CN110117586A

CN110117586A - 一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因与应用

Info

Publication number: CN110117586A
Application number: CN201910372586.7A
Authority: CN
Inventors: 杨江科; 上官芳; 韩正刚
Original assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Wuhan Polytechnic University
Current assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2019-05-06
Filing date: 2019-05-06
Publication date: 2019-08-13
Anticipated expiration: 2039-05-06
Also published as: CN110117586B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因与应用。所述木聚糖酶XynGold的核心氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述木聚糖碱基序列与SEQ ID NO：3的序列具有95％以上的同一性。本发明显著提高了人工合成的木聚糖酶基因xyngold在毕赤酵母细胞中的表达量，显著提高了木聚糖酶的活性、温度稳定性和表达水平，获得了在毕赤酵母中高水平表达的、高酶活力、耐高温的木聚糖酶及基因。

Description

一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因序列、以及重组表达载体、重组表达菌株、该木聚糖酶XynGold的应用和一种水解木聚糖的方法。

背景技术

木聚糖是存在于植物细胞壁中的半纤维素类物质的主要成分。它约占细胞干重的15％～35％。木聚糖是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生多糖类资源。但是木聚糖只有被木聚糖酶水解为短链的木寡糖和木糖等小分子物质后才能被生物体利用。

木聚糖酶是一类能够将木聚糖水解为木糖或木寡糖的酶。它主要包括β-1,4-内切酶，β-1,4-外切酶和木糖苷酶等。其中β-1,4-内切酶发挥主要的水解作用。该酶作用于木聚糖的β-1,4-木糖苷键，将木聚糖水解为木糖、木二糖、木三糖等不同长度的可被生物体利用的小分子糖类。

一般工业上生产的木聚糖酶主要来源于青霉(Penicillium)、木霉(Trichodermi)、曲霉(Aspergilli)、芽胞杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomycetes)和瘤胃纤维菌(Rumihococci)等。

木聚糖酶广泛应用于各个工业领域。在饲料工业中，饲料中的麸皮、小麦等谷物类原料含有大量的木聚糖。动物饲用含木聚糖的饲料后易在肠道内形成食糜不利于消化吸收，形成强烈的抗营养性。在饲料中添加木聚糖酶可以使木聚糖变为可被肠道消化利用的单糖和寡糖，从而提高饲料的营养价值。在面包烘焙行业，木聚糖酶可以提高面团的机械加工能力，使面团柔软且易于拉伸、延缓老化。在果汁加工行业，木聚糖酶可以使其澄清、口感清新。在造纸领域，木聚糖酶能有效去除木质素，促进纸张的漂白。木聚糖酶在生物燃料的生产过程中也发挥着重要的作用。

尽管木聚糖酶在食品、饲料、造纸等领域具有广泛的应用前景，但仍然存在需要解决的关键问题：1)酶的比活力低。天然存在的木聚糖酶活性普遍较低，对木聚糖的水解效率低。2)木聚糖酶在工业生产中产量较低，生产成本较高。3)木聚糖酶的高温稳定性较差，特别是在饲料工业中，高温制粒工艺易使不耐热的木聚糖酶失去活性。

因此，需要对木聚糖酶进行改造来提高酶对温度的稳定性，提高其表达水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种高水平表达的超耐热木聚糖酶XynGold及基因序列、以及重组表达载体、重组表达菌株、该木聚糖酶XynGold的应用和一种水解木聚糖的方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种超耐热的木聚糖酶XynGold，所述木聚糖酶XynGold的核心氨基酸序列含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。根据本发明，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为核心序列，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列即可实现本发明的效果。进一步优选地，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

根据本发明，所述木聚糖酶XynGold由木聚糖酶Xyn通过点突变得到，所述木聚糖酶Xyn的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。具体的突变包括：将原始木聚糖酶Xyn序列中68位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺(N68Y)，将96位的谷氨酸突变为色氨酸(E96W)。所述点突变可采用本领域常规的各种突变方法，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。

本发明的第二方面提供一种木聚糖酶基因xyngold，用于编码木聚糖酶XynGold。具体地，所述木聚糖酶基因xyngold的碱基序列与SEQ ID NO：3所示的碱基序列具有95％以上的同一性。优选地，所述的木聚糖酶基因xyngold含有SEQ ID NO：3所示的碱基序列。在最优选情况下，本发明所述的木聚糖酶xyngold的碱基序列为SEQ ID NO：3所示的碱基序列。

