改变细胞中的环境，从而转基因在RDE控制下进行表达。识别和响应化学信号的受体可以通过RDE与转基因的表达偶联。例如，离子通道连接的(离子型)受体、G蛋白连接的(代谢型)受体和酶连接的受体可以与转基因的表达偶联。
可以与转基因表达偶联的一类受体是免疫受体，例如T细胞受体、B细胞受体(又名抗原受体或免疫球蛋白受体)和先天免疫受体。
T细胞受体是两种不同多肽链的异二聚体。在人类中，大多数T细胞具有由alpha(α)链和beta(β)链构成的T细胞受体，具有由gamma和delta(γ/δ)链构成的T细胞受体(分别由TRG和TRD编码)。用于扩增编码来自淋巴细胞的T细胞受体链的核酸的技术和引物是本领域公知的，并且披露于例如由Clontech商业销售的SMARTer Human TCR a/b ProfilingKits,Boria等人，BMC Immunol.9:50-58(2008)；Moonka等人，J.Immunol.Methods 169：41-51(1994)；Kim等人，PLoS ONE 7：e37338(2012)；Seitz等人，Proc.NatlAcad.Sci.103：12057-62(2006)中，所有这些均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。TCR库(repertoire)可以用作单独的链以形成抗原结合结构域。TCR库可被转化为单链抗原结合结构域。单链TCR可以利用本领域公知的技术由编码人α和β链的核酸制备，所述技术包括例如那些披露于美国专利申请公开号US2012/0252742，Schodin等人，Mol.Immunol.33:819-829(1996)；Aggen等人，“Engineering Human Single-Chain T Cell Receptors，”Ph.D.Thesis with the University ofIllinois at Urbana-Champaign(2010)，参见ideals.illinois.edu/bitstream/handle/2142/18585/Aggen_David.pdf？sequence＝1，所有这些均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
B细胞受体包括膜结合的免疫球蛋白、信号转导部分、CD79和ITAM。用于扩增编码人抗体轻链和重链的核酸的技术和引物是本领域公知的，并且披露于例如ProGen’s HumanIgG and IgM Library Primer Set，目录号F2000；Andris-Widhopf等人，“Generation ofHuman Fab Antibody Libraries:PCR Amplification and Assembly of Light andHeavy Chain Coding Sequences，”Cold Spring Harb.Protoc.2011；Lim等人，Nat.Biotechnol.31：108-117(2010)；Sun等人，World J.Microbiol.Biotechnol.28:381-386(2012)；Coronella等人，Nucl.Acids.Res.28:e85(2000)中，所有这些均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。用于扩增编码小鼠抗体轻链和重链的核酸的技术和引物是本领域公知的，并且披露于例如美国专利号8,143,007；Wang等人，BMC Bioinform.7(Suppl)：S9(2006)中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。抗体库可用作抗原结合结构域中的单独链，或转化为单链抗原结合结构域。单链抗体可以利用本领域公知的技术由编码人轻链和重链的核酸制备，所述技术包括例如那些披露于Pansri等人，BMCBiotechnol.9:6(2009)；Peraldi-Roux，Methods Molc.Biol.907：73-83(2012)中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。单链抗体可以利用本领域公知的技术由编码小鼠轻链和重链的核酸制备，所述技术包括例如那些披露于Imai等人，Biol.Pharm.Bull.29:1325-1330(2006)；Cheng等人，PLoS ONE6：e27406(2011)中，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
先天免疫受体包括例如，CD94/NKG2受体家族(例如，NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKG2H)，2B4受体，NKp30、NKp44、NKp46和NKp80受体，类Toll受体(例如，TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、RP105)。
G蛋白连接受体(也称为七跨膜结构域受体)是一个大的受体家族，其通过G蛋白将结合配体的受体与细胞反应相偶联。这些G蛋白是α、β和γ亚基(分别称为Gα、Gβ和Gγ)的三聚体，当与GTP结合时是有活性的，并且当与GDP结合时是无活性的。当受体结合配体时，它经历构象变化并且变构地激活G蛋白以交换GTP为结合的GDP。GTP结合后，G蛋白从受体解离，产生Gα-GTP单体和Gβγ二聚体。G蛋白连接的受体已被归为包括例如类视紫红质受体、促胰液素受体、代谢型谷氨酸/信息素受体、真菌交配信息素受体、环AMP受体和卷曲/平滑受体的类别。G蛋白受体用于多种生理过程，包括电磁辐射、味感(味觉)、嗅觉、神经传递、免疫***调节、生长、细胞密度传感的检测等。
酶联受体也称为催化受体，是一种跨膜受体，其中细胞外配体的结合导致细胞内侧的酶活性。酶联受体具有通过多肽的跨膜部分(或结构域)连接在一起的两个结构域。两个末端结构域是细胞外配体结合结构域和具有催化功能的细胞内结构域。存在多个酶联受体家族，包括例如Erb受体家族、神经胶质细胞衍生的神经营养因子受体家族、利尿钠肽受体家族、trk神经营养蛋白受体家族和类toll受体家族。
离子通道连接受体(也称为配体门控离子通道)是允许离子(例如Na+、K+、Ca2+和Cl-)通过膜的受体，以响应配体与受体的结合。存在多个配体门控离子通道家族，包括例如阳离子cys-环受体、阴离子cys-环受体、离子型谷氨酸受体(AMPA受体、NMDA受体)、GABA受体，5-HT受体、ATP门控通道和PIP2门控通道。
真核细胞
各种真核细胞可以用作本发明的真核细胞。真核细胞可以是动物细胞。真核细胞可以是哺乳动物细胞，例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、猪、牛、猫或犬。哺乳动物细胞可以是灵长类动物细胞，包括但不限于猴、黑猩猩、大猩猩和人。哺乳动物细胞可以是小鼠细胞，因为小鼠通常用作其它哺乳动物的模型，尤其是用作人的模型(参见例如，Hanna，J.等人，Science318：1920-23,2007；Holtzman,D.M.等人，J Clin Invest.103(6):R15-R21,1999；Warren,R.S.等人，J Clin Invest.95:1789-1797,1995；每篇公开文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。动物细胞包括例如成纤维细胞、上皮细胞(例如，肾、乳腺、***、肺)、角质细胞、肝细胞、脂肪细胞、内皮细胞和造血细胞。动物细胞可以是成体细胞(例如，终末分化的、***的或非***的)或胚胎细胞(例如，囊胚细胞等)或干细胞。真核细胞还可以是来源于动物或其它来源的细胞系。
真核细胞可以是干细胞。多种干细胞类型是本领域已知的，并且可以用作真核细胞，包括例如，胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、造血干细胞、神经干细胞、表皮神经嵴干细胞、乳腺干细胞、肠干细胞、间充质干细胞、嗅觉成体干细胞、睾丸细胞和祖细胞(例如，神经的、成血管细胞、成骨细胞、成软骨细胞、胰腺、表皮等)。干细胞可以是来源于取自受试者的细胞的干细胞系。
真核细胞可以是在哺乳动物(包括人)的循环***中发现的细胞。示例性循环***细胞包括红细胞、血小板、浆细胞、T细胞、天然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等，以及其前体细胞。总体来讲，这些细胞被定义为本发明的循环真核细胞。真核细胞可以来源于任何这些循环真核细胞。转基因可以与这些循环细胞或来源于循环细胞的真核细胞中的任何一种一起使用。真核细胞可以是T细胞或T细胞前体或祖细胞。真核细胞可以是辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞、γδT细胞，或上述的前体或祖细胞。真核细胞可以是天然杀伤细胞，或天然杀伤细胞的前体或祖细胞。真核细胞可以是B细胞，或B细胞前体或祖细胞。真核细胞可以是嗜中性粒细胞或嗜中性粒细胞前体或祖细胞。真核细胞可以是巨核细胞或巨核细胞的前体或祖细胞。真核细胞可以是巨噬细胞或巨噬细胞的前体或祖细胞。
真核细胞可以是植物细胞。植物细胞可以是单子叶植物或双子叶植物的细胞，包括但不限于苜蓿、杏仁、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、黑莓、芸苔、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、柑橘、咖啡、棉花、黄瓜、桉树、***、莴苣、小扁豆、玉米、芒果、甜瓜、燕麦、番木瓜、豌豆、花生、菠萝、李子、马铃薯(包括甘薯)、南瓜、萝卜、油菜籽、覆盆子、大米、黑麦、高粱、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、番茄、白萝卜、小麦、西葫芦、以及其它果菜类(例如，番茄、胡椒、辣椒、茄子、黄瓜、南瓜等)、其它球茎类蔬菜(例如，大蒜、洋葱、韭葱等)、其它仁果类(例如，苹果、梨等)、其它核果类(例如，桃、油桃、杏、梨、李子等)、拟南芥、木本植物如针叶树和落叶树、观赏植物、多年生牧草、饲料作物、开花植物、其它蔬菜、其它水果、其它农作物、草本植物、牧草、或多年生植物部分(例如，球茎；块茎；根；冠；茎；匍匐茎/枝；分蘖；芽；插条，包括无根插条、有根插条和愈伤组织插条或愈伤组织生成的苗木；顶端分生组织等)。术语“植物”是指植物的所有物理部分，包括种子、幼苗、幼树、根、块茎、茎、梗、叶和果实。
真核细胞还可以是藻类，包括但不限于绿球藻属、衣藻属、栅藻属、等鞭金藻属、杜氏藻属、扁藻属、微拟球藻属或原囊藻属的藻类。真核细胞可以是真菌细胞，包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利氏酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属、接合酵母属或裂殖酵母属的真菌。
真核细胞可以从受试者获得。受试者可以是任何生物体。细胞可以来源于从受试者获得的细胞。受试者的示例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。还可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。可以利用本领域技术人员已知的任何数量的技术，例如Ficoll分离法，从受试者采集的血液单位获得T细胞。来自个体的循环血液的细胞可以通过血液成分单采术(apheresis)获得。血液成分单采术产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它成核的白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤通过血液成分单采术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。可以用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在可替换的方面，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁，或者可能缺乏很多(如果不是全部)二价阳离子。在缺乏钙的情况下的初始活化步骤可导致放大的活化。
通过阴性选择富集T细胞群体可以通过针对负选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来实现。可以使用针对细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物(cocktail)通过经由负磁性免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择来富集细胞。例如，为富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。可能希望富集通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FocP3+的调节性T细胞。可替换地，在某些方面，T调节性细胞通过抗-C25缀合珠或其它类似的选择方法耗尽。
T细胞一般利用例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法可被活化或扩增，上述每篇专利文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
NK细胞可在已经过遗传修饰以表达膜结合的IL-15和4-1BB配体(CD137L)的骨髓细胞系的存在下被扩增。以这种方式修饰的不具有MHC I类和II类分子的细胞系对NK细胞裂解高度敏感并激活NK细胞。例如，可以用嵌合蛋白构建体转导K562骨髓细胞，所述嵌合蛋白构建体由与人CD8α和GFP的信号肽和跨膜结构域融合的人IL-15成熟肽组成。然后可以通过有限稀释对转导的细胞进行单细胞克隆，并选择具有最高GFP表达和表面IL-15的克隆。然后可以用人CD137L转导该克隆，产生K562-mb15-137L细胞系。为了优先扩增NK细胞，在10IU/mL的IL-2存在下，将含有NK细胞的外周血单核细胞培养物与K562-mb15-137L细胞系一起培养达足以活化和富集NK细胞群体的一段时间。该段时间可以在2-20天的范围内，优选约5天。然后可用抗-CD19-BB-ζ嵌合受体转导扩增的NK细胞。
核酸
本发明还描述了至少部分编码本文所述的各个肽、多肽、蛋白质和RNA控制装置的核酸。核酸可以是天然的、合成的或其组合。本发明的核酸可以是RNA、mRNA、DNA或cDNA。
本发明的核酸还包括表达载体，例如质粒、或病毒载体、或线性载体、或整合到染色体DNA中的载体。表达载体可以含有能够使载体在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。所述序列对于多种细胞是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌。在真核宿主细胞中，例如，在哺乳动物细胞中，表达载体可被整合入宿主细胞染色体中，并随后与宿主染色体一起复制。类似地，载体可被整合入原核细胞的染色体中。
表达载体一般还包含选择基因，也称为选择标记。用于原核和真核细胞(包括本发明的宿主细胞)的选择标记是本领域公知的。一般，选择基因编码对于在选择性培养基中生长的转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码下列蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素，(b)补充营养缺陷，或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养素，例如，编码芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。示例性选择方案可以利用药物来抑制宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予抗药性的蛋白质，并因此在选择方案中存活。用于细菌或真核(包括哺乳动物)***的其它选择标记是本领域公知的。
能够在哺乳动物T细胞中表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR转基因的启动子的示例是EFla启动子。天然EFla启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，其负责氨酰基tRNA到核糖体的酶促递送。EFla启动子已广泛用于哺乳动物表达质粒，并已被表明可有效驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见例如，Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。启动子的另一示例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、MND启动子(含有具有骨髓增殖性肉瘤病毒增强子的修饰的MoMuLV LTR的U3区域的合成启动子，参见例如Li等人，J.Neurosci.Methods vol.189，pp.56-64(2010)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子，以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明并不限于使用组成型启动子。
诱导型或阻抑型启动子也预期用于本公开内容。诱导型启动子的示例包括但不限于活化的T细胞诱导型启动子的核因子(NFAT)、金属硫蛋白启动子，糖皮质激素启动子、***启动子、四环素启动子、c-fos启动子、将人类巨细胞病毒即刻早期启动子的表达置于四环素操纵子的控制下的ThermoFisher的T-REx***、以及Intrexon的RheoSwitch启动子。Macian等人，Oncogene 20:2476-2489(2001)；Karzenowski,D.等人，BioTechiques 39:191-196(2005)；Dai,X.等人，Protein Expr.Purif42:236-245(2005)；Palli,S.R.等人，Eur.J.Biochem.270:1308-1515(2003)；Dhadialla,T.S.等人，Annual Rev.Entomol.43:545-569(1998)；Kumar,M.B.等人，J.Biol.Chem.279:27211-27218(2004)；Verhaegent,M.等人，Annal.Chem.74:4378-4385(2002)；Katalam,A.K.等人，Molecular Therapy 13:S103(2006)；和Karzenowski,D.等人，Molecular Therapy 13:S194(2006)；美国专利号8,895,306、8,822,754、8,748,125、8,536,354，所有文献或专利出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
表达载体通常具有启动子元件，例如增强子，以调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp区域，尽管已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔往往是灵活的，以便当元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到相隔50bp。取决于启动子，似乎各个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
表达载体可能是双顺反子构建体或多顺反子构建体。两个顺反子可被定向成沿相反方向，其中顺反子的控制区域位于两个顺反子之间。当构建体具有两个以上的顺反子时，顺反子可以排列成两组，其中两组定向成相反方向用于转录。示例性双顺反子构建体披露于Amendola等人，Nat.Biotechnol.23：108-116(2005)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。一个顺反子的控制区域可能能够具有高转录活性，而另一个可能在使用条件下具有低转录活性。一个或两个控制区域可能是诱导型的。高转录活性控制区域的示例包括，例如MND、EF1-α、PGK1、CMV、泛素C、SV40早期启动子、四环素响应元件启动子、细胞特异性启动子、人类beat-actin启动子和CBG(鸡β-珠蛋白)，可选地包括CMV早期增强子。低转录活性控制区域的示例包括，例如TRE3G(由Clontech商业销售，具有降低基础表达的突变的四环素响应元件启动子)、T-RExTM(由ThermoFisher商业销售)和最小TATA启动子(Kiran等人，Plant Physiol.142：364-376(2006)，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、HSP68和最小CMV启动子。诱导型控制区域的示例包括，例如NFAT控制区域(Macian等人，Oncogene 20：2476-2489(2001))，以及上述的诱导型控制区域。
双顺反子构建体可能编码CAR和多肽，其是在靶位点待递送的有效负载(或产生有效负载)。示例性有效载荷在上文和下文中描述。编码CAR的核酸可以与强启动子、弱启动子和/或诱导型启动子可操作地连接，并且可选地可与RNA控制装置、DE、RDE或前述的组合可操作地连接。CAR可被Side-CAR形式的核酸编码。编码多肽的核酸可以与强启动子、弱启动子和/或诱导型启动子可操作地连接。编码作为有效负载(或产生有效负载)的多肽的核酸可以在RDE的控制下。RDE可以是通过例如糖酵解酶如磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、烯醇酶(ENO1或ENO3)、磷酸甘油酸激酶(PGK1)、磷酸丙糖异构酶(TPI1)、醛缩酶A(ALDOA)或磷酸甘油酸变位酶(PGAM1)响应细胞的活化状态的RDE。RDE还可被其它能量代谢酶结合和调节，例如转酮醇酶(TKT)、苹果酸脱氢酶(MDH2)、琥珀酰CoA合成酶(SUGLG1)、ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)或异柠檬酸脱氢酶(IDH1/2)。宿主细胞可以表达在受试者的靶位点与其抗原结合的CAR。这种靶位点处抗原的结合激活细胞，导致细胞增加糖酵解，诱导在RDE控制下的编码多肽的核酸的表达(由糖酵解或其它能量代谢酶结合)。
多顺反子构建体可以具有三个或更多个顺反子，其中每个顺反子具有控制区域(可选地可诱导的)和可操作地与一些或所有转基因连接的RDE。这些盒(cassette)可被组织成在构建体上以相反的方向转录的两组。两个或更多个转基因可以从相同的控制区域转录，并且两个或更多个转基因可具有与下游转基因可操作地连接的IRES(内部核糖体进入位点)序列。可替换地，如发现于blog.addgene.org/plasmids-101-multicistrnic-vectors的Plasmids 101:Multicistronic Vectors所述，两个或更多个转基因通过2A元件可操作地连接在一起。常用的2A序列包括例如EGRGSLLTCGDVEENPGP(T2A)(SEQ ID NO：24)，ATNFSLLKQAGDVEENPGP(P2A)(SEQ ID NO：25)；QCTNYALLKLAGDVESNPGP(E2A)(SEQ ID NO：26)；和VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(F2A)(SEQ ID NO：27)，所有这些都可以可选地在氨基末端包含序列GSG。这允许多个转基因转录到单个转录物上，该转录物由具有RDE(或多个RDE)的3'-UTR调节。
双顺反子/多顺反子载体可以提高两个或更多个顺反子的整体表达(相对于在单独的构建体上引入顺反子)。双顺反子/多顺反子构建体可以来源于慢病毒载体。双顺反子/多顺反子构建体可以编码CAR和在转基因上编码的多肽(例如，有效负载)，并且当细胞被CAR激活时，双顺反子构建体可以提高由转基因编码的多肽的表达。
可能希望修饰本文所述的多肽。本领域技术人员会认识到在给定核酸构建体中产生改变以产生变体多肽的许多方法。这些公知的方法包括定点突变、使用简并寡核苷酸的PCR扩增、含有核酸的细胞暴露于诱变剂或辐射、希望寡核苷酸的化学合成(例如，与连接和/或克隆结合以产生大的核酸)和其它公知的技术(参见，例如，Gillam和Smith，Gene 8：81-97，1979；Roberts等人，Nature 328：731-734，1987，所述文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。可以修饰编码本发明多肽的重组核酸，以提供优选的密码子，其增强所选生物体中核酸的转译。