本发明提供的木聚糖酶基因xyngold，系基于木聚糖酶氨基酸序列人工设计。与原始的木聚糖酶基因xyn(SEQ ID NO：4)相比，本发明的木聚糖酶基因xyngold采用了在毕赤酵母中高频使用的密码子，从而显著提高了人工设计的木聚糖酶基因xyngold在毕赤酵母细胞中的表达量。本发明根据木聚糖酶的氨基酸序列，人工设计出一条全新的木聚糖酶基因序列，并通过人工合成的方法获得所述木聚糖酶基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示，命名为xyngold，所述木聚糖酶基因xyngold编码出的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。本发明的木聚糖酶基因xyngold表达出的木聚糖酶XynGold的适宜温度为90～100℃，最优选为100℃。

本发明的第三方面提供一种重组表达载体，其包括上述木聚糖酶基因xyngold，还可包括其他功能单元。在木聚糖酶XynGold的氨基酸序列和木聚糖酶基因xyngold的碱基序列确定的情况下，本领域技术人员能够选择合适的重组表达载体以及其他功能单元，例如，毕赤酵母表达载体。

本发明对所述重组表达载体的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。

根据本发明一种具体实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括以下步骤：将合成的木聚糖酶基因xyngold连接至表达载体中。在本发明的一些实施例中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体pPICZαA。当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母表达载体。

根据本发明一种更加具体的实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括如下步骤：将合成的木聚糖酶基因xyngold通过限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切，获得具有粘性末端的木聚糖酶基因xyngold片段；将毕赤酵母表达载体pPICZαA通过限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切，获得具有粘性末端的pPICZαA片段；将木聚糖酶基因xyngold片段和pPICZαA片段通过T4DNA连接酶连接，获得pPIC-xyngold重组表达质粒。

本发明的第四方面提供一种重组表达菌株，其表达产物为上述木聚糖酶XynGold。在木聚糖酶XynGold的氨基酸序列确定的情况下，本领域技术人员能够获得合适的重组表达菌株。

通常来说，所述宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞，例如动物细胞等。优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。同时，本发明提供的木聚糖酶基因xyngold经过密码子优化，采用了适合于毕赤酵母进行转录翻译表达出木聚糖酶的高频密码子，提高了木聚糖酶基因xyngold在毕赤酵母细胞中的表达量。

本发明对所述重组表达菌株的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。

根据本发明一种具体实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：将重组表达载体通过限制性内切酶线性化；将上述线性化片段导入毕赤酵母中，获得重组表达菌株。可选地，通过电转将重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母X-33，当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。

根据本发明一种更加具体的实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：将pPIC-xyngold重组表达质粒通过Bgl II限制性内切酶线性化；通过电转化法将线性化的pPIC-xyngold导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。

本发明中，重组表达菌株制备木聚糖酶的方法可以采用本领域常规的方法。根据本发明一种具体实施方式，生产木聚糖酶的方法包括：通过发酵培养上述重组表达菌株，从发酵上清液中提纯获得木聚糖酶。在一些实施方式中，也可以不经过提纯处理，直接将发酵上清液视为木聚糖酶产物。

根据本发明一种更加具体的实施方式，由上述重组表达菌株制备木聚糖酶的方法包括如下步骤：挑取重组表达菌株至培养基中培养约24小时，并收获菌体；将菌体转入新鲜的培养基中，每24小时加入约1％的甲醇，诱导木聚糖酶XynGold的表达。诱导表达约96小时后，离心收集上清液，获得含木聚糖酶XynGold的溶液。

本发明的第五方面提供上述木聚糖酶XynGold的应用。

具体地，本发明的第六方面提供一种水解木聚糖的方法，该方法包括：将上述木聚糖酶XynGold与含木聚糖物料接触。所述含木聚糖物料包括各种类型的木聚糖，例如，榉木木聚糖、燕麦木聚糖，也包括含有木聚糖的其他物料。