多核苷酸还可以包括的多核苷酸包括与本文所述的其它多核苷酸基本等同的核苷酸序列。多核苷酸可以与另一多核苷酸具有至少约80％、更通常至少约90％、并且甚至更通常至少约95％的序列同一性。核酸还提供多核苷酸的互补序列，包括与编码本文所述的多肽的多核苷酸具有至少约80％、更通常至少约90％、并且甚至更通常至少约95％的序列同一性的核苷酸序列。多核苷酸可以是DNA(基因组、cDNA、扩增的或合成的)或RNA。用于获得所述多核苷酸的方法和算法是本领域技术人员公知的，并且可以包括例如用于确定杂交条件的方法，其可以常规分离希望序列同一性的多核苷酸。
编码蛋白质类似物或变体(即，其中一个或多个氨基酸被设计成与野生型多肽不同)的核酸可以使用定点突变或PCR扩增产生，其中引物具有希望的点突变。对于合适的突变技术的详细描述，参见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratoryManual，ColdSpring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和/或CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等人，eds，Green Publishers Inc.and Wileyand Sons，N.Y(1994)，每篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。利用本领域公知方法的化学合成物，例如如Engels等人，Angew Chem IntlEd.28：716-34，1989(该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)所述，也可用于制备所述核酸。
用于产生变体的氨基酸“取代”优选是用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代一氨基酸的结果，即，保守的氨基酸替代。氨基酸取代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
本文还公开了编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的核酸。编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的核酸可以通过常规方法由指定CAR的氨基酸序列与RNA控制装置的序列组合容易地制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以从上述NCBI RefSeq ID或每个元件的氨基酸序列的GenBank登录号获得，并且本发明的核酸可以利用标准分子生物学和/或化学过程制备。例如，基于碱基序列，可以合成核酸，并且可以通过结合DNA片段来制备本发明的核酸，所述DNA片段利用聚合酶链式反应(PCR)从cDNA文库获得。
核酸可以与另一核酸连接，以便在合适的启动子的控制下表达。为了获得核酸的有效转录，核酸还可以连接至与启动子或转录起始位点配合的其它调节元件，例如，包括增强子序列、polyA位点或终止子序列的核酸。除了本发明的核酸之外，可以包含可以是用于确认核酸表达的标记的基因(例如，药物抗性基因、编码报告酶的基因或编码荧光蛋白的基因)。
当核酸被体外导入细胞时，除上述赋形剂外，核酸可以与促进核酸转移到细胞中的物质结合，例如，用于引入核酸的试剂，如脂质体或阳离子脂质。可替换地，携带本发明的核酸的载体也是有用的。特别是，以适于施加至含有本发明核酸的活体的形式的组合物适合于体内基因治疗，所述核酸由合适的载体携带。
将核酸引入真核细胞
用于产生表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或与RDE可操作地连接的转基因的细胞的方法包括将编码本文所述的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸引入真核细胞的步骤。该步骤可在体外进行。例如，可以用携带本文所述的核酸的病毒载体或非病毒载体体外转化细胞，以产生表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的细胞。
在一种方法中，可以使用如上所述的真核细胞。真核细胞可以来源于哺乳动物，例如人类细胞，或者可以使用来源于非人类的哺乳动物的细胞，例如猴子、小鼠、大鼠、猪、马或狗。在所述方法中使用的细胞没有特定限制，可以使用任何细胞。例如，可以使用从体液、组织或器官如血液(外周血、脐带血等)或骨髓中收集、分离、纯化或诱导的细胞。可以使用外周血单核细胞(PBMC)、免疫细胞、树突细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞或造血细胞、脐带血单核细胞、成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、皮肤角质形成细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、各种癌细胞株或神经干细胞。在本发明中，特别优选使用T细胞、T细胞的前体细胞(造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或含有它们的细胞群。T细胞的示例包括CD8阳性T细胞、CD4阳性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞。包含T细胞和T细胞的前体细胞的细胞群包括PBMC。前述细胞可以从活体收集，通过从活体收集的细胞的扩大培养获得，或者建立为细胞株。当希望将产生的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE表达细胞或从产生的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE表达细胞分化的细胞移植到活体中时，优选将核酸引入从活体本身收集的细胞中。
将编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸***载体中，并将载体引入细胞。通过转染(例如，Gorman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.79.22(1982):6777-6781，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、转导(例如，Cepko和Pear(2001)CurrentProtocols in Molecular Biology unit 9.9；DOI:10.1002/0471142727.mb0909s36，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、磷酸钙转化(例如，Kingston,Chen和Okayama(2001)Current Protocols in Molecular BiologyAppendix 1C；DOI:10.1002/0471142301.nsa01cs01，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、细胞穿透肽(例如，Copolovici,Langel,Eriste和Langel(2014)ACS Nano 20148(3),1972-1994；DOI:10.1021/nn4057269，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、电穿孔(例如，Potter(2001)Current Protocols in Molecular Biology unit 10.15；DOI:10.1002/0471142735.im1015s03和Kim等(2014)Genome1012-19.doi:10.1101/gr.171322.113；Kim等人2014年描述了Amaza Nucleofector,an optimizedelectroporation system，上述两篇文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、显微注射(例如，McNeil(2001)Current Protocols inCell Biology unit 20.1；DOI:10.1002/0471143030.cb2001s18，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、脂质体或细胞融合(例如，Hawley-Nelson和Ciccarone(2001)Current Protocols inNeurosience Appendix 1F；DOI:10.1002/0471142301.nsa01fs10，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、机械操纵(例如，Sharon等人(2013)PNAS 2013110(6)DOI：10.1073/pnas.1218705110，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)或用于将核酸递送至真核细胞的其它公知技术将编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸引入真核细胞。一旦引入，Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE核酸可以瞬时游离地表达，或者可以使用公知的技术如重组(例如，Lisby和Rothstein(2015)Cold Spring Harb PerspectBiol.Mar 2；7(3).pii:a016535.doi:10.1101/cshperspect.a016535，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)或非同源整合(例如，Deyle和Russell(2009)CurrOpin Mol Ther.2009Aug；11(4):442-7，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)整合到真核细胞的基因组中。通过引入靶向双链断裂(DSB)的基因组编辑技术可以促进同源和非同源重组的效率。DSB生成技术的示例是CRISPR/Cas9、TALEN、锌指核酸酶或等效***(例如，Cong等人，Science 339.6121(2013):819-823；Li等人，Nucl.AcidsRes(2011):gkr188；Gajet等人，Trends in Biotechnology 31.7(2013):397-405，所有文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、转座子如Sleeping Beauty(例如，Singh等人(2014)Immunol Rev.2014Jan；257(1):181-90.doi:10.1111/imr.12137，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、使用例如FLP重组酶的靶向重组(例如，O’Gorman，Fox和Wahl Science(1991)15:251(4999):1351-1355，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、CRE-LOX(例如，Sauer和HendersonPNAS(1988)85:5166-5170)或等效***，或本领域已知的用于将编码Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side CAR的核酸整合到真核细胞基因组中的其它技术。
编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的多核苷酸可被整合到真核细胞的染色体中。编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的多核苷酸可以存在于染色体外的真核细胞中。编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的多核苷酸可以利用基因组编辑酶(CRISPR、TALEN、锌指核酸酶)和适当的核酸(包括编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸)进行整合。编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR，DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸可以在基因组安全港位点(例如CCR5、AAVS1、人ROSA26或PSIP1基因座)整合到真核细胞染色体中(Sadelain等人，Nature Rev.12:51-58(2012)；Fadel等人，J.Virol.88(17)：9704-9717(2014)；Ye等人，PNAS 111(26)：9591-9596(2014)，所有这些文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸在CCR5、PSIP1或TRAC基因座(T细胞受体α恒定基因座)处的整合可以使用基因编辑***进行，例如CRISPR、TALEN、Sleeping Beauty转座酶、PiggyBac转座酶或锌指核酸酶***。Eyquem等人，Nature 543：113-117(2017)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。真核细胞可以是人T淋巴细胞，并且CRISPR***用于在CCR5或PSIP1基因座处整合Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE。使用CRISPR***在CCR5、PSIP1或TRAC基因座处整合核酸还可能删除CCR5基因、PSIP1基因或TRAC基因座的一部分或全部。真核细胞中的Cas9可以来源于编码Cas9的质粒、编码Cas9的外源mRNA、或单独的或在核糖核蛋白复合物中的重组Cas9多肽。(Kim等人(2014)Genome 1012-19.doi：10.1101/gr.171322.113；Wang等人(2013)Cell 153(4).Elsevier Inc.：910-18.doi：10.1016/j.cell.2013.04.025，两者均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学装置包括胶体分散***，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的***，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送工具的示例性胶体***是脂质体(例如，人造膜囊泡)。最先进的靶向递送核酸的其它方法是可用的，例如用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米尺寸的递送***来递送多核苷酸。
可以用病毒载体进行转导，例如可以使用逆转录病毒载体(包括致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿病毒载体、牛痘病毒载体或仙台病毒载体、Epstein-Barr病毒(EBV)载体和HSV载体。作为病毒载体，优选使用缺少复制能力的病毒载体，以免在感染细胞中自我复制。
当逆转录病毒载体用于转导宿主细胞时，该方法可以通过基于载体所具有的LTR序列和包装信号序列选择合适的包装细胞并使用包装细胞制备逆转录病毒颗粒来进行。包装细胞的示例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12(美国专利号5,278,056，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)和Psi-Crip(Proceedings ofthe NationalAcademy of Sciences ofthe United States ofAmerica，vol.85，pp.6460-6464(1988)，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。还可以使用具有高转染效率的293细胞或T细胞来制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒产生的多种逆转录病毒载体和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞可广泛地从很多公司商业购得。
已经开发出许多基于病毒的***用于将基因转移到哺乳动物细胞中。可以使用本领域已知的技术将选择的基因***载体并包装在病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或体外递送至受试者的细胞。许多病毒***是本领域已知的。可以使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的并且可以使用。另外，可以使用慢病毒载体。
来源于RNA病毒的病毒载体可用于向细胞引入Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE编码多核苷酸。RNA病毒载体可以编码多核苷酸的反向互补序列链或反义链，所述多核苷酸编码RNA控制装置和CAR构建体(互补链编码RNA控制装置、DE、RDE、CAR和/或Side-CAR构建体的有义链)。因此，RNA控制装置不应在单链RNA病毒载体中具有活性。可以使用编码RNA控制装置、DE、RDE、CAR、Side-CAR和/或转基因的RNA病毒构建体的有义链，并且具有RNA控制装置、DE、RDE、CAR和/或Side-CAR构建体的病毒载体在RNA控制装置的传感器元件的配体存在(或不存在)下(或在RDE稳定的条件下)被保持并复制以防止RNA的切割。然后编码病毒载体中RNA控制装置、DE、RDE、CAR、Side-CAR和/或转基因构建体的有义链的病毒载体可以被保持并复制而需要(或不需要)传感器元件的配体。
非病毒载体可用于结合脂质体和缩合剂如阳离子脂质，如披露于WO96/10038、WO97/18185、WO97/25329、WO97/30170和WO97/31934(上述专利文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。可以通过磷酸钙转导、DEAE-葡聚糖、电穿孔或粒子轰击将本发明的核酸引入细胞。
可以使用具有促进稳定性和/或转译效率能力的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。5'UTR的长度可以在1至3000个核苷酸之间。可以通过不同的方法改变被添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度，包括但不限于设计用于对UTR的不同区域退火的PCR的引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以修改在转录的RNA转染后实现最佳转译效率所需的5'和3'UTR长度。5'和3'UTR可以是感兴趣核酸的天然存在的内源5'和3'UTR。可以通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过应用于模板的其它修饰技术来添加感兴趣核酸的非内源UTR序列。使用感兴趣核酸的非内源UTR序列可有助于修饰RNA的稳定性和/或转译效率。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域公知的UTR性质来选择或设计3'UTR以提高转录的RNA的稳定性。
mRNA可能具有5'端的帽和3'多聚(A)尾，其决定细胞中核糖体结合、转译起始和稳定性mRNA。在环状DNA模板上，例如质粒DNA，RNA聚合酶产生长的形成联体的产物，其不适于在真核细胞中表达。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，即使它在转录后是多聚腺苷酸化的，其在真核转染中也不是有效的。
在将核酸引入细胞的步骤中，还可以使用用于提高引入效率的功能性物质(例如，WO95/26200和WO 00/01836，上述专利文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。用于提高引入效率的物质的示例包括具有能力结合至病毒载体的物质，例如纤连蛋白和纤连蛋白片段。纤连蛋白片段可以具有肝素结合位点，例如可以使用商业可购得的片段RetroNetcin(注册商标，CH-296，由TAKARABIO INC.制造)。此外，可以使用聚凝胺(其是具有提高逆转录病毒感染细胞效率的效果的合成的多聚阳离子)、成纤维细胞生长因子、V型胶原、聚赖氨酸或DEAE-葡聚糖。
功能性物质可以固定在合适的固相上，例如，用于细胞培养的容器(板、培养皿、烧瓶或袋)或载体(微珠等)。
表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的真核细胞
表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的细胞可以是其中引入和表达编码SmartCAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸的细胞。
真核细胞可以通过CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽与特异性抗原结合，引起CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽将信号传输到真核细胞中，结果真核细胞可被活化。表达SmartCAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的真核细胞的活化可以根据真核细胞和Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的细胞内元件的种类而变化，并且可以基于例如细胞因子的释放、细胞增殖率的提高、细胞表面分子的变化等作为指标来确认。例如，从活化细胞释放细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)导致表达抗原的靶细胞的破坏。此外，细胞因子的释放或细胞表面分子的变化刺激其它免疫细胞，例如B细胞、树突细胞、NK细胞和/或巨噬细胞。
表达CAR、Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR构建体的真核细胞可以使用蛋白质L(从Peptostreptoccocus magnus分离的细菌表面蛋白，其选择性结合免疫球蛋白的可变轻链(κ链))进行检测。蛋白质L可以用报道子(例如光发射或吸收部分)直接标记，或者可以用诸如生物素的试剂标记。当使用生物素或相关分子来标记蛋白质L时，可以通过添加用报道子(例如，藻红蛋白)标记的链霉亲和素(或类似的成对分子)来检测蛋白质L与展示CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的真核细胞的结合。Zheng等人，J.Translational Med.，10：29(2012)，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。蛋白质L与包含CAR、SmartCAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR构建体的真核细胞结合可能在真核细胞上显示抗体轻链(CAR的细胞外结构域)的存在。这种检测真核细胞上CAR表达的方法还可用于对真核细胞表面上的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的量进行定量。蛋白质L可用于QC和QA方法论，用于制备具有CAR、SmartCAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR构建体的真核细胞。
表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可用作治疗疾病的治疗剂。该治疗剂可以包括表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE作为活性成分的真核细胞，并且还可包括合适的赋形剂。赋形剂的示例包括用于组合物的药学上可接受的赋形剂。施用表达SmartCAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞所针对的疾病没有特别限制，只要该疾病显示对真核细胞的敏感性即可。本发明的疾病的示例包括癌症(血癌(白血病)、实体瘤(卵巢癌)等)，炎性疾病/自身免疫性疾病(哮喘、湿疹)，肝炎，以及病因是病毒如流感和HIV、细菌或真菌的传染性疾病，例如肺结核、MRSA、VRE和深部真菌病。可以用表达与引起自身免疫性疾病的免疫蛋白结合的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞治疗自身免疫性疾病(例如，寻常型天疱疮、红斑狼疮、类风湿性关节炎)。例如，表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可以靶向产生引起自身免疫性疾病的抗体的细胞。表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可以靶向引起自身免疫性疾病的T淋巴细胞。
可以将Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE用作治疗过敏的治疗剂。所述治疗剂可以包括表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE作为活性成分的真核细胞，并且还可能包括合适的赋形剂。赋形剂的示例包括用于组合物的药学上可接受的赋形剂。可以用表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞治疗过敏的示例包括，例如，对花粉、动物毛屑、花生、其它坚果、乳制品、麸质、蛋、海鲜、贝类和大豆的过敏。表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可以靶向产生抗体的细胞，所述抗体引起对例如花粉、动物毛屑、花生、其它坚果、乳制品、麸质、蛋、海鲜、贝类和大豆的过敏反应。靶细胞可以是B细胞、记忆B细胞、浆细胞、前体B细胞和祖细胞B细胞中的一种或多种。表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可以靶向引起对例如花粉、动物毛屑、花生、其它坚果、奶制品、麸质、蛋、海鲜、贝类和大豆的过敏反应的T淋巴细胞。Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE可以结合抗体或T细胞受体的遗传决定因子。
表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可被施用于治疗疾病或病症。这些真核细胞可用于预防骨髓移植或暴露于辐射后的感染性疾病、供体淋巴细胞输血用于缓解复发性白血病等目的。包括表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞的治疗剂可以是活性成分，并且可以通过肠胃外施用(例如通过注射或输注/输液)皮内、肌肉内、皮下、腹腔内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内或进入传入***施用，虽然施用途径是不受限制的。
具有Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可在向受试者给药之前表征。具有Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可以被测试以确认Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE表达。具有Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的真核细胞可以暴露于一定水平的配体，所述配体在真核细胞中产生所希望水平的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽表达。当置于受试者时，该希望水平的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽可以产生具有希望水平的抗靶细胞活性和/或希望水平的增殖活性的真核细胞。
Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE可以与具有侵袭性抗肿瘤特性的T淋巴细胞一起使用，例如那些披露于Pegram等人，CD28z CARs and armored CARs，2014，Cancer J.20(2)：127-133中，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。RNA控制装置可以与T淋巴细胞中的盔甲(armored)CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽一起使用。
上述Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE实施例还可以包括DE-LEM、RDE-LEM、SmartLEM、Smart-DE-LEM、Smart-RDE-LEM、DE-RDE-LEM和/或Smart-DE-RDE-LEM以提供LEM或DE-LEM的受控表达。可以控制LEM或DE-LEM的量，以便在所需时间提供其扩增信号。通过改变与LEM或DE-LEM相关的DE和/或RNA控制装置的配体的量来实现对扩增信号的这种控制，由此改变LEM或DE-LEM的量。LEM扩增信号的控制还可以通过在所需时间向真核细胞添加外源LEM来实现。
药物组合物
本发明的药物组合物可能包括Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、和/或转基因-RDE表达细胞，例如，本文所述的多种Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE表达细胞，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。所述组合物可包括缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。一方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
药物组合物可以按适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素确定，尽管合适的剂量可以通过临床试验确定。
合适的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员公知的。药学上可接受的赋形剂的示例包括磷酸盐缓冲盐水(例如，0.01M磷酸盐、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH7.4)，含有无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐的水溶液，盐水，乙二醇或乙醇的溶液，以及有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。还可以使用佐剂如润湿剂或乳化剂以及pH缓冲剂。可以适当地使用在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)(该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中描述的药学上可接受的赋形剂。可以将组合物配制成适合肠胃外施用如注射或输液的已知形式。组合物可能包括配方助剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂，以及用于在储存期间延长有效期的保存剂。
包括本文所述的真核细胞作为活性成分的组合物可以施用于治疗例如癌症(血癌(白血病)、实体瘤(卵巢癌)等)，炎性疾病/自身免疫性疾病(寻常型天疱疮、红斑狼疮、类风湿性关节炎、哮喘、湿疹)，肝炎，以及病因是病毒如流感和HIV、细菌或真菌的传染性疾病，例如肺结核、MRSA、VRE或深部真菌病疾病，取决于CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽结合的抗原。
受试者/主体组合物的施用可以按任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、吞入、输液、植入或移植。本文所述的组合物可以通过静脉(i.v.)注射或腹腔内经动脉、皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、鼻内、动脉内、瘤内进入传入***中施用至患者。一方面，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用至患者。一方面，本发明的T细胞组合物通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注射入肿瘤、***或感染部位。可以通过过继转移来进行施用。
当表示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生通过考虑患者(受试者)在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及状况的个体差异来确定待施用的本发明的组合物的精确量。包括本文所述的真核细胞的药物组合物可以按104至109个细胞/kg体重的剂量施用，在某些情况下按105至106个细胞/kg体重的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。真核细胞组合物还可能按这些剂量多次施用。真核细胞还可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见，例如，Rosenberg等人，NewEng.J.of Med.319：1676，1988，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。
真核细胞的使用
编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸可用于在真核细胞中表达CAR、DE-CAR、Side-CAR和/或转基因多肽。真核细胞可以是哺乳动物细胞，包括例如人细胞或鼠科细胞。真核细胞还可以是，例如，造血细胞，包括例如T细胞、天然杀伤细胞、B细胞或巨噬细胞。
编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或转基因-RDE的核酸可用于在真核细胞的表面表达希望水平的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽。在这方面，DE、RNA控制装置、RDE和/或Side-CAR至少部分地控制CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽表达的水平，并且通过调节DE、RNA控制装置、RDE和/或Side-CAR的活性水平，在真核细胞的表面表达并展示希望量的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽。可以使用对CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽特异的抗体来测量CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的量。可以使用被细胞外元件识别的抗原来测量CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的量。可以在靶细胞杀伤的功能测定中测量CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的量。可以在对真核细胞增殖(由CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽诱导)的功能测定中测量CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的量。上述真核细胞可以是T淋巴细胞或天然杀伤细胞或巨噬细胞或其它吞噬细胞类型。
DE的配体、RNA控制装置传感器的配体和/或Side-CAR的配体可以按增加量添加，直到获得希望水平的真核细胞活性。希望的真核细胞活性可以是杀伤靶细胞。靶细胞杀伤可以在所需时间段发生，例如，在12小时，或24小时，或36小时，或两天，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天，或两个月，或3、4、5或6个月杀死一定数量的靶细胞。靶细胞杀伤可被表达为标准化数目的靶细胞的半衰期。靶细胞杀伤的半衰期可以是12小时，24小时，36小时，或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天，或两个月，或3、4、5或6个月。希望的真核细胞活性可以是增殖。细胞增殖可以通过12小时，24小时，36小时，两天，或3、4、5、6或7天的倍增时间发生。上述真核细胞可以是T淋巴细胞或天然杀伤细胞或巨噬细胞或其它吞噬细胞类型。
可以随时间添加一区域的不同量的配体(用于传感器、DE和/或Side-CAR)，使得在不同时间在真核细胞上存在不同的希望水平的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽。例如，在用Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side CAR T细胞或Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side CAR天然杀伤细胞治疗患者的癌症中，可以最初减少CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽表达的量以降低肿瘤溶解的毒性，并且随着肿瘤块清除，可以增加CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽表达的量以杀死剩余的肿瘤细胞，因为它们在体内变得更加罕见。可以最初增加CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽表达，并且随着肿瘤块缩小，降低CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽表达水平以减少对也可能表达靶抗原的健康组织的杀伤。可以调节对肿瘤细胞的反应性，使得肿瘤细胞杀伤与正常组织杀伤的比率保持在希望的范围内。可以通过真核细胞增殖来减少在真核细胞表面表达的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的量。当真核细胞增殖时，如果来自Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side CAR核酸的表达水平不足以将CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽拷贝数保持在亲代真核细胞中发现的水平(即，如果亲代细胞不加倍其CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的量，那么与亲代细胞相比，每个子代细胞将具有减少量的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽)，CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽将被稀释。与受试者中真核细胞的倍增时间相比，CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽可被设计成具有短的半衰期。当与受试者中真核细胞的倍增时间相比，配体在受试者中可以具有短的半衰期。可以将抗配体抗体或不同的配体结合分子施用于受试者或给予真核细胞(体外)，使得配体与抗体或配体结合分子结合并且不能与DE、RNA控制装置传感器和/或Side-CAR反应。上述真核细胞可以是T淋巴细胞或天然杀伤细胞或巨噬细胞或其它吞噬细胞类型。
具有Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的真核细胞可以表达希望量的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽，以使包含具有CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的真核细胞的受试者可以产生治疗水平的靶细胞杀伤，同时将毒性和不良事件保持在可接受的水平。上述真核细胞可以是T淋巴细胞或天然杀伤细胞或巨噬细胞或其它免疫细胞类型。例如，本发明的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR可通过具有Smart CAR、DE-CAR、Smart-DE-CAR和/或Side CAR的T淋巴细胞用于减少肿瘤溶解综合征、细胞因子风暴或健康组织杀伤。
Smart CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR可以与两种或更多种RNA控制装置相关联。可以将DE、Side-CAR和/或两种或更多种RNA控制装置的不同量的两种或更多种配体添加到真核细胞，以在真核细胞中产生希望量的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽。可以将不同范围的配体的组合应用于真核细胞，以在真核细胞表面产生CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽的量随时间的希望的表达谱。
希望量的CAR表达可以激活T淋巴细胞或天然杀伤细胞中的效应物功能，具有最小量的T淋巴细胞耗尽、功能障碍和/或其它失调过程(例如细胞命运的改变，或代谢作用例如糖酵解的改变)。希望量的CAR表达可以激活T淋巴细胞或天然杀伤细胞中的效应物功能，具有最小量的细胞抑制、耗尽和/或功能障碍(其导致T淋巴细胞或天然杀伤细胞变得耗尽或功能障碍)。希望量的CAR表达可以提供效应物功能的希望动态范围来响应靶细胞存在的靶抗原。希望量的CAR表达可以提供效应物功能的希望范围。希望量的CAR表达可以提供小的动态范围的效应物功能(表现得像打开-关闭开关)，例如，当靶细胞具有高密度的靶抗原而健康的非靶细胞具有低密度的靶抗原时。希望量的CAR表达可以使真核细胞区分靶细胞(打开-CAR激活效应物功能)vs.健康的正常细胞(关闭-CAR激活很少或没有效应物功能)。希望量的CAR表达可以增加工程化的真核细胞(例如，T淋巴细胞或天然杀伤细胞)对靶细胞的亲合力，由此增加对靶细胞的效应。希望量的CAR表达可以增加工程化的真核细胞(例如，T淋巴细胞或天然杀伤细胞)对靶细胞的亲合力，由此增强靶细胞杀伤。希望量的CAR表达可以增加工程化的造血细胞(例如，T淋巴细胞或天然杀伤细胞)对靶细胞的亲合力，由此增强细胞因子分泌。
T细胞(例如，CD4+或CD8+)或天然杀伤细胞可以用编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的多核苷酸进行工程化。将RNA控制装置、DE或Side CAR的配体添加到T细胞(例如，CD4+或CD8+)或天然杀伤细胞，可以按增加量添加以获得希望量的效应物功能。希望量的效应物功能可以是优化量的效应物功能，其在靶细胞上具有已知量(和/或密度)的靶抗原。效应物功能可以是靶细胞杀伤、宿主免疫细胞的活化、细胞因子分泌、颗粒酶产生、细胞凋亡诱导配体的产生、调节免疫***的其它配体的产生等。效应物功能可以是细胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α、TGF-β和/或IL-10的分泌。效应物功能可以是靶细胞的杀伤。可以用颗粒酶杀伤靶细胞。可以诱导靶细胞经历细胞凋亡。具有CAR的真核细胞可以通过细胞凋亡和颗粒酶杀伤靶细胞。配体的最佳浓度可能增加效应物功能。配体的最佳浓度可以增加效应物功能的动态范围(响应靶抗原的效应物活性)。配体的最佳浓度可以提供希望量的效应物功能和希望(或可耐受)量的真核细胞(例如，T淋巴细胞或天然杀伤细胞)的耗尽、功能障碍和/或抑制。最佳活性量可以产生希望的增殖活性。最佳活性量可以是靶结合的量或效应物活性的量(例如，靶细胞杀伤)。当真核细胞是合适的免疫细胞时，最佳CAR、DE-CAR和/或Side-CAR表达可以提供希望的记忆细胞形成率。可能优化的其它真核细胞活性包括可用于疾病治疗的任何活性，包括例如记忆细胞形成率、细胞因子的释放率、吞噬作用、靶标的结合、先天髓细胞或淋巴细胞的募集、表位扩散、耗尽的发展、细胞功能障碍的发展和/或真核细胞功能的抑制。
RDE、DE、RNA控制装置或Side CAR调节元件可用于控制转基因的表达。该转基因表达可以在靶位点处递送有效负载。转基因的表达可以引起真核细胞中的所需变化。受GAPDH调节的RDE可用于有效负载递送，并且当其到达靶位点时可以(例如由CAR)激活真核细胞(例如，T细胞、天然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞或其它抗原呈递细胞)。在通过CAR在靶位点处激活真核细胞后，细胞诱导糖酵解，并且RDE释放的GAPDH允许有效负载表达和递送。靶位点可以是肿瘤或感染，并且转基因可以编码细胞因子、趋化因子、抗体、检查点抑制剂、颗粒酶、细胞凋亡诱导剂、补体、制备细胞毒性小分子的酶、切割肽或糖类的酶(例如，用于消化生物膜)、其它细胞毒性化合物或可在靶位点处具有所需效果的其它多肽。检查点抑制剂包括在免疫检查点起作用的试剂，包括例如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白(PD-1)、杀伤细胞类免疫球蛋白受体(KIR)和淋巴细胞活化基因-3(LAG3)。可用作有效负载的检查点抑制剂的示例包括，例如，Nivolumab(Opdivo)、Pembrolizumab(Keytruda)、Atezolizumab(Tecentriq)、Ipilimumab(Yervoy)、Lirilumab和BMS-986016。Nivolumab、Atezolizumab和Pembrolizumab作用于检查点蛋白PD-1并抑制抗肿瘤免疫细胞的凋亡。一些检查点抑制剂阻止PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用。Ipilimumab作用于CTLA4并阻止CTLA4下调肿瘤中活化的T细胞。Lirilumab作用于KIR并促进天然杀伤细胞的活化。BMS-986016作用于LAG3并激活抗原特异性T淋巴细胞并增强细胞毒性T细胞介导的肿瘤细胞裂解。细胞因子可以包括例如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、TNF-α、TGF-β和/或IL-10。细胞毒性试剂可以包括例如颗粒酶、细胞凋亡诱导剂、补体或细胞毒性小分子。在靶位点(例如，非肿瘤靶位点)递送的有效负载可以是保护靶位点的因子如抗炎症、将T调节细胞吸引到该位点的因子、或细胞因子或引起免疫活性抑制和降低的其它因子。有效负载可以是切割肽或糖类的酶，例如透明质酸酶、乙酰肝素酶、金属蛋白酶和其它蛋白酶，其可以用于例如消化不需要的生物膜。有效负载可以是允许对靶位点进行成像的成像剂。有效负载可以是可直接成像的多肽，或者它可以是与底物相互作用以产生可以成像的产物的多肽，成像多肽包括例如胸苷激酶(PET)、多巴胺D2(D2R)受体、碘化钠转运蛋白(NIS)、脱氧胞苷激酶、生长抑素受体亚型2、去甲肾上腺素转运蛋白(NET)、***素受体、葡萄糖转运蛋白(Glut1)、酪氨酸酶、碘化钠转运蛋白、多巴胺D2(D2R)受体、修饰的卤代烷脱卤素酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶和生长抑素受体2。这些报告有效负载可以使用例如光学成像、超声成像、计算机断层成像、光学相干断层成像、射线成像、核医学成像、正电子发射断层成像、断层成像、光声层析成像、x射线成像、热成像、荧光透视成像、生物发光成像和荧光成像来成像。这些成像方法包括正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。
胸苷激酶可以与PET报告探针一起使用，例如[18F]9-(4-[18F]-氟-3-羟甲基丁基)-鸟嘌呤、氟-18-标记的喷昔洛韦类似物，当被胸苷激酶(TK)磷酸化时在细胞内保留，或者是5-(76)Br-溴-2'-氟-2'-脱氧尿苷。每种PET报道子的相关报告探针是本领域技术人员所熟知的。多巴胺D2(D2R)受体的示例性报告探针是3-(2'-[18F]氟乙基)螺哌隆(FESP)(MacLaren等人，Gene Ther.6(5):785-91(1999))。碘化钠转运蛋白的示例性报告探针是124I，其在转运蛋白转运后保留在细胞中。脱氧胞苷激酶的示例性报告探针是2'-脱氧-2'-18F-5-乙基-1-β-d-***呋喃糖尿嘧啶(18F-FEAU)。生长抑素受体亚型2的示例性报告探针是111In-,99m/94mTc-,90Y-或177Lu-标记的奥曲肽类似物，例如90Y-或177Lu-标记的DOTATOC(Zhang等人，J Nucl Med.50(suppl 2)：323(2009))；68Ga-DOTATATE；和111In-DOTABASS(参见例如Brader等人，J Nucl Med.54(2)：167-172(2013)，在此被援引加入本文)。去甲肾上腺素转运蛋白的示例性报告探针是11C-m-羟基麻黄碱(Buursma等人，J Nucl Med.46:2068-2075(2005))。***素受体的示例性报告探针是11C-标记的CB2配体,11C-GW405833(Vandeputte等人，J Nucl Med.52(7):1102-1109(2011))。葡萄糖转运蛋白的示例性报告探针是[18F]氟-2-脱氧-d-葡萄糖(Herschman，H.R.，Crit Rev Oncology/Hematology 51：191-204(2004))。酪氨酸酶的示例性报告探针是N-(2-(二乙氨基)乙基)-18F-5-氟吡啶甲酰胺(Qin等人，SciRep.3:1490(2013))。本领域描述了其它报告探针，例如，Yaghoubi等人，Theranostics 2(4)：374-391(2012)，在此被援引加入本文。