本发明提供的木聚糖酶XynGold系由原始木聚糖酶突变而来，基因xyngold依照XynGold的氨基酸序列进行人工设计，根据毕赤酵母密码子的偏好性，选用毕赤酵母中高频使用的密码子，降低了xyngold基因mRNA二级结构的自由能，从而显著提高了人工合成的木聚糖酶基因xyngold在毕赤酵母细胞中的表达量，显著提高了木聚糖酶的活性、温度稳定性和表达水平，获得了在毕赤酵母中高水平表达的、高酶活力、耐高温的木聚糖酶及基因。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1A-图1B为本发明实施例1中以PCR介导的原始木聚糖酶基因的点突变的电泳结果图。

图2为本发明实施例2中原始木聚糖酶和优化后的木聚糖酶mRNA二级结构图。其中，左图为xyn基因mRNA的二级结构。最小自由能为-39.56kcal/mol；右图为xyngold基因mRNA的二级结构，最小自由能为-35.87kcal/mol。

图3A为本发明实施例3中单酶切后的pPICZαA重组表达载体和xyngold片段的电泳图；图3B为本发明实施例3中含有木聚糖酶基因xyngold的pPIC-xyngold重组表达质粒的双酶切检验结果图。

图4示出了本发明实施例4中高水平表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE测试结果。

图5示出了本发明实施例4中发酵上清液的酶活随时间的变化曲线。

图6示出了本发明实施例5中木聚糖酶XynGold活性随温度的变化曲线。

图7示出了本发明实施例6中木聚糖酶水解木聚糖的薄层层析测试结果。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例用于说明木聚糖酶基因的定点突变。

以木聚糖酶基因xyn(SEQ ID NO：4)为基础，采用定点突变技术，将原始木聚糖酶Xyn中68位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺(N68Y)，将96位的谷氨酸突变为色氨酸(E96W)。经过点突变后(N68Y、E96W)所获得的木聚糖酶即为XynGold(SEQ ID NO：1)具体实施步骤包括：

(1)采用重叠延伸PCR技术向木聚糖酶Xyn(SEQ ID NO：2)中引入N68Q突变。以xyn10B基因为模板，分别采用引物NQF1(SEQ ID NO：5，5’-GAATTCAATGAAAATATTACCTTCTGTG-3’)和NQR1(SEQ ID NO：6，5’-GTATCCCACTTCATCTGGTTCTCAGGGGTCAGGATG-3’)扩增出xyn基因的前半段nqF1，分别采用引物NQF2(SEQ ID NO：7，5’-GTATCCCACTTCATCTGGTTCTCAGGGGTCAGGATG-3’)和NQR2(SEQ ID NO：8，5’-GCGGCCGCTCATTTTCTTTCTTCTATC-3’)扩增出xyn基因的后半段nqF2；分别以nqF1和nqF2为模板，再采用引物NQF1和NQR2扩增出全长的突变基因，完成N68Q的突变；

(2)在上述突变基因的基础上，采用重叠延伸PCR技术向木聚糖酶基因xyn中引入E96W突变。采用引物EWF1(SEQ ID NO：9，5’-GAATTCATGAAAATATTACCTTCTGTG-3’)和EWR1(SEQ ID NO：10，5’-CACAGAAGGTAATATTTTCATTGAATTC-3’)扩增得到上游片段ewF1，再采用引物EWF2(SEQ ID NO：11，5’-GAATTCAATGAAAATATTACCTTCTGTG-3’)和引物EWR2(SEQ IDNO：12，5’-GCGGCCGCTCATTTTCTTTCTTCTATC-3’)扩增得到下游片段ewF2；再以ewF1和ewF2为模板，以EWF1和EWR2为引物，PCR扩增并获得全长的xyn-M2基因片段。

图1A-图1B为本发明实施例1中以PCR介导的原始木聚糖酶基因的点突变的电泳结果图。其中，M为DL5000DNA Marker，图1A为两个突变位点第一步PCR结果，泳道1和2为N68Q的PCR结果、泳道3和4为E96W的PCR结果。图1B为两个突变位点第二步PCR结果，泳道1和2分别为突变位点二次PCR后的产物。

经测序，确定两步突变成功。

实施例2

本实施例用于说明木聚酶基因密码子的优化获得基因xyngold。

本实施例基于突变后的木聚糖酶的氨基酸序列，利用DNA 2.0软件，人工重新设计了木聚糖酶基因的核苷酸序列。具体包括：与原始的木聚酶基因(SEQ ID NO：4)相比，采用高频率的密码子替代低频率的密码子；降低了基因编码的mRNA的二级结构的复杂度和最小自由能(图2)。计算机辅助下设计木聚糖酶基因xyngold序列，通过人工合成的方法获得木聚糖酶基因xyngold片段。