β-半乳糖苷酶的示例性光声报告探针是5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)(Li等人，J Biomed Opt.12(2):020504(2007))。示例性X射线报告子尤其包括生长抑素受体2或其它类型的基于受体的结合剂。报告探针可以具有不透射线的标记部分，其与报告探针结合并例如通过X射线或计算机断层扫描来成像。示例性的不透射线标记是碘，特别是多碘化化学基团(参见例如美国专利号5,141,739)和顺磁标记(例如钆)，其可以通过常规方法附着于报告探针。光学成像剂包括例如荧光多肽。荧光多肽包括例如来自维多利亚水母(Aequoreavictoria)或海肾(Renillareniformis)的绿色荧光蛋白及其活性变体(例如，蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白等)；来自水螅虫水母(Hydroidjellyfish)、桡足类(Copepod)、栉水母类(Ctenophora)、珊瑚虫类(Anthrozoas)和奶嘴海葵(Entacmaea quadricolor)的荧光蛋白及其活性变体；和藻胆蛋白及其活性变体。光学成像剂也可以是生物发光多肽。这些包括例如水母发光蛋白(和其它Ca+2调节的发光蛋白)、基于荧光素底物的荧光素酶、基于腔肠素底物的荧光素酶(例如Renilla、Gaussia和Metridina)和来自Cypridina的荧光素酶及其活性变体。
所需量的CAR表达可能考虑靶细胞浓度、靶抗原的密度、靶细胞是否与其它靶细胞(例如，在肿瘤或生物膜中)相关联、细胞外元件(抗原结合元件)对靶抗原的结合亲和力(Kd)以及具有CAR的真核细胞的浓度。这些参数可用于在真核细胞上得到所需的CAR密度，这将确定所需的CAR表达水平。所需量的CAR表达还可能考虑在真核细胞上表达的抑制性受体(IR)的量以及在靶(和其它)细胞上表达的抑制性受体配体(IRL)的量。可以至少部分地使用以下等式来得到所需的CAR表达量：
CAR表达＝[靶细胞][靶抗原密度][Kd][宿主细胞] I
CAR表达＝[靶细胞][靶抗原密度][Kd][宿主细胞] II
[IR][IRL]
等式II可以可选地包括分母中的[健康细胞上的靶抗原密度]。
所需量的CAR表达可在真核细胞表面产生所需数量的CAR。所需量的CAR表达可在真核细胞表面产生2-100,000个CAR(或DE-CAR或Side-CAR)。真核细胞可以是T淋巴细胞，并且T淋巴细胞表面上的CAR(或DE-CAR或Side-CAR)的数量可以是2-100,000。CAR、DE-CAR和/或Side-CAR可以以微摩尔(μM)范围内的亲和力与靶配体结合，并且T淋巴细胞或天然杀伤细胞表面上的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的所需数量可以是100-500,000。CAR、DE-CAR和/或Side-CAR可以以纳摩尔(nM)范围内的亲和力与靶配体结合，并且T淋巴细胞或天然杀伤细胞表面上的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的所需数量可以是2-100,000。
所需量的CAR表达可以在真核细胞表面产生2-1,000、10-1,000、10-5,000、10-10,000、10-50,000、10-100,000、10-500,000或10-1,000,000个CAR(或DE-CAR或Side-CAR)。所需量的CAR表达可以在真核细胞表面产生100-1,000、100-5,000、100-10,000、100-50,000、100-100,000、100-500,000、100-1,000,000、1,000-5,000、1,000-10,000、1,000-50,000、1,000-100,000、1,000-500,000、1,000-1,000,000、10,000-50,000、10,000-100,000、10,000-500,000或10,000-1,000,000个CAR(或DE-CAR或Side-CAR)。所需量的CAR表达可以在真核细胞表面产生至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、30,000、31,000、32,000、33,000、34,000、35,000、36,000、37,000、38,000、39,000、40,000、41,000、42,000、43,000、44,000、45,000、46,000、47,000、48,000、49,000、50,000、51,000、52,000、53,000、54,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000个CAR(或DE-CAR或Side-CAR)。所需量的CAR表达可以在真核细胞表面产生少于10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、30,000、31,000、32,000、33,000、34,000、35,000、36,000、37,000、38,000、39,000、40,000、41,000、42,000、43,000、44,000、45,000、46,000、47,000、48,000、49,000、50,000、51,000、52,000、53,000、54,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000个CAR(或DE-CAR或Side-CAR)。所需量的CAR表达可以在真核细胞表面产生10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、30,000、31,000、32,000、33,000、34,000、35,000、36,000、37,000、38,000、39,000、40,000、41,000、42,000、43,000、44,000、45,000、46,000、47,000、48,000、49,000、50,000、51,000、52,000、53,000、54,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000个CAR(或DE-CAR或Side-CAR)。真核细胞可以是T淋巴细胞，并且T淋巴细胞表面上的CAR(或DE-CAR或Side-CAR)的数量可以是100-100,000。CAR、DE-CAR和/或Side-CAR可以以微摩尔(μM)范围(例如，1-500μM)内的亲和力与靶配体结合，并且T淋巴细胞或天然杀伤细胞表面上的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的所需数量可以是100-100,000。CAR、DE-CAR和/或Side-CAR可以以微摩尔(μM)范围内的亲和力与靶配体结合，并且T淋巴细胞或天然杀伤细胞表面上的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的所需数量可以是100-1,000、100-5,000、100-10,000、100-50,000、100-100,000、100-500,000、100-1,000,000、1,000-5,000、1,000-10,000、1,000-50,000、1,000-100,000、1,000-500,000、1,000-1,000,000、10,000-50,000、10,000-100,000、10,000-500,000或10,000-1,000,000。CAR、DE-CAR和/或Side-CAR可以以纳摩尔(nM)范围内的亲和力与靶配体结合，并且T淋巴细胞或天然杀伤细胞表面上的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的所需数量可以是10-100,000。CAR、DE-CAR和/或Side-CAR可以以纳摩尔(nM)范围(例如，1-500nM)内的亲和力与靶配体结合，并且T淋巴细胞或天然杀伤细胞表面上的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR的所需数量可以是100-1,000、100-5,000、100-10,000、100-50,000、100-100,000、100-500,000、100-1,000,000、1,000-5,000、1,000-10,000、1,000-50,000、1,000-100,000、1,000-500,000、1,000-1,000,000、10,000-50,000、10,000-100,000、10,000-500,000或10,000-1,000,000。
所需量的CAR表达可以是在所需活性(例如，作为时间函数的靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)的曲线下给予所需量的面积的数量。所需量的CAR表达可以是在所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)的曲线下给予最大量的面积的数量。所需量的CAR表达可以是在所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)的曲线下给予最佳量的面积的数量。所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)给予所需活性率最大值(类似于Cmax)的数量。所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)给予最大活性率的数量。所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)给予最佳活性率的数量。可被自定义的真核细胞活性包括例如用于疾病治疗的任何活性，包括例如增殖率、记忆细胞形成率、细胞因子的释放率、吞噬作用、靶标结合、先天性骨髓细胞或淋巴细胞的募集、表位扩散、耗尽的发展、细胞功能障碍的发展和/或真核细胞功能的抑制。一方面，所需量的CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽可以使得真核细胞的耗尽、功能障碍和/或抑制信号可被最小化。
所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)曲线下给予所需量的面积的数量，具有所需量的耗尽、功能障碍和/或抑制性受体活性和/或表达。所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)曲线下给予所需量的面积的数量，具有可耐受量的抑制活性、T淋巴细胞功能障碍活性和/或耗尽。所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)曲线下给予最大量的面积的数量，具有最小量的宿主细胞功能障碍、耗尽和/或抑制性受体表达。所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)曲线下给予最大量的面积的数量，具有最小量的宿主细胞功能障碍。所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)曲线下给予最大量的面积的数量，具有所需活性曲线下的面积与抑制活性曲线下的面积的希望比率。所需量的CAR表达可以是对于所需活性(例如，靶细胞杀伤和/或细胞因子释放)曲线下给予最大量的面积的数量，具有所需活性曲线下的面积与宿主细胞功能障碍曲线下的面积的希望比率。所需量的CAR表达可以是给出效应物功能曲线下的面积与抑制性受体活性曲线下的面积的最大比率的数量。所需量的CAR表达可以是给出效应物功能曲线下的面积与宿主细胞功能障碍活性曲线下的面积的最大比率的数量。所需量的CAR表达可以是给出效应物功能曲线下的面积与抑制或功能障碍活性和/或耗尽曲线下的面积的最大比率的数量。
所需量的CAR表达可以是在一段时间内在对于所需活性的曲线下以及CAR细胞为下一个周期(效应物功能的周期)恢复(或维持)所需活性(在关闭期间)所需的时间长度给出所需面积的数量。所需量的CAR表达可以是对于所需活性曲线下以及CAR细胞重新获得所需效应物功能(在关闭期间)所需的时间长度给出所需面积的数量。所需量的CAR表达可以与诱导效应物功能的速率，诱导T淋巴细胞(或天然杀伤细胞)的抑制功能、耗尽和/或功能障碍的速率，以及当CAR表达被关闭时抑制性受体丧失和/或抑制活性从T淋巴细胞或天然杀伤细胞中丧失的速率相关。
所需量的CAR表达可以循环，使真核细胞经历开启(真核细胞和效应物功能的活化)和关闭(失活-抑制剂受体的下调)的周期。所需量的CAR表达可以循环，使得由CAR真核细胞激活的细胞进行循环，例如由具有CAR的真核细胞(和由真核细胞激活的其它免疫细胞)表达的细胞因子激活的细胞。可以工程化T淋巴细胞和/或天然杀伤细胞以敲除抑制性受体表达，包括例如PD-1和CTLA-4。CAR表达的循环以及活化和失活状态可以基于群体进行。可以对个体真核细胞进行CAR表达的循环以及活化和失活状态。
CAR、DE-CAR或Side-CAR的最佳表达可以通过将所需效应物活性的一阶导数(以找到最大值)作为时间的函数来确定。以下等式可用于描述效应物活性、其可以取决于活化相关的信号分子(FA)的产生速率，减去抑制相关信号分子(FI)的产生速率，并且可选地减去取决于代谢状态改变的效应物功能参数Qm的某些丧失。
Figure BDA0001981322340000621
FA是活化分子的产生速率，其也可表示为dNA/dt。FA可以线性取决于NRT(与靶标结合的受体的瞬时数量)以及常数c活化。
Figure BDA0001981322340000622
活化
NRT可以通过反应等式以及相应的结合和解离速率找到。
Figure BDA0001981322340000623
Figure BDA0001981322340000624
Figure BDA0001981322340000625
求解dNRT的该第一阶ODE
Figure BDA0001981322340000628
在平衡条件下，dNRT/dt可以设置为0，留下NRT，其可以代入FA的等式，完全取决于NR(受体的数量)、NT(靶标的数量)、k1和k_1，它们是受体靶复合物的结合和解离速率常数，由其靶标的抗体亲和力定义。
Figure BDA0001981322340000626
对于FI，我们寻求对活化提供负反馈，这与观察到的生物学功能一致。这里，我们将其表达为NA的指数函数和常数c2和c抑制。
Figure BDA0001981322340000627
抑制
可选形式的Q可以是NA的任意函数，其通常也取决于活化状态。
Q＝f(NA)·c代谢
这些等式可用于绘制E，并且对于给定的nT、k1、k_1和变化的NR，可以如图4中所示识别最大E。图4示出了效应物功能(E)、(效应物功能的)活化信号或分子(NA)和(效应物功能的)抑制信号或分子(NI)作为细胞上CAR受体的数量的函数的图标。图4中的图表具有设定的靶浓度，并且图表示出了最大(并且在一些情况下最佳)效应物功能发生在CAR受体数目小于可以在真核细胞表面上表达的CAR受体的最大数目。
所需量的CAR表达可以考虑真核宿主细胞活化(与CAR表达相关)和宿主细胞的效应物功能的抑制(失活、功能障碍和/或耗尽)的竞争过程。所需量的CAR表达可以考虑T淋巴细胞或天然杀伤细胞活化(与CAR表达相关)和效应物功能的抑制(失活、功能障碍和/或耗尽)的竞争过程。图5示出了随着抑制(耗尽、功能障碍和/或失活)升高，T淋巴细胞活化(宿主细胞的效应物功能)降低。Smart-CAR宿主细胞的可操作窗口可以通过如图5所示的这两个过程来定义。Smart-CAR宿主细胞可以暴露于配体循环中，使效应物功能保持在操作窗口中(通过关闭CAR表达，宿主细胞应该减少活化，这反过来会减少宿主细胞中的抑制过程的表达，例如抑制性受体)。
图7示出了效应物功能(E)、靶细胞数(nT)、CAR受体数(nR)和CAR受体-靶细胞相互作用数(nRT)与时间的计算图，如通过本说明书结尾的程式码(python code)中的程序计算。尽管事实是CAR受体在整个模拟过程中与抗原结合，但在时间0.7可达到最大效应物功能(E)。说明书末尾的python程序可以与不同参数的靶细胞数(nT)、CAR受体数(nR)和CAR受体-靶细胞相互作用数(nRT)一起使用，以将最大效应物功能做成模型。
图7示出了将效应物活性看作CAR拷贝数、靶抗原(表位)数和对其抗原(表位)的CAR结合亲和力的函数的图表。当CAR拷贝数、抗原的CAR亲和力和靶表位的拷贝数的变量被协调以在细胞中产生所需量的效应物活性时，可以获得最佳的CAR活性。控制装置可以控制CAR拷贝数以将效应物功能的量保持在图7的最佳CAR活性范围内。随着靶表位的拷贝数减少(由于靶细胞被杀伤)，可能增加CAR拷贝数以补偿可用于结合CAR并激活它们的靶抗原的减少量。
所需量的CAR表达可以循环，因此真核细胞(或真核细胞群体)经历开启(细胞和效应物功能的活化)和关闭(未活化-抑制剂受体、抑制剂活性和/或功能障碍的下调)的周期。所需量的CAR表达可以循环，从而使CAR真核细胞诱导的细胞的活性循环，例如，由具有CAR的真核细胞表达的细胞因子活化的细胞(以及由真核细胞活化的其它免疫细胞)循环。可以工程化T淋巴细胞和/或天然杀伤细胞以敲除抑制性受体表达或敲除引起功能障碍和/或耗尽的其它因子，包括例如PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、T-bet和/或Blimp-1。CAR表达的循环以及活化和失活状态可以基于群体进行。可以对个体真核细胞进行CAR表达的循环以及活化和失活状态。
Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR可用于基因工程化T细胞以用于癌症免疫疗法。当用于一些免疫疗法应用，通过白细胞去除术从患者体内除去白细胞，优先分选并保存T淋巴细胞。T淋巴细胞经历编码Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR转基因的慢病毒或逆转录病毒引入(或其它方式的核酸引入)，扩增至靶向治疗细胞浓度并输注到患者体内，导致自体治疗，具有少的移植物vs宿主并发症。尽管CAR已被表明在实现和维持难治性/复发性急性淋巴细胞白血病的缓解方面非常有效(Maude等人，NEJM，371：1507，2014，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)，仍然发生与细胞因子释放综合征(CRS)、肿瘤溶解综合征(TLS)、B细胞发育不全或“靶向-脱靶”毒性有关的危险的副作用。通过在Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR中结合入DE、RDE、RNA控制装置和/或Side-CAR来调节CAR表达可以控制这些毒性。通过在Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR中结合入DE、RDE、RNA控制装置和/或Side-CAR来调节CAR表达也可以使耗尽、功能障碍和/或T淋巴细胞(或天然杀伤细胞)的抑制最小化，同时提供希望水平的效应物功能。
T细胞可以包括CAR、DE-CAR、RDE-CAR和/或Side-CAR(具有整合的RNA控制装置)。可以使用组合的Smart DE-CAR、Smart-RDE-CAR和/或Smart Side-CAR T细胞，其中独立的T细胞表达正交的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR，靶向不同的肿瘤相关抗原(TAA)。同时靶向多个TAA可以针对原发性肿瘤或转移来引导更大的CTL应答并防止复发。使用CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽T细胞的潜在缺点是可能存在引发靶向脱靶效应而引起毒性的更高可能性。DE、RDE、RNA控制装置和/或Side-CAR与Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞中的CAR的耦联减轻了毒性问题，同时使得Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞具有更强的反应和复发预防。可以通过多个配体控制Smart-DE-CAR和/或Side-CAR T细胞。DE、RDE、RNA控制装置和Side-CAR可用于组合的SmartCAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞，对不同配体或配体组合是特异性的，从而最小化或消除表达串扰。可以使用Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞通过靶向不同的肿瘤相关表面抗原来针对单个肿瘤。可以使用这些Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞通过靶向相同的肿瘤相关表面抗原来针对单个肿瘤，具有Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR或其组合的不同的跨膜、铰链、受体、共刺激元件、其它方面。可以使用Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞针对克隆异质性肿瘤类型，其中Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞的每个群体对于特定的TAA是特异性的。Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞的相对群体可以控制。可以给药配体的组合以诱导Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞的特定种群的表达。可以使用通用的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞。所述CAR T细胞是单个T细胞，其包括一个以上的SmartCAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR或一种以上的用于Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR表达的装置。
Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR和/或通用CAR可被设计成包括抗具有细菌、真菌或病毒来源的抗原的受体。因为Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR可用于对抗感染(感染是免疫功能低下患者的毒性来源)，所述抗病原体Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR可以与对TAA特异性的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR T细胞疗法结合使用。
真核细胞可以通过CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽与特定的抗原结合，使得CAR、DE-CAR和/或Side-CAR多肽将信号传递到真核细胞中，并且结果是，真核细胞可以被激活并因此表达适当的RDE-转基因。表达Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的真核细胞的激活根据真核细胞的种类和Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR的细胞内元件而变化。真核细胞可以表达RDE转录物，其在通过Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR和/或Side-CAR刺激真核细胞后使细胞平衡效应物功能。
表达RDE-转基因或RDE转录物以及可选的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体和/或其它受体或靶向多肽的真核细胞可用作治疗疾病的治疗剂。治疗剂可以包括真核细胞表达RDE-转基因或RDE转录物以及可选的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体和/或其它受体或靶向多肽作为活性成分，并且还可能包括合适的赋形剂。赋形剂的示例包括用于组合物的药学上可接受的赋形剂。施用真核细胞表达RDE-转基因或RDE转录物以及可选的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体和/或其它受体或靶向多肽所针对的疾病没有特别限制，只要该疾病对真核细胞和/或RDE-转基因的产物显示出敏感性。