本实施例根据木聚糖酶的氨基酸序列，人工设计出一条全新的木聚糖酶基因序列，并通过人工合成的方法获得所述木聚糖酶基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示，命名为xyngold，所述木聚糖酶基因xyngold编码出的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

图2为本发明实施例2中原始木聚糖酶基因和经密码子优化后的基因mRNA二级结构图。其中，左图为xyn基因mRNA的二级结构。最小自由能为-39.56kcal/mol；右图为xyngold基因mRNA的二级结构，最小自由能为-32.87kcal/mol。

实施例3

本实施例用于说明木聚糖酶基因xyngold重组表达菌株的构建。

(1)在木聚糖酶基因xyngold两端加上酶切位点EcoR I和Not I酶切位点，经EcoRI和Not I酶切；同样载体pPICZαA经EcoRⅠ和Not I酶切。其中，酶切体系为：3mg DNA、10UEcoR I、10U Not I、20μL的Buffer H加水补齐至300μL体积，在37℃条件下酶切4h。结果如图3A所示(图中：M为DL5000DNA Marker，1泳道为酶切后的pPICZαA重组表达载体；2泳道为酶切后的xyngold片段；由图可知，pPICZαA和xyngold片段的大小分别为3.7kb和1.0kb左右，与实际相符。

(2)将木聚糖酶基因xyngold酶切片段和pPICZαA酶切片段通过T4DNA连接酶连接，获得pPIC-xyngold重组表达载体；其中，连接体系为：150ng的基因片段、50ng的pPICZαA片段、1μL的T4buffer、5U的T4DNA连接酶、加水补齐至10μL；在16℃条件下连接8h后，将连接体系转化至大肠杆菌(DH5α)。转化过程为：将体系与DH5α菌株混匀后于冰上放置10min，然后置于42℃处理1min，再加入800μL培养基后，置于37℃培养40min；最后，涂布于筛选平板上筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有木聚糖酶基因xyngold的重组表达载体pPIC-xyngold。提取重组表达载体pPIC-xyngold，进行双酶切验证(EcoR I、Not I)，结果如图3B所示(图中：M为DL5000DNA Marker，1泳道为双酶切后的pPIC-xyngold重组表达载体)。图3B中，在1000bp位置有条带，说明木聚糖酶基因xyngold成功连接至pPICZαA重组表达载体上。

(3)将重组表达载体pPIC-xyngold转化入巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)X-33中，然后在YPD(含酵母粉、蛋白胨和葡萄糖的培养基)平板上筛选得到含木聚糖酶基因xyngold的重组表达菌株。其中，电转化方法为：分别取3μg的重组表达载体pPIC-xyngold与90μL的巴斯德毕赤酵母X-33混匀，置于冰上5min，然后用电转化仪(BioRad公司生产)电击。

实施例4

本实施例用于说明木聚糖酶XynGold的发酵生产。

(1)将实施例3中含xyngold基因的毕赤基因工程菌接种到400mLYPD培养基中，培养20h，获得种子液；

(2)将上述种子液接种至含发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养基包括：350g KH₂PO₄、7g CaSO₄、40g(NH₄)₂SO₄、50g MgSO₄、120g K₂SO₄和560g甘油。

(3)发酵培养可分为营养生长阶段和甲醇诱导表达阶段。在营养生长阶段，发酵参数控制为：培养温度28℃，pH值为5.5，转速为300-500rpm，通气量3.0-5.5L/min。本阶段持续约30h。营养生长结束后，即进入甲醇诱导表达阶段；在甲醇诱导阶段，溶氧维持在20-30％，温度25℃，pH值为5.0-5.5，甲醇流速为2.5-4.0mL/L/h，流加时间为105h。每隔15h取样，并测定发酵液的木聚糖酶活性。