可以治疗的疾病的示例包括癌症(血癌(白血病)、实体瘤(卵巢癌)等)，炎性疾病/自身免疫性疾病(哮喘、湿疹)，肝炎和传染性疾病，病因是病毒如流感和HIV、细菌或真菌，例如肺结核、MRSA、VRE和深部真菌病，其它免疫介导的疾病，如神经退化性疾病如阿尔茨海默氏症或帕金森氏症等，以及代谢疾病如糖尿病。受体(例如，CAR)可以将真核细胞靶向至患病细胞，并且当受体在患病细胞处与其靶标结合时，受体可以将信号发送到真核细胞中，引起RDE-转基因的表达。RDE-转基因编码可用于治疗或杀死患病细胞的多肽。表达受体的真核细胞可以用于治疗癌症和/或实体瘤，所述受体与肿瘤相关(或癌症相关)抗原结合，例如上述那些。当受体与肿瘤相关抗原结合时，受体向细胞发送信号，引起RDE-转基因被表达(例如，信号影响RDE结合蛋白，引起RDE-转录物的表达)。RDE-转录物可以编码激活真核细胞的多肽，使得真核细胞治疗癌症，和/或RDE-转录物编码自身治疗癌症的多肽(例如，细胞毒性多肽)。
表达RDE-转基因或RDE转录物以及可选的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体和/或其它受体或靶向多肽(结合至与自身免疫性疾病相关的免疫蛋白)的真核细胞可以用于治疗自身免疫性疾病(例如，寻常型天疱疮、红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症、克罗恩病)。受体或靶向多肽可以触发编码可用于治疗自身免疫性疾病的多肽(例如，多肽可以调节引起自身免疫性疾病的细胞或杀死这些细胞)的RDE-转基因的表达。表达RDE-转基因或RDE转录物以及受体或靶向多肽的真核细胞可以靶向使抗体参与自身免疫性疾病的细胞(例如，RDE-转基因可以编码杀死抗体产生细胞或抑制通过这些细胞产生抗体的多肽。)。表达RDE-转基因或RDE转录物和受体或靶向多肽的真核细胞可以靶向参与自身免疫性疾病的T淋巴细胞(例如，RDE-转基因可以编码杀死靶T淋巴细胞或调节T淋巴细胞的活性的多肽)。
表达RDE-转基因或RDE转录物以及可选的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体和/或其它受体或靶向多肽的真核细胞可用作治疗过敏症的治疗剂。可以治疗的过敏症的示例包括例如对花粉、动物毛屑、花生、其它坚果、乳制品、麸质、蛋、海鲜、贝类和大豆的过敏。表达RDE-转基因或RDE转录物以及受体或靶向多肽的真核细胞可以靶向产生抗体的细胞，所述抗体引起对例如花粉、动物毛屑、花生、其它坚果、乳制品、麸质、蛋、海鲜、贝类和大豆的过敏反应。靶向的细胞可以是B细胞、记忆B细胞、浆细胞、前体B细胞和祖细胞B细胞中的一种或多种。靶向的细胞还可以包括T淋巴细胞，其引起对例如花粉、动物毛屑、花生、其它坚果、乳制品、麸质、蛋、海鲜、贝类和大豆的过敏反应。表达RDE-转基因或RDE转录物以及受体或靶向多肽的真核细胞可以与抗体或T细胞受体的独特型决定簇结合。
表达RDE-转基因或RDE转录物以及可选的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体和/或其它受体或靶向多肽的真核细胞可被施用，用于治疗疾病或病症。例如，真核细胞可用于治疗传染性疾病。真核细胞可以表达受体或靶向多肽，其结合在传染性致病试剂或被这种试剂感染的细胞上发现的抗原。受体或靶向多肽结合与传染性疾病相关的抗原，并将信号发送到真核细胞中，引起RDE-转基因的表达。RDE-转基因编码可以激活真核细胞用于治疗传染性疾病的产物(例如，真核细胞可以产生细胞毒性多肽或激活免疫细胞的细胞因子)。RDE-转基因还可以编码本身是细胞毒性多肽或细胞因子的多肽。真核细胞还可用于预防传染性疾病(预防性使用)，例如，在骨髓移植或暴露于辐射之后，为了缓解复发性白血病而进行供体淋巴细胞输注等。
包括真核细胞表达RDE-转基因或RDE转录物以及可选的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体和/或其它受体或靶向多肽作为活性成分的治疗剂可以通过肠胃外施用(例如通过注射或输注)皮内、肌肉内、皮下、腹腔内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内或进入传入***施用，尽管施用途径不受限制。
RDE-转基因或RDE转录物以及可选的Smart CAR、DE-CAR、RDE-CAR、Smart-DE-CAR、Smart-RDE-CAR、DE-RDE-CAR、Smart-DE-RDE-CAR、Side-CAR、T细胞受体、B细胞受体、先天免疫受体和/或其它受体或靶向多肽可以与具有侵袭性抗肿瘤特性的T淋巴细胞一起使用，例如Pegram等人，CD28z CARs and armored CARs，2014，Cancer J.20(2)：127-133中描述的那些，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。RDE转录物可以编码引起T淋巴细胞中侵袭性抗肿瘤特性的多肽。
转基因、CAR、DE-CAR和/或SideCAR多肽可以通过来自编码IL-2的基因的3'-UTR或IFN-γ的3'-UTR的RDE来控制。可以修饰这些RDE以失活RDE中发现的microRNA位点。使用这些控制元件通过RDE与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的相互作用使CAR、DE-CAR、Side-CAR和/或转基因的表达对宿主细胞的糖酵解状态的变化敏感。当宿主细胞处于静止状态时，大部分的GAPDH不参与糖酵解并且能够结合RDE，导致编码CAR、DE-CAR、Side-CAR和/或转基因多肽的转录物的转译减少。当诱导宿主细胞提高糖酵解时，例如通过向宿主细胞提供葡萄糖或其它会增加糖酵解活性的小分子，GAPDH变得具有酶活性并且不能结合RDE。GAPDH与RDE结合的减少提高了编码CAR、DE-CAR、Side-CAR或其它转基因的转录物的转译(例如，通过增加转录物的半衰期和/或通过提高转译率)。可以通过增大丙糖异构酶的量和/或活性来提高GAPDH的糖酵解活性。可以诱导宿主细胞过表达重组丙糖异构酶，并且这种过表达提高了GAPDH的糖酵解活性。可以加入糖酵解抑制剂以降低具有RDE的转录物的表达。所述糖酵解抑制剂包括例如雷帕霉素、2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸(bromophyruvic acid)、碘乙酸盐、氟化物、草氨酸盐、普洛格唑(ploglitazone)、二氯乙酸、醌或其它代谢抑制剂如脱氢表雄酮。通过添加抑制GAPDH(或其它RDE结合蛋白)结合RDE的GAPDH(或其它RDE结合蛋白)抑制剂，可以增加RDE控制的转录物的表达。所述GAPDH抑制剂包括，例如CGP 3466B马来酸盐或Heptelidic酸(均由Santa Cruz Biotechnology,Inc.销售)、戊丙酯菌素或3-溴丙酮酸。
编码具有RDE的转录物的构建体可以在真核细胞中表达以结合RDE结合蛋白，因此降低那些RDE结合蛋白与细胞中的天然转录物相互作用的能力。重组转录物可以竞争结合RDE结合蛋白，这可以通过RDE结合蛋白减少真核细胞中天然转录物的抑制和/或活化。编码具有RDE的转录物的构建体可以以这种方式用于改变天然转录物何时以及如何在真核细胞中表达。真核细胞可以是T细胞、天然杀伤细胞或B细胞，重组转录物具有与细胞因子或细胞毒性转录物共享的RDE(例如，在它们的3'非翻译区)。重组转录物可以竞争结合RDE结合蛋白(例如，上述的GAPDH和/或其它糖酵解酶)，其调节细胞因子或细胞毒性多肽的表达并改变表达细胞因子或细胞毒性多肽所需的阈值(例如，GAPDH的糖酵解活性)。这可以用于创建超级T细胞(又名愤怒(Angry)T细胞或大黄蜂(Hornet)T细胞)，其将分泌更高量的细胞因子和/或细胞毒性蛋白(更大的Cmax)来响应免疫细胞的刺激(例如，通过CAR或T细胞受体)。可以用编码来自IL-2转录物的RDE的重组转录物重编程T细胞，使得当T细胞受其T细胞受体刺激时，其产生更多的IL-2和其它具有更快动力学的效应物多肽。这些重编程的T细胞还可以以更大的量和更快的动力学产生其它炎性细胞因子和细胞毒性多肽(例如，颗粒酶和/或穿孔素)。将T细胞和天然杀伤细胞重编程为所述愤怒(Angry)/大黄蜂(Hornet)状态可用于治疗疾病和失调，包括例如肿瘤、其它癌症和传染性疾病。
通过识别受试者的RDE中的变化可以诊断受试者的某些疾病。所述变化可能导致RDE的功能获得或丧失。例如，缺失、染色体重排和某些碱基取代可导致RDE丧失功能(例如，通常与RDE相互作用的RNA结合蛋白不再结合)。所述功能丧失的改变可以改变转录物的表达并导致异常表达。异常RDE的检测可以使用下一代核酸测序、蛋白质-RNA结合测定或RNA结合蛋白捕获方法进行，例如Castello等人，Molc.Cell 63：696-710(2016)中描述的那些，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。这些RNA结合测定可用于诊断受试者的RDE的功能的改变。这种异常表达可导致疾病状态，例如癌症，包括例如成人T细胞白血病/淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和胃腺癌(这些癌症具有变体，其中PD-L1的3'-UTR的RDE被改变，导致PD-L1的过表达)(Kataoka K等人，Nature(2016)534：402，doi：10.1038/nature18294，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)；炎性疾病；自身免疫性疾病，例如***性红斑狼疮、I型糖尿病、乳糜泻(de Jong等人，Genes and Immunity(2016)17，75-78，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)(CTLA-4的3'-UTR中的改变，其增加与自身免疫相关的RDE的长度)和类风湿性关节炎(Tsuzaka等人，ModernRheumatol.(2002)12：167-173，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)(选择性剪接改变T细胞受体ζ链的RDE并导致表达的下调)；和神经障碍和疼痛障碍(Foulkes和Wood，PLoS Genetics(2008)4(7)：e1000086，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。
可以使用测序技术、扩增方法、基于杂交的技术和用于检测序列改变的其它方法来检测受试者的异常RDE。可以通过分析受试者的核酸(mRNA和/或DNA)来检测RDE。测序技术包括例如，sanger测序、其它链终止测序方法、Maxam和Gilbert测序、Polony测序、SOLID测序(通过连接测序)、单分子测序(例如，Pacific Biosciences)、离子激流测序、焦磷酸测序(例如，454Life Sciences)、通过合成测序(Illumina)、纳米孔测序等。扩增方法包括例如，聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、转录介导的扩增技术、逆转录酶PCR、连接酶链式反应、链置换扩增、裂解酶侵入物等。杂交方法包括例如，Southerns、Northerns、DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交、荧光原位杂交等。在其它方面，使用蛋白质-RNA结合测定法或RNA结合蛋白质捕获方法(例如，Castello等人，Molc.Cell 63：696-710(2016)中描述的那些，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)来鉴定RDE与RDE结合蛋白的相互作用中的变化。
从下面的实验细节可以更好地理解本文公开的发明。然而，本领域技术人员将容易理解，所讨论的具体方法和结果仅仅是对本发明的例证，所附权利要求书更全面地描述本发明。除非另有说明，否则本公开不限于特定程序、材料等，因为这些可能变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。
实例
实例1.用Smart-CAR控制T细胞效应物活性
利用Budde 2013中所述的第三代抗CD20CAR盒(Budde等人，PLoS1，2013doi：10.1371/journal.pone.0082742，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)和RNA控制装置，3XL2bulge9(Win和Smolke 2007Proc.Natl Acad.Sci.104(36)：14283-88，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)来制备Smart Car。将编码3XL2bulge9控制装置的核酸在合适的表达载体工程化到抗CD20CAR盒中。
通过常规方法将该抗CD20Smart CAR转染到T细胞(Jurkat细胞和/或原代人类T细胞)中，并利用合适的抗生素(或其它选择方案)选择稳定的T细胞群体。通过与抗CD3/CD28珠共同孵育来活化具有抗CD20Smart CAR(CD20-/CD22-/CD3+)的T细胞群体。
活化的抗CD20Smart CAR T细胞与CD20+/CD22+/CD3-Ramos靶细胞共培养，SmartCAR T细胞与Ramos靶标的比率为2：1、5：1和10：1。将RNA控制装置的配体茶碱以500μM至1mM范围的浓度(可以使用更低或更高的浓度将Smart-CAR活性滴定至所需水平)添加至培养基中。Smart-CAR T细胞与Ramos细胞一起生长达48小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Ramos靶细胞)和CD3+细胞(Smart CAR T细胞)进行计数。这些测量将确认Smart-CAR T细胞在不同Smart-CAR表达水平下的靶细胞杀伤率(例如，半衰期)和增殖率。
实例2.用组合Smart-CAR在人类受试者中控制T细胞效应物活性
构建编码正交Smart CAR的核酸并将其包装到慢病毒载体中，所述正交Smart CAR对不同的TAA具有特异性并响应不同的小分子配体。这些Smart CAR中的每一个展示体外细胞毒性T细胞效应物功能和抗原依赖性扩增来响应同源配体暴露，并且各自在人类患者中具有已知的治疗窗。
为了治疗患有表达由该Smart CAR池识别的定义组的多个TAA的肿瘤的人类受试者，通过血液成分单采术从患者的外周血中收获自体T细胞，并单独或在池中用编码同源Smart CAR的慢病毒体外转导。然后将扩增的Smart CAR CD4+和/或CD8+T细胞过继转移回患者体内。每个Smart CAR均通过其自身的同源小分子配体单独活化，以启动肿瘤识别和消除。由于每个Smart CAR都是单独控制的，针对每个Smart CAR的治疗窗被调节以执行最大的移植物对抗(vs.)肿瘤反应，具有可容忍的移植物对抗(vs.)宿主反应。如果达到肿瘤免疫编辑的逃逸阶段，则通过移除其同源配体来失活靶向丢失的TAA的Smart CAR，以限制不再提供移植物对抗(vs.)肿瘤益处的Smart CAR的进一步移植物对抗(vs.)宿主反应。通过控制Smart CAR毒性并快速并行化对TAA的分布式攻击，可以实现任何肿瘤类型的持久缓解。
实例3.用DE-CAR控制T细胞效应物活性
使用Budde 2013中所述的抗CD20CAR盒(Budde等人，PLoS1，2013doi：10.1371/journal.pone.0082742，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)和Iwamoto 2010中所述的去稳定元件(DE)ecDHFR(Iwamoto等人，Chemistry and Biology，2010doi：10.1016/j.chembiol.2010.07.009，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)来制备DE-CAR。DE-CAR还可以编码RNA控制装置3XL2bulge9(Win和Smolke2007Proc.NatlAcad.Sci.104(36)：14283-88，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)。将编码突变体scDHFR的DE的核酸在合适的表达载体工程化到抗CD20CAR盒中。可替换地，将编码3XL2bulge9控制装置的核酸进一步工程化到DE-抗CD20CAR盒中。
通过常规方法将该抗CD20DE-CAR转染到T细胞(Jurkat细胞和/或原代人类T细胞)中，并使用合适的抗生素(或其它选择方案)来选择稳定的T细胞群体。通过与抗CD3/CD28珠共同孵育来活化具有抗CD20DE-CAR或抗CD20Smart-DE-CAR(CD20-/CD22-/CD3+)的T细胞群。
活化的抗CD20DE-CAR T细胞或抗CD20Smart-DE-CAR T细胞与CD20+/CD22+/CD3-Ramos靶细胞共同培养，DE-CAR T细胞(或Smart-DE-CAR T细胞)与Ramos靶标的比率为2：1、5：1和10：1。将DE的配体甲氧苄啶和/或RNA控制装置的配体茶碱以500μM至1mM范围的浓度(更低或更高的浓度可用于将Smart-CAR活性滴定到所需水平)添加至培养基中。DE-CAR T细胞或Smart-DE-CAR T细胞与Ramos细胞一起生长达48小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Ramos靶细胞)和CD3+细胞(DE-CAR和/或Smart-DE-CAR T细胞)进行计数。这些测量将确定Smart-CAR T细胞在不同Smart-CAR表达水平下的靶细胞杀伤率(例如，半衰期)和增殖率。
实例4.用Smart-CAR增加T细胞效应物活性
使用WO2012/079000中所述的第三代抗CD19CAR盒(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)和RNA控制装置3XL2bulge9(Win和Smolke 2007Proc.NatlAcad.Sci.104(36)：14283-88，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)来制备Smart Car。将编码3XL2bulge9控制装置的核酸在合适的表达载体工程化到抗CD19CAR盒中。
通过常规方法将抗CD19Smart CAR和抗CD19CAR构建体转染到不同的T细胞群体(Jurkat细胞和/或原代人类T细胞)中，并且使用合适的抗生素(或其它选择方案)来选择稳定的T细胞群体。通过与抗CD3/CD28珠共同孵育来活化具有抗CD19Smart CAR(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体和具有抗CD19CAR(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体。
活化的抗CD19Smart CART细胞与CD19+/CD22+/CD3-Ramos靶细胞共同培养，SmartCART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。将RNA控制装置的配体茶碱以2μM至2mM(2μM、10μM、20μM、100μM、200μM、1mM和2mM)范围的浓度添加至培养基中。Smart-CART细胞与Raji细胞一起生长达48小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Raji靶细胞)和CD3+细胞(Smart CART细胞)进行计数。这些测量将确定Smart-CAR T细胞在不同Smart-CAR表达水平下的靶细胞杀伤率(例如，半衰期)和增殖率。
活化的抗CD19Smart CART细胞与CD19+/CD22+/CD3-Ramos靶细胞共同培养，SmartCART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。RNA控制装置的配体茶碱以2μM至2mM(2μM、10μM、20μM、100μM、200μM、1mM和2mM)范围的浓度添加至培养基中。Smart-CART细胞与Raji细胞一起生长达48小时。取出来自培养基的样品并通过ELISA测试IL-2。
作为对照，活化的抗CD19CART细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，CART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。RNA控制装置的配体茶碱以2μM至2mM(2μM、10μM、20μM、100μM、200μM、1mM和2mM)范围的浓度添加至培养基中。CART细胞与Ramos细胞一起生长达48小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Raji靶细胞)和CD3+细胞(CAR T细胞)进行计数。这些测量将确定CAR T细胞在不同CAR表达水平下的靶细胞杀伤率(例如，半衰期)和增殖率。
作为对照，活化的抗CD19CART细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，CART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。RNA控制装置的配体茶碱以2μM至2mM(2μM、10μM、20μM、100μM、200μM、1mM和2mM)范围的浓度添加至培养基中。CART细胞与Raji细胞一起生长达48小时。取出来自培养基的样品并通过ELISA对IL-2进行测试。
实例5：通过具有Smart-CAR的CD8+T淋巴细胞的靶细胞杀伤
使用WO2012/079000(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD19CAR以及RNA控制装置3XL2bulge9(Win和Smolke2007Proc.NatlAcad.Sci.104(36)：14283-88，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)来制备Smart Car。将编码3XL2bulge9控制装置的核酸以表达载体工程化到抗CD19CAR盒中。
通过常规方法将抗CD19Smart CAR和抗CD19CAR构建体转染到不同的T细胞群体(Jurkat细胞和/或原代人类T细胞)中，并且使用合适的抗生素(或其它选择方案)选择稳定的T细胞群体。具有抗CD19Smart CAR(CD20-/CD22-/CD3+)的T细胞群体和具有抗CD19CAR(CD20-/CD22-/CD3+)的T细胞群体通过与抗CD3/CD28珠共同孵育而被活化。
具有抗CD19Smart CAR或抗CD19CAR的T细胞与茶碱以0、75和250μM孵育达72小时。活化的抗CD19Smart CAR T细胞或抗CD 19CAR T细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，Smart CAR T细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。RNA控制装置的配体茶碱以0μM、75μM和250μM的浓度维持在培养基中。Smart-CAR T细胞或CAR T细胞与Raji细胞一起生长达18小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Raji靶细胞)和CD3+细胞(Smart CART细胞)进行计数。
本实验的结果如图6所示，其示出了针对每种茶碱浓度和针对具有抗CD19SmartCAR的T淋巴细胞或具有抗CD19CAR的T淋巴细胞的各自曲线的对时间所绘制的靶细胞杀伤。该图展示了茶碱控制的Smart CAR相对于组成型表达的CAR在靶细胞杀伤的改善。在250μM茶碱时改善约2倍，并且75μM和250μM茶碱均改善了相对于组成型表达的CAR的靶细胞杀伤。与没有茶碱时生长的具有抗CD19Smart CAR的T淋巴细胞相比，两个茶碱浓度也显示出在细胞杀伤上增加约2倍(这些细胞也杀伤靶细胞，显示出一些基础水平的CAR表达)。
实例6：用CD-19CAR减少CD8+T淋巴细胞的T淋巴细胞耗尽标志物
使用WO2012/079000(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD19CAR以及RNA控制装置3XL2bulge9(Win和Smolke2007Proc.NatlAcad.Sci.104(36)：14283-88，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)来制备Smart Car。将编码3XL2bulge9控制装置的核酸以表达载体工程化到抗CD19CAR盒中。