(4)木聚糖酶产量的测试：发酵液中蛋白质组份的检测采用SDS-PAGE法检测，检测结果如图4所示。

木聚糖酶活性采用还原糖法测定。步骤如下：

a、取0.5mL稀释500倍的发酵上清液，加入到0.5mL的木聚糖溶液(1％)和1mL的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH值为5.0)的混合液中，于100℃水浴反应5min，随后，用2mL的DNS(3,5-二硝基水杨酸)终止反应，并置于沸水浴中5min让还原糖充分显色；冷却至室温后用蒸馏水定容至25mL，混合均匀后测试520nm处的吸光度；

b、根据所测得的吸光度，参照酶活公式计算出木聚糖酶酶活。酶活(U/mL)计算公式为：U＝r×Df×1000/150.14/t，其中，Df为上清液稀释倍数；r为根据OD₅₂₀吸光度值，得到的产物木糖的摩尔浓度(μmol/mL)；t为酶解反应时间(min)。酶活单位定义为：每分钟木聚糖形成1μmol木糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

(5)结果如图5所示。由图5可知，木聚糖酶生产水平高，随着甲醇诱导时间的延长，发酵液中木聚糖酶的活力逐渐增高，在培养时间为90h时，发酵液中木聚糖酶的活力最高为98,000U/mL发酵液。

实施例5

本实施例用于测试木聚糖酶XynGold最适温度。

(1)木聚糖酶XynGold水解反应体系为：燕麦木聚糖0.001g，用50mmoL pH 5.0的NaAC-HAC溶液配制成1％浓度的木聚糖溶液，加入0.1mL适量稀释后的木聚糖酶溶液。

(2)分别设置40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃等温度梯度，将上述反应体系置入所设置的不同温度中，反应10分钟，反应结束后，采用如实施例4中的DNS法测定反应产生的还原糖含量并计算剩余的酶活性。

(3)根据不同温度下测定的酶活绘制出木聚糖酶活与反应温度的曲线，获得最适反应温度。结果如图6所示，随着温度的升高，木聚糖酶XynGold的表观活性逐渐升高，当温度达到100℃时活性最高。由于受到客观条件的限制，本发明所能设定的液体的最高温度为100℃。因此，本发明的耐高温木聚糖酶在体系可测定范围内的最适温度为100℃。

实施例6

本实施例用于说明采用木聚糖酶XygGold水解木聚糖。

(1)木聚糖酶XygGold水解木聚糖：取1mL实施例4制备的发酵上清液，用蒸馏水稀释100倍，取0.5mL加入到0.5mL浓度为2％的木聚糖溶液和1mL醋酸钠-醋酸缓冲液(pH为5.0)的混合溶液中，并100℃水浴反应10min。

(2)采用薄层层析法检测木聚糖水解产物：取上述步骤(1)中的水解产物9μL点于硅胶板上，放入展开剂中展层60min；取出硅胶板，干燥，并均匀喷涂显色剂，放入108℃的烘箱中烘干显色。结果如图7所示。由图7可知，本发明提供的木聚糖酶可以将木聚糖完全水解。

综上所述，本发明采用定点突变技术成功地对木聚糖酶进行了定点突变，并根据毕赤酵母的偏好性对木聚糖基因进行优化设计后，合成出木聚糖酶基因xyngold。该基因与表达载体pPICZαA连接后，转入毕赤酵母GS115中表达，从而获得了高效表达的、高产、耐高温木聚糖酶生产菌株；其在发酵罐中诱导表达96小时后，上清液中木聚糖酶的酶活可达98,000U/mL。本发明获得的耐高温木聚糖酶的最适温度为100℃，且对木聚糖具有高效的水解能力。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 武汉轻工大学

中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）

<120> 一种超耐热的木聚糖酶XynGold及基因与应用

<130> BJI1801889WHPU

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 347

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Ile Leu Pro Ser Val Leu Ile Leu Leu Leu Gly Cys Val Pro

1 5 10 15

Val Phe Ser Ser Gln Asn Val Ser Leu Arg Glu Leu Ala Glu Lys Leu

20 25 30

Asn Ile Tyr Ile Gly Phe Ala Ala Ile Asn Asn Phe Trp Ser Leu Ser

35 40 45

Asp Ala Glu Lys Tyr Met Glu Val Ala Arg Arg Glu Phe Asn Ile Leu

50 55 60

Thr Pro Glu Tyr Gln Met Lys Trp Asp Thr Ile His Pro Glu Arg Asp

65 70 75 80

Arg Tyr Asn Phe Thr Pro Ala Glu Lys His Val Glu Phe Ala Glu Trp

85 90 95

Asn Asp Met Ile Val His Gly His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Leu