通过常规方法将抗CD19Smart CAR和抗CD19CAR构建体转染到不同的T细胞群体(Jurkat细胞和/或原代人类T细胞)中，并且使用合适的抗生素(或其他选择方案)选择稳定的T细胞群体。具有抗CD19Smart CAR(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体和具有抗CD19CAR(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体通过与抗CD3/CD28珠共同孵育而被活化。
具有抗CD19Smart CAR或抗CD19CAR的T细胞用茶碱以0、75和250μM孵育达72小时。活化的抗CD19Smart CAR T细胞或抗CD19CAR T细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，Smart CAR T细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1，和10：1。RNA控制装置的配体茶碱以0μM、75μM和250μM的浓度维持在培养基中。Smart-CAR T细胞或CAR T细胞与Raji细胞一起生长达18小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Raji靶细胞)和CD3+细胞(Smart CAR T细胞)进行计数。细胞也用抗PD-1、抗TIM3和/或抗LAG-3试剂染色以通过ELISA或细胞分选测定这些T淋巴细胞耗尽标记物。
与组成型表达的CD-19CAR T淋巴细胞相比，CD-19Smart CAR T淋巴细胞会具有更低水平的耗尽标记物。甚至在通过靶Raji细胞上的CD-19刺激CD-19CAR淋巴细胞和CD-19Smart CAR淋巴细胞之前可能看到耗尽标志物的这种减少。
实例7.用RDE-CAR控制T细胞效应物活性
使用WO2012/079000(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的第三代抗CD19CAR盒和编码IL-2的基因的3'-UTR(NCBI参考序列编号：NM_000586.3)(其出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)来制备RDE Car。将编码IL-23'-UTR的核酸在合适的表达载体工程化到抗CD19CAR盒中。使用的IL-2,3'-UTR序列是：
Figure BDA0001981322340000761
通过常规方法将抗CD19RDE CAR和抗CD19CAR构建体转染到不同的T细胞群体(原代人类T细胞)中，并使用合适的抗生素(或其它选择方案)选择稳定的T细胞群体。具有抗CD19RDE CAR(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体和具有抗CD19CAR(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体通过与抗CD3/CD28珠共同孵育而被活化并允许在去珠后回到静止状态。
静止的抗CD19RDE CAR T细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，RDE CART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。将糖酵解活化剂葡萄糖以1.0mM至10mM(1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、7.5mM和10mM)范围的浓度添加至培养基中。RDE-CAR T细胞与Raji细胞一起生长达24小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Raji靶细胞)和CD3+细胞(Smart CAR T细胞)进行计数。这些测量将确定RDE-CAR T细胞在不同RDE-CAR表达水平下的靶细胞杀伤率(例如，半衰期)和增殖率。
活化的抗CD19RDE CAR T细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，RDE CART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。将糖酵解活化剂葡萄糖以1.0mM至10mM(1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、7.5mM和10mM)范围的浓度添加至培养基中。RDE-CAR T细胞与Raji细胞一起生长达24小时。取出来自培养基的样品并通过ELISA对IL-2进行测试。
作为对照，活化的抗CD19CART细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，CART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。将糖酵解活化剂葡萄糖以1.0mM至10mM(1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、7.5mM和10mM)范围的浓度添加至培养基中。CART细胞与Raji细胞一起生长达24小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Raji靶细胞)和CD3+细胞(CART细胞)进行计数。
作为对照，活化的抗CD19CART细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，CART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。将糖酵解活化剂葡萄糖以1.0mM至10mM(1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、7.5mM和10mM)范围的浓度添加至培养基中。CART细胞与Raji细胞一起生长达48小时。取出来自培养基的样品并通过ELISA对IL-2进行测试。
实例8：从RDE去除microRNA结合位点
来自IL-2的3'-UTR的富含AU的元件具有mir-181和mir 186microRNA结合位点。从IL-2的3'-UTR去除不同组合的microRNA位点。当MIR186micro-RNA位点从IL-2的3'-UTR去除时，来自具有该UTR的构建体的表达的动态范围增加50倍。修饰的IL-2,3'-UTR用GAA替换序列中的CTT，并如下所示(新的GAA在序列中加下划线)：
Figure BDA0001981322340000781
来自IFNg的3'UTR的富含AU的元件也具有表征为mir-125的micro-RNA结合位点。IFNg RDE的序列是：
Figure BDA0001981322340000782
从IFNg的3'UTR去除不同组合的micro-RNA位点，并测试增加的表达。当从IFN-γ的3'-UTR去除mir125micro-RNA位点时，来自具有该UTR的构建体的表达率增加。
将用RDE-GFP加上microRNA位点转染的T细胞中GFP的表达与用CD3/CD28珠激活达24小时后去除microRNA位点的具有RDE-GFP的T细胞中GFP的表达进行比较。相对于具有microRNA位点的细胞，去除microRNA位点使GFP的表达在24小时后增加2-5倍。
实例9：控制AML的嵌合抗原受体
使用Budde 2013(Budde等人，PLoS1，2013doi:10.1371/journal.pone.0082742，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD20CAR盒制备CAR，其中抗CD133mAb 293C3-SDIE用于细胞外元件(Rothfelder等人，2015，ash.confex.com/ash/2015/webprograrn/Paper81121.html，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)替换抗CD20细胞外结构域。编码抗CD133CAR的核酸还可以包括来自IL-2的3'-UTR(被工程化以去除MIR186micro-RNA位点)或IFN-γ的3'-UTR(被工程化以去除MIR125micro-RNA位点)，如实例11所述。编码抗CD20CAR盒的构建体被工程化以用抗CD133元件替换抗CD20细胞外结构域，并且被工程化以去除MIR186microRNA位点的IL-2的3'-UTR或被工程化以去除MIR125micro-RNA位点的IFN-γ的3'-UTR也被工程化到构建体中。将具有或不具有3'-UTR的抗CD133CAR克隆到合适的表达载体中。
将该抗CD133CAR或抗CD133RDE-CAR(IL-2的3'UTR或IFN-γ的3'-UTR)之一通过常规方法转染到T淋巴细胞(Jurkat细胞和/或原代人类T淋巴细胞)中，并且使用合适的抗生素(或其它选择方案)选择稳定的T淋巴细胞群体。通过与抗CD3/CD28珠共同孵育并加入糖酵解诱导剂(例如，葡萄糖)，活化具有抗CD133CAR或抗CD133RDE CAR(CD20-/CD22-/CD3+)的T淋巴细胞群体。
活化的抗CD133CAR或抗CD133RDE CART淋巴细胞与CD133+/CD3-AML靶细胞(例如，U937、MV4-11、MOLM-14、HL-60和/或KG1a)共同培养，抗CD133CAR或抗CD133RDE CART淋巴细胞与AML靶标的比率为2：1、5：1和10：1。抗CD133CAR或抗CD133RDE CART淋巴细胞与AML细胞一起生长达48小时。清洗培养物，然后用抗CD133和抗CD3试剂染色，随后对CD133+(AML靶细胞)和CD3+细胞(抗CD133CAR或抗CD133RDE CART淋巴细胞)进行计数。这些测量将确定抗CD133CAR或抗CD133RDE CART淋巴细胞在不同CAR表达水平下的靶细胞杀伤率(例如，半衰期)和增殖率。
实例10.用于控制T细胞效应物活性的关闭开关
可以使用Wang等人，Cold Spring Harb Perspect Biol 2：a002279(2010)(该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)中所述的Y319F ZAP 70突变体以及实例9中所述的Tet RNA控制装置来制备Smart-ZAP 70突变体。编码Tet-RNA控制装置的核酸与编码Y319F ZAP 70突变体的核酸可操作地连接，并且该构建***于合适的表达载体中。
在本实例中使用具有实例8的抗CD19RDE CAR和抗CD19CAR构建体的T细胞。通过常规方法将RNA控制装置Y319F ZAP 70转染到具有跟随实例8制备的抗CD19RDE CAR和抗CD19CAR构建体的T细胞中，并使用合适的抗生素(或其它选择方案)选择稳定的T细胞群体。具有抗CD19RDE CAR(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体和具有抗CD19CAR的T细胞群体(CD19-/CD22-/CD3+)通过与抗CD3/CD28珠共同孵育而被活化。
活化的RNA控制装置Y319F ZAP 70和抗CD19RDE CAR T细胞与CD19+/CD22+/CD3-Ramos靶细胞共同培养，RDE CART细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。将糖酵解活化剂葡萄糖以1.0mM至10mM(1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、7.5mM和10mM)范围的浓度添加至培养基中。向细胞中添加或不添加2μM至2mM(2μM、10μM、20μM、100μM、200μM、1mM和2mM)范围的四环素(具有细胞培养物±四环素)。RNA控制装置Y319F ZAP 70+RDE-CAR T细胞与Raji细胞一起生长达48小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Raji靶细胞)和CD3+细胞(Smart CART细胞)进行计数。这些测量将确定RNA控制装置Y319F ZAP 70+RDE-CART细胞对比RDE-CAR T细胞在不同Y319F ZAP 70表达水平和不同RDE-XAP表达水平的靶细胞杀伤率(例如，半衰期)和增殖率。
实例11：使用抗CD19CART细胞向DLBCL进行有效负载递送
在本实例中使用实例6的抗CD19Smart CART淋巴细胞和抗CD19CAR T细胞淋巴细胞。这些CAR T淋巴细胞被进一步工程化以包括在已通过去除MIR186位点而被修饰的IL2的3'-UTR控制下编码PD-1抑制剂的构建体。由构建体表达的PD-1抑制剂包括，例如，Pembrolizumab
Figure BDA0001981322340000801
Nivolumab
Figure BDA0001981322340000802
Atezolizumab
Figure BDA0001981322340000803
BMS-936558、Lambrolizumab或来源于这些药物的多肽。可由构建体表达的其它PD-1抑制剂包括Herbst等人，J Clin Oncol.，31：3000(2013)；Heery等人，J Clin Oncol.，32：5s，3064(2014)；Powles等人，J Clin Oncol，32：5s，5011(2014)；Segal等人，J Clin Oncol.，32：5s，3002(2014)，或美国专利号8,735,553；8,617,546；8,008,449；8,741,295；8,552,154；8,354,509；8,779,105；7,563,869；8,287,856；8,927,697；8,088,905；7,595,048；8,168,179；6,808,710；7,943,743；8,246,955；和8,217,149中公开的那些。
具有抗CD19Smart CAR/PD-1(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体和具有抗CD19CAR/PD-1(CD19-/CD22-/CD3+)的T细胞群体通过与抗CD3/CD28珠共同温育而被活化。具有抗CD19Smart CAR/PD-1抑制剂或抗CD19CAR/PD-1抑制剂的T细胞与茶碱以0、75和250μM温育72小时。活化的抗CD19Smart CAR/PD-1T细胞或抗CD19CAR/PD-1T细胞与CD19+/CD22+/CD3-Raji靶细胞共同培养，Smart CAR/PD-1T细胞与Raji靶标的比率为2：1、5：1和10：1。RNA控制装置的配体茶碱以0μM、75μM和250μM的浓度维持在培养基中。Smart-CAR/PD-1T细胞或CAR/PD-1T细胞与Raji细胞一起生长达18小时。清洗培养物，然后用抗CD22和抗CD3试剂染色，随后对CD22+(Raji靶细胞)和CD3+细胞(Smart CAR T细胞)进行计数。同样在6、12和18小时取出来自培养基的样品，并通过ELISA测试PD-1抑制剂。
实例12：使用抗CD133CAR T细胞向AML进行有效负载递送
使用Budde 2013(Budde等人，PLoS1，2013doi：10.1371/journal.pone.0082742，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD20CAR盒来制备CAR，其中抗CD133mAb 293C3-SDIE用于细胞外元件(Rothfelder等人，2015，ash.confex.com/ash/2015/webprograrn/Paper81121.html，该篇文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)替换抗CD20细胞外结构域。抗CD133CAR也可以编码RNA控制装置3XL2bulge9(Win和Smolke 2007Proc.NatlAcad.Sci.104(36)：14283-88，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)。编码抗CD20CAR盒的核酸被工程化以用抗CD133元件替换抗CD20细胞外结构域，并且可选地，RNA控制装置也被工程化到盒中。将具有或不具有RNA控制装置的抗CD133CAR克隆到合适的表达载体中。
通过常规方法将这些抗CD133CAR和抗CD133Smart CAR构建体转染到T淋巴细胞(Jurkat细胞和/或原代人类T淋巴细胞)中，并使用合适的抗生素(或其它选择方案)选择稳定的T淋巴细胞群体。
这些CAR T淋巴细胞被进一步工程化以包括在已通过去除MIR186位点而被修饰的来自IL2的3'-UTR的RDE控制下编码PD-1抑制剂的构建体。由构建体表达的PD-1抑制剂包括，例如，Pembrolizumab
Figure BDA0001981322340000811
Nivolumab
Figure BDA0001981322340000812
Atezolizumab
Figure BDA0001981322340000813
BMS-936558、Lambrolizumab或来源于这些药物的多肽。可由构建体表达的其它PD-1抑制剂包括Herbst等人，J Clin Oncol.，31：3000(2013)；Heery等人，J ClinOncol.，32：5s，3064(2014)；Powles等人，J Clin Oncol，32：5s，5011(2014)；Segal等人，JClin Oncol.，32：5s，3002(2014)，或美国专利号8,735,553；8,617,546；8,008,449；8,741,295；8,552,154；8,354,509；8,779,105；7,563,869；8,287,856；8,927,697；8,088,905；7,595,048；8,168,179；6,808,710；7,943,743；8,246,955；和8,217,149中公开的那些。
具有抗CD133CAR/PD-1抑制剂或抗CD133Smart CAR/PD-1抑制剂(CD20-/CD22-/CD3+)的T淋巴细胞群体通过与抗CD3/CD28珠共同温育而被活化。
活化的抗CD133CAR/PD-1抑制剂或抗CD133Smart CAR/PD-1抑制剂T淋巴细胞与CD133+/CD3-AML靶细胞(例如，U937、MV4-11、MOLM-14、HL-60和/或KG1a)共同培养，抗CD133CAR和/或抗CD133Smart CAR T淋巴细胞与AML靶标的比率为2：1、5：1和10：1。RNA控制装置的配体茶碱以500μM至1mM范围的浓度添加至培养基中(可以使用更低或更高的浓度将Smart-CAR活性滴定至所需水平)。抗CD133CAR/PD-1抑制剂和/或抗CD133Smart CAR/PD-1抑制剂T淋巴细胞与AML细胞一起生长达48小时。清洗培养物，然后用抗CD133和抗CD3试剂染色，随后对CD133+(AML靶细胞)和CD3+细胞(抗CD133CAR、抗CD133DE-CAR、抗CD133SmartCAR和/或抗CD133DE-Smart CAR T淋巴细胞)进行计数。这些测量将确定抗CD133CAR/PD-1抑制剂和/或抗CD133Smart CAR/PD-1抑制剂T淋巴细胞在不同CAR表达水平的靶细胞杀伤率(例如，半衰期)和增殖率。同样在12、24、26和48小时取出来自培养基的样品，并通过ELISA测试PD-1抑制剂。
实例13：用于表达CAR和第二转基因的构建体
使用如WO2012/079000(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD19CAR盒和GFP-RDE2(来自IL-2的3'-UTR)***物来制备构建体。将这两个***物/盒置于不同的慢病毒构建体上或置于相同的双顺反子慢病毒构建体中。在双顺反子构建体中，具有抗CD19CAR的***物和具有GFP-RDE的***物以相反的方向转录，并且每个的控制区位于两个***物/盒之间。单一构建体慢病毒载体中GFP-RDE2***物的控制区是MND(含有具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的修饰的MoMuLV LTR的U3区的合成型启动子)，其披露于Li等人，J.Neurosci.Methods 189：56-64(2010)，该篇文献出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文。双顺反子慢病毒载体中GFP-RDE2***物的控制区是MinP，并且RDE使用IL-2的内源性3'-UTR。两种构建体中抗CD19CAR盒的控制区也是MND。CD4+T细胞用单独的抗CD19CAR慢病毒构建体和GFP-RDE2慢病毒构建体进行双重转导，或用具有抗CD19CAR慢病毒构建体和GFP-RDE2慢病毒构建体的双顺反子构建体进行单独转导。
允许转导的T细胞回到静息状态，并随后如下在刺激后进行测试。对于“无刺激”组，将转导的T细胞在培养基中单独温育24小时。对于“Raji共同培养”组和“CD3/CD28珠”组，将CD19+Raji B细胞或抗CD3/抗CD28珠与转导的T细胞一起温育24小时。在24小时，对T细胞的CD25和CD69(其是活化标记物)进行染色，并进行流式细胞术以测定这些标记物和T细胞中的GFP表达。
当与Raji靶细胞(活化CAR)一起培养时，双重转导的T细胞显示出荧光增加19.5％至42.5％(约2倍)，并且当与CD3/CD28珠(活化TCR)一起培养时，荧光增加19.5％至34.9％(约1.8倍)。双重转化的T细胞显示出当与Raji细胞一起培养时群体中活化细胞的变化为0.9％至56.9％，而当与CD3/CD28珠一起培养时为0.9％至92.5％。
单独转导的T细胞显示出当与Raji细胞一起培养时群体中活化细胞的变化为3.6％至5.8％，而当与CD3/CD28珠一起培养时为3.6％至6.6％。
实例14：用于表达第二转基因的RDE构建体
使用如WO2012/079000(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD19CAR盒和GFP-RDE1(来自IFNg的3'-UTR)***物来制备构建体。将这两个***物/盒置于相同的慢病毒构建体中。抗CD19CAR盒和具有GFP-RDE的***物以相反的方向转录，并且每个的控制区位于两个***物/盒之间。GFP-RDE***物的控制区是MinP，并且RDE是IFNg的内源性3'-UTR。抗CD19CAR盒的控制区是MND(如上所述)。用双顺反子构建体转导CD4+T细胞。
允许转导的T细胞回到静息状态，并随后如下在刺激后进行测试。对于“无刺激”组，将转导的T细胞在培养基中单独温育24小时。对于“Raji共同培养”组和“CD3/CD28珠”组，将CD19+Raji B细胞或抗CD3/抗CD28珠与转导的T细胞一起温育24小时。在24小时，对T细胞的CD25和CD69(其是活化标记物)进行染色，并进行流式细胞术以测定这些标记物和T细胞中的GFP表达。
当与Raji靶细胞(活化CAR)一起培养时，转导的T细胞显示出荧光增加为1.0％至6.5％(约6.5倍)，而当与CD3/CD28珠(活化TCR)一起培养时，荧光增加为1.0％至4.4％(约4.4倍)。当与Raji细胞一起培养时，转化的T细胞显示出群体中活化细胞的变化为0.9％至84.8％，而当与CD3/CD28珠一起培养时为0.9％至90.8％。
实例15：用于表达第二转基因的修饰的RDE2构建体
使用如实例11和12中所述的抗CD19CAR盒和GFP-RDE2.1(IL-2RDE)***物来制备构建体。修饰RDE2.1以去除MIR186microRNA位点，改变用作RDE2的IL-2的3'-UTR的核苷酸。
将这两个***物/盒置于相同的慢病毒构建体中。抗CD19CAR盒和具有GFP-RDE的***物以相反的方向转录，并且每个的控制区位于两个***物/盒之间。GFP-RDE***物的控制区是MinP。抗CD19CAR盒的控制区是MND(如上所述)。用双顺反子构建体转导CD4+T细胞。
允许转导的T细胞回到静息状态，并随后如下在刺激后进行测试。对于“无刺激”组，将转导的T细胞在培养基中单独温育24小时。对于“Raji共同培养”组和“CD3/CD28珠”组，将CD19+Raji B细胞或抗CD3/抗CD28珠与转导的T细胞一起温育24小时。在24小时，对T细胞的CD25和CD69(其是活化标记物)进行染色，并进行流式细胞术以测定这些标记物和T细胞中的GFP表达。
当与Raji细胞一起培养时，转导的T细胞显示出群体中活化细胞的变化为3.9％至12.1％，而当与CD3/CD28珠一起培养时为3.9％至11.1％。
实例16：用于表达荧光素酶转基因的RDE构建体
使用如WO2012/079000(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD19CAR盒和荧光素酶-RDE1(IFNg的3'-UTR，Gold1)***物或荧光素酶-3'-UTR(3'-UTR不赋予差异转基因翻译来响应细胞的代谢状态，3'-UTR)来制备构建体。抗CD19CAR盒和具有荧光素酶-RDE1的***物以相反的方向转录，并且每个的控制区位于两个***物/盒之间。荧光素酶-RDE1***物和荧光素酶-3'-UTR的控制区是MinP启动子或具有以下序列的NFAT启动子：
Figure BDA0001981322340000851
抗CD 19CAR盒的控制区是MND启动子。用双顺反子构建体转导CD4+T细胞。
允许转导的T细胞回到静息状态，并随后如下在刺激后进行测试。对于“无刺激”组，将转导的T细胞在培养基中单独温育24小时。对于“Raji共同培养”组和“CD3/CD28珠”组，将CD19+Raji B细胞或抗CD3/抗CD28珠与转导的T细胞一起温育24小时。在24小时，对T细胞的CD25和CD69(其是活化标记物)进行染色，并进行流式细胞术以测定这些标记物和T细胞中的荧光素酶表达。
图16显示，与静息时T细胞的生物发光相比，当与Raji靶细胞(活化CAR)一起培养时或当与CD3/CD28珠(活化TCR)一起培养时，转导的T细胞的生物发光增加。具有NFAT启动子和IFNg的3'-UTR(Gold1)的T细胞显示出来自CAR刺激相对于TCR刺激的更大的开关响应。在所有条件下，具有Gold1的T细胞具有比在相同条件下(和相同的启动子)具有不受IFNg的3'UTR(3'-UTR)控制的荧光素酶的T细胞更低的生物发光量。
实例17：RDE控制荧光素酶的比较
使用如WO2012/079000(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD19CAR盒和荧光素酶-RDE1(IFNg的3'UTR，Gold1)***物、荧光素酶-RDE2(IL-2的3'-UTR，Gold2)***物、荧光素酶-RDE3(如上所述修饰的IL-2的3'-UTR以去除mir186位点，Gold3)或荧光素酶-3'-UTR(3'-UTR不赋予差异转基因翻译来响应细胞的代谢状态，3'-UTR)来制备构建体。将图17中所示的这些***物/盒的组合置于类似的慢病毒构建体中。抗CD19CAR盒和具有荧光素酶-RDE的***物以相反的方向转录，并且每个的控制区位于两个***物/盒之间。荧光素酶-RDE***物和荧光素酶-3'-UTR的控制区是MinP启动子或NFAT启动子。抗CD19CAR盒的控制区是MND启动子，并且用双顺反子构建体转导CD4+T细胞。
允许转导的T细胞回到静息状态，并随后如下在刺激后进行测试。对于“无刺激”组，将转导的T细胞在培养基中单独温育24小时。对于“Raji共同培养”组，将CD19+Raji B细胞与转导的T细胞一起温育24小时。在24小时，对T细胞的CD25和CD69(其是活化标记物)进行染色，并进行流式细胞术以测定这些标记物和T细胞中的荧光素酶表达。
图17显示，对于具有RDE1(Gold1)、RDE2(Gold2)或RDE3(Gold3)的构建体，与静息时T细胞的生物发光相比，当与Raji靶细胞(活化CAR)一起培养时，转导的T细胞的生物发光增加。具有NFAT启动子和RDE1的T细胞显示出比具有MinP启动子和相应RDE的T细胞更大的开关响应。在所有条件下，具有RDE控制荧光素酶的T细胞具有比具有不受RDE控制的荧光素酶盒的T细胞更低的生物发光量。结合MinP启动子，RDE1通过CAR刺激在生物发光上增加4.1倍，RDE2在生物发光上增加1.8倍，而RDE3增加1.4倍。结合NFAT启动子，RDE1通过CAR刺激在生物发光上增加8.5倍，RDE2在生物发光上增加3.1倍，而RDE3增加1.3倍。通过任一启动子，RDE3构建体产生最高的生物发光量，RDE1构建体产生最低的生物发光量，而RDE2构建体产生的生物发光量在RDE3和RDE1之间。
实例18：用于表达IL-12的RDE构建体
使用如WO2012/079000(该篇专利出于所有目的以其全文形式在此被援引加入本文)中所述的抗CD19CAR盒和IL-12-RDE1(IFNg的3'-UTR)***物或IL-123'-UTR(3'-UTR不赋予差异转基因翻译来响应细胞的代谢状态)来制备构建体。抗CD19CAR盒和具有IL-12-RDE1的***物以相反的方向转录，并且每个的控制区位于两个***物/盒之间。IL-12-RDE1***物和IL-123'-UTR的控制区是minP启动子或NFAT启动子。抗CD19CAR盒的控制区是MND启动子。通过双顺反子构建体转导CD4+T细胞。
允许转导的T细胞回到静息状态，并随后如下在刺激后进行测试。对于“无刺激”组，将转导的T细胞在培养基中单独温育24小时。对于“Raji共同培养”组，将CD19+Raji B细胞与转导的T细胞一起温育24小时。在24小时，对T细胞的CD25和CD69(其是活化标记物)进行染色，并进行流式细胞术以测定这些标记物。通过ELISA测定T细胞中的IL-12表达。
图18显示，使用由MinP启动子或NFAT启动子控制的构建体，与静息时T细胞的IL-12表达相比，当与Raji靶细胞(活化CAR)一起培养时，转导的T细胞的IL-12表达增加。具有NFAT启动子和RDE1(Gold1)的T细胞显示静息至CAR刺激的IL-12表达的168倍变化。具有NFAT启动子和3'-UTR(对CAR刺激无响应，3'-UTR)的T细胞表现出50倍的表达变化，并且具有RDE1(Gold1)的minP启动子表现出6.3倍的表达变化。
披露用于计算时间依赖性效应物功能的Python Code(程式码)
Figure BDA0001981322340000871
Figure BDA0001981322340000881
Figure BDA0001981322340000891
本文讨论和引用的所有出版物、专利以及专利申请均以其全文形式在此被援引加入本文。应当理解，所披露的发明并不限于所描述的特定方法、方案和材料，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同情况。这样的等同情况旨在由所附权利要求书涵盖。
序列表
<110> 嵌合体生物工程公司
<120> Gold优化的CAR T细胞
<130> CBIO.0024
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 98
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 四环素RNA控制装置（Tetracycline RNA control device）
<400> 1
gcgcguccug gauuaaaaca uaccagauuu cgaucuggag aggugaagaa uacgaccacc 60
uaauccagcu gaugaguccc aaauaggacg aaacgcgc 98
<210> 2
<211> 110
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 新四环素RNA控制装置（New tetracycline RNA control device）
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(74)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 2
gcgcguccug gauucnnnnn uaaaacauac cagauuucgg ucuggagagg ugaagaauac 60
gaccaccuan nnnnauccag cugaugaguc ccaaauagga cgaaacgcgc 110
<210> 3
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6R-亚叶酸的适体（Aptamer for 6R-folinic acid）
<400> 3
acgucgacuu auauugcaug guucgugacg u 31
<210> 4
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6R-亚叶酸的可替换的适体（Alternative apatamer for 6R-folinicacid）
<400> 4
cgaaccggcc uuauauugca uggugcguug cggcucg 37
<210> 5
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6R-亚叶酸的新适体（New aptamer for 6R-folinic acid）
<400> 5
gcugucaccg gaugcuuggu acguuauauu caguccgguc ugaugagucc gugaggacga 60
aacagc 66
<210> 6
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6R-亚叶酸的适体（Aptamer for 6R-folinic acid）
<400> 6
gcugucaccg gauggcguug cgugguacgu uauauuccgg ccaucugguc ugaugagucc 60
gugaggacga aacagc 76
<210> 7
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 6R-亚叶酸的适体（Aptamer for 6R-folinic acid）
<400> 7
gcugucaccg gauugcgugg uacguuauau uccguccggu cugaugaguc cgugaggacg 60
aaacagc 67
<210> 8
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AU重复元件（AU repeat element）
<400> 8
auuua 5
<210> 9
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 富含AU的元件（AU rich element）
<400> 9
auuuauuuau uua 13
<210> 10
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 富含GU的重复元件（GU rich repeat element）
<400> 10
uuguu 5
<210> 11
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 富含GU的重复元件（GU rich repeat element）
<400> 11
uggggau 7
<210> 12
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 富含U的重复元件（U rich repeat element）
<400> 12
guuug 5
<210> 13
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 富含GU的元件（GU rich element）
<400> 13
uuuguuu 7
<210> 14
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 富含U的元件（U rich element）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n is a, c, g, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 14
nnuunnuuu 9
<210> 15
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 富含U的元件（U rich element）
<400> 15
uuuauuu 7
<210> 16
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 富含U的元件（U rich element）
<400> 16
uuuuuuu 7
<210> 17
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RDE元件（RDE element）
<400> 17
uuaga 5
<210> 18
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RDE元件（RDE element）
<400> 18
aguuu 5
<210> 19
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RDE元件（RDE element）
<400> 19
uuauuuauu 9
<210> 20
<211> 4
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RDE元件（RDE element）
<400> 20
uuga 4
<210> 21
<211> 7
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RDE元件（RDE element）
<400> 21
uggggau 7
<210> 22
<211> 9
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RDE元件（RDE element）
<400> 22
cugcugcug 9
<210> 23
<211> 5
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RDE元件（RDE element）
<400> 23
auuga 5
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> Thoseaasigna病毒2A（Thoseaasigna virus 2A）
<400> 24
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒-1（Porcine teschovirus-1）
<400> 25
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 马鼻炎A病毒（Equine rhinitis A virus）
<400> 26
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 27
<211> 22
<212> PRT
<213> ***病毒（foot and mouth disease virus）
<400> 27
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 28
<211> 282
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 28
taattaagtg cttcccactt aaaacatatc aggccttcta tttatttaaa tatttaaatt 60
ttatatttat tgttgaatgt atggtttgct acctattgta actattattc ttaatcttaa 120
aactataaat atggatcttt tatgattctt tttgtaagcc ctaggggctc taaaatggtt 180
tcacttattt atcccaaaat atttattatt atgttgaatg ttaaatatag tatctatgta 240
gattggttag taaaactatt taataaattt gataaatata aa 282
<210> 29
<211> 282
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 29
taattaagtg cttcccactt aaaacatatc aggccttcta tttatttaaa tatttaaatt 60
ttatatttat tgttgaatgt atggtttgct acctattgta actattattc ttaatcttaa 120
aactataaat atggatcttt tatgattgaa tttgtaagcc ctaggggctc taaaatggtt 180
tcacttattt atcccaaaat atttattatt atgttgaatg ttaaatatag tatctatgta 240
gattggttag taaaactatt taataaattt gataaatata aa 282
<210> 30
<211> 585
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 30
tggttgtcct gcctgcaata tttgaatttt aaatctaaat ctatttatta atatttaaca 60
ttatttatat ggggaatata tttttagact catcaatcaa ataagtattt ataatagcaa 120
cttttgtgta atgaaaatga atatctatta atatatgtat tatttataat tcctatatcc 180
tgtgactgtc tcacttaatc ctttgttttc tgactaatta ggcaaggcta tgtgattaca 240
aggctttatc tcaggggcca actaggcagc caacctaagc aagatcccat gggttgtgtg 300
tttatttcac ttgatgatac aatgaacact tataagtgaa gtgatactat ccagttactg 360
ccggtttgaa aatatgcctg caatctgagc cagtgcttta atggcatgtc agacagaact 420
tgaatgtgtc aggtgaccct gatgaaaaca tagcatctca ggagatttca tgcctggtgc 480
ttccaaatat tgttgacaac tgtgactgta cccaaatgga aagtaactca tttgttaaaa 540
ttatcaatat ctaatatata tgaataaagt gtaagttcac aacta 585
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MinP启动因子（MinP promoter）
<400> 31
tagagggtat ataatggaag ctcgacttcc ag 32
<210> 32
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> NFAT启动子（NFAT promoter）
<400> 32
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 60
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt agatctagac tctagagggt atataatgga 120
agctcgaatt c 131

Claims (13)

1.一种控制转基因的方法，包括步骤：获得包括受体和异源核酸的原代T-细胞，所述异源核酸包括编码转基因的多核苷酸，可操作地连接至编码RNA去稳定元件(RDE)的多核苷酸，其中RDE是富含AU的元件，其中异源核酸被转录以产生编码可操作地连接至RDE的转基因的转录物；将原代T-细胞暴露于受体的配体，其中受体与配体的结合激活原代T-细胞并且从而改变原代T-细胞的代谢状态；和，表达转基因，其中在改变原代T-细胞的代谢状态后，由转基因制备的多肽的量增加。
2.根据权利要求1所述的方法，其中受体是T细胞受体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中转基因编码细胞因子、FasL、抗体、生长因子、趋化因子、切割多肽或多糖的酶、颗粒酶、穿孔素或检查点抑制剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中转基因编码报道子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中报道子可以成像，并且进一步包括使表达配体的靶位点成像的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中配体是在靶细胞上发现的抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其中靶细胞是癌细胞或细菌。
8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括杀伤靶细胞的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中转录物中的RDE由糖酵解酶结合，所述糖酵解酶选自由磷酸甘油醛脱氢酶、烯醇酶、磷酸甘油酸酯激酶、磷酸丙糖异构酶、醛缩酶A或磷酸甘油酸变位酶组成的组。
10.根据权利要求9所述的方法，其中糖酵解酶是磷酸甘油醛脱氢酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中原代T-细胞的激活诱导糖酵解，其中糖酵解的激活导致由糖酵解酶结合转录物中RDE的降低。
12.根据权利要求11所述的方法，进一步包括将第二RDE结合蛋白结合至转录物中的RDE的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中第二RDE结合蛋白的结合增加具有RDE的转录物的半衰期。
CN201780053381.1A 2016-09-01 2017-08-31 Gold优化的car t-细胞 Active CN110121352B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011246069.4A CN112481217A (zh) 2016-09-01 2017-08-31 Gold优化的car t-细胞

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662382565P 2016-09-01 2016-09-01
US62/382,565 2016-09-01
US201762466060P 2017-03-02 2017-03-02
US62/466,060 2017-03-02
US201762533858P 2017-07-18 2017-07-18
US62/533,858 2017-07-18
PCT/US2017/049628 WO2018045177A1 (en) 2016-09-01 2017-08-31 Gold optimized car t-cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011246069.4A Division CN112481217A (zh) 2016-09-01 2017-08-31 Gold优化的car t-细胞

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110121352A CN110121352A (zh) 2019-08-13
CN110121352B true CN110121352B (zh) 2020-12-11

Family

ID=61241793

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011246069.4A Pending CN112481217A (zh) 2016-09-01 2017-08-31 Gold优化的car t-细胞
CN201780053381.1A Active CN110121352B (zh) 2016-09-01 2017-08-31 Gold优化的car t-细胞

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011246069.4A Pending CN112481217A (zh) 2016-09-01 2017-08-31 Gold优化的car t-细胞

Country Status (5)

Country Link
US (13) US10323248B2 (zh)
EP (3) EP3858365B1 (zh)
JP (3) JP7045378B2 (zh)
CN (2) CN112481217A (zh)
WO (1) WO2018045177A1 (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107708710A (zh) 2015-03-17 2018-02-16 嵌合体生物工程公司 Smart CAR装置,DE CAR多肽,Side CAR及其使用
EP3858365B1 (en) * 2016-09-01 2024-01-31 Chimera Bioengineering Inc. Gold optimized car t-cells