100 105 110

Pro Gly Trp Ile Thr Gly Arg Glu Trp Thr Lys Glu Glu Leu Leu Asn

115 120 125

Val Leu Glu Asp His Ile Lys Thr Val Val Ser His Phe Lys Gly Arg

130 135 140

Val Lys Ile Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Val Ser Asp Ser Gly Thr

145 150 155 160

Tyr Arg Glu Ser Val Trp Tyr Lys Thr Ile Gly Pro Glu Tyr Ile Glu

165 170 175

Lys Ala Phe Arg Trp Ala Lys Glu Ala Asp Pro Asp Ala Ile Leu Ile

180 185 190

Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile Glu Glu Ile Asn Ala Lys Ser Asn Phe Val

195 200 205

Tyr Asn Met Ile Lys Glu Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro Val Asp Gly

210 215 220

Ile Gly Phe Gln Met His Ile Asp Tyr Arg Gly Leu Asn Tyr Asp Ser

225 230 235 240

Phe Arg Arg Asn Leu Glu Arg Phe Ala Lys Leu Gly Leu Gln Ile Tyr

245 250 255

Ile Thr Glu Met Asp Val Arg Ile Pro Leu Ser Gly Ser Glu Glu Tyr

260 265 270

Tyr Leu Lys Lys Gln Ala Glu Val Cys Ala Lys Ile Phe Asp Ile Cys

275 280 285

Leu Asp Asn Pro Ala Val Lys Ala Ile Gln Phe Trp Gly Phe Thr Asp

290 295 300

Lys Tyr Ser Trp Val Pro Gly Phe Phe Lys Gly Tyr Gly Lys Ala Leu

305 310 315 320

Leu Phe Asp Glu Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Cys Tyr Tyr Ala Ile Lys

325 330 335

Glu Val Leu Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys

340 345

<210> 2

<211> 347

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Ile Leu Pro Ser Val Leu Ile Leu Leu Leu Gly Cys Val Pro

1 5 10 15

Val Phe Ser Ser Gln Asn Val Ser Leu Arg Glu Leu Ala Glu Lys Leu

20 25 30

Asn Ile Tyr Ile Gly Phe Ala Ala Ile Asn Asn Phe Trp Ser Leu Ser

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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130 135 140

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Tyr Arg Glu Ser Val Trp Tyr Lys Thr Ile Gly Pro Glu Tyr Ile Glu

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180 185 190

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275 280 285

Leu Asp Asn Pro Ala Val Lys Ala Ile Gln Phe Trp Gly Phe Thr Asp

290 295 300

Lys Tyr Ser Trp Val Pro Gly Phe Phe Lys Gly Tyr Gly Lys Ala Leu

305 310 315 320

Leu Phe Asp Glu Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Cys Tyr Tyr Ala Ile Lys

325 330 335

Glu Val Leu Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys

340 345

<210> 3

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaatcc tgccgtctgt tctgatcctg ctgctgggtt gcgttccggt tttctcttct 60

cagaacgttt ctctgcgtga actggcggaa aaactgaaca tctacatcgg tttcgcggcg 120

atcaacaact tctggtctct gtctgacgcg gaaaaataca tggaagttgc gcgtcgtgaa 180

ttcaacatcc tgaccccgga ataccagatg aaatgggaca ccatccaccc ggaacgtgac 240

cgttacaact tcaccccggc ggaaaaacac gttgaattcg cggaatggaa cgacatgatc 300

gttcacggtc acaccctggt ttggcacaac cagctgccgg gttggatcac cggtcgtgaa 360

tggaccaaag aagaactgct gaacgttctg gaagaccaca tcaaaaccgt tgtttctcac 420

ttcaaaggtc gtgttaaaat ctgggacgtt gttaacgaag cggtttctga ctctggtacc 480

taccgtgaat ctgtttggta caaaaccatc ggtccggaat acatcgaaaa agcgttccgt 540

tgggcgaaag aagcggaccc ggacgcgatc ctgatctaca acgactactc tatcgaagaa 600

atcaacgcga aatctaactt cgtttacaac atgatcaaag aactgaaaga aaaaggtgtt 660

ccggttgacg gtatcggttt ccagatgcac atcgactacc gtggtctgaa ctacgactct 720

ttccgtcgta acctggaacg tttcgcgtgg ctgggtctgc agatctacat caccgaaatg 780

gacgttcgta tcccgctgtc tggttctgaa gaatactacc tgaaaaaaca ggcggaagtt 840

tgcgcgaaaa tcttcgacat ctgcctggac aacccggcgg ttaaagcgat ccagttctgg 900

ggtttcaccg acaaatactc ttgggttccg ggtttcttca aaggttacgg taaagcgctg 960

ctgttcgacg aaaactacaa cccgaaaccg tgctactacg cgatcaaaga agttctggaa 1020

aaaaaaatcg aagaacgtaa ataa 1044

<210> 4

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaaatat taccttctgt gttgatcctt ttgttgggat gtgttccagt tttcagctct 60

cagaatgtat ctctgagaga actcgcagaa aagctgaaca tctatattgg ttttgccgca 120

atcaacaact tttggtctct ttccgacgca gaaaagtaca tggaagttgc aagaagagaa 180

ttcaacatcc tgacccctga gaaccagatg aagtgggata cgattcatcc agaaagagac 240

agatacaatt tcactcccgc tgaaaaacac gttgagtttg cagaagaaaa cgacatgatc 300

gtgcatggac acactcttgt ctggcacaac cagcttcctg gatggatcac tggtagagaa 360

tggacaaagg aagaactttt gaacgttctt gaagaccaca taaaaacggt ggtgtctcat 420

ttcaaaggta gagtgaagat ctgggatgtg gtgaacgaag cggtgagcga ttctggaacc 480

tacagggaaa gcgtgtggta caagacgatc ggtcctgaat acattgaaaa agcgttcaga 540

tgggcaaaag aagccgatcc agatgcgatt ctcatctaca acgactacag catagaagaa 600

atcaacgcaa aatcgaactt cgtctacaac atgataaaag agctgaaaga aaagggagta 660

cctgttgatg gaataggatt tcagatgcac atagactaca gagggctcaa ttatgacagt 720

ttcagaagga atttggagag atttgcgaaa ctcggtcttc aaatatacat cacagagatg 780

gatgtgagaa ttcctctcag tggttcggag gagtattatt tgaaaaaaca ggctgaagtt 840

tgtgcgaaga tcttcgatat atgcttggac aaccctgcag ttaaagcgat ccagttttgg 900

ggattcacag acaaatactc ctgggttccc ggctttttca aagggtacgg gaaagcgttg 960

ctcttcgatg agaattacaa ccccaagcct tgttattacg cgataaaaga ggtgctggag 1020

aaaaagatag aagaaagaaa atga 1044

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcaatg aaaatattac cttctgtg 28

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtatcccact tcatctggtt ctcaggggtc aggat 35

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtatcccact tcatctggtt ctcaggggtc aggatg 36

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggccgctc attttctttc ttctatc 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattcatga aaatattacc ttctgtg 27

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacagaaggt aatattttca ttgaattc 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaattcaatg aaaatattac cttctgtg 28

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcggccgctc attttctttc ttctatc 27

Claims

1.一种超耐热的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶XynGold的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶XynGold由木聚糖酶Xyn通过点突变得到，所述木聚糖酶Xyn的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种木聚糖酶基因xyngold，用于编码权利要求1-3中任意一项所述的木聚糖酶XynGold，其特征在于，所述木聚糖酶基因xyngold的碱基序列与SEQ ID NO：3所示的碱基序列具有95％以上的同一性。

5.根据权利要求4所述的木聚糖酶基因xyngold，其特征在于，所述木聚糖酶基因xyngold的碱基序列含有SEQ ID NO：3所示的碱基序列。

6.根据权利要求5所述的木聚糖酶基因xyngold，其特征在于，所述木聚糖酶基因xyngold的碱基序列为SEQ ID NO：3所示的碱基序列。

7.一种重组表达载体，其特征在于，其包括权利要求4-6中任意一项所述的木聚糖酶基因xyngold。

8.一种重组表达菌株，其特征在于，其表达产物为权利要求1-3中任意一项所述的木聚糖酶XynGold；所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

9.权利要求1-3中任意一项所述的木聚糖酶XynGold的应用。

10.一种水解木聚糖的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1-3中任意一项所述的木聚糖酶XynGold与含木聚糖物料接触。