CN111989108A (zh) * 2018-02-13 2020-11-24 嵌合体生物工程公司 利用rna去稳定元件协调基因表达
AU2019253562A1 (en) * 2018-04-09 2020-11-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions comprising a viral vector for expression of a transgene and an effector
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
WO2020027832A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 Nantkwest, Inc. Chemokine responsive activated natural killer cells with secondary homing activation for verified targets
WO2021033089A1 (en) * 2019-08-16 2021-02-25 Janssen Biotech, Inc. Therapeutic immune cells with improved function and methods for making the same
US20210046117A1 (en) * 2019-08-18 2021-02-18 Chimera Bioengineering, Inc. Combination Therapy with Gold Controlled Transgenes
EP4028413A1 (en) 2019-09-10 2022-07-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2-il15 fusion proteins for tunable regulation
WO2021213479A1 (zh) * 2020-04-22 2021-10-28 复星凯特生物科技有限公司 Shp2特异性失活突变蛋白及其在car-t治疗中应用
CN111440823B (zh) * 2020-04-23 2020-12-01 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种重组载体及其构建方法和应用
TW202210632A (zh) 2020-05-28 2022-03-16 日商中外製藥股份有限公司 經改良之顆粒酶b變體
CN111676245B (zh) * 2020-06-24 2022-09-13 武汉波睿达生物科技有限公司 一种含有HSV-1型溶瘤病毒的NFAT-Cre-CAR-T细胞及其应用
US11770377B1 (en) * 2020-06-29 2023-09-26 Cyral Inc. Non-in line data monitoring and security services
CN111856037B (zh) * 2020-07-31 2021-06-22 四川大学华西第二医院 Unc45a与hsp10的比值在pop早期预警、诊断、预后评估中的应用和产品
CN112656798B (zh) * 2020-12-28 2023-03-07 复旦大学附属肿瘤医院 Cdk7靶向抑制剂在制备治疗细胞因子释放综合征药物中的应用
CN117396607A (zh) 2020-12-30 2024-01-12 阿劳诺斯治疗公司 包含多顺反子表达盒的重组载体及其使用方法
WO2022214887A1 (en) * 2021-04-08 2022-10-13 Phosphogam, Llc Methods and compositions for enhancing the cytotoxicity of gamma/delta-t cells
CN113564175A (zh) * 2021-07-26 2021-10-29 新乡医学院 一种具有己糖激酶2抑制活性的基因、蛋白、载体、慢病毒及应用
WO2023056193A2 (en) * 2021-09-29 2023-04-06 Chimera Bioengineering, Inc. Il-18 variants and uses thereof
WO2023088440A1 (en) * 2021-11-18 2023-05-25 Correctsequence Therapeutics Regeneration of surface antigen-negative cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107708710A (zh) * 2015-03-17 2018-02-16 嵌合体生物工程公司 Smart CAR装置,DE CAR多肽,Side CAR及其使用

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141739A (en) 1986-07-03 1992-08-25 Advanced Magnetics, Inc. Delivery of x-ray contrast agents using receptor mediated endocytosis
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
KR100246529B1 (ko) 1990-12-14 2000-04-01 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 수용체 관련된 신호 변환 경로를 위한 키메라 사슬
US6972193B1 (en) 1993-02-12 2005-12-06 Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Regulated transcription of targeted genes and other biological events
US5686278A (en) 1994-03-25 1997-11-11 Indiana University Foundation Methods for enhanced retrovirus-mediated gene transfer
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
FR2741066B1 (fr) 1995-11-14 1997-12-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
FR2743365A1 (fr) 1996-01-10 1997-07-11 Rhone Poulenc Rorer Sa Derives de 5h,10h-imidazo(1,2-a)indolo(3,2-e)pyrazine-4-one, leur preparation et les medicaments les contenant
DE19605548A1 (de) 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
DE19607686A1 (de) 1996-02-29 1997-09-04 Chemicon Lab Gmbh Neue metabolisierbare Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung
EP1094114B1 (en) 1998-07-01 2007-01-03 Takara Bio Inc. Gene transfer methods
DE69941836D1 (de) * 1998-07-10 2010-02-04 Univ Paris Curie Verfahren zur Verabreichng von Nukleinsäuren in Zellen in vitro oder ex vivo
HU228477B1 (en) 1999-08-23 2013-03-28 Dana Farber Cancer Inst Inc Pd-1, a receptor for b7-4, and uses therefor
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
ATE373078T1 (de) 2000-02-24 2007-09-15 Xcyte Therapies Inc Gleichzeitige stimulation und konzentration von zellen
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
JP2004530425A (ja) 2001-03-09 2004-10-07 ジーン ストリーム プロプライエトリー リミティッド 新規な発現ベクター
DK2206517T3 (da) 2002-07-03 2023-11-06 Ono Pharmaceutical Co Immunpotentierende sammensætninger omfattende af anti-PD-L1-antistoffer
WO2004056875A1 (en) 2002-12-23 2004-07-08 Wyeth Antibodies against pd-1 and uses therefor
WO2004072286A1 (ja) 2003-01-23 2004-08-26 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. ヒトｐｄ−１に対し特異性を有する物質
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7304162B2 (en) 2003-02-21 2007-12-04 Intrexon Corporation Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US20090048191A1 (en) * 2004-03-31 2009-02-19 Lions Eye Institute Limited Therapeutic molecules for modulating stability of vegf
CA2607147C (en) 2005-05-09 2018-07-17 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1 (pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
JP5252635B2 (ja) 2005-07-01 2013-07-31 メダレックス インコーポレーティッド プログラム死リガンド１（ｐｄ−ｌ１）に対するヒトモノクローナル抗体
CA2636111C (en) * 2006-01-13 2018-04-03 The Government Of The United States, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Codon optimized il-15 and il-15r-alpha genes for expression in mammalian cells
WO2007096877A2 (en) 2006-02-21 2007-08-30 Rf Dynamics Ltd. Electromagnetic heating
WO2008108890A2 (en) 2006-10-18 2008-09-12 University Of Rochester Conditionally replicating viruses for cancer therapy
US8173792B2 (en) 2007-02-09 2012-05-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for regulating protein function in cells using synthetic small molecules
CN104945508B (zh) 2007-06-18 2019-02-22 默沙东有限责任公司 针对人程序性死亡受体pd-1的抗体
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
EP2100970B1 (en) 2008-03-13 2017-05-10 National Institute of Immunology Ig genes specific oligonucleotides and uses thereof
WO2009114201A2 (en) 2008-03-14 2009-09-17 Intrexon Corporation Steroidal ligands and their use in gene switch modulation
JP2012501670A (ja) 2008-09-12 2012-01-26 アイシス・イノベーション・リミテッド Ｐｄ−１特異抗体およびその使用
EP3133086B1 (en) 2008-09-26 2018-08-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses thereof
KR101050829B1 (ko) 2008-10-02 2011-07-20 서울대학교산학협력단 항 ｐｄ-1 항체 또는 항 ｐｄ-ｌ1 항체를 포함하는 항암제
LT4209510T (lt) 2008-12-09 2024-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pd-l1 antikūnai ir jų panaudojimas t ląstelių funkcijos pagerinimui
EP2393835B1 (en) 2009-02-09 2017-04-05 Université d'Aix-Marseille Pd-1 antibodies and pd-l1 antibodies and uses thereof
WO2011044186A1 (en) 2009-10-06 2011-04-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Human single-chain t cell receptors
WO2012056440A1 (en) 2010-10-28 2012-05-03 Nanodoc Ltd. COMPOSITIONS AND METHODS FOR ACTIVATING EXPRESSION BY A SPECIFIC ENDOGENOUS miRNA
JP5947311B2 (ja) 2010-12-09 2016-07-06 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用
JP6053688B2 (ja) 2011-10-07 2016-12-27 国立大学法人三重大学 キメラ抗原受容体
WO2013074916A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
WO2013125878A1 (ko) 2012-02-21 2013-08-29 고려대학교산학협력단 메탈로프로테이즈에 의한 도파민성 신경세포로의 분화조절
ES2824024T3 (es) 2012-10-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics Inc Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos
US20140255361A1 (en) 2013-03-07 2014-09-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Estrogen-receptor based ligand system for regulating protein stability
PT3470018T (pt) 2013-03-13 2021-10-04 Stratatech Corp Criopreservação de substitutos de pele humana viáveis
JP6541639B2 (ja) 2013-03-14 2019-07-10 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｔ細胞増殖をコントロールするための方法
CN112457403B (zh) 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
AU2014337367B2 (en) * 2013-10-15 2020-04-30 The Scripps Research Institute Peptidic chimeric antigen receptor T cell switches and uses thereof
GB201322798D0 (en) * 2013-12-20 2014-02-05 Oxford Biomedica Ltd Production system
DK3105335T3 (da) 2014-02-14 2020-01-13 Univ Texas Kimære antigenreceptorer og fremgangsmåder til fremstilling heraf
AU2015218396A1 (en) * 2014-02-14 2016-08-11 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for activating T cells using an inducible chimeric polypeptide
ES2939760T3 (es) 2014-03-15 2023-04-26 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico para antígenos
ES2857226T3 (es) 2014-03-15 2021-09-28 Novartis Ag Receptor de antígeno quimérico regulable
ES2740903T3 (es) 2014-03-19 2020-02-07 Cellectis Receptores antigénicos quiméricos específicos de CD123 para inmunoterapia del cáncer
EP3158064A1 (en) 2014-06-17 2017-04-26 Cellectis Cd123 specific multi-chain chimeric antigen receptor
JP7084138B2 (ja) 2014-08-19 2022-06-14 ノバルティス アーゲー 癌処置に使用するための抗ｃｄ１２３キメラ抗原受容体（ｃａｒ）
MX2017005258A (es) 2014-10-31 2017-07-26 Oncomed Pharm Inc Terapia combinada para tratamiento de enfermedad.
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
US11052111B2 (en) 2015-12-08 2021-07-06 Chimera Bioengineering, Inc. Smart CAR devices and DE CAR polypeptides for treating disease and methods for enhancing immune responses
BR112018067679A2 (pt) 2016-03-04 2019-01-15 Novartis Ag células que expressam múltiplas moléculas do receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso
EP3858365B1 (en) * 2016-09-01 2024-01-31 Chimera Bioengineering Inc. Gold optimized car t-cells
EP3581651A4 (en) 2017-02-07 2021-05-12 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-GPRC5D ANTIBODY AND MOLECULE WITH IT
AU2018359907A1 (en) 2017-11-06 2020-05-07 Fred Hutchinson Cancer Center Combination of a cell therapy and a gamma secretase inhibitor
JOP20200172A1 (ar) 2018-01-12 2020-07-12 Amgen Inc الأجسام المضادة لـ pd-1 وطرق العلاج
CN111989108A (zh) * 2018-02-13 2020-11-24 嵌合体生物工程公司 利用rna去稳定元件协调基因表达

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107708710A (zh) * 2015-03-17 2018-02-16 嵌合体生物工程公司 Smart CAR装置,DE CAR多肽,Side CAR及其使用

Also Published As

Publication number Publication date
US10669549B2 (en) 2020-06-02
EP3506916A1 (en) 2019-07-10
US20200354724A1 (en) 2020-11-12
US20220228156A1 (en) 2022-07-21
US20180057822A1 (en) 2018-03-01
JP7374246B2 (ja) 2023-11-06
US20200385741A1 (en) 2020-12-10
US10323248B2 (en) 2019-06-18
US20190309310A1 (en) 2019-10-10
US20220204977A1 (en) 2022-06-30
EP3506916B1 (en) 2021-04-07
CN112481217A (zh) 2021-03-12
US11535853B2 (en) 2022-12-27
WO2018045177A1 (en) 2018-03-08
JP2024010077A (ja) 2024-01-23
US20190024095A1 (en) 2019-01-24
EP3858365A1 (en) 2021-08-04
US11572566B2 (en) 2023-02-07
JP2019526285A (ja) 2019-09-19
US11459572B2 (en) 2022-10-04
US20200032273A1 (en) 2020-01-30
EP4342978A2 (en) 2024-03-27
EP3858365B1 (en) 2024-01-31
JP7045378B2 (ja) 2022-03-31
US20200131520A1 (en) 2020-04-30
US20220325288A1 (en) 2022-10-13
US20210292771A1 (en) 2021-09-23
JP2022101542A (ja) 2022-07-06
EP3506916A4 (en) 2020-04-08
CN110121352A (zh) 2019-08-13
US10858660B2 (en) 2020-12-08
US20220186233A1 (en) 2022-06-16
US20200354725A1 (en) 2020-11-12
US10323249B2 (en) 2019-06-18
US10472637B2 (en) 2019-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110121352B (zh) Gold优化的car t-细胞
US11497774B2 (en) Coordinating gene expression using RNA destabilizing elements
US11648277B2 (en) Combination therapy with gold controlled transgenes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant