CN110114086A - 用于使用***癌相关抗原肿瘤疫苗接种的组合物和方法 - Google Patents

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J·巴林特
Y·拉特齐曼
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    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering

Abstract

本申请提供用于构筑和制造重组腺病毒类载体疫苗的方法和组合物。在特定方面，提供涉及腺病毒载体的组合物和方法，所述腺病毒载体包括：针对靶抗原的基因，所述靶抗原如***特异性抗原(PSA)、***特异性膜抗原(PSMA)、MUC1、CEA和/或Brachyury；和用于治疗方法中的共刺激分子，所述治疗方法产生高反应性抗肿瘤免疫反应，且允许在对于腺病毒具有预存免疫的个体中多次疫苗接种。

Description

用于使用***癌相关抗原肿瘤疫苗接种的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2016年6月3日提交的第62/345,582号美国临时专利申请的权益，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
疫苗通过训练免疫***识别和破坏有害物质与病变细胞，来帮助身体对抗疾病。很大程度上，疫苗可分为两种类型，预防性疫苗和治疗性疫苗。向健康人群给予预防疫苗，以预防发展特定疾病；同时向已诊断患有疾病的个人给予治疗性疫苗(也被称作免疫疗法)，以帮助终止疾病生长和扩散，或作为规避措施。
目前正在开发病毒疫苗，以帮助抗争传染性疾病和癌症。这些病毒疫苗通过诱导宿主细胞内与疾病相关联的小部分基因的表达来起作用，此转而增强宿主的免疫***以识别和破坏病变细胞。因此，病毒疫苗的临床反应可取决于疫苗获得高水平免疫原性和具有持久长期表达的能力。
因此，仍需要开发用于对复杂疾病(如癌症)的治疗性反应增强的新颖组合物和方法。
发明内容
在各种方面中，本公开提供一种组合物，其包括复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性抗原(PSA)的核酸序列和/或编码***特异性膜抗原(PSMA)的核酸序列，其中PSA具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:34至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列，PSMA具有与SEQ ID NO:11至少80％同一的氨基酸序列。
在一些方面，载体包括编码PSA的核酸序列，所述PSA具有与SEQ ID NO:35至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列，或编码PSA的核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一。在一些方面，载体包括编码PSMA的核酸序列，所述PSMA具有与SEQ ID NO:36至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。
在一些方面，组合物进一步包括：第二复制缺陷型病毒载体，其包括编码Brachyury抗原的第二核酸序列；第三复制缺陷型病毒载体，其包括编码MUC1抗原的第三核酸序列；或其组合。在一些方面，Brachyury抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合结合。在一些方面，Brachyury抗原为经修饰的Brachyury抗原，其包括WLLPGTSTV(SEQ ID NO:7)中所阐述的氨基酸序列。在一些方面，Brachyury抗原为经修饰的Brachyury抗原，其包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些方面，第二复制缺陷型载体包括与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4的位置13到1242、SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。在一些方面，第二复制缺陷型载体包括与SEQ ID NO:12(具有编码经修饰的Brachyury抗原的序列的Ad载体)、SEQ ID NO:12的位置1033-2083或SEQ ID NO:42，至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。
在一些方面，MUC1抗原包括与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:41至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的序列。在一些方面，编码MUC1抗原的第三核酸序列包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:41至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。在一些方面，MUC-1抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合结合。
在其它方面，复制缺陷型病毒载体、第二复制缺陷型病毒载体和/或第三复制缺陷型病毒载体为腺病毒载体。在一些方面，腺病毒载体包括E1区、E2b区、E3区、E4区或其组合中的缺失。在一些方面，腺病毒载体包括E2b区中的缺失。在其它方面，腺病毒载体包括E1区、E2b区和E3区中的缺失。
在一些方面，组合物包括至少1×109个病毒颗粒到至少5×1012个病毒颗粒。在一些方面，组合物包括至少5×109个病毒颗粒。在一些方面，组合物包括至少5×1010个病毒颗粒。在一些方面，组合物包括至少5×1011个病毒颗粒。在一些方面，组合物包括至少5×1012个病毒颗粒。
在一些方面，组合物或复制缺陷型病毒载体进一步包括编码共刺激分子的核酸序列。在一些方面，共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。在一些方面，共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。
在其它方面，组合物进一步包括位于同一复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。在一些方面，组合物进一步包括位于单独复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
在额外方面中，组合物进一步包括编码一种或更多种额外靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在一些方面，复制缺陷型病毒载体进一步包括编码一种或更多种额外靶抗原或其免疫表位的核酸序列。在一些方面，一种或更多种额外靶抗原为肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、丝裂原或其组合。在一些方面，一种或更多种额外靶抗原为CEA、叶酸受体α、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSCA、PSMA、PAP、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、Her2/neu、BRCA1、BRACHYURY、BRACHYURY(TIVS7-2，多态性)、BRACHYURY(IVS7T/C多态性)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、Her2/neu、Her3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1、或经修饰的变体、剪接变体、功能性表位、表位激动剂，或其组合。在一些方面，一种或更多种额外靶抗原为CEA。在一些方面，一种或更多种额外靶抗原为CEA、Brachyury和MUC1。在一些方面，CEA与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一。在一些方面，一种或更多种额外靶抗原为HER3。在一些方面，一种或更多种额外靶抗原为HPV E6或HPV E7。
在一些方面，复制缺陷型病毒载体进一步包括可选标记。在一些方面，可选标记为lacZ基因、胸苷激酶、gpt、GUS、或牛痘K1L宿主范围基因，或其组合。
在各种方面中，本公开提供一种组合物，其包括一种或更多种复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性抗原(PSA)的核酸序列、编码***特异性膜抗原(PSMA)的核酸序列、编码Brachyury抗原的核酸序列、编码MUC1抗原的核酸序列或其组合。
在各种方面中，本公开提供一种组合物，其包括一种或更多种复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性抗原(PSA)的核酸序列、编码Brachyury抗原的核酸序列和编码MUC1抗原的核酸序列。
在各种方面中，本公开提供一种组合物，其包括一种或更多种复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性膜抗原(PSMA)的核酸序列、编码Brachyury抗原的核酸序列和编码MUC1抗原的核酸序列。
在各种方面中，本公开提供一种组合物，其包括一种或更多种复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性抗原(PSA)的核酸序列、编码***特异性膜抗原(PSMA)的核酸序列、编码Brachyury抗原的核酸序列、编码MUC1抗原的核酸序列和编码CEA抗原的核酸序列。
在一些方面，以上组合物中的任一种的复制缺陷型病毒载体进一步包括编码免疫融合配偶体的核酸序列。
在各种方面中，本公开提供一种药物组合物，其包括根据本文所描述的任何组合物的组合物和药学上可接受的载剂。
在各种方面中，本公开提供一种宿主细胞，其包括根据本文所描述的任何组合物的组合物。
在各种方面中，本公开提供一种制备肿瘤疫苗的方法，所述方法包括制备根据权利要求42的药物组合物。在各种方面中，本公开提供一种增强有需要的个体中的免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用治疗有效量的本文所描述的任何组合物或如本文所描述的药物组合物。在各种方面中，本公开提供一种治疗有需要的个体中的表达PSA或表达PSMA的癌症的方法，所述方法包括向个体施用治疗有效量的本文所描述的任何组合物或如本文所描述的药物组合物。
在一些方面，方法进一步包括向个体再施用药物组合物。
在一些方面，方法进一步包括向个体施用免疫检查点抑制剂。在其它方面，免疫检查点抑制剂抑制PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA或CD244。在一些方面，免疫检查点抑制剂抑制PD1或PDL1。在一些方面，免疫检查点抑制剂为抗PD1抗体或抗PDL1抗体。在一些方面，免疫检查点抑制剂为抗PDL1抗体。
在一些方面，施用途径为静脉内、皮下、***内、肿瘤内、皮内、肌肉内、腹膜内、直肠内、***内、鼻内、口服、经膀胱滴注或经划痕。
在一些方面，增强的免疫反应为细胞介导的反应或体液反应。在一些方面，增强的免疫反应为B细胞增殖、CD4+T细胞增殖、CD8+T细胞增殖或其组合的增强。在一些方面，增强的免疫反应为IL-2产生、IFN-γ产生或其组合的增强。在一些方面，增强的免疫反应为抗原呈递细胞增殖、功能或其组合的增强。
在一些方面，个体先前已施用腺病毒载体。在一些方面，个体对于腺病毒载体具有预存免疫。在一些方面，确定个体对于腺病毒载体具有预存免疫。
在一些方面，方法进一步包括向个体施用化疗、放射、不同免疫疗法或其组合。
在一些方面，个体为人类或非人类动物。在一些方面，个体先前已针对癌症治疗。
在一些方面，施用治疗有效量重复至少三次。在一些方面，施用治疗有效量包括1×109到5×1012个病毒颗粒/剂量。在一些方面，施用治疗有效量包括5×109个病毒颗粒/剂量。在一些方面，施用治疗有效量包括5×1010个病毒颗粒/剂量。在一些方面，施用治疗有效量包括5×1011个病毒颗粒/剂量。在一些方面，施用治疗有效量包括5×1012个病毒颗粒/剂量。在一些方面，每一、二或三周，重复施用治疗有效量。
在一些方面，施用治疗有效量，随后施用包括相同组合物或药物组合物的一次或更多次加强免疫。在一些方面，每一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二个月或更多，施用加强免疫。在一些方面，重复加强免疫三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二或更多次。在一些方面，施用治疗有效量为每一、二或三周重复三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二或更多次的初次免疫，随后每一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二或更多个月重复三次或更多次加强免疫。
在额外方面，方法进一步包括向个体施用包括工程改造的自然杀伤(NK)细胞的群体的药物组合物。在一些方面，工程改造的NK细胞包括：一个或更多个NK细胞，其已经修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制性受体)的表达；一个或更多个NK细胞，其已经修饰以表达高亲和力CD16变体；和一个或更多个NK细胞，其已经修饰以表达一种或更多种CAR(嵌合抗原受体)，或其任何组合。在一些方面，工程改造的NK细胞包括已经修饰为基本上缺乏KIR表达的一个或更多个NK细胞。在一些方面，工程改造的NK细胞包括已经修饰以表达高亲和力CD16变体的一个或更多个NK细胞。在一些方面，工程改造的NK细胞包括已经修饰以表达一种或更多种CAR的一个或更多个NK细胞。在其它方面，CAR为针对以下的CAR：肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her2/neu、Her3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1，或其任何组合。
在一些方面，细胞包括复制缺陷型腺病毒载体。在一些方面，细胞为树突状细胞(DC)。
在一些方面，方法进一步包括施用药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的IL-15或包括编码IL-15的核酸序列的复制缺陷型载体。
在一些方面，个体患有***癌。在一些方面，个体患有晚期***癌。在一些方面，个体患有不可切除性、局部晚期或转移性癌症。
在一些方面，施用治疗有效量的本文所描述的组合物或如本文所描述的药物组合物包括呈1:1:1:1比率的以下病毒载体：第一复制缺陷型病毒载体，其包括编码PSA抗原的第一核酸序列；第二复制缺陷型病毒载体，其包括编码PSMA抗原的第二核酸序列；第三复制缺陷型病毒载体，其包括编码Brachyury抗原的第三核酸序列；第四复制缺陷型病毒载体，其包括编码MUC1抗原的第四核酸序列。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中细致阐述。将参考以下详细说明和附图来获得对本发明特征和优势的更好理解，以下详细说明阐述利用了本发明原理的说明性实施例，在附图中：
图1图示在同源免疫之后，小鼠中的PSA特异性细胞免疫的诱导。
图1A图示Ad5免疫BALB/c小鼠中的IFN-γ细胞介导的免疫(CMI)反应，所述小鼠以7天间隔，用注射缓冲液(对照组)或1010个病毒颗粒(VP)的Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫三次。
图1B图示Ad5免疫BALB/c小鼠中的IL-2细胞介导的免疫(CMI)反应，所述小鼠以7天间隔，用注射缓冲液(对照组)或1010个病毒颗粒(VP)的Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫三次。
图2图示在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫之后，PSA细胞介导的免疫的特异性。
图2A图示在离体暴露于PSA或对照抗原(HIV-gag、CMV)之后，IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
图2B图示在离体暴露于PSA或对照抗原(HIV-gag、CMV)之后，IL-2斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
图3图示使用定量ELISA，针对PSA的抗体(抗PSA Ab)反应。
图4图示在植入表达PSA的肿瘤细胞之后，相较于用Ad5[E1-、E2b-]-null免疫的小鼠，用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫的小鼠中的肿瘤生长。
图5图示在用Ad5[E1-]-PSA或Ad5[E1-、E2b-]-PSA感染之后，来自细胞的PSA分泌。RM-11鼠类***肿瘤细胞或HEK-293细胞，分别用Ad5[E1-]-PSA或Ad5[E1-、E2b-]-PSA感染。评定在不同时间点时分泌到培养基中的PSA水平。注意，相较于用Ad5[E1-]-PSA感染的细胞，用Ad5[E1-、E2b-]-PSA感染的细胞分泌的PSA更高。
图6图示在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫三次之后的原生小鼠或在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫三次之后的Ad5免疫小鼠中的PSA特异性细胞免疫。原生或Ad5免疫BALB/c小鼠，以7天间隔，用注射缓冲液(对照组)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSA的VP免疫三次。在最终免疫之后14天，在ELISpot分析中，评定脾细胞的IFN-γ分泌。将细胞暴露于2μg PSA抗原。
图7图示在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫三次之后的原生小鼠或在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫三次之后的Ad5免疫小鼠中的PSA特异性细胞免疫。原生或Ad5免疫BALB/c小鼠，以7天间隔，用注射缓冲液(对照组)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSA的VP免疫三次。在最终免疫之后14天，在ELISpot分析中，评定脾细胞的IL-2分泌。将细胞暴露于2μg PSA抗原。
图8图示在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫之后，Ad5免疫小鼠中PSA细胞介导的免疫的特异性。Ad5免疫BALB/c小鼠，以14天间隔，用1010个Ad5[E1-]-null的VP免疫两次。在最后一次Ad5[E1-]-null免疫两周之后，以7天间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSA的VP免疫小鼠三次。在最后免疫14天之后，通过ELISpot分析，评定脾细胞的IFN-γ和IL-2两个在离体暴露于PSA或对照抗原(HIV-gag、CMV)之后的分泌。
图8A图示在将脾细胞离体暴露于PSA或对照抗原肽库(HIV-gag、CMV)之后，IFN-γ分泌细胞的频率。
图8B图示在将脾细胞离体暴露于PSA或对照抗原肽库(HIV-gag、CMV)之后，IL-2分泌细胞的频率。
图9图示在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫三次之后，原生小鼠中的抗PSA抗体(Ab)活性。以7天间隔，用注射缓冲液(对照组)或1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSA的VP，免疫BALB/c小鼠三次。在最后免疫14天之后，使用已纯化PSA作为抗体捕捉抗原目标，在定量ELISA中，评定血清的抗PSA Ab的存在。
图10图示用于***到Ad5[E1-、E2b-]中的可能***癌多抗原基因构建。
图10A图示***癌疫苗的三基因***。
图10B图示在图10A翻译之后的产物。
图11图示在对小鼠疫苗接种Ad5[E1-、E2b-]-PSMA之后，表达IFN-γ、IL-2和颗粒酶B的脾细胞的分析。以2周间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSMA(红色条柱)或Ad5[E1-、E2b-]-null(黑色条柱)的VP，疫苗接种C57BL/6小鼠(n＝5只/组)两次。在最后疫苗接种且离体暴露于PSMA肽库、阴性对照抗原(Nef肽库)或阳性对照(ConA)7天之后，收集脾细胞。ELISPOT分析，用于评价在分别暴露于PSMA肽库、阴性对照抗原(Nef肽库)或ConA之后的IFN-γ分泌、IL-2分泌和颗粒酶B分泌。数据报告为斑点形成细胞(SFC)数/106个脾细胞。误差棒描绘SEM。
图11A图示在离体刺激之后，IFN-γ分泌细胞的频率。
图11B图示在离体刺激之后，IL-2分泌细胞的频率。
图11C图示在离体刺激之后，颗粒酶B分泌细胞的频率。
图12图示在用Ad5[E1-、E2b-]-PSMA疫苗接种之后，CD8+脾细胞和CD4+脾细胞以及多功能细胞群体的分析。以2周间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSMA或Ad5[E1-、E2b-]-null(黑色条柱)的VP，疫苗接种C57BL/6小鼠(n＝5只/组)两次。在最后疫苗接种7天之后，收集脾细胞，且用PSMA肽库或阴性对照(单纯培养基或SIV nef肽库)离体刺激脾细胞。通过流式细胞术评定细胞的表型和发炎性细胞因子分泌。对于阳性对照，将脾细胞暴露于PMA/伊屋诺霉素(ionomycin)(数据未显示)。误差棒描绘SEM。
图12A图示在离体刺激之后，分泌IFN-γ的CD8β+脾细胞的百分比。
图12B图示在离体刺激之后，分泌IFN-γ的CD4+脾细胞的百分比。
图12C图示在离体刺激之后，分泌IFN-γ和TNF-α的CD8β+脾细胞的百分比。
图12D图示在离体刺激之后，分泌IFN-γ和TNF-α的CD4+脾细胞的百分比。
图13图示在用Ad5[E1-、E2b-]-PSMA疫苗接种之后，小鼠中的抗体反应。以2周间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSMA(红色条柱)或Ad5[E1-、E2b-]-null(黑色条柱)的VP，疫苗接种C57BL/6小鼠(n＝5只/组)两次。在最后疫苗接种7天之后，收集血清，且通过ELISA评定血清的针对PSMA蛋白的抗原特异性抗体。
图14图示在对小鼠疫苗接种Ad5[E1-、E2b-]-PSA之后，表达IFN-γ、IL-2和颗粒酶B的脾细胞的分析。在向肿瘤植入1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSA(条纹条柱)或Ad5[E1-、E2b-]-null(黑色条柱)的VP之前，以2周间隔，疫苗接种C57BL/6小鼠(n＝5只/组)三次。在最后疫苗接种两周之后，向小鼠注射5×105个表达PSA的D2F2肿瘤发生性细胞到小鼠右后侧中。在实验结束(肿瘤植入后37天)时，收集脾细胞，且用PSA肽库、阴性对照(SIV-Nef肽库)或阳性对照(伴刀豆球蛋白A(Con A))离体刺激脾细胞。在离体刺激之后，使用ELISPOT分析，为细胞因子分泌。数据报告为斑点形成细胞(SFC)数/106个脾细胞，且误差棒显示SEM。
图14A图示在离体暴露刺激之后，IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
图14B图示在离体刺激之后，IL-2斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
图14C图示在离体刺激之后，颗粒酶B斑点形成细胞(SFC)/106个脾细胞。
图15图示在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗接种之后，CD8+脾细胞和CD4+脾细胞以及多功能细胞群体的分析。以2周间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSA或Ad5[E1-、E2b-]-null(黑色条柱)的VP，疫苗接种C57BL/6小鼠(n＝5只/组)三次。在最后疫苗接种两周之后，向小鼠注射5×105个表达PSA的D2F2肿瘤发生性细胞到小鼠右后侧中。在实验结束(肿瘤接种后37天)时，收集脾细胞，且将脾细胞离体暴露于PSA肽库或阴性对照抗原(培养基或SIV-Nef肽库)。将细胞进行表面标记物和胞内细胞因子分泌染色，且通过流式细胞测量术进行分析。
图15A图示分泌IFN-γ的CD8β+脾细胞的百分比。
图15B图示分泌IFN-γ的CD4+脾细胞的百分比。
图15C图示分泌IFN-γ和TNF-α的CD8β+脾细胞的百分比。
图15D图示分泌IFN-γ和TNF-α的CD4+脾细胞的百分比。
图16图示在来自BALB/c小鼠(n＝5只/组)的血清中测量的抗体反应，所述小鼠每两周一次，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-null或Ad5[E1-、E2b-]-PSA VP免疫三次。在最后疫苗接种两周之后，向小鼠注射5×105个表达PSA的D2F2肿瘤发生性细胞到小鼠右后侧中。在实验结束(肿瘤接种后37天)时，收集血清，且使用酶联免疫吸附分析(ELISA)，分析血清的抗体的存在。
图16A图示针对PSA的IgG特异性抗体的质量。
图16B图示针对PSA的IgG1特异性抗体的质量。
具体实施方式
以下段落更详细地描述某些实施例的不同方面。除非相反地清楚指示，否则每个方面都可以与任何其它一个或更多个方面组合。确切地说，任何指示为优选或有利的特征都可以与任何其它指示为优选或有利的特征组合。
除非另外指示，否则任何实施例可与任何其它实施例组合。各种方面可以一个范围形式出现。应理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，并且不应该被解释为是对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应视为，已具体地公开所有可能子范围以及在所述范围内的个别数值，如同明确地写出一般。举例来说，对如从1到6的范围的描述应视为已经具体地公开子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范围内的个别数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。当存在范围时，范围包含范围端点。
I.靶抗原
在某些方面，可提供表达构建体或载体，其包括编码一种或更多种所关注的靶蛋白或靶抗原，例如如本文所描述的PSA、PSMA、CEA、MUC1、Brachyury或其组合的核酸序列。在这点上，可提供表达构建体或载体，所述表达构建体或载体可含有编码以下种或由其衍生的任何数量或范围的所关注的不同靶抗原的核酸：至少、最多或约一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500。表达构建体或载体可含有编码来自一种或更多种靶抗原的多个片段或表位的核酸序列，或可含有来自多种不同靶抗原的一种或更多种片段或表位。
靶抗原可以是全长蛋白质，或可以是其免疫原性片段(例如表位)。免疫原性片段可使用可用技术来鉴定，所述技术如在Paul,Fundamental Immunology,第3版.,243-247(Raven Press,1993)和其中列举的参考文献中概述的那些技术。用于鉴定免疫原性片段的代表性技术包含筛选能够与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的多肽。特定靶标多肽的免疫原性片段，可以是以大体上不小于全长靶标多肽的反应性的水平(例如在ELISA和/或T细胞反应性分析中)，与这类抗血清和/或T细胞反应的片段。换句话说，免疫原性片段可在这类分析中以类似于或大于全长多肽的反应性的水平反应。这类筛选一般可使用所属领域的一般技术人员可用的方法来进行，所述方法如在Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988中描述的那些方法。
在一些情况下，靶抗原可为免疫原性表位，例如8到10个氨基酸长的表位。在一些情况下，靶抗原为四到十个氨基酸长，或超过10个氨基酸长。靶抗原可包括长度为以下或可包括长度至少、约或最多为以下或由其衍生的任何数量或范围的氨基酸：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。靶抗原可为任何氨基酸长度。
靶抗原的额外非限制性实例包含：癌胚抗原(CEA)、叶酸受体α、WT1、brachyury(TIVS7-2，多态性)、brachyury(IVS7T/C多态性)、T brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、HPVE6、HPV E7、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSMA、PSCA、STEAP、PAP、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、EGFR、Her2/neu、Her3、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1-c、MUC1-n、MUC1、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、人类表皮生长因子受体2(HER2/neu)、人类表皮生长因子受体3(HER3)、人***瘤病毒(HPV)、***特异性抗原(PSA)、α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、CAR-ABL融合蛋白(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、β-连环蛋白、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD2、延伸因子2、ETV6-AML1融合蛋白、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-岩藻糖苷转移酶融合蛋白、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、neo-PAP、肌球蛋白I类、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1融合蛋白或SYT-SSX2融合蛋白、TGF-βRII、磷酸丙糖异构酶、BAGE-1、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、Gage 3、Gage 4、Gage 5、Gage6、Gage 7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、粘蛋白、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、激肽释放酶4、***珠蛋白-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、adipophilin、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、细胞周期素D1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α胎蛋白、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、MUC1、p53、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、分离蛋白1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、VEGF或其任何组合。
在一些方面，如本文所用的肿瘤新表位为肿瘤特异性表位，如EQVWGMAVR(SEQ IDNO:13)或CQGPEQVWGMAVREL(SEQ ID NO:14)(FLRT2的R346W突变)、GETVTMPCP(SEQ ID NO:15)或NVGETVTMPCPKVFS(SEQ ID NO:16)(VIPR2的V73M突变)、GLGAQCSEA(SEQ ID NO:17)或NNGLGAQCSEAVTLN(SEQ ID NO:18)(FCRL1的R286C突变)、RKLTTELTI(SEQ ID NO:19)、LGPERRKLTTELTII(SEQ ID NO:20)、或PERRKLTTE(SEQ ID NO:21)(FAT4的S1613L突变)、MDWVWMDTT(SEQ ID NO:22)、AVMDWVWMDTTLSLS(SEQ ID NO:23)、或VWMDTTLSL(SEQ ID NO:24)(PIEZO2的T2356M突变)、GKTLNPSQT(SEQ ID NO:25)、SWFREGKTLNPSQTS(SEQ ID NO:26)、或REGKTLNPS(SEQ ID NO:27)(SIGLEC14的A292T突变)、VRNATSYRC(SEQ ID NO:28)、LPNVTVRNATSYRCG(SEQ ID NO:29)、或NVTVRNATS(SEQ ID NO:30)(SIGLEC1的D1143N突变)、FAMAQIPSL(SEQ ID NO:31)、PFAMAQIPSLSLRAV(SEQ ID NO:32)、或AQIPSLSLR(SEQ ID NO:33)(SLC4A11的Q678P突变)。
肿瘤相关抗原可为不通常由宿主表达的抗原；其可为通常由宿主表达的分子进行突变、截断、错误折叠或以其它方式异常表现的；其可与通常表达的分子同一但以异常高的水平表达；或其可在异常情况或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是例如蛋白质或蛋白质片段、复合碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、其它生物分子或其任何组合。
II.PSA家族抗原靶标
本文中所公开的包含组合物，所述组合物包括含有以下的复制缺陷型载体：一个或更多个核酸序列，其编码PSA和/或PSMA抗原；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如MUC1；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码CEA，所述核酸序列是在同一或单独复制缺陷型载体中。
***特异性抗原(PSA)，也称为γ-***蛋白或激肽释放酶-3(KLK3)，是一种在人体内由KLK3基因编码的糖蛋白酶。PSA为激肽释放酶相关肽酶家族的成员，且由***的上皮细胞分泌。PSA是为***而产生的，在其中，其将***液化于***凝结物中，并允许***自由地游动。还认为，其在溶解子***中起作用，从而允许***进入子宫。
PSA以少量存在于具有健康***的男性的血清中，但通常在存在***癌或其它***病症的情况下升高。PSA不是***癌的唯一指示剂，但也可检测***炎或良性***增生。百分之三十的具有高PSA的患者，在活检之后诊断患有***癌。
基于其致肿瘤性靶向PSA和引发疗法在目前是可行的，这是因为可信赖的测试可快速确认PSA水平在循环和人类癌症活检中升高。PSA被视为靶向肿瘤特异性免疫疗法的诱人抗原，这是因为***癌细胞过表达这种抗原，且PSA水平升高与***癌的诊断相关联。研究指示，PSA诱发的免疫反应，在人体内和在表达PSA的癌症的实验动物模型中诱导抗肿瘤CMI反应上有效。
此处所公开的包含Ad5[E1-、E2b-]类载体平台的用途，其用于***人类PSA基因作为新免疫疗法疫苗(被称作Ad5[E1-、E2b-]-PSA)，来治疗表达PSA的***癌。在某些实施例中所描述的临床前研究中，这种疫苗在表达PSA的癌症的小鼠模型中诱导抗肿瘤细胞介导的免疫(CMI)反应，且为我们使用Ad5[E1-、E2b-]-PSA作为治疗表达PSA的***癌症的免疫治疗性疫苗，提供了有力的理论依据。
在一些实施例中，本公开的PSA抗原可具有与SEQ ID NO:34至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开的PSA抗原可具有SEQ ID NO:34中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的PSA抗原可具有与SEQ ID NO:35至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。在某些实施例中，本公开的PSA抗原可具有SEQ ID NO:35中所阐述的核苷酸序列。
III.PSMA抗原靶标
本文中所公开的包含组合物，所述组合物包括含有以下的复制缺陷型载体：一个或更多个核酸序列，其编码PSA和/或PSMA抗原；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如MUC1；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码CEA，所述核酸序列是在同一或单独复制缺陷型载体中。
谷氨酸羧肽酶II(GCPII)，也称为N-乙酰基-L-天冬氨酰基-L-谷氨酸肽酶I(NAALADase I)、NAAG肽酶或***特异性膜抗原(PSMA)，是一种在人体内由FOLH1(叶酸水解酶1)基因编码的酶。人类GCPII含有750个氨基酸，且重量大致为84kDa。
GCPII为存在于膜中的锌金属酶。大部分所述酶存在于胞外空间。GCPII为II类膜糖蛋白。根据向右的反应方案，其催化N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)水解成谷氨酸和N-乙酰天冬氨酸(NAA)。
在一些实施例中，本公开的PSMA抗原可具有与SEQ ID NO:11至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开的PSMA抗原可具有SEQ ID NO:11中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的PSMA抗原可具有与SEQ ID NO:36至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。在某些实施例中，本公开的PSMA抗原可具有SEQ IDNO:36中所阐述的核苷酸序列。
IV.粘蛋白家族抗原靶标
本文中所公开的包含组合物，所述组合物包括含有以下的复制缺陷型载体：一个或更多个核酸序列，其编码PSA和/或PSMA抗原；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如MUC1；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码CEA，所述核酸序列是在同一或单独复制缺陷型载体中。
人类粘蛋白家族(MUC1到MUC21)包含在身体上皮细胞表面上形成保护性粘液屏障中起作用的分泌性和跨膜粘蛋白。这些蛋白质的作用是保护呼吸道、肠胃道的上皮层和重要器官(例如乳腺、肝、胃、胰脏和肾)中的内层导管。
MUC1(CD227)为在大部分人类癌瘤和几种血液科恶性疾病上过表达的TAA。MUC1(基因库：X80761.1，NCBI：NM_001204285.1)激活已知涉及人类疾病的许多重要细胞路径。MUC1为通过两个亚基形成，通常在几种人类癌症中过表达的杂二聚体蛋白质。MUC1进行自体蛋白质溶解，产生两个亚基MUC1n和MUC1c，所述两个亚基转而形成稳定的非共价杂二聚体。
MUC1C端亚基(MUC1c)可包括58氨基酸胞外结构域(ED)、28氨基酸跨膜结构域(TM)和72氨基酸细胞质结构域(CD)。MUC1c还可含有可允许MUC1二聚化的“CQC”基序，且其还可赋予细胞致癌功能。在一些情况下，MUC1可部分地通过MUC1c诱导细胞信号传导而起致癌作用。MUC1c可与EGFR、ErbB2和其它受体酪氨酸激酶相互作用，且促进PI3K→AKT和MEK→ERK细胞路径的活化。在细胞核中，MUC1c激活Wnt/β-连环蛋白、STAT和NF-κB RelA细胞路径。在一些情况下，MUC1可通过MUC1n诱导细胞信号传导赋予致癌功能。MUC1N端亚基(MUC1n)可包括不同数量的可糖基化的20氨基酸串联重复序列。MUC1通常在腺上皮细胞的表面表达，且在癌瘤中过表达和异常糖基化。MUC1为可用作肿瘤免疫疗法的靶标的TAA。几个临床试验已进行和正进行评价MUC1在免疫治疗性疫苗中的用途。重要的是，这些试验指示，用MUC1靶向的免疫疗法是安全的，且可提供存活益处。
然而，临床试验也已显示，MUC1为一种相对较差的免疫原。为了克服这个问题，本发明人已鉴定MUC1癌蛋白(MUC1-C或MUC1c)的C端区中的T淋巴细胞免疫增强子肽序列。相较于原生肽序列，其经修饰的MUC1-C中的激动剂：(a)以更低肽浓度结合HLA-A2；(b)表明针对HLA-A2更高的抗体亲抗原性；(c)当与抗原呈递细胞一起使用时，诱导T细胞产生比与原生肽一起使用时更多的IFN-γ；和(d)能够更高效地从癌症患者产生MUC1特异性人类T细胞系。重要的是，对于用原生表位脉冲的靶标的裂解和在表达MUC1的HLA-A2人类肿瘤细胞的裂解中，使用激动剂表位产生的T细胞系比那些使用原生表位产生的T细胞系更高效。此外，本发明人已鉴定MUC1-C的额外CD8+细胞毒性T淋巴细胞免疫增强子激动剂序列表位。
在某些方面，提供一种针对免疫增强子能力进行修饰的强效MUC1-C(mMUC1-C或MUC1-C或MUC1c)。本公开提供一种针对免疫增强子能力进行修饰的强效MUC1-C，将其并入到重组Ad5[E1-、E2b-]平台中，产生新的和更强效的免疫治疗性疫苗。举例来说，免疫治疗性疫苗可为用于治疗表达MUC1的癌症或传染性疾病的Ad5[E1-、E2b-]-mMUC1-C。
翻译后修饰在控制身体和人类疾病中的蛋白质功能中起重要作用。举例来说，除上文所论述的蛋白质裂解以外，MUC1可在特定氨基酸残基处具有几种翻译后修饰，如糖基化、唾液酸化、棕榈酰化或其组合。本文提供靶向MUC1的糖基化、唾液酸化、磷酸化或棕榈酰化修饰的免疫疗法。
MUC1可高度糖基化(在每个串联重复序列内，丝氨酸和苏氨酸残基上不同程度的N-连接和O-连接碳水化合物和唾液酸，范围为单糖基化到五糖基化)。在***癌瘤中，3,4-连接的GlcNAc进行不同O-糖基化。N-糖基化由高甘露糖、酸性复合物型和呈分泌性形式MUC1/SEC的杂合聚糖，以及呈跨膜形式MUC1/TM.4的中性复合物型组成。本公开提供靶向MUC1的不同O-糖基化形式的免疫疗法。
此外，MUC1可唾液酸化。来自肾脏和乳癌细胞的膜脱落糖蛋白优选地具有唾液酸化的核心1结构，而来自相同组织的分泌性形式主要显示核心2结构。在这两种组织中，O-糖基化含量是重叠的，其中以末端岩藻糖和半乳糖、2-连接和3-连接的半乳糖、3-连接的和3,6-连接的GalNAc-ol和4-连接的GlcNAc为主。本公开提供靶向MUC1的不同唾液酸化形式的免疫疗法。CQC基序中的半胱氨酸残基上的双棕榈酰化，是从内体再循环回到质膜所需要的。本公开提供靶向MUC1的不同棕榈酰化形式的免疫疗法。
磷酸化会影响MUC1诱导对于人体健康为重要的特定细胞信号传导反应的能力。本公开提供靶向MUC1的不同磷酸化形式的免疫疗法。举例来说，MUC1可在C端结构域中的酪氨酸和丝氨酸残基上进行磷酸化。C端结构域中的酪氨酸上的磷酸化可增加MUC1和β-连环蛋白的细胞核位置。通过PKCδ的磷酸化可诱导MUC1与β-连环蛋白/CTNNB1的结合，且降低β-连环蛋白/E-钙粘素复合物的形成。Src介导的MUC1磷酸化可抑制与GSK3B的相互作用。Tyr-1229上Src和EGFR介导的MUC1磷酸化，可增加与β-连环蛋白/CTNNB1的结合。Ser-1227上GSK3B介导的MUC1磷酸化，可降低这种相互作用，但恢复β-钙粘素/E-钙粘素复合物的形成。PDGFR介导的MUC1磷酸化，可增加MUC1CT和CTNNB1的细胞核共定位。本公开提供靶向MUC1、MUC1c和MUC1n的已知调节其细胞信号传导能力的不同磷酸化形式的免疫疗法。
本公开提供调节MUC1c细胞质结构域和其在细胞中的功能的免疫疗法。本公开提供包括调节MUC1c中的CQC基序的免疫疗法。本公开提供包括调节MUC1c的胞外结构域(ED)、跨膜结构域(TM)、细胞质结构域(CD)或其组合的免疫疗法。本公开提供包括调节MUC1c通过EGFR、ErbB2或其它受体酪氨酸激酶诱导细胞信号传导的能力的免疫疗法。本公开提供包括调节MUC1c诱导PI3K→AKT、MEK→ERK、Wnt/β-连环蛋白、STAT、NF-κBRelA细胞路径或其组合的能力的免疫疗法。
在一些实施例中，MUC1c免疫疗法可进一步包括在同一复制缺陷型病毒载体或单独复制缺陷型病毒载体中的PSA、PSMA、CEA或Brachyury免疫疗法。
本公开还提供调节MUC1n和其细胞功能的免疫疗法。本公开还提供包括MUC1n的串联重复序列、MUC1n的串联重复序列上的糖基化位点或其组合的免疫疗法。在一些实施例中，MUC1n免疫疗法进一步包括在同一复制缺陷型病毒载体或单独复制缺陷型病毒载体中的PSA、PSMA、CEA或Brachyury免疫疗法。
本公开还提供包括MUC1n、MUC1c、PSA、brachyury、CEA或其组合的疫苗。本公开提供包括MUC1c和PSA、PSMA、brachyury、CEA或其组合的疫苗。本公开还提供靶向MUC1n和PSA、Brachyury、CEA或其组合的疫苗。在一些实施例中，抗原组合含于如本文所提供的一个载体中。在一些实施例中，抗原组合含于如本文所提供的单独载体中。
本发明涉及一种血清型5的复制缺陷型腺病毒载体，其包括编码免疫原性多肽的序列。免疫原性多肽可为MUC1同种型或其亚基或片段。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码多肽的序列，所述多肽与免疫原性多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。在一些实施例中，相较于野生型人类MUC1序列，由本文所描述的腺病毒载体编码的免疫原性多肽包括上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个点突变，如单个氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，本公开的MUC1-c抗原可以是经修饰的MUC1，且可具有与SEQ IDNO:10至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。在某些实施例中，本公开的MUC1-c抗原可具有如SEQ ID NO:10中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的MUC1-c抗原可以是经修饰的MUC1，且可具有与SEQ IDNO:41至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。在某些实施例中，本公开的MUC1-c抗原可具有如SEQ ID NO:41中所阐述的核苷酸序列。
V.Brachyury抗原靶标
本文中所公开的包含组合物，所述组合物包括含有以下的复制缺陷型载体：一个或更多个核酸序列，其编码PSA和/或PSMA抗原；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如MUC1；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码CEA，所述核酸序列是在同一或单独复制缺陷型载体中。
本公开提供包括针对Brachyury的一个或更多个抗原的免疫疗法。Brachyury(也称为人体内的“T”蛋白)为转录因子的T-盒家族的成员，其在早期发育期间，主要在正常中胚层的形成和分化中起关键作用，且表征为高度保守的DNA结合结构域，称为T-结构域。上皮细胞到间叶细胞转换(EMT)为在原发性肿瘤进展为转移性状态期间的关键步骤，其中Brachyury起关键作用。Brachyury在人类癌瘤细胞中的表达，诱导EMT的变化特征，包含间叶细胞标记上调、上皮细胞标记下调和细胞迁移与侵袭增加。相反，Brachyury的抑制引起间叶细胞标记下调、和细胞迁移与侵袭减少，以及人类肿瘤细胞形成癌转移的能力减弱。Brachyury可用以介导上皮细胞-间叶细胞转换，且促进侵袭。
本公开还提供调节Brachyury对于细胞增殖疾病(如癌症)中的上皮细胞-间叶细胞转换功能的效果的免疫疗法。本公开还提供调节Brachyury促进细胞增殖疾病(如癌症)中的侵袭的能力免疫疗法。本公开还提供调节Brachyury的T-盒结构域的DNA结合功能的免疫疗法。在一些实施例中，Brachyury免疫疗法可进一步包括针对PSA、PSMA、CEA、或MUC1、MUC1c或MUC1n的一种或更多种抗原。
Brachyury表达在大部分正常人类组织中几乎是不可检测的，且高度限于人类肿瘤并通常过表达，使得其为一种诱人的免疫疗法靶抗原。在人体内，Brachyury由T基因(基因库：AJ001699.1，NCBI：NM_003181.3)编码。在人体内，发现存在至少有两种通过替代性剪接产生的不同同种型。每种同种型具有多种天然变体。
Brachyury为免疫原性的，且活体外扩增的Brachyury特异性CD8+T细胞可将表达Brachyury的肿瘤细胞裂解。这些Brachyury特征使得其为一种诱人的用于免疫疗法的肿瘤相关抗原(TAA)。Brachyury蛋白为一种T-盒转录因子。其可通过其N端中称为T-盒的区，与特定DNA元件(近回文序列“TCACACCT”)结合，以当与这种位点结合时激活基因转录。
本公开还提供包括Brachyury、PSA、PSMA、MUC1、CEA或其组合的疫苗。在一些实施例中，抗原组合含于如本文所提供的一个载体中。在一些实施例中，抗原组合含于如本文所提供的单独载体中。
在特定实施例中，本发明涉及一种血清型5的复制缺陷型腺病毒载体，其包括编码免疫原性多肽的序列。免疫原性多肽可为Brachyury同种型或其亚基或片段。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码多肽的序列，所述多肽与免疫原性多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。在一些实施例中，相较于野生型人类Brachyury序列，由本文所描述的腺病毒载体编码的免疫原性多肽包括上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40个或更多点突变，如单个氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，本公开的Brachyury抗原可具有与SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开的Brachyury抗原可具有如SEQ ID NO:42中所阐述的氨基酸序列。
VI.CEA抗原靶标
本文中所公开的包含组合物，所述组合物包括含有以下的复制缺陷型载体：一个或更多个核酸序列，其编码PSA和/或PSMA抗原；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如MUC1；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码CEA，所述核酸序列是在同一或单独复制缺陷型载体中。
CEA表示一种诱人的免疫疗法靶抗原，这是由于其几乎在所有结肠直肠癌和胰脏癌中过表达，且也由一些肺癌和乳腺癌以及不常见肿瘤(如甲状腺髓样癌)表达，但除在肠胃上皮中低水平表达以外，不在身体其它细胞中表达。CEA含有可以MHC限制性方式由T细胞识别的表位。
发现，尽管存在预存或诱发的Ad5中和抗体，但用编码肿瘤抗原CEA的Ad5[E1-、E2b-]-CEA(6D)的多次同源免疫以抗肿瘤活性在小鼠中诱发CEA特异性细胞介导的免疫(CMI)反应。在本发明I/II期研究中，患有晚期结肠直肠癌的患者组用递增剂量的Ad5[E1-、E2b-]-CEA(6D)免疫。观测到CEA特异性CMI反应，尽管在大部分(61.3％)患者中存在预存Ad5免疫。重要的是，毒性极小，且不管预存Ad5中和抗体滴度，总体患者存活率(在12个月，48％)类似。结果表明，在癌症患者中，新颖Ad5[E1-、E2b-]基因递送平台，在天然获得和免疫诱发的Ad5特异性免疫的情况下，对于肿瘤抗原CEA产生显著CMI反应。
CEA抗原特异性CMI可为例如大于10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000或更多个IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/106个外周血液单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，在预存的反向Ad5中和抗体滴度高于50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、1000、12000、15000或更高的人类个体中，免疫反应升高。免疫反应可包括如本文所描述的细胞介导的免疫和/或体液免疫。免疫反应可通过以下中的一个或更多个来测量：胞内细胞因子染色(ICS)；ELISpot；增殖分析；细胞毒性T细胞分析，包含如本文所描述的铬释放或等价分析，和使用任何数量的聚合酶链式反应(PCR)的基因表达分析或基于RT-PCR的分析，且在某种程度上，其对于所属领域的技术人员为可用的；以及所属领域中已知用于测量免疫反应的任何其它合适分析。
在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码亚基的经修饰序列，所述亚基与多肽的野生型亚基具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。
免疫原性多肽可以是突变CEA或其片段。在一些实施例中，免疫原性多肽包括在位置610处具有Asn->Asp取代的突变CEA。在一些实施例中，复制缺陷型腺病毒载体包括编码多肽的序列，所述多肽与免疫原性多肽具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性。在一些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括SEQ ID NO:37(CEA-CAP1(6D)的核酸序列)或SEQ ID NO:38(突变CAP1(6D)表位的氨基酸序列)的序列。
在一些实施例中，编码免疫原性多肽的序列包括与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的序列；或由SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38通过替代性密码子置换产生的序列。在一些实施例中，相较于野生型人类CEA序列，由腺病毒载体编码的免疫原性多肽包括上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个点突变，如单个氨基酸取代或缺失。
在一些实施例中，免疫原性多肽包括来自SEQ ID NO:37的序列或SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的经修饰的形式，例如包括上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个点突变，如单一氨基酸取代或缺失。
基于序列相似性、发育表达谱和其生物功能，CEA基因家族的成员细分为三个子组：CEA相关细胞粘附分子(CEACAM)子组，其含有十二个基因(CEACAM1、CEACAM3-CEACAM8、CEACAM16和CEACAM18-CEACAM21)；糖蛋白(PSG)子组，其含有十一个紧密相关的基因(PSG1-PSG11)；和十一个假基因(CEACAMP1-CEACAMP11)的子组。大部分CEACAM子组成员具有类似结构，由胞外Ig样结构域(所述Ig样结构域由单个N端V集结构域构成，与免疫球蛋白可变结构域具有结构同源性)、随后变化数量的A或B亚型C2集结构域、跨膜域和细胞质结构域组成。CEACAM子组的两个成员(CEACAM16和CEACAM20)在其结构组织中显示少数例外。CEACAM16在其N端和C端处含有两个Ig样V型结构域，且CEACAM20含有截断的Ig样V型1结构域。CEACAM分子可通过其跨膜域(CEACAM5到CEACAM8)锚定于细胞表面，或直接与糖磷脂酰肌醇(GPI)脂质部分(CEACAM5、CEACAM18到CEACAM21)连接。
CEA家族成员在不同细胞类型中表达，且具有广泛范围的生物功能。CEACAM主要发现于大部分上皮细胞上，且存在于不同白细胞上。在人体内，CEA家族的祖先成员CEACAM1，在上皮和内皮细胞的顶侧上以及在淋巴细胞和骨髓细胞上表达。CEACAM1通过血友病性(CEACAM1到CEACAM1)以及异宗性(例如CEACAM1到CEACAM5)相互作用介导细胞-细胞粘附。另外，CEACAM1参与许多其它生物过程，如血管生成、细胞迁移和免疫功能。CEACAM3和CEACAM4表达很大程度上限于粒细胞，且其能够传递几种细菌病原体(包含奈瑟菌属(Neisseria)、莫拉菌属(Moraxella)和嗜血杆菌属(Haemophilus)物种)的摄取和破坏。
因此，在不同实施例中，组合物和方法涉及针对CEA的免疫反应升高，所述CEA选自由以下组成的组：CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM16、CEACAM18、CEACAM19、CEACAM20、CEACAM21、PSG1、PSG2、PSG3、PSG4、PSG5、PSG6、PSG7、PSG8、PSG9和PSG11。使用方法和组合物，针对表达或过表达CEA中的一种或更多种的细胞，例如癌细胞，的免疫反应可升高。在一些实施例中，相较于非癌细胞，这类癌细胞中的一种或更多种CEA的过表达超过5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多。
在某些实施例中，本文所用的CEA抗原为野生型CEA抗原、或在YLSGANLNL(SEQ IDNO:39)(CEA的CAP1表位)中具有至少一突变的经修饰的CEA抗原。突变可为保守或非-保守的取代、添加或缺失。在某些实施例中，本文所用的CEA抗原具有YLSGADLNL(SEQ ID NO:38)(突变的CAP1表位)中所阐述的氨基酸序列。在其它实施例中，第一复制缺陷型载体或表达CEA的复制缺陷型载体，具有与SEQ ID NO:40(表达经修饰的CEA抗原的腺病毒载体的预测序列)的任何部分，如SEQ ID NO:40的位置1057到3165或全长SEQ ID NO:40，至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％同一的核苷酸序列。
VII.***癌
本文中所公开的包含用于治疗***癌方法，其包括向有需要的个体施用组合物，所述组合物包括复制缺陷型载体，所述载体包括：一个或更多个核酸序列，其编码PSA家族抗原(例如PSA和/或PSMA)；和/或一个或更多个核酸序列，其编码粘蛋白家族抗原，如MUC1；和/或一个或更多个核酸序列，其编码Brachyury；和/或一个或更多个核酸序列，其编码CEA，所述核酸序列是在同一或单独复制缺陷型载体中。
***癌，也称为***癌瘤，为在***(一种男性生殖***中的腺体)中发展癌症。大部分***癌生长减缓；然而，一些相对快速生长。癌细胞可从***扩散到身体的其它部分，特定来说骨和***。其最初可能不引起症状。在后期，其可引起，在排尿后或排尿时排尿困难、血尿或骨盘疼痛。一种称为良性***增生的疾病可产生类似症状。其它晚期症状可包含由于低红细胞水平而感觉疲倦。
早期***癌通常不具有明显症状。然而，有时***癌确实引起症状，通常类似于如良性***增生的疾病的那些症状。这些症状包含尿频、夜尿症(夜间排尿增加)、开始和维持平稳尿液流困难、血尿症(尿液中有血)和尿痛(排尿疼痛)。基于美国1998年患者护理评价的研究发现，约三分之一诊断患有***癌的患者具有一种或更多种这类症状，而三分之二的不具有症状。
由于***包围***尿道，所以***癌与泌尿功能障碍相关联。因此，腺体内的变化直接影响泌尿功能。因为输精管将***沉积到***尿道中，且来自***自身的分泌物包含于***内含物中，所以***癌也可导致关于性功能和性能的问题，如***困难或***疼痛。
在某些方面，晚期***癌可扩散到身体的其它部分，可能引起额外症状。最常见症状为骨骼疼痛，通常脊椎(脊椎骨)、骨盘或肋中的骨骼疼痛。癌症扩散到其它骨(如股骨)中，通常为扩展到骨骼近端或附近部分的结果。脊椎中的***癌还可压制脊髓，引起发麻、腿虛弱和大小便失禁。
由于一些原因，***癌为免疫疗法的理想候选项。癌症在***内的缓慢生长性质，允许足够的时间以在引发/增强或多次免疫策略之后产生抗肿瘤免疫反应。另外，***癌表达多种肿瘤相关抗原(TAA)，所述抗原包含***特异性抗原(PSA)、***酸性磷酸酶(PAP)、***特异性膜抗原(PSMA)、***干细胞抗原(PSCA)和***的六跨膜上皮细胞抗原(STEAP)。所有这些TAA提供多种可能免疫抗肿瘤靶标，且待靶向抗原的理想组合尚未完全确定。
患者血清中PSA的存在，使得恶性疾病能够在早期检测到，且在一些情况下，在可用放射方法检测到肿瘤之前。这转而可有助于较早治疗。先前已检测到与***TAA反应的循环T细胞，这表明可克服对于这些抗原的自身耐受性。***被视为非必需器官，且因此针对特异性***TAA诱导的免疫反应应该不会导致急性脱靶毒性。最重要的是，第一种***癌特异性免疫疗法西普亮塞-T(Sipuleucel-T)(Dendreon Corporation,Seattle,WA)，在2010年得到美国食品和药物管理局(FDA)的许可，用于无症状或极少症状性的去势抗性***癌(CRPC)。西普亮塞-T由自身的外周血液单核细胞与抗原呈递树突状细胞组成，所述抗原呈递树突状细胞已用重组融合蛋白(PA2024)离体活化，所述重组融合蛋白由与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)连接的PAP组成。在III期试验中，接受西普亮塞-T的CPRC患者呈现死亡率降低22％。现在，治疗性西普亮塞-T的成功已为待获得监管部门批准和进入市场的其它免疫治疗性***癌疫苗铺设道路。
在随机分组的2期试验中，评价痘病毒PSA类疫苗(牛痘PSA引发，鸟痘PSA增强)。将患有极少症状性转移性去势抗性***癌的个体随机分出2/1(85/41)到疫苗疗法与安慰剂组。相对于18个月，治疗个体具有延长的中值总存活期(OS)，26个月。这种方法用于随机分组的关键3期试验，现在全部参与(N＝1200)，且等待事件推进结果。
另外，正研发腺病毒PSA方法。已将PSA并入没有复制能力的早代Ad5[E1-]类载体平台中，且在1期试验中测试。个体依序组具有增加剂量的Ad5-PSA单一注射。大部分18/32(67％)个体发展出可检测的细胞介导的抗PSA反应。使用多次剂量(3次注射)，以1个月间隔，在2期试验中评价这种方法。
因此，基于PSA的疫苗接种方法具有初步临床活性迹象以及诱导抗PSA定向细胞免疫的能力。改进的载体，如本文所描述的新Etubics Ad5[E1-、E2b-]类载体平台，应有助于这种靶向方法的临床发展。非复制性腺病毒载体将提高这种方法的安全性，且规避中和抗病毒免疫反应的能力将使得能够持久增强以最大化免疫反应。这些特征可通过如本文所描述的Ad5[E1-、E2b-]载体提供。
侵袭性***癌的标准治疗可涉及手术(即，根除性***切除术)、包含近距离放射治疗(***近距离放射治疗)和外射束放射疗法的放射、高强度聚焦超声(HIFU)、化疗、口服化疗药(替莫唑胺(Temozolomide)/TMZ)、冷冻手术、激素疗法或某种组合。
在某些实施例中，如本文所用的Ad5[E1-、E2b-]-PSA类和/或Ad5[E1-、E2b-]-PSMA类疫苗接种方法，可与任何可用***癌疗法(如上述实例)组合。
VIII.载体
某些方面包含将表达构建体转移到细胞中，所述表达构建体包括编码一种或更多种靶抗原(如PSA、MUC1、Brachyury、PSMA、CEA或其组合)的一个或更多个核酸序列。在某些实施例中，可使用病毒载体，来实现将表达构建体转移到细胞中。病毒载体可用于包含含有病毒序列的那些构建体，所述病毒序列足以表达已克隆到其中的重组基因构建体。
在特定实施例中，病毒载体为腺病毒载体。腺病毒为DNA病毒家族，特征为含有线性双链基因组的二十面体未包膜衣壳。在人类腺病毒中，没有一个是与任何肿瘤性疾病相关联，且在具有免疫能力的个体中仅引起相对轻微的自我限制病痛。
腺病毒载体可具有整合到基因组DNA中的低容量(capacity)。腺病毒载体可引起高效基因转移。腺病毒载体的额外优势包含，其在基因递送到未***和***细胞两者上为有效的，且可大量生产。
与整合病毒相比，宿主细胞的腺病毒感染可能不会引起染色体整合，这是因为腺病毒DNA可以游离型方式复制而无潜在基因毒性。另外，腺病毒载体可为结构稳定的，且在广泛扩增之后未检测到基因组重排。腺病毒因为其中等大小的基因组、易于操纵、高滴度、宽目标细胞范围和高感染性而尤其适用作基因转移载体。
病毒表达的第一基因为E1基因，其用以从野生型基因组中存在的其它Ad5基因启动子起始高水平基因表达。病毒DNA复制和子代病毒粒子的组装发生在受感染细胞的细胞核内，且整个生命周期花费约36小时，其中每个细胞大致输出104个病毒粒子。
野生型Ad5基因组大致为36kb，且编码分成早期和晚期病毒功能的基因，所述早期和晚期病毒功能取决于是在DNA复制之前还是之后表达。早期/晚期定界几乎为绝对的，这是由于已证实，先前用Ad5感染的细胞的超感染引起缺乏超感染病毒的晚期基因表达，直到其已复制其自身基因组之后。在不受理论束缚的情况下，这可能是由于Ad5主要晚期启动子(MLP)的复制依赖型顺式活化，阻止晚期基因表达(主要为Ad5衣壳蛋白)，直到所复制的基因组被囊封为止。组合物和方法可在研发先进一代的Ad载体/疫苗中利用这些特征。
腺病毒载体可为复制缺陷型、或至少条件性地缺陷型。腺病毒可具有42种不同已知血清型或子组A-F中的任一种，且设想其它血清型或子组。在特定实施例中，可使用子组C的腺病毒类型5，以获得复制缺陷型腺病毒载体。这是因为腺病毒类型5为已知关于其的大量生物化学和基因信息的人类腺病毒，且历史上大部分构建体已采用腺病毒作为载体。
腺病毒生长和操作为所属领域的技术人员已知的，且在活体外和活体内呈现宽广的宿主范围。还可使用经修饰的病毒，如CAR结构域改变的腺病毒。还设想用于增强递送或避开免疫反应的方法，如病毒的脂质体包封。
载体可包括腺病毒的基因工程改造形式，如E2缺失的腺病毒载体，或更具体地说，E2b缺失的腺病毒载体。如本文所用，术语“E2b缺失的”是指经突变，用这样一种方法以便阻止至少一种E2b基因产物的表达和/或功能的特定DNA序列。因此，在某些实施例中，“E2b缺失的”是指从Ad基因组缺失(去除)的特定DNA序列。E2b缺失的或“在E2b区内含有缺失”是指在Ad基因组的E2b区内缺失至少一个碱基对。在某些实施例中，缺失多于一个碱基对，且在其它实施例中，缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一实施例中，缺失具有在Ad基因组的E2b区内超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。E2b缺失可以是防止至少一个E2b基因产物的表达和/或功能的缺失，且因此涵盖在E2b特定蛋白质的外显子编码部分内的缺失以及在启动子和前导序列内的缺失。在某些实施例中，E2b缺失为防止E2b区的DNA聚合酶和前末端蛋白中的一个或两个的表达和/或功能的缺失。在另一实施例中，“E2b缺失的”是指Ad基因组的此区的DNA序列中使得一个或更多个所编码蛋白质呈非功能性的一个或更多个点突变。这类突变包含残基被不同残基置换，导致产生非功能性蛋白质的氨基酸序列改变。
在阅读本公开后，如所属领域的技术人员将理解，可缺失Ad基因组的其它区。因此，如本文所用，Ad基因组的特定区中的“缺失的”是指特定DNA序列，所述DNA序列用防止由所述区编码的至少一种基因产物的表达和/或功能这样一种方法进行突变。在某些实施例中，特定区中的“缺失的”是指特定DNA序列，所述DNA序列用防止由所述区编码的至少一种基因产物的表达和/或功能(例如DNA聚合酶的E2b功能或前末端蛋白功能)这样一种方法进行缺失(去除)。特定区“缺失的”或在特定区内“含有缺失”是指在Ad基因组的所述区内缺失至少一个碱基对。
因此，在某些实施例中，缺失超过一个碱基对，且在其它实施例中，从特定区缺失至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个碱基对。在另一实施例中，缺失为在Ad基因组的特定区内的超过150、160、170、180、190、200、250或300个碱基对。这些缺失使得阻止由所述区编码的基因产物的表达和/或功能。因此，缺失涵盖蛋白质的外显子编码部分内的缺失以及启动子和前导序列内的缺失。在另一实施例中，Ad基因组的特定区中的“缺失”是指Ad基因组的这个区的DNA序列中使得一个或更多个所编码的蛋白质呈非功能性的一个或更多个点突变。这类突变包含残基被不同残基置换，导致产生非功能性蛋白质的氨基酸序列改变。
在某些实施例中，预期应用的腺病毒载体包含E2b缺失的腺病毒载体，所述腺病毒载体在Ad基因组的E2b区和任选地E1区中具有缺失。在一些情况下，这类载体并不缺失Ad基因组的任何其它区。
在另一实施例中，预期应用的腺病毒载体包含E2b缺失的腺病毒载体，所述腺病毒载体在Ad基因组的E2b区和任选地E1和E3区中具有缺失。在一些情况下，这类载体未缺失其它区。
在另一实施例中，预期应用的腺病毒载体包含以下腺病毒载体：其在Ad基因组的E2b区中具有缺失，和任选地在E1和E3区中具有缺失，以及还任选地部分或完全去除E4区。在一些情况下，这类载体无其它缺失。
在另一实施例中，预期应用的腺病毒载体包含以下腺病毒载体：其在Ad基因组的E2b区中具有缺失，和任选地在E1和/或E4区中具有缺失。在一些情况下，这类载体不含有其它缺失。
在额外实施例中，预期应用的腺病毒载体包含以下腺病毒载体：其在Ad基因组的E2a、E2b和/或E4区中具有缺失。在一些情况下，这类载体无其它缺失。
在一个实施例中，本文中应用的腺病毒载体包括缺失E1和/或E2b区的DNA聚合酶功能的载体。在一些情况下，这类载体无其它缺失。
在另一实施例中，本文中应用的腺病毒载体缺失E1和/或E2b区的前末端蛋白功能。在一些情况下，这类载体无其它缺失。
在另一实施例中，本文中应用的腺病毒载体缺失E1、DNA聚合酶和/或前末端蛋白功能。在一些情况下，这类载体无其它缺失。在一个特定实施例中，预期本文中应用的腺病毒载体缺失E2b区和/或E1区的至少一部分。
在一些情况下，这类载体不是“空壳”腺病毒载体。在这点上，载体可同时缺失E2b区的DNA聚合酶和前末端蛋白功能。在额外实施例中，应用的腺病毒载体包含在腺病毒基因组的E1、E2b和/或100K区中具有缺失的腺病毒载体。在某些实施例中，腺病毒载体可以是“空壳”腺病毒载体。
在一个实施例中，本文中应用的腺病毒载体包括缺失E1、E2b和/或蛋白酶功能的载体。在一些情况下，这类载体无其它缺失。
在另一实施例中，本文中应用的腺病毒载体缺失E1和/或E2b区，而纤维基因已通过突变或其它改变(例如以更改Ad向性)进行修饰。可向所提到的任一种腺病毒载体添加去除基因的E3或E4区。
缺失的腺病毒载体可使用所属领域中已知的重组技术(参见例如Amalfitano等人J.Virol.1998；72:926-33；Hodges等人J Gene Med 2000；2:250-59)来产生。如所属领域的技术人员应认识到，使用组成性表达E2b基因产物和可能已缺失的必需基因中的任一种的产物的适当包装细胞系，某些方面中应用的腺病毒载体可成功地生长到高滴度。在某些实施例中，可使用HEK-293来源的细胞，其不仅组成性表达E1和DNA聚合酶蛋白，且还表达Ad前末端蛋白。在一个实施例中，E.C7细胞用于成功地生长高滴度的腺病毒载体储备液(参见例如Amalfitano等人J.Virol.1998；72:926-33；Hodges等人J Gene Med 2000；2:250-59)。
为了从自我繁殖的腺病毒载体缺失关键基因，可在HEK-293细胞中共表达或类似连同E1蛋白一起共表达由靶基因编码的蛋白质。因此，仅可使用当组成性共表达时无毒的那些蛋白质(或诱导性表达的有毒蛋白质)。已证实E1和E4基因在HEK-293细胞中的共表达(使用诱导性、非组成性启动子)(Yeh等人J.Virol.1996；70:559；Wang等人GeneTherapy1995；2:775；以及Gorziglia等人J.Virol.1996；70:4173)。已共表达E1和蛋白质IX基因(病毒粒子结构蛋白)(Caravokyri等人J.Virol.1995；69:6627)，且也已描述E1、E4和蛋白质IX基因的共表达(Krougliak等人Hum.Gene Ther.1995；6:1575)。E1和100k基因已成功地在反补细胞系中表达，E1和蛋白酶基因也一样(Oualikene等人Hum Gene Ther 2000；11:1341-53；Hodges等人J.Virol 2001；75:5913-20)。
用于生长高滴度的E2b缺失的Ad颗粒中共表达E1和E2b基因产物的细胞系，描述于美国专利第6,063,622号中。E2b区编码Ad基因组复制绝对必需的病毒复制蛋白质(Doerfler等人Chromosoma 1992；102:S39-S45)。适用细胞系组成性表达大致140kDa Ad-DNA聚合酶和/或大致90kDa前末端蛋白。确切地说，具有高水平组成性共表达E1、DNA聚合酶和前末端蛋白而无毒性的细胞系(例如E.C7)，是用于繁殖用于多次疫苗接种中的Ad所需的。这些细胞系准许缺失E1、DNA聚合酶和前末端蛋白的腺病毒载体繁殖。
可以使用所属领域中可用的技术来繁殖重组腺病毒载体。举例来说，在某些实施例中，以适当MOI(例如5)，用腺病毒载体病毒储备液来感染含有E.C7细胞的组织培养平板，且在37.0℃下温育40-96h。收集感染细胞，再悬浮于10mM Tris-Cl(pH 8.0)中且超声处理，并且病毒通过两轮氯化铯密度离心来纯化。在某些技术中，在Sephadex CL-6B柱(Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ.)上将含有病毒的带脱盐，且添加蔗糖或甘油，且将等分试样存储在-80℃下。在一些实施例中，将病毒载体放置于设计成增强其稳定性的溶液中，所述溶液如A195(Evans等人J Pharm Sci 2004；93:2458-75)。测量储备液的滴度(例如通过测量病毒等分试样在裂解之后在260nm下的光密度)。在另一实施例中，可将涵盖整个重组E2b缺失的腺病毒载体的线性或环状质粒DNA，转染到E.C7或类似细胞中，且在37.0℃下温育，直到存在病毒产生迹象(例如细胞病变效应)为止。随后，来自这些细胞的条件培养基可用于感染更多E.C7或类似细胞，以扩增在纯化之前所生产的病毒的量。可通过两轮氯化铯密度离心或选择性过滤来实现纯化。在某些实施例中，病毒可使用可商购的产品(例如来自Puresyn,Inc.,Malvem,PA的Adenopure)或定制色谱柱，通过柱色谱来纯化。
在某些实施例中，重组腺病毒载体可包括足够的病毒，以确保待感染的细胞面对某一数量的病毒。因此，可提供重组Ad的储备液，特定来说重组Ad的无RCA储备液。Ad储备液的制备和分析可使用所属领域中可用的任何方法。病毒储备液的滴度变化相当大，很大程度上取决于病毒基因型和用于制备其的方案与细胞系。病毒储备液可具有至少约106、107或108个病毒颗粒(VP)/ml的滴度，且许多这类储备液可具有更高滴度，如至少约109、1010、1011或1012VP/ml。
某些方面涵盖使用E2b缺失的腺病毒载体，如在美国专利第6,063,622号、第6,451,596号、第6,057,158号、第6,083,750号和第8,298,549号中描述的那些腺病毒载体。在许多情况下，具有E2b区中的缺失的载体损害病毒蛋白质表达，和/或降低产生具有复制能力的Ad(RCA)的频率。
这些E2b缺失的腺病毒载体的繁殖可使用表达缺失E2b的基因产物的细胞系来进行。某些方面还提供这类包装细胞系，例如衍生于HEK-293细胞系的E.C7(正式地称为C-7)。
在其它方面，E2b基因产物、DNA聚合酶和前末端蛋白，可连同E1基因产物一起在E.C7或类似细胞中组成性表达。基因片段从Ad基因组转移到生产细胞系具有直接的益处：(1)增加携载容量；以及(2)降低RCA产生的可能，通常需要两个或大于两个独立重组事件来产生RCA。本文所用的E1、Ad DNA聚合酶和/或前末端蛋白表达细胞系，可使得具有接近13kb携载容量的腺病毒载体能够繁殖，而不需要污染性辅助病毒。另外，当缺失病毒生命周期关键的基因(例如E2b基因)时，发生Ad复制或表达其它病毒基因蛋白的进一步损害。这可降低受病毒感染细胞的免疫识别，且允许延长外源转基因表达的持续时间。
E1、DNA聚合酶和前末端蛋白缺失的载体通常不能够表达E1和E2b区对应的蛋白质。此外，其可显示缺乏大部分病毒结构蛋白的表达。举例来说，Ad的主要晚期启动子(MLP)负责转录晚期结构蛋白L1到L5。尽管MLP在Ad基因组复制之前具有极小活性，但仅在已发生病毒基因组复制之后，从MLP开始主要转录且翻译高毒性Ad晚期基因。这种顺式依赖型的晚期基因转录活化为DNA病毒(一般来说，如多瘤病毒和SV-40中生长的DNA病毒)的一种特征。DNA聚合酶和前末端蛋白对于Ad复制为重要的(不同于E4或蛋白质IX蛋白)。其缺失对于腺病毒载体晚期基因表达和所述表达在细胞(如APC)中的毒性效果可能是极其不利的。E1缺失的腺病毒载体
某些方面涵盖使用E1缺失的腺病毒载体。构建第一代或E1缺失的腺病毒载体Ad5[E1-]，使得转基因仅替代基因的E1区。通常，约90％的野生型Ad5基因组保留于载体中。Ad5[E1-]载体的复制能力降低，且在感染不表达Ad5E1基因的细胞之后不能产生感染性病毒。重组Ad5[E1-]载体在允许Ad5[E1-]载体复制和包装的人类细胞(通常293细胞)中繁殖。Ad5[E1-]载体具有多种正面属性；最重要的一个是其相对易于规模扩大和cGMP生产。目前，远远超过220例人类临床试验使用Ad5[E1-]载体，其中超过两千名个体皮下、肌肉内或静脉内给予病毒。
此外，Ad5载体并不整合；其基因组保持游离型。一般来说，对于不会整合到宿主基因组中的载体，就算是有的话，***诱变和/或生殖系转移的风险极低。常规Ad5[E1-]载体具有接近7kb的携载容量。
人类和动物中的研究已表明，针对Ad5的预存免疫可为商用Ad类疫苗的抑制因子。多数人类具有针对Ad5的抗体，人类疫苗最广泛使用的亚型，其中所研究人类的三分之二具有针对Ad5的淋巴增殖性反应。预存免疫可使用典型Ad5疫苗来抑制免疫或再免疫，且可在稍后时间使用Ad5载体来阻止疫苗针对第二抗原的免疫。克服预存抗载体免疫的问题已成为重点研究的主题。已检查使用替代性人类(非Ad5类)Ad5亚型或甚至非人类Ad5形式的研究。即使这些方法初始免疫成功，但疫苗接种可能是有问题的，这是由于对于新颖Ad5亚型的免疫反应。
为了避免Ad5免疫屏障，且改进第一代Ad5[E1-]载体的有限功效以诱导最优免疫反应，提供涉及一种下一代Ad5载体类疫苗平台的某些实施例。下一代Ad5平台具有额外的E2b区中的缺失，去除DNA聚合酶和前末端蛋白基因。Ad5[E1-、E2b-]平台具有足以允许包含许多可能基因的扩大的克隆容量。相较于Ad5[E1-]载体7kb容量，Ad5[E1-、E2b-]载体具有高达约12kb基因携载容量，提供多个基因的空间(如果需要)。在一些实施例中，将超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11kb的***物引入到Ad5载体中，所述载体如Ad5[E1-、E2b-]载体。
E2b区的缺失可赋予Ad5载体有利的免疫特性，通常引起强效免疫反应以靶向抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)，同时最小化对于Ad病毒蛋白质的免疫反应。
在不同实施例中，Ad5[E1-、E2b-]载体可诱导强效CMI以及针对载体表达的靶抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的抗体，即使在Ad免疫存在的情况下。
相较于Ad5[E1-]载体，Ad5[E1-、E2b-]载体还具有降低的不良反应，尤其肝毒性和组织损伤的出现。
这些Ad5载体的某些方面为，Ad晚期基因的表达极大地降低。举例来说，可在活体内检测Ad5[E1-]载体的衣壳纤维蛋白的产生，而从Ad5[E1-、E2b-]载体疫苗去除纤维表达。对于野生型Ad的先天性免疫反应是复杂的。从Ad5[E1-、E2b-]载体缺失的蛋白质一般起重要作用。具体来说，相较于Ad5[E1-]载体，具有前末端蛋白或DNA聚合酶缺失的Ad5[E1-、E2b-]载体在注射后第一个24到72h期间显示发炎降低。在不同实施例中，Ad5基因表达的缺乏使得受感染细胞对抗Ad活性不可见，且准许受感染细胞表达转基因很长一段时间，这发展对于靶标的免疫。
各种实施例构思增加Ad5[E1-、E2b-]载体转导树突状细胞的能力，通过利用针对Ad5[E1-、E2b-]载体病毒蛋白质的发炎性反应降低以及产生的预存Ad免疫逃避而改进疫苗中的抗原特异性免疫反应。
在一些情况下，免疫诱导可耗费数月。Ad5[E1-、E2b-]载体不仅比Ad5[E1-]载体更安全，且关于诱导抗原特异性免疫反应来说看起来更优异，使得其更适用作递送可引起临床反应的肿瘤疫苗的平台。
在某些实施例中，提供方法和组合物，其通过利用Ad5[E1-、E2b-]载体***，用于研发克服使用其它Ad5***的情况下存在的屏障以及准许先前已暴露于Ad5的人群进行免疫的治疗性肿瘤疫苗。
相较于第一代腺病毒载体的5到6kb容量，E2b缺失的载体可具有上至13kb基因携载容量，容易地为编码各种靶抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)中的任一种的核酸序列提供空间。
相较于第一代腺病毒载体，E2b缺失的腺病毒载体还具有降低的不良反应。E2b缺失的载体具有降低的病毒基因表达，且这个特征引起活体内延长的转基因表达。
相较于第一代腺病毒载体，某些实施例的第二代E2b缺失的腺病毒载体，含有DNA聚合酶基因(pol)中的额外缺失和前末端蛋白(pTP)的缺失。
似乎由腺病毒载体表达的Ad蛋白质起重要作用。具体来说，E2b缺失的载体中的前末端蛋白和DNA聚合酶的缺失似乎能够在注射后第一个24到72小时期间降低发炎，而第一代腺病毒载体在此时间期间刺激发炎。
另外，据报道，由E2b缺失产生的额外复制阻断还引起Ad晚期基因表达降低10,000倍，远远超过单独E1、E3缺失得到的降低。通过E2b缺失的腺病毒载体产生的Ad蛋白水平降低，有效地降低针对Ad抗原的竞争性非所需免疫反应的可能，从而防止在Ad免疫接种或暴露的个体中重复使用平台。
通过第二代E2b缺失的载体降低发炎性反应的诱导，使得载体在抗原呈递细胞(即，树突状细胞)感染期间表达所需疫苗抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的可能增加，降低抗原竞争的可能，从而使得疫苗对于所需抗原相对于用第一代腺病毒载体的相同尝试具有更高的免疫。
E2b缺失的腺病毒载体提供一种改进的Ad类疫苗候选项，其比先前描述使用第一代腺病毒载体的候选疫苗更安全、更有效且更通用。
因此，第一代E1缺失的腺病毒亚型5(Ad5)类载体(尽管用作疫苗为有前景的平台)的活性，可能会被天然存在或诱发的Ad特异性中和抗体阻碍。
在不受理论束缚的情况下，具有E1和E2b区的缺失的Ad5类载体(Ad5[E1-、E2b-])，后者编码DNA聚合酶和前末端蛋白，例如凭借减弱的晚期病毒蛋白质表达，可避免免疫清除，且诱导针对Ad免疫宿主中所编码的抗原转基因(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)更强效的免疫反应。
IX.异源核酸
在一些实施例中，载体(如腺病毒载体)可包括异源核酸序列，所述异源核酸序列编码可调节免疫反应的一种或更多种肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合、其融合物或其片段。在某些方面，可提供第二代E2b缺失的腺病毒载体，其包括编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的异源核酸序列。
因此，可提供：多核苷酸，其编码来自如在本文中进一步描述的任何来源的PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合；载体或构建体，其包括这类多核苷酸；和宿主细胞，其用这类载体或表达构建体转化或转染。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文基本上互换使用。如所属领域的技术人员还将认识到，本文所用的多核苷酸可为单链(编码或反义链)或双链，且可为DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可包含HnRNA分子，其含有内含子且以一对一方式对应于DNA分子；和mRNA分子，其不含有内含子。额外编码或非编码序列可(但不一定)存在于如本文中所公开的多核苷酸内，且多核苷酸可(但不一定)与其它分子和/或载体材料连接。如本文所用，经分离多核苷酸意指，多核苷酸大体上与其它编码序列分开。举例来说，如本文所用，经分离DNA分子不含有大部分的无关编码DNA，如大的染色体片段或其它功能性基因或多肽编码区。当然，这是指如起初经分离的DNA分子，且不排除在实验室中通过重组稍后添加到区段中的基因或编码区。
如所属领域的技术人员将理解，多核苷酸可包含基因组序列、基因组外和质粒编码的序列，和较小的工程改造基因区段，所述基因区段表达或可适于表达如本文所描述的靶抗原、抗原片段、肽以及其类似物。这类区段可为天然经分离的，或通过人力以合成方式经修饰的。
多核苷酸可包括原生序列(即，编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合或其部分)的内源性序列)，或可包括编码这种序列的变体或衍生物的序列。在某些实施例中，本文中阐述的多核苷酸序列编码一种或更多种突变的肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合。在一些实施例中，多核苷酸表示已对于在特定细胞类型(即，人类细胞系)中的表达进行优化的新颖基因序列，其可大体上不同于原生核苷酸序列或变体但编码类似蛋白质抗原。
在其它相关实施例中，可提供多核苷酸变体，其与编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的原生序列具有大体同一性，例如以下那些：使用本文所描述的方法(例如BLAST分析，使用标准参数，如下文所描述)，相较于编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的原生多核苷酸序列具有至少70、80、90、95、96、97、98或99序列同一性，或其任何可得出范围或值，特定来说至少75％上到99％或更高序列同一性的序列。所属领域的技术人员将认识到，这些值可以适当地调整，以便通过考虑密码简并、氨基酸类似性、阅读框定位等，确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
在一些实施例中，多核苷酸变体将含有一个或更多个取代、添加、缺失和/或***，特定来说使得由变体多核苷酸编码的多肽的表位的免疫原性或使得异源靶蛋白的免疫原性相对于由原生多核苷酸序列编码的多肽不大体上减弱。如本文其它地方所描述，多核苷酸变体优选地编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的变体或其片段(例如表位)，其中变体多肽或其片段(例如表位)与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的倾向，相对于原生多肽大体上不减弱。术语“变体”还应理解为涵盖异种来源的同源基因。
在某些方面，可提供多核苷酸，其包括或由以下组成：编码多肽的(包含如本文所描述靶蛋白抗原)至少约5到1000或更多个连续核苷酸，以及其间的所有中间长度。将容易地理解，在此环境中，“中间长度”意味着在给出值之间的任何长度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包含200-500、500-1,000之间的以及类似范围的所有整数。如本文所描述的多核苷酸序列可在一端或两端延长额外核苷酸，所述额外核苷酸不存在于编码如本文所描述的多肽(如表位或异源靶蛋白)的原生序列中。这种额外序列可由在所公开序列的任一端或所公开序列的两端的1到20或更多个核苷酸组成。
多核苷酸或其片段，不管编码序列自身的长度，可与如以下的其它DNA序列组合：启动子、表达控制序列、聚腺苷酸化信号、额外限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段以及其类似序列，使得其总长度可变化相当大。因此预期，可采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地受制备简易性和预期重组DNA方案中的用途限制。举例来说，预期具有以下总长度的说明性多核苷酸区段适用于某些方面：长度约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、约500、约200、约100、约50个碱基对，以及类似长度(包含所有中间长度)。
当比较多核苷酸序列时，如果如下文所描述，两个序列中的核苷酸的序列当经比对以获得最大对应性时相同，那么两个序列被称为“同一的”。两个序列之间的比较典型地通过在比较窗口比较序列，以鉴定和比较局部区的序列类似性来进行。如本文所用，“比较窗口”是指至少约20个、通常30到约75个、40到约50个邻接位置的片段，其中在两个序列经最优比对之后，序列可以与具有相同数目的邻接位置的参考序列相比较。
用于比较的序列的最优比对可以使用默认参数，使用生物信息学软件的Lasergene套件中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)来执行。这个程序实施在以下参考中描述的几种比对流程：Dayhoff MO(1978)A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships。参见Dayhoff MO(编)Atlasof Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC第5卷,增刊3,第345-358页；Hein J Unified Approach to Alignment andPhylogenes,第626-645页(1990)；Methods in Enzymology第183卷,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins等人PM CABIOS 1989；5:151-53；Myers EW等人CABIOS 1988；4:11-17；Robinson ED Comb.Theor 1971；11A 05；Saitou N等人Mol.Biol.Evol.1987；4:406-25；Sneath PHA and Sokal RR Numerical Taxonomy-the Principles and Practiceof Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA(1973)；Wilbur WJ等人Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 1983 80:726-30)。
替代地，用于比较的序列最优比对可通过以下来进行：Smith等人Add.APL.Math1981；2:482的局部同一性算法；Needleman等人Mol.Biol.1970 48:443的同一性比对算法；搜索Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988；85:2444的相似性方法；这些算法(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wl中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)的计算机化实施方式；或检测(inspection)。
适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人,Nucl.Acids Res.1977 25:3389-3402和Altschul等人J.MoI.Biol.1990 215:403-10中。BLAST和BLAST 2.0可以例如以本文所述的参数使用，以确定多核苷酸的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用。在一个说明性实例中，对于核苷酸序列，累积得分可以使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的惩罚得分；始终<0)计算。当累积比对得分从其达到的最大值降低量X；累积得分因一次或多次负分残基比对的累积而变成零或低于零；或到达任一序列的末端时，中断字命中点在各方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)是11，并且期望值(E)是10，并且BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989；89:10915)比对(B)是50，预期值(E)是10，M＝5，N＝-4，并且比较两条链。
在某些实施例中，“序列同一性的百分比”通过在至少20个位置的比较窗口中比较两个最优比对序列来测定，其中比较窗口中的多核苷酸序列部分可包括相较于参考序列(其不包括添加或缺失)的20％或更少，通常5到15％或10到12％的添加或缺失(即，间隙)，以用于对两个序列进行最优比对。百分比通过以下方式计算：确定两个序列中存在的同一核酸碱基的位置数得到匹配位置数，将匹配位置数除以参考序列中的总位置数(即，窗口大小)，并且将结果乘以100得到序列同一性百分比。
所属领域的一般技术人员应了解，如本文所描述，由于遗传密码的简并，存在多种编码所关注的特定抗原或其片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列携有最小同源性。但是，特异性地涵盖由于密码子使用差异而变化的多核苷酸。
此外，还可涵盖包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于核苷酸的一个或多个突变(例如缺失、添加和/或取代)而改变的内源基因。所得mRNA和蛋白质可(但不一定)具有改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定。
因此，在另一实施例中，采用诱变方法(如位点特异性诱变)，以用于制备核酸序列的变体和/或衍生物，所述核酸序列编码如本文所描述的一种或更多种肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合，或其片段。通过此方法，多肽序列中的特异性修饰可通过编码其的基本多核苷酸的诱变来制备。这些技术提供制备和测试序列变体的直接了当的方法，例如结合前述考虑中的一个或更多个，通过一种或更多种核苷酸序列变化引入到多核苷酸中。
通过使用编码具有所需突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足够数量的相邻核苷酸，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，在横穿的缺失接合两侧形成稳定的双螺旋。可在所选择多核苷酸序列中采用突变，以改进、更改、降低、修饰或以其它方式改变多核苷酸自身的特性，和/或更改所编码多肽的性质、活性、组成、稳定性或一级序列。
编码多肽的多核苷酸区段或片段可容易地通过以下来制备：例如通过化学方法直接合成片段，如通常实践使用自动化寡核苷酸合成器一样。另外，片段可通过以下来获得：应用核酸复制技术(如美国专利4,683,202的PCRTM技术)，通过将所选择序列引入到重组载体中以用于重组生产，和通过分子生物学领域的技术人员一般已知的其它重组DNA技术(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,NY,NY)。
为了表达如本文所描述的所需肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合，多肽或其片段、或包括以上中的任一种的融合蛋白，使用所属领域中已知的重组技术，将编码多肽或功能等效物的核苷酸序列***到适当载体(如本文所描述的如复制缺陷型腺病毒载体)中。适当载体含有用于转录与翻译所***编码序列的必需元件以及任何所需连接子。
所属领域的技术人员可用的方法可用于构建这些载体，所述载体含有编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的序列和适当的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。这类技术例如描述于以下中：Amalfitano等人J.Virol.1998；72:926-33；Hodges等人J Gene Med 2000；2:250-259；Sambrook J等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press,Plainview,N.Y.和Ausubel FM等人(1989)Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y。
可使用各种载体/宿主***来容纳和产生多核苷酸序列。这些***包含(但不限于)：微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA载体转化的细菌，用酵母菌载体转化的酵母菌；昆虫细胞***，其用病毒载体(例如杆状病毒)感染；植物细胞***，其用病毒载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或细菌载体(例如Ti或pBR322质粒)转化；或动物细胞***。
存在于载体(如腺病毒载体)中的“控制元件”或“调控序列”，为载体非翻译区的那些序列：增强子、启动子、5'和3'非翻译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录与翻译。所述元件可在其强度和特异性方面变化。取决于所用的载体***和宿主，可以使用任何数量的合适的转录与翻译元件，包含组成性启动子和诱导性启动子。举例来说，可将编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的序列接合到Ad转录/翻译复合物中，所述复合物由晚期启动子和三联前导序列组成。病毒基因组的非必需E1或E3区中的***，可用于获得能够在受感染宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan J等人Proc.Natl.Acad.Sci 1984；87:3655-59)。另外，转录增强子，如劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus，RSV)增强子，可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
特异性起始信号还可用以实现编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的序列的更高效翻译。这类信号包含ATG起始密码子和相邻序列。在将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列***到适当表达载体中的情况下，可能不需要额外的转录或翻译控制信号。然而，在仅***编码序列或其部分的情况下，应提供包含ATG起始密码子的外源性翻译控制信号。此外，起始密码子应在正确阅读框中以确保整个***的翻译。外源性翻译元件和起始密码子可具有多个天然和合成的起点。可通过包含适合于所用的特定细胞***的增强子来增强表达效率，所述增强子如描述于文献(Scharf D.等人Results Probl.Cell Differ.1994；20:125-62)中的那些增强子。也可并入特异性终止序列(用于转录或翻译)，以实现编码所选多肽的序列的有效翻译。
用于使用对产物具有特异性的多克隆或单克隆抗体，来检测和测量多核苷酸编码的产物(例如一种或更多种肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的表达的各种方案为所属领域中已知的。实例包含酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。对于一些应用，使用单克隆抗体与既定多肽上的两个非干扰表位反应的基于两位点单克隆的免疫分析可为优选的，但也可采用竞争性结合分析。在其它位置中，这些和其它分析描述于Hampton R等人(1990；Serological Methods,aLaboratory Manual,APS Press,St Paul.Minn.)和Maddox DE等人J.Exp.Med.1983；758:1211-16中。
在某些实施例中，可以将增加所需肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的表达的元件，并入到表达构建体或载体(如本文所描述的腺病毒载体)的核酸序列中。这类元件包含内部核糖体结合位点(IRES；Wang等人Curr.Top.Microbiol.Immunol1995；203:99；Ehrenfeld等人Curr.Top.Microbiol.Immunol.1995；203:65；Rees等人Biotechniques 1996；20:102；Sugimoto等人Biotechnology 1994；2:694)。IRES增加翻译效率。同样，其它序列可增强表达。对于一些基因，尤其在5'端处的序列抑制转录和/或翻译。这些序列通常为可形成发夹结构的回文结构。一般缺失待递送核酸中的任何这类序列。分析转录或翻译产物的表达水平，以确认或确定哪些序列影响表达。可通过任何已知方法，包含Northern印迹杂交、RNA酶探针保护以及类似方法，来分析转录水平。可通过任何已知方法，包含ELISA，来分析蛋白质水平。
如所属领域的技术人员应认识到，包括异源核酸序列的载体(如本文所描述的腺病毒载体)，可使用所属领域中已知的重组技术来产生，如以下中描述的那些技术：Maione等人Proc Natl Acad Sci USA 2001；98:5986-91；Maione等人Hum Gene Ther 2000 1:859-68；Sandig等人Proc Natl Acad Sci USA,2000；97:1002-07；Harui等人Gene Therapy2004；11:1617-26；Parks等人Proc Natl Acad Sci USA 1996；93:13565-570；DelloRusso等人Proc Natl Acad Sci USA 2002；99:12979-984；Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,NY,NY。
X.药物组合物
在某些方面，可提供药物组合物，其包括编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)(将产生针对其的免疫反应)的核酸序列。
举例来说，本文所描述的腺病毒载体储备液可与适当缓冲液、生理学上可接受的载剂、赋形剂或类似物组合。在某些实施例中，在适当缓冲液(如无菌PBS)中施用适当数量的腺病毒载体颗粒。在某些情形中，将期望，肠胃外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内递送本文中所公开的腺病毒载体组合物。
在某些实施例中，呈游离碱或药理学上可接受盐形式的药物组合物的溶液，可在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及在油中制备分散液。在其它实施例中，E2b缺失的腺病毒载体可以丸剂形式递送，所述丸剂通过吞咽或通过栓剂递送。
适合于可注射用途的说明性药物形式包含：无菌水溶液或分散液，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂(例如参见美国专利第5,466,468号)。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是达到存在流畅注射能力的程度的流体。其在制造和存储条件下必须是稳定的，并且必须保护其免遭如细菌、霉菌和真菌等微生物的污染作用。
载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、脂质、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇以及类似物)、其合适的混合物和/或植物油。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液情况下维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞以及类似物)来实现。在许多情况下，合适的是包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
在一个实施例中，对于以水溶液形式肠胃外施用，溶液可进行适当地缓冲(必要时)，且液体稀释剂首先呈现与足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定水溶液尤其适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在此方面，根据本公开，可采用的无菌水性介质将为所属领域的技术人员所知。举例来说，可将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中，且添加到1000ml皮下输注液中或注射在建议输注位点处(参见例如“Remington's PharmaceuticalSciences”第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。取决于所治疗个体的条件，剂量将有必要发生一些变化。此外，对于人类施用，制剂当然将合适地满足FDA生物标准办公室(FDAOffice of Biology standards)要求的无菌、产热原性和一般安全性以及纯度标准。
载剂可进一步包括任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬浮液、胶体以及类似物。这类介质和药剂用于药物活性物质的用途是所属领域中众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。还可将补充性活性成分并入到组合物中。短语“药学上可接受的”是指当向人类施用时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。
本文所描述的治疗性组合物的施用途径和频率以及剂量，将因人而异且因病而异，并且可容易地使用标准技术确立。一般来说，药物组合物和疫苗可通过注射(例如皮內、肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内(例如通过抽吸)、以丸剂形式(例如吞咽、用于***或直肠递送的栓剂)来施用。在某些实施例中，可在6周时段内施用1到3次之间的剂量，且其后可定期给予进一步增强疫苗接种。
举例来说，合适的剂量为当如上文所描述施用时，腺病毒载体能够如本文其它地方所描述促进靶抗原免疫反应的量。在某些实施例中，免疫反应高于基础(即，未处理的)水平至少10-50％。这类反应可通过以下来监测：测量患者中的靶抗原抗体，或能够活体外杀伤靶抗原表达细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖性产生，或监测免疫反应领域中已知的其它方法。在一些方面，靶抗原为PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合。
一般来说，适当剂量和治疗方案以足以提供预防性益处的量提供腺病毒载体。保护性免疫反应一般可使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子分析来评价，其可以使用在免疫(疫苗接种)前后从患者获得的样本进行。
在某些方面，可通过身体和生理因素，如体重、病状的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时治疗性干预、患者的原发症以及投药途径，来测定向患者或个体施用的组合物的实际剂量。负责投与的医师将在任何情况下确定组合物中活性成分的浓度和用于个别个体的适当的一个或多个剂量。
尽管本文所描述的组合物和方法的一个优势是，能够尤其在对于Ad具有预存免疫的个体中施用多次相同腺病毒载体疫苗接种，但本文所描述的腺病毒疫苗也可作为引发和增强方案的一部分施用。混合模式的引发和增强接种方案可引起免疫反应增强。因此，一个方面是一种用质粒疫苗，如包括编码一种或更多种肿瘤抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的核酸序列的质粒载体，通过施用质粒疫苗至少一次，允许经历预定时间长度，且随后通过施用本文所描述的腺病毒载体进行增强，来引发个体的方法。
可采用多次引发，例如1-3次，但可使用更多次。引发与增强之间的时间长度通常可在约六个月到一年之间变化，但可使用其它时间范围。
在某些实施例中，药物组合物可包括例如至少约0.1％的治疗剂(如本文中用作疫苗的表达构建体或载体)、相关脂质纳米小泡或装载有治疗剂的核外体或纳米小泡。在其它实施例中，治疗剂可占约2％到约75％的单位重量，或例如约25％到约60％，和其中可得出的任何范围。在其它非限制性实例中，剂量还可以包括每次施用每千克体重约1微克、每千克体重约5微克、每千克体重约10微克、每千克体重约50微克、每千克体重约100微克、每千克体重约200微克、每千克体重约350微克、每千克体重约500微克、每千克体重约1毫克、每千克体重约5毫克、每千克体重约10毫克、每千克体重约50毫克、每千克体重约100毫克、每千克体重约200毫克、每千克体重约350毫克、每千克体重约500毫克到每千克体重约1000毫克或超过1000毫克，和其中可得出的任何范围。在从本文所列数值的可得出范围内的非限制性实例中，可施用每千克体重约5微克到每千克体重约100mg、每千克体重约5微克到每千克体重约500毫克等的范围。
基于预期目标，确定药物组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于个体的物理离散单位，每一单位含有结合其施用(即，适当途径和治疗方案)，经计算产生上文所论述的所需反应的预定数量的药物组合物。待投与的量(同时根据治疗和单位剂量的数量)取决于所需保护或效果。
药物组合物的确切量还取决于医师的判断并且对于每一个体都是特有的。影响剂量的因素包含：患者的身体和临床状态、投药途径、预期治疗目标(例如缓解症状与治愈)和特定治疗性物质的效能、稳定性和毒性。
在某些方面，包括如本文所描述的疫苗接种方案的组合物，可通过任何途径单独投与或与药学上可接受的载剂或赋形剂一起投与，且这类施用可以单一和多个剂量两种形式进行。更确切地说，药物组合物可与各种医药上可接受的惰性载剂呈以下形式进行组合：片剂、胶囊、糖锭、锭剂、硬糖、粉剂、喷雾剂、水性悬浮液、可注射溶液、酏剂、糖浆以及类似形式。这类载剂包含固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。此外，这类口服医药调配物可借助于各种通常用于这类目的的药剂类型，适当地增甜和/或调味。通篇描述的组合物可调配成医药药物，且用于治疗诊断患有疾病(例如癌症)的(有需要的)人类或哺乳动物，或增强免疫反应。
在某些实施例中，可结合一种或更多种免疫刺激剂，如佐剂，来施用本文所描述的病毒载体或组合物。免疫刺激剂是指增强或加强对于抗原的免疫反应(抗体和/或细胞介导的)的基本上任何物质。免疫刺激剂的一种类型包括佐剂。许多佐剂含有：设计成保护抗原免于快速代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油；和免疫反应的刺激剂，如脂质A、百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌来源的蛋白质。某些佐剂为可商购，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories)；默克佐剂65(Merck and Company,Inc.)AS-2(SmithKline Beecham)；铝盐，如氢氧化铝凝胶(矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不可溶悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰脂质A和quil A。也可使用如以下的细胞因子作为佐剂：GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-23和/或IL-32等，如生长因子。
在某些实施例内，佐剂组合物可为诱导主要Th1类型免疫反应的佐剂。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导对于所施用抗原的细胞介导的免疫反应。相比之下，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于促进诱导体液免疫反应。在施加如本文所提供的疫苗之后，患者可支持包含Th1型和/或Th2型反应的免疫反应。在反应主要为Th1型的某些实施例内，Th1型细胞因子的水平将比Th2型细胞因子的水平增加到更高程度。这些细胞因子的水平可容易地使用标准分析来进行评定。因此，各种实施例涉及使用在复制缺陷型病毒载体治疗同时所提供的细胞因子来提高针对靶抗原(例如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的免疫反应的疗法，所述细胞因子例如IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13和/或IL-15。在一些实施例中，与本文所描述的复制缺陷型病毒一起，施用细胞因子或编码细胞因子的核酸。在一些实施例中，在病毒载体施用之前或之后，进行细胞因子施用。在一些实施例中，能够提高针对靶抗原(例如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的免疫反应的复制缺陷型病毒载体，进一步包括编码细胞因子的序列。
引起主要Th1型反应的某些说明性佐剂包含例如单磷酰脂质A(如3-脱氧酰化单磷酰脂质A)与铝盐的组合。佐剂为可商购的(参见例如美国专利第4,436,727号、第4,877,611号、第4,866,034号和第4,912,094号)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)还诱导主要Th1反应。(参见例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利第6,008,200号和第5,856,462号)。还可使用免疫刺激性DNA序列。
在一些实施例中，所使用的另一佐剂包括皂苷(如Quil A)或其衍生物，包含QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.)、七叶皂苷；毛地黄皂苷；或满天星(Gypsophila)或昆诺藜(Chenopodium quinoa)皂苷。其它调配物可在佐剂组合中包含超过一种皂苷，所述佐剂组合例如以下包括QS21、QS7、Quil A、β-七叶皂苷或毛地黄皂苷的组中的至少两种的组合。
在一些实施例中，组合物可通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶递送载体来递送。可采用使用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰基-甘油化合物的药物递送(参见例如美国专利第5,725,871号)。同样，可采用呈聚四氟乙烯支持基质形式的说明性经粘膜药物传递(参见例如美国专利第5,780,045号)。
脂质体、纳米胶囊、微粒、脂质颗粒、囊泡以及类似物，可用于将如本文所描述的组合物引入到合适的热细胞/生物体中。如本文所描述的组合物可被调配成用于进行包封于脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米粒子或类似物中的递送。替代地，如本文所描述的组合物可与这类载体的表面共价或非共价结合。可有效地使用脂质体，以将基因、各种药物、放射性治疗剂、酶、病毒、转录因子、别构效应子以及类似物引入到各种培养细胞系和动物中。此外，脂质体的使用似乎并不与在全身递送之后的自身免疫反应或不可接受的毒性相关联。在一些实施例中，脂质体是由分散于水性介质中的磷脂形成，且自发地形成多层同心双层囊泡(即，多层囊泡(MLV))。
在一些实施例中，提供组合物的药学上可接受的纳米胶囊调配物或如本文所描述的载体。纳米胶囊可一般以稳定和可再现的方式捕获药物组合物。为了避免由于胞内聚合物过载的副作用，可使用能够在活体内降解的聚合物来设计这类超细颗粒(大小约0.1μm)。
在某些方面，可结合本文提供的一种或更多种疗法，特定来说包括编码一种或更多种肿瘤抗原(如本文所描述的PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的核酸序列的一种或更多种腺病毒载体，向有需要的个体施用包括IL-15的药物组合物。
白介素15(IL-15)为具有类似于IL-2的结构的细胞因子。如IL-2，IL-15与由IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同γ链(γ-C，CD132)构成的复合物结合，且通过所述复合物发送信号。IL-15是在受病毒感染后由单核吞噬细胞(和一些其它细胞)分泌。这种细胞因子诱导自然杀伤细胞的细胞增殖，所述自然杀伤细胞为主要用于杀伤受病毒感染细胞的先天免疫***细胞。
在临床前模型中，IL-15可增强CD8+T细胞的抗肿瘤免疫。在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)开始登记患者进行I期临床试验，以评价IL-15在患有转移性黑素瘤和肾细胞癌(肾癌)的患者中的安全性、给药和抗肿瘤功效。
本文中所公开的IL-15还可包含IL-15的突变体，所述突变体经修饰以维持其原生形式功能。
IL-15为由小鼠中的染色体4的34kb区4q31和染色体8的中心区编码的14-15kDa糖蛋白。人类IL-15基因包括九个外显子(1到8和4A)和八个内含子，其中的四个(外显子5到8)编码成熟蛋白质。已报告，编码相同蛋白质的这个基因的两个交替剪接转录变体。具有48个氨基酸的长信号肽的最初鉴定的同种型(IL-15LSP)由以下组成：316bp5'-非翻译区(UTR)、486bp编码序列和C端400bp 3'-UTR区。其它同种型(IL-15SSP)具有由外显子4A和5编码的21氨基酸的短信号肽。两种同种型共用在N端信号序列之间的11个氨基酸。尽管两种同种型均产生相同成熟蛋白质，但它们的细胞运输不同。IL-15LSP同种型是在高尔基体(GC)、早期内体中和在内质网(ER)中鉴定。其以两种形式存在于树突状细胞上，特定来说分泌性和膜结合形式。另一方面，IL-15SSP同种型不是分泌性的，且似乎受限于细胞质和细胞核，在其中，所述IL-15SSP在调控细胞周期中起重要作用。
已表明，IL-15mRNA的两种同种型在小鼠中是通过替代性剪接产生。具有含有另一3'剪接位点的替代性外显子5的同种型呈现高翻译效率，且产物在N端信号序列中缺乏疏水性结构域。这表明，衍生于这种同种型的蛋白质位于细胞内。具有正常外显子5的其它同种型(其通过替代性外显子5的整体剪接产生)，可释放到细胞外。
尽管IL-15mRNA可在许多细胞和组织(包含肥大细胞、癌细胞或纤维母细胞)中找到，但这种细胞因子主要由树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞作为成熟蛋白质形式产生。在IL-15mRNA的普遍存在与蛋白质的有限产量之间的这种不一致，可通过人体内的十二个和小鼠内的五个上游起始密码子的存在来解释，所述密码子可抑制IL-15mRNA的翻译。翻译的无活性mRNA存储于细胞内，且可在特异性信号后诱发。IL-15的表达可通过细胞因子，通过Toll样受体(TLR)、干扰素γ(IFN-γ)或在感染单核细胞疱疹病毒、结核分枝杆菌和白色念珠菌(Candida albicans)之后刺激，所述细胞因子如GM-CSF、双链mRNA、未甲基化CpG寡核苷酸、脂多醣(LPS)。
XI.自然杀伤(NK)细胞
在某些实施例中，可结合如本文所描述的腺病毒载体类组合物或免疫疗法，向有需要的个体施用原生或工程改造的NK细胞。
免疫***是多种多样的免疫细胞家族的集合，所述免疫细胞其自身各自在保护免于感染和疾病中具有不同作用。在这些中，免疫细胞为作为身体的第一道防线的自然杀伤或NK细胞。NK细胞，具有在无先前暴露或其它支持分子活化的情况下，快速搜寻和破坏异常细胞(如癌症或受病毒感染细胞)的先天能力。与适应性免疫细胞(如T细胞)相比，NK细胞已在1阶段临床试验中用作基于细胞的“现成”治疗，且已证实对于癌症的肿瘤杀伤能力。
1.aNK细胞
除原生NK细胞以外，可向不表达杀伤抑制受体(KIR)的患者施用NK细胞，病变细胞通常采用所述杀伤抑制受体以避开NK细胞的杀伤功能。这种独特活化的NK或aNK细胞，缺乏这些抑制受体同时保留大量的能够选择性靶向和杀伤病变细胞的活化受体。aNK细胞还携载较大有效负载的含有颗粒酶和穿孔素的颗粒，从而使得其能够将较高有效负载的杀伤性酶递送到多个靶标。
2.taNK细胞
嵌合抗原受体(CAR)技术是目前研发的最新颖癌症疗法之一。CAR为允许免疫效应细胞(靶标活化的自然杀伤细胞)靶向呈现特异性表面抗原的癌细胞的蛋白质，其为其中aNK细胞经工程改造具有癌症上发现的靶蛋白的一种或更多种CAR的平台，且随后与广泛的CAR结合在一起。这种策略相较于使用患者或供体来源的效应细胞(如自身T细胞)的其它CAR方法，具有多种优势，尤其在可扩展性、质量控制和一致性方面。
许多癌细胞杀伤依赖于ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)，于是效应免疫细胞附着于抗体，所述抗体转而与靶标癌细胞结合，从而促进效应细胞对癌症的杀伤。NK细胞为身体中ADCC的关键效应细胞，且使用专门的受体(CD16)来结合抗体。
3.haNK细胞
研究已显示，可能仅20％的人群均一地表达CD16的“高亲和力”变体(haNK细胞)，相较于具有“低亲和力”CD16的患者所述人群与更良好的治疗结果紧密相关。此外，许多癌症患者具有由于化疗、疾病自身或其它因子而严重弱化的免疫***。
在某些方面，NK细胞经修饰以表达高亲和力CD16(haNK细胞)。因此，haNK细胞可加强针对癌细胞的广泛抗体的治疗功效。
XII.组合疗法
包括腺病毒载体类疫苗(其包括编码肿瘤抗原(如通篇描述的PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的核酸序列)的组合物，可调配成医药药物，且用于治疗有需要的或诊断患有疾病(例如癌症)的人类或哺乳动物。这些药物可与一种或更多种额外疫苗一起向人类或哺乳动物共投与，或与以下一起共投与：一种或更多种常规癌症疗法或替代性癌症疗法、细胞因子(如IL-15)或编码这类细胞因子的核酸序列、经工程改造的自然杀伤细胞或如本文所描述的免疫路径检查点调节剂。
常规癌症疗法包含选自基于化学或放射的治疗和手术的群组的一种或更多种。化疗包含例如顺铂(CDDP)、卡铂、丙卡巴肼(procarbazine)、二氯甲二乙胺、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、亚硝基脲、放线菌素、道诺红菌素(daunorubicin)、阿霉素、博莱霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)(VP16)、他莫昔芬、雷诺昔酚(raloxifene)、***受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法呢基(farnesyl)-蛋白质转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、长春花新碱、长春碱和甲氨蝶呤、或前述的任何类似物或衍生变体。
在一些实施例中，本文所描述的任何疫苗(例如Ad5[E1-、E2b-]-HER3)可与低剂量化疗或低剂量放射组合。举例来说，在一些实施例中本文所描述的任何疫苗(例如Ad5[E1-、E2b-]-HER3)可与化疗组合，使得所施用的化疗剂量低于临床护理标准。在一些实施例中，化疗可为环磷酰胺。环磷酰胺可以低于临床护理给药标准的剂量施用。举例来说，化疗可在每2周的第1-5天和第8-12天，以50mg，一日两次(BID)施用，总共8周。在一些实施例中，本文所描述的任何疫苗(例如Ad5[E1-、E2b-]-HER3)可与放射组合，使得所施用的放射剂量低于临床护理标准。举例来说，在一些实施例中，在8Gy下的并行立体定向身体放射(SBRT)，可在第8、22、36、50天给予(每2周，4次剂量)。可使用SBRT向所有可行的肿瘤位点施用放射。
导致DNA损伤并且已经被广泛使用的放射疗法包含通常被称为γ-射线、X射线的东西和/或放射性同位素到肿瘤细胞的定向递送。还预期其它形式的DNA破坏因素，例如微波和UV照射。最可能的是，这些因素全部对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持实现大范围的破坏。X射线的剂量范围在50到200伦琴日剂量持续长时间段(3到4周)到单次剂量2000到6000伦琴的范围。放射性同位素的剂量范围大幅变化，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型，以及赘生性细胞的摄入。
本文所用的术语“接触”和“暴露”在应用于细胞时，描述治疗性构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送到目标细胞或与目标细胞直接并列放置的过程。为了实现细胞杀伤或停滞，两种药剂以有效杀伤细胞或防止其***的组合量递送到细胞。
约60％患有癌症的人员将进行一些类型的手术，包括预防性、诊断或分期、治愈性和缓解性手术。治愈性手术是一种可以与其它疗法(如本文所描述的治疗、化疗、放疗、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用的癌症治疗。
治愈性手术包括用物理方式去除、切除和/或破坏全部或部分癌组织的切除术。肿瘤切除术指的是物理去除肿瘤的至少部分。除了肿瘤切除术之外，通过手术治疗包含激光手术、冷冻手术、电外科手术以及显微镜控制的手术(莫氏手术(Mohs'surgery))。进一步预期，本文所描述的治疗方法可以与去除表层癌症、初癌或附带量的正常组织结合使用。
在切除全部癌细胞、组织或肿瘤的部分时，可能在体内形成空腔。可以通过向区域灌注、直接注射或局部施用额外抗癌疗法来实现治疗。这类治疗可重复，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月。这些治疗也可具有变化的剂量。
替代性癌症疗法包含除手术、化疗和放射疗法以外的任何癌症疗法，如免疫疗法、基因疗法、激素疗法或其组合。使用本发明方法鉴定具有不良预后的个体，可能对于单独常规治疗不具有良好反应，且可开一种或更多种替代癌症疗法本身的处方或施用一种或更多种替代癌症疗法，或与一种或更多种常规治疗组合。
免疫治疗剂一般依赖于靶向和破坏癌细胞的免疫效应细胞和分子的使用。免疫效应子可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标记物具有特异性的抗体。单独的抗体可以用作疗法的效应子或其可以募集其它细胞以实际实现细胞杀伤。抗体还可以共轭到药物或毒素(化学治疗、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅用作靶向剂。或者，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，其直接或间接与肿瘤细胞目标相互作用。多种效应细胞包含细胞毒性T细胞和NK细胞。
基因疗法为将多核苷酸(包含DNA或RNA)***到个体的细胞和组织中来治疗疾病。反义疗法也为一种基因疗法形式。治疗性多核苷酸可在第一癌症疗法之前、之后或同时施用。在一些实施例中，提供编码各种蛋白质的载体的递送。举例来说，外源性肿瘤抑制因子致癌基因的细胞表达应发挥其抑制过高细胞增殖的功能，如p53、p16和C-CAM。
待用于改进治疗的治疗功效的额外试剂包含免疫调节剂、影响细胞表面受体和GAP接合的上调的试剂、细胞生长抑制和分化试剂、细胞粘附抑制剂或增加过度增殖细胞对于凋亡诱导剂的敏感性的试剂。免疫调节剂包含肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其它细胞因子；F42K和其它细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其它趋化因子。进一步预期，细胞表面受体或其配体(如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL)的上调，将通过对于过度增殖细胞建立自分泌或旁分泌效果而加强凋亡诱导能力。通过增加GAP接合的数量增加胞间信号传导，将提高对相邻过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其它实施例中，细胞生长抑制或分化试剂可与本文所描述的药物组合物结合使用，以改进治疗的抗过度增殖功效。涵盖细胞粘附的抑制剂，以改进本文所描述的药物组合物的功效。细胞粘附抑制剂的实例是局部粘附激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀(Lovastatin)。进一步预期，增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其它试剂(例如抗体c225)，可以与本文所描述的药物组合物组合使用，以改进治疗功效。
激素疗法还可与先前描述的任何其它癌症疗法组合使用。可在某些癌症(如乳腺癌、***癌、卵巢癌或***)的治疗中采用激素，以降低某些激素(如睾酮或***)的水平或阻断其效果。这种治疗通常与至少一种其它癌症疗法组合使用，作为一种治疗选择，或以降低癌转移风险。
如本文所用，“化疗剂”或“化学治疗化合物”和其语法等效物，可以是适用于癌症治疗的化合物。可与所公开的T细胞组合使用的癌症化学治疗试剂，包含(但不限于)有丝***抑制剂(长春花生物碱)。这些包含长春新碱、长春碱、长春地辛(vindesine)和NavelbineTM(长春瑞宾(vinorelbine)、5'-noranhydroblastine)。在又其它实施例中，癌症化学治疗试剂包含拓扑异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物。如本文所用，“喜树碱化合物”包含CamptosarTM(伊立替康(irinotecan)HCL)、HycamtinTM(拓朴替康HCL)和衍生于喜树碱和其类似物的其它化合物。可用于本文所公开的方法和组合物中的癌症化学治疗试剂的另一类别为鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)和米托鬼臼肼(mitopodozide)。
在某些方面，本文所描述的方法或组合物进一步涵盖称为烷基化剂的其它癌症化学治疗试剂的用途，其在肿瘤细胞中使基因材料烷基化。这些包含(但不限于)顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)、白消安、苯丁酸氮芥、贝鲁司汀(belustine)、尿嘧啶氮芥、氯苯匹嗪(chlomaphazin)和达卡巴嗪(dacarbazine)。本公开涵盖作为化疗剂的抗代谢物。这些试剂类型的实例包含胞嘧啶***糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。可在本文所公开的方法和组合物中使用的癌症化学治疗试剂的额外类别包含抗生素。实例包含(但不限于)阿霉素、博莱霉素、放线菌素、道诺红菌素、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在众多针对这些化合物的可商购的脂质体调配物。在某些方面，本文所描述的方法或组合物进一步涵盖其它癌症化学治疗试剂的用途，所述其它癌症化学治疗试剂包含(但不限于)抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶(amsacrine)、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌(mitoxantrone)。
本文所公开的腺病毒疫苗可与其它抗肿瘤试剂，包含细胞毒性/抗肿瘤剂和抗血管生成剂组合施用。细胞毒性/抗肿瘤试剂可定义为攻击和杀伤癌细胞的试剂。一些细胞毒性/抗肿瘤试剂可为烷基化剂，其使肿瘤细胞中的基因材料烷基化，例如顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、贝鲁司汀、尿嘧啶氮芥、氯苯匹嗪和达卡巴嗪。其它细胞毒性/抗肿瘤试剂可为肿瘤细胞的抗代谢物，例如胞嘧啶***糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、硫唑嘌呤和丙卡巴肼。其它细胞毒性/抗肿瘤试剂可为抗生素，例如阿霉素、博莱霉素、放线菌素、道诺红菌素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。存在众多针对这些化合物的可商购的脂质体调配物。又其它细胞毒性/抗肿瘤试剂可为有丝***抑制剂(长春花生物碱)。这些试剂包含长春新碱、长春碱和依托泊苷。其它细胞毒性/抗肿瘤试剂包含紫杉醇和其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
包括CAR T细胞、经T细胞受体工程改造的T细胞、经B细胞受体工程改造的群体的额外调配物，可在施用本文所描述的药物组合物同时、之前或之后向个体施用。当实践本文所描述的方法时，可向个体治疗有效群体的过继转移细胞。一般来说，施用包括约1×104到约1×1010个CAR T细胞、经T细胞受体工程改造的细胞或经B细胞受体工程改造的细胞的调配物。在一些情况下，调配物包括约1×105到约1×109个经工程改造的细胞、约5×105到约5×108个经工程改造的细胞或约1×106到约1×107个经工程改造的细胞。然而，取决于癌症的位置、起源、属性、范围和严重程度、所治疗个体的年龄和病状等，向个体施用的经工程改造的细胞的数量将在宽限制之间变化。医生最终将决定所使用的适当剂量。
还可使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物中的合适抗血管生成剂包含抗VEGF抗体，包含人类化和嵌合抗体、抗VEGF适体和反义寡核苷酸。血管生成的其它抑制剂包含血管生长抑素、内皮抑制素、干扰素、白介素1(包含α和β)、白介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和金属蛋白酶-2的组织抑制剂(TIMP-1和TIMP-2)。还可使用小分子，包含拓扑异构酶，如雷佐生(razoxane)，一种抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
在一些情况下，例如在治疗癌症的组合物、调配物和方法中，所施用的组合物和调配物的单位剂量可为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。在一些情况下，所施用的组合物和调配物的总量可为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100g。
XIII.免疫融合配偶体抗原靶标
本文所描述的病毒载体或组合物可进一步包括编码蛋白质或“免疫融合配偶体”的核酸序列，所述蛋白质或“免疫融合配偶体”可增加靶抗原(如PSA和/或PSMA)的免疫原性，或其中所述靶抗原为本文中所公开的任何靶抗原。在这点上，在用含有这种蛋白质的病毒载体免疫后产生的蛋白质，可以是融合蛋白，所述融合蛋白包括与增加所关注的靶抗原的免疫原性的蛋白质融合的所关注靶抗原。此外，用编码PSA和/或PSMA和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法可引起免疫反应增强，使得相较于编码单独PSA和/或PSMA或单独免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体，两个治疗性部分的组合用以协同增强免疫反应。举例来说，用编码PSA和/或PSMA和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法，可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞反应的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞反应的刺激、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制或其任何组合。这种协同增强可极大地提高在向有需要的个体施用之后的存活率结果。在某些实施例中，用编码PSA和/或PSMA和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法，可引起产生免疫反应，包括相较于施用对照的个体，施用腺病毒载体的个体中的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于施用对照的个体，施用编码PSA和/或PSMA抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的个体中的靶特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于对照，靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加约1.5到20倍或更多倍，如由ELISpot分析测量细胞因子分泌所测量，所述细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其它细胞因子。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于施用适当对照的个体，施用如本文所描述的编码PSA和/或PSMA抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的个体中的靶特异性抗体产生增加1.5到5倍之间。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于施用对照的个体，施用腺病毒载体的个体中的靶特异性抗体产生增加约1.5到20倍或更多倍。
作为额外实例，用编码靶标表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法，可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞反应的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞反应的刺激、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制或其任何组合。这种协同增强可极大地提高在向有需要的个体施用之后的存活率结果。在某些实施例中，用编码靶标表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法，可引起产生免疫反应，包括相较于施用对照的个体，施用腺病毒载体的个体中的靶抗原特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于施用对照的个体，施用编码靶标表位抗原和免疫融合配偶体的Ad5[E1-、E2b-]载体的个体中的靶特异性CTL活性增加约1.5到20倍或更多倍。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于对照，靶抗原特异性细胞介导的免疫活性增加约1.5到20倍或更多倍，如由ELISpot分析测量细胞因子分泌所测量，所述细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或其它细胞因子。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于施用适当对照的个体，施用如本文所描述的腺病毒载体的个体中的靶特异性抗体产生增加1.5到5倍之间。在另一实施例中，产生免疫反应包括相较于施用对照的个体，施用腺病毒载体的个体中的靶特异性抗体产生增加约1.5到20倍或更多倍。
在一个实施例中，这类免疫融合配偶体来源于分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)，如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的Ra12片段。来源于分枝杆菌属的免疫融合配偶体可以是SEQ ID NO:43-SEQ ID NO:51中所阐述的序列中的任一者。增强异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的Ra12组合物和其使用方法，描述于美国专利第7,009,042号中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。简单来说，Ra12是指为结核分枝杆菌MTB32A核酸的子序列的多核苷酸区。MTB32A为由毒性和无毒结核分枝杆菌菌株中的基因编码的32kDa丝氨酸蛋白酶。MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列已有描述(参见例如美国专利第7,009,042号；Skeiky等人,Infection and Immun.67:3998-4007(1999)，其以全文引用的方式并入本文中)。MTB32A编码序列的C端片段可以高水平表达，且在整个纯化过程中保持为可溶多肽。此外，Ra12可增强与其融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。Ra12融合多肽可包括对应于MTB32A的氨基酸残基192到323的14kDa C端片段。其它Ra12多核苷酸一般可包括编码Ra12多肽的一部分的至少约15、30、60、100、200、300或更多个核苷酸。Ra12多核苷酸可包括原生序列(即，编码Ra12多肽或其部分的内源性序列)或可包括这种序列的变体。Ra12多核苷酸变体可含有一个或更多个取代、添加、缺失和/或***，使得所编码融合多肽的生物活性相对于包括原生Ra12多肽的融合多肽不大体上减弱。变体与编码原生Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列可具有至少约70％、80％或90％同一性或更多。
在某些方面，免疫融合配偶体可来源于蛋白质D，一种革兰氏阴性细菌B型流感嗜血杆菌的表面蛋白。来源于蛋白质D的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO:52中所阐述的序列。在一些情况下，蛋白质D衍生物包括前三分之一的蛋白质(例如前N端100-110氨基酸)。蛋白质D衍生物可经脂化。在某些实施例内，脂蛋白D融合配偶体的前109个残基包含于N端上，提供具有额外外源性T细胞表位的多肽，其可增加在大肠杆菌中的表达水平，且可用作表达增强剂。脂质尾可确保将抗原最优呈递到抗原呈递细胞。其它融合配偶体可包含来自流感病毒的非-结构蛋白质NS1(血凝素)。通常，使用N端81个氨基酸，尽管可使用包含T-辅助表位的不同片段。
在某些方面，免疫融合配偶体可为称为LYTA的蛋白质或其部分(特定来说，C端部分)。衍生于LYTA的免疫融合配偶体可为SEQ ID NO:53中所阐述的序列。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，所述肺炎链球菌合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码)。LYTA为特异性降解肽聚糖主链中的某些键的自溶素。LYTA蛋白的C端结构域对于胆碱或对于一些胆碱类似物(如DEAE)具有亲和力。已采用这种特性来研发适用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。可采用在氨基端处含有C-LYTA片段的杂交蛋白质的纯化。在另一实施例内，可以将LYTA的重复部分并入到融合多肽中。重复部分可例如发现于在残基178开始的C端区中。一个特定重复部分并入残基188-305。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的群组的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。靶抗原融合物可产生与以下中的一种或更多种具有大体同一性的蛋白质：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。靶抗原融合可编码核酸，所述核酸编码与以下中的一种或更多种具有大体同一性的蛋白质：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。在一些实施例中，靶抗原融合物进一步包括一种或更多种免疫融合配偶体，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，其包括选自以下的群组的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。IFN-γ的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:54中所阐述的序列。TNFα的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:55中所阐述的序列。IL-2的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:56中所阐述的序列。IL-8的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:57中所阐述的序列。IL-12的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:58中所阐述的序列。IL-18的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:59中所阐述的序列。IL-7的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:60中所阐述的序列。IL-3的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:61中所阐述的序列。IL-4的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:62中所阐述的序列。IL-5的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:63中所阐述的序列。IL-6的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:64中所阐述的序列。IL-9的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:65中所阐述的序列。IL-10的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:66中所阐述的序列。IL-13的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:67中所阐述的序列。IL-15的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:68中所阐述的序列。IL-16的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:95中所阐述的序列。IL-17的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:96中所阐述的序列。IL-23的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:97中所阐述的序列。IL-32的序列可为(但不限于)SEQ ID NO:98中所阐述的序列。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的群组的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体一起在细胞中共表达，所述免疫融合配偶体在本文中也被称作“免疫原性组分”，包括选自以下的群组的细胞因子：IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、IL-36β、IL-36λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1和MIF。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体包括CpG ODN(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:69中)、霍乱毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:70中)、来源于细菌ADP核糖基化外毒素的截断的A亚基编码区(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:71中)、来源于细菌ADP核糖基化外毒素的截断的B亚基编码区(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:72中)、Hp91(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:73中)、CCL20(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:74中)、CCL3(非限制性实例序列显示于SEQ IDNO:75中)、GM-CSF(非限制性实例序列显示于SEQ IDNO:76中)、G-CSF(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:77中)、LPS肽模拟物(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:78-SEQ ID NO:89中)、志贺毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:90中)、白喉毒素(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:91中)或CRM197(非限制性实例序列显示于SEQ ID NO:94中)。
在一些实施例中，靶抗原与免疫融合配偶体融合或连接，所述免疫融合配偶体包括IL-15超激动剂。白介素15(IL-15)为在病毒感染之后分泌的天然存在的炎性细胞因子。分泌性IL-15可通过效应免疫细胞上的其同源受体信号传导来执行其功能，且因此可使得效应免疫细胞活性总体增强。
基于IL-15刺激和维持细胞免疫反应的广泛能力，认为其为可能治愈某些癌症的有前景的免疫治疗药物。然而，IL-15临床研发的主要限制可包含：在标准哺乳动物细胞表达***中的低生产产率和短血清半衰期。此外，包括由同一细胞共表达的蛋白质的IL-15:IL-15Rα复合物，而不是游离IL-15细胞因子，可负责刺激携带IL-15βγc受体的免疫效应细胞。
为了处理这些缺点，鉴定出已增大结合IL-15Rβγc的能力和生物活性增强的一种新颖IL-15超激动剂突变(IL-15N72D)。向等摩尔浓度的IL-15N72D中添加小鼠或人类IL-15Rα与Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)，可提供IL-15生物活性进一步增加，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物呈现对于支持IL-15依赖型细胞生长的中值有效浓度(EC50)比游离IL-15细胞因子的中值有效浓度低10倍以上。
在一些实施例中，IL-15超激动剂可以是新颖IL-15超激动剂突变(IL-15N72D)。在某些实施例中，向等摩尔浓度的IL-15N72D中添加小鼠或人类IL-15Rα与Fc融合蛋白(免疫球蛋白的Fc区)，可提供IL-15生物活性进一步增加，使得IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物呈现对于支持IL-15依赖型细胞生长的中值有效浓度(EC50)可比游离IL-15细胞因子的中值有效浓度低10倍以上。
因此，在一些实施例中，本公开提供一种IL-15N72D:IL-15Rα/Fc超激动剂复合物，其中对于支持IL-15依赖型细胞生长的EC50比游离IL-15细胞因子的EC50低2倍以上、低3倍以上、低4倍以上、低5倍以上、低6倍以上、低7倍以上、低8倍以上、低9倍以上、低10倍以上、低15倍以上、低20倍以上、低25倍以上、低30倍以上、低35倍以上、低40倍以上、低45倍以上、低50倍以上、低55倍以上、低60倍以上、低65倍以上、低70倍以上、低75倍以上、低80倍以上、低85倍以上、低90倍以上、低95倍以上或低100倍以上。
在一些实施例中，IL-15超激动剂为两个IL-15N72D分子与可溶IL-15Rα/Fc融合蛋白的二聚体的生物活性蛋白质复合物，也称为ALT-803。ALT-803的组成和制造与使用ALT-803的方法，描述于美国专利申请公开案2015/0374790中，所述文献以引用的方式并入本文中。众所周知，在N端含有所谓的“sushi”结构域(Su)的可溶IL-15Rα片段，可携带负责高亲和力细胞因子结合的结构元件的大部分。可溶融合蛋白可通过将人类IL-15RαSu结构域(人类IL-15Rα成熟蛋白质的氨基酸1-65)与含有Fc域(232个氨基酸)的人类IgG1CH2-CH3区连接来产生。这种IL-15RαSu/IgG1 Fc融合蛋白可具有以下优势：通过IgG1结构域二硫键结形成二聚体；和易于使用标准蛋白A亲和力色谱法来纯化。
在一些实施例中，ALT-803可具有可溶复合物，所述可溶复合物由与同二聚体IL-15Rαsushi结构域/人类IgG1 Fc融合蛋白具有高亲和力相关联的人类IL-15变体的2个蛋白质亚基组成。IL-15变体为114个氨基酸多肽，其包括在螺旋C的位置72处具有Asn取代为Asp(N72D)的成熟人类IL-15细胞因子序列。人类IL-15R sushi结构域/人类IgG1 Fc融合蛋白包括IL-15R亚基的sushi结构域(人类IL-15Rα成熟蛋白的氨基酸1-65)，所述sushi结构域与含有Fc域(232个氨基酸)的人类IgG1CH2-CH3区连接。除N72D取代以外，所有蛋白质序列为人类的。基于亚基的氨基酸序列，包括两条IL-15N72D多肽(实例IL-15N72D序列显示于SEQ ID NO:92中)和二硫健连接的同源二聚体IL-l5RαSu/IgG1 Fc蛋白(实例IL-15RαSu/Fc域显示于SEQ ID NO:93中)的复合物的计算分子量为92.4kDa。在一些实施例中，编码靶抗原和ALT-803的重组载体可具有本文所描述的任何序列来编码靶抗原，且可按任何次序具有SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:93来编码ALT-803。
各IL-15N720多肽具有大致12.8kDa的计算分子量，且IL-15RαSu/IgG 1 Fc融合蛋白具有大致33.4kDa的计算分子量。IL-15N72D和IL-15RαSu/IgG 1 Fc蛋白质均可经糖基化，由尺寸排阻色谱法，得到ALT-803的表观分子量为大致114kDa。对于ALT-803所测定的等电点(pI)可以在大致5.6到6.5范围内。因此，融合蛋白在pH 7下可带负电。
用编码PSA和/或PSMA和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法，可引起免疫反应增强，使得相较于任一单独疗法，两个治疗部分的组合协同作用以增强免疫反应。举例来说，用编码PSA和/或PSMA抗原和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法，可引起以下的协同增强：抗原特异性效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的刺激、针对杀伤受感染细胞的NK细胞反应的刺激、通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)针对杀伤受感染细胞的嗜中性粒细胞或单核细胞反应的刺激、或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)机制。用编码PSA和/或PSMA抗原和ALT-803的Ad5[E1-、E2b-]载体的组合疗法，可协同增强以上反应中的任一者或以上反应的组合，极大地提高在向有需要的个体施用之后的存活率结果。
通过在同一重组载体中表达免疫原性增强药剂和靶抗原，使用本文所描述的任何重组载体，本文所描述的免疫原性增强药剂中的任一种可与靶抗原融合或连接。
编码这类免疫原性增强药剂的核酸序列可为SEQ ID NO:43-SEQ ID NO:98中的任一者，且概述于表1中。
表1：免疫原性增强试剂的序列
在一些实施例中，靶抗原和免疫融合配偶体的核酸序列未由任何核酸分隔开。在其它实施例中，可将编码连接子的核酸序列，***在编码本文所描述的任何靶抗原的核酸序列与编码本文所描述的任何免疫融合配偶体的核酸序列之间。因此，在某些实施例中，在用含有靶抗原、连接子和免疫融合配偶体的病毒载体免疫之后产生的蛋白质，可以是融合蛋白，所述融合蛋白包括所关注的靶抗原，随后连接子和最后的免疫融合配偶体，因此通过连接子将靶抗原与增加所关注的靶抗原的免疫原性的免疫融合配偶体连接。在一些实施例中，连接子核酸的序列的长度可从约1到约150个核酸长、约5到约100个核酸长或约10到约50个核酸。在一些实施例中，核酸序列可编码一个或更多个氨基酸残基。在一些实施例中，连接子的氨基酸序列的长度可为约1到约50或约5到约25个氨基酸残基。在一些实施例中，连接子的序列包括小于10个氨基酸。在一些实施例中，连接子可以是聚丙氨酸连接子、聚甘氨酸连接子或具有丙氨酸和甘氨酸两者的连接子。
编码这类连接子的核酸序列可为SEQ ID NO:99-SEQ ID NO:113中的任一者，且概述于表2中。
表2：连接子的序列
XIV.共刺激分子
除使用含有靶抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的重组腺病毒类载体疫苗以外，可将共刺激分子并入到所述疫苗中，以增加免疫原性。免疫反应的起始需要至少两个信号来由APC活化初始T细胞(Damle等人J Immunol 148:1985-92(1992)；Guinan等人Blood 84:3261-82(1994)；Hellstrom等人Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44(1996)；Hodge等人Cancer Res 39:5800-07(1999))。抗原特异性第一信号通过肽/主要组织相容性复合物(MHC)被递送穿过T细胞受体(TCR)，且使得T细胞进入细胞周期。可递送第二或共刺激信号，以用于细胞因子产生和增殖。
已报告通常在专职抗原呈递细胞(APC)表面上发现的至少三种不同分子能够提供对T细胞活化重要的第二信号：B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)和LFA-3(人类CD58)(Damle等人JImmunol 148:1985-92(1992)；Guinan等人Blood 84:3261-82(1994)；Wingren等人CritRev Immunol 15:235-53(1995)；Parra等人Scand.J Immunol 38:508-14(1993)；Hellstrom等人Ann NY Acad Sci 690:225-30(1993)；Parra等人J Immunol 158:637-42(1997)；Sperling等人J Immunol 157:3909-17(1996)；Dubey等人J Immunol 155:45-57(1995)；Cavallo等人Eur J Immunol 25:1154-62(1995))。
这些共刺激分子具有不同的T细胞配体。B7-1与CD28和CTLA-4分子相互作用，ICAM-1与CD11a/CD18(LFA-1β2整合素)复合物相互作用，且LFA-3与CD2(LFA-2)分子相互作用。因此，在一优选实施例中，期望的是，具有分别含有B7-1、ICAM-1和LFA-3的重组腺病毒载体，当与含有编码靶抗原(如PSA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的一种或更多种核酸的重组腺病毒类载体疫苗组合时，将进一步增加/增强针对于特定靶抗原的抗肿瘤免疫反应。
XV.免疫路径检查点调节剂
在某些实施例中，免疫路径检查点抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)与包括本文中所公开的腺病毒载体的组合物组合。在某些实施例中，患者结合本文所描述的疫苗或药物组合物接受免疫路径检查点抑制剂。在其它实施例中，与一种或更多种免疫路径检查点调节剂一起施用组合物。活化与抑制信号之间的平衡，调节T淋巴细胞与疾病细胞之间的相互作用，其中T细胞反应通过被T细胞受体(TCR)抗原识别来起始。抑制性路径和信号被称作免疫路径检查点。在正常情况下，免疫路径检查点在控制和预防自身免疫性中起关键作用，以及回应于病原性感染保护免于组织损伤。
某些实施例提供组合免疫疗法，其包括病毒载体类疫苗和组合物，其用于调节免疫路径检查点抑制路径以预防和/或治疗癌症和传染性疾病。在一些实施例中，调节是增加基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施例中，调节是降低基因或蛋白质的表达或活性。在一些实施例中，调节影响基因或蛋白质家族。
一般来说，免疫抑制路径通过配体-受体相互作用来起始。现在清楚，在疾病中，疾病可共选择免疫检查点路径作为诱导个体中的免疫耐受性的机制。
在个体中由既定疾病诱导的免疫耐受性或免疫抑制路径，可通过已知调节免疫抑制路径中的一个或更多个的分子组合物来阻断，所述分子组合物如siRNA、反义物、小分子、模拟物、配体的重组形式、受体或蛋白质、或抗体(其可为Ig融合蛋白)。举例来说，用免疫检查点蛋白，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1)的阻断剂的初始临床研究结果，已显示增强抗肿瘤免疫的前景。
因为病变细胞可表达多种抑制性配体，且疾病浸润淋巴细胞表达多种抑制性受体，所以免疫路径检查点蛋白的双重或三重阻断可增强抗疾病免疫。如本文所提供的组合免疫疗法可包括靶向以下免疫检查点蛋白中的一个或更多个的免疫路径检查点调节剂的一种或更多种分子组合物：PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3(也称为CD276)、B7-H4(也称为B7-S1、B7x和VCTN1)、BTLA(也称为CD272)、HVEM、KIR、TCR、LAG3(也称为CD223)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3(也称为HAVcr2)、GAL9、A2aR和腺苷。
在一些实施例中，分子组合物包括siRNA。在一些实施例中，分子组合物包括小分子。在一些实施例中，分子组合物包括配体的重组形式。在一些实施例中，分子组合物包括受体的重组形式。在一些实施例中，分子组合物包括抗体。在一些实施例中，组合疗法包括多于一种分子组合物和/或多于一种类型的分子组合物。如所属领域的技术人员应了解，本公开设想也应涵盖将来发现的免疫检查点抑制路径的蛋白质。
在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节CTLA4的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节PD1的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节PDL1的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节LAG3的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节B7-H3的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节B7-H4的分子组合物。在一些实施例中，组合免疫疗法包括用于调节TIM3的分子组合物。在一些实施例中，调节为增加或增强表达。在其它实施例中，调节为表达降低或不存在。
两种非限制性例示性免疫路径检查点抑制剂包含细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白质-1(PD1)。CTLA-4可仅仅在T细胞上表达，其中其调节T细胞活化的早期阶段。CTLA-4与共刺激T细胞受体CD28相互作用，这可引起抑制T细胞活性的信号传导。一旦发生TCR抗原识别，那么CD28信号传导可增强TCR信号传导，在一些情况下引起活化T细胞和CTLA-4抑制CD28的信号传导活性。本公开提供如本文所提供的免疫疗法，其与抗CTLA-4单克隆抗体组合，以用于预防和/或治疗癌症和传染性疾病。本公开提供如本文所提供的疫苗或免疫疗法，其与CTLA-4分子组合物组合，以用于预防和/或治疗癌症和传染性疾病。
程序性死亡细胞蛋白质配体-1(PDL1)为B7家族的成员，且分布于各种组织和细胞类型中。PDL1可与抑制T细胞活化和CTL介导的裂解的PD1相互作用。PDL1的显著表达已在各种人类肿瘤上证实，且PDL1表达为肿瘤避开宿主抗肿瘤免疫反应的一种关键机制。程序性死亡配体1(PDL1)和程序性细胞死亡蛋白质-1(PD1)作为免疫路径检查点相互作用。这种相互作用可能是造成抗肿瘤免疫反应钝化且随后肿瘤进展的主要耐受性机制。PD1存在于活化T细胞上，且PDL1(PD1的初级配体)通常在肿瘤细胞和抗原呈递细胞(APC)以及其它细胞(包含B细胞)上表达。PDL1的显著表达已在多种人类肿瘤上证实，所述肿瘤包含HPV相关头颈癌。PDL1与T细胞上的PD1相互作用，从而抑制T细胞活化和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的裂解。本公开提供如本文所提供的免疫疗法，其与抗PD1或抗PDL1单克隆抗体组合，以用于预防和/或治疗癌症和传染性疾病。
某些实施例可提供如本文所提供的免疫疗法，其与PD1或抗PDL1分子组合物组合，以用于预防和/或治疗癌症和传染性疾病。某些实施例可提供如本文所提供的免疫疗法，其与抗CTLA-4和抗PD1单克隆抗体组合，以用于预防和/或治疗癌症和传染性疾病。某些实施例可提供如本文所提供的免疫疗法，其与抗CTLA-4和PDL1单克隆抗体组合。某些实施例可提供如本文所提供的疫苗或免疫疗法，其与抗CTLA-4、抗PD1、抗PDL1单克隆抗体或其组合组合，以用于治疗癌症和传染性疾病。
免疫路径检查点分子可由T细胞表达。免疫路径检查点分子可有效地用作下调或抑制免疫反应的“制动器”。免疫路径检查点分子包含(但不限于)：程序性死亡1(PD1或PD-1，也称为PDCD1或CD279，登录号：NM_005018)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，基因库登录号AF414120.1)、LAG3(也称为CD223，登录号：NM_002286.5)、Tim3(也称为肝炎A病毒细胞受体2(HAVCR2)，基因库登录号：JX049979.1)、B和T淋巴细胞相关(BTLA)(也称为CD272，登录号：NM_181780.3)、BY55(也称为CD160，基因库登录号：CR541888.1)、TIGIT(也称为IVSTM3，登录号：NM_173799)、LAIR1(也称为CD305，基因库登录号：CR542051.1)、SIGLECIO(基因库登录号：AY358337.1)、自然杀伤细胞受体2B4(也称为CD244，登录号：NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIFl、ILIORA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3，其直接抑制免疫细胞。举例来说，PD1可与腺病毒载体类组合物组合，以治疗有需要的患者。
可靶向的额外免疫路径检查点可为腺苷A2a受体(ADORA)、CD276、含有T细胞活化抑制剂1的V集结构域(VTCN1)、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体三个结构域长细胞质尾区1(KIR3DL1)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)、含细胞因子诱导性SH2的蛋白质(CISH)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT)、腺相关病毒整合位点1(AAVS1)或趋化因子(C-C基序)受体5(基因/假基因)(CCR5)或其任何组合。
在非穷尽性的情况下，表3显示可经失活以提高如本文所描述的腺病毒载体类组合物的效率的例示性免疫路径检查点基因。免疫路径检查点基因可选自：表3中列出的这类基因；和涉及以下的其它基因：共抑制性受体功能、细胞死亡、细胞因子信号传导、精氨酸色氨酸不足、TCR信号传导、诱导性T-reg抑制、控制耗尽或失能的转录因子和缺氧介导的耐受性。
表3-例示性免疫路径检查点基因
相较于任一单独试剂，腺病毒类组合物与免疫路径检查点调节剂的组合，可引起所治疗患者的疾病的感染、进展或症状减少。在另一实施例中，相较于任一单独试剂，腺病毒类组合物和免疫路径检查点调节剂的组合，可引起所治疗患者的总存活率提高。在一些情况下，相较于任一单独试剂，腺病毒类组合物与免疫路径检查点调节剂的组合，可增加所治疗患者中的疾病特异性T细胞反应的频率或强度。
某些实施例也可提供免疫路径检查点抑制的用途，其用于改进腺病毒载体类组合物的性能。某些免疫路径检查点抑制剂可在腺病毒载体类组合物同时施用。某些免疫路径检查点抑制剂也可在施用腺病毒载体类组合物之后施用。可在腺病毒疫苗施用同时发生免疫路径检查点抑制。可在疫苗接种之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或60分钟发生免疫路径检查点抑制。免疫路径检查点抑制也可在施用腺病毒载体类组合物之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时发生。在一些情况下，可在疫苗接种之后1、2、3、4、5、6或7天发生免疫抑制。免疫路径检查点抑制可在施用腺病毒载体类组合物之前或之后的任何时间发生。
在另一方面，提供方法，其涉及包括编码抗原和免疫路径检查点调节剂的一种或更多种核酸的疫苗。举例来说，提供一种用于治疗个体的方法，所述个体患有将从免疫路径检查点蛋白质(例如PD1或PDL1)和个体细胞上的其天然结合配偶体的下调获益的病状。
免疫路径检查点调节剂可与包括编码任何抗原的一种或更多种核酸的腺病毒载体类组合物组合。举例来说，抗原可以是肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合；或本文所描述的任何抗原。
当与腺病毒载体类组合物(如疫苗)组合时，免疫路径检查点调节剂可产生协同效应。当与腺病毒载体类组合物组合时，免疫路径检查点调节剂也可产生有益效果。
XVI.癌症
特异性地设想，包括本文所描述的腺病毒载体的组合物可用于评价或治疗各阶段的疾病，如在增生、发育异常、瘤形成、初癌和癌症之间，或在原发性肿瘤或转移肿瘤之间。
如本文所用，术语“赘生性细胞”和“瘤形成”可互换使用，且是指呈现相对自发生长，以使得其呈现特征为细胞增殖显著失控的异常生长表型的细胞。赘生性细胞可为恶性或良性的。在特定方面，瘤形成包含发育异常和癌症两个。赘瘤可为良性的、癌前(原位癌或发育异常)或恶性的(癌症)。赘生性细胞可形成或不形成结块(即，肿瘤)。
术语“发育异常”可在细胞异常限于发源组织时使用，如在早期原位肿瘤的情况下。发育异常可指示早期赘生性过程。术语“癌症”可指代恶性肿瘤，包含一大组涉及失控细胞生长的不同疾病。
癌转移或转移性疾病，可指代癌症从一个器官或部位扩散到另一非相邻器官或部位。因此产生的疾病新出现可被称作癌转移。
可通过所公开的方法和组合物评价或治疗的癌症包含尤其来自胰腺(包含胰腺导管腺癌(PDAC))的癌细胞，但还可包含来自以下的细胞和癌细胞：膀胱、血液、骨骼、骨髓、大脑、***、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头部、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、***、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。另外，癌症可具体地具有以下组织学类型，但不限于这些：恶性赘瘤；癌瘤；未分化癌瘤；巨细胞和梭细胞癌；小细胞癌；***状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；***状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；家族性结肠息肉腺癌；实体癌瘤；恶性类癌瘤；腮裂肺泡腺癌；***状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性癌瘤；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌瘤；卵泡腺癌；***状和卵泡腺癌；非包膜硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌瘤；皮肤附件癌；顶泌腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；***状囊腺癌；***状浆液囊腺癌；粘液囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性管癌；髓性癌；小叶癌；发炎性癌瘤；***佩吉特氏病(paget's disease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；鳞状化生伴随腺癌(adenocarcinoma w/squamous metaplasia)；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性卵泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性睾丸母细胞瘤；塞特利氏(sertoli)细胞癌瘤；恶性莱迪希(leydig)细胞肿瘤；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性***外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；筋膜纤维肉瘤；恶性黑素瘤；无色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；呈巨大色素痣的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝斑；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合肿瘤；苗勒(mullerian)混合肿瘤；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳氏瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒膜癌；恶性中肾瘤；血管内皮瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西(kaposi's)肉瘤；恶性血管外皮瘤；***肉瘤；骨肉瘤；密质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶细胞软骨肉瘤；骨骼巨细胞瘤；尤文氏(ewing's)瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞性牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞性纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；肌原纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；神经胶母细胞瘤；寡树突神经胶质瘤；成少突神经胶质瘤；原始神经外胚层肿瘤；小脑肉瘤；节细胞性神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；成视网膜细胞瘤；鼻神经性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏(Hodgkin's)病；霍奇金氏淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；大细胞弥散性恶性淋巴瘤；恶性卵泡淋巴瘤；蕈样真菌病；其它指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓白血病；嗜碱性白血病；嗜曙红白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓系肉瘤；以及毛细胞白血病。
XVII.治疗方法
本文所描述的腺病毒载体，可用于多种疫苗情况中，所述疫苗用于针对如本文所描述的一种或更多种靶抗原产生免疫反应。在一些实施例中，提供针对任何靶抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合产生免疫反应的方法。
腺病毒载体尤其重要，这是因为以下出人意料的发现：其可用于在对于Ad具有预存免疫的个体中产生免疫反应，且可用于包含使用腺病毒载体进行多轮免疫的疫苗接种方案中，而使用先前代的腺病毒载体的方案是不可能的。
一般来说，产生免疫反应包括诱导体液反应和/或细胞介导的反应。可能需要增加针对所关注的靶抗原的免疫反应。
产生免疫反应可涉及：免疫***的某些细胞的活性和/或数量降低；或某些细胞因子或其它效应分子的水平和/或活性降低。用于检测免疫反应(例如细胞数量、细胞因子表达、细胞活性)的变化的各种方法为可获得的，且适用于一些方面中。适用于这种情况的说明性方法包含胞内细胞因子染色(ICS)、ELISpot、增殖分析、细胞毒性T细胞分析(包含铬释放或等效分析)和使用任何数量的聚合酶链式反应(PCR)的基因表达分析或基于RT-PCR的分析。
产生免疫反应可包括：相较于对照，施用如本文所描述的腺病毒载体的个体中的靶抗原特异性CTL活性增加1.5到5倍。在另一实施例中，产生免疫反应包括：相较于对照，施用腺病毒载体的个体中的靶特异性CTL活性增加约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、16、17、18、19、20或更多倍。
产生免疫反应可包括：相较于适当对照，施用如本文所描述的腺病毒载体(其包括编码靶抗原的核酸)的个体中的靶抗原特异性HTL活性(如辅助性T细胞的增殖)增加1.5到5倍。在另一实施例中，产生免疫反应包括：相较于对照，靶特异性HTL活性增加约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、16、17、18、19、20或更多倍。在此环境中，HTL活性可包括特定细胞因子的产量增加(如上文所描述)或降低，所述细胞因子如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其它细胞因子。在这点上，产生免疫反应可包括从Th2类型反应变为Th1类型反应，或在某些实施例中，从Th1类型反应变为Th2类型反应。在其它实施例中，产生免疫反应可包括刺激主要Th1或Th2类型反应。
产生免疫反应可包括：相较于适当对照，施用如本文所描述的腺病毒载体的个体中的靶特异性抗体产量增加1.5到5倍之间。在另一实施例中，产生免疫反应包括：相较于对照，施用腺病毒载体的个体中的靶特异性抗体产量增加约2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、16、17、18、19、20或更多倍。
因此，在某些实施例中，提供用于针对所关注的靶抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合产生免疫反应的方法，所述方法包括向个体施用腺病毒载体，所述腺病毒载体包括：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体具有E2b区中的缺失，和b)核酸，其编码靶抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合；以及向个体再施用腺病毒载体至少一次；从而产生针对靶抗原的免疫反应。在某些实施例中，提供方法，其中所施用载体不是空壳载体。在特定实施例中，靶抗原可以是野生型蛋白质、其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，靶抗原包括肿瘤抗原，如PSA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合；其片段、变体或变体片段。
在另一实施例中，提供用于通过向个体施用腺病毒载体，而在所述个体中针对靶抗原产生免疫反应的方法，其中所述个体对于Ad具有预存免疫，所述腺病毒载体包括：a)复制缺陷型腺病毒载体，其中腺病毒载体具有E2b区中的缺失，和b)核酸，其编码靶抗原；以及向个体再施用腺病毒载体至少一次；从而产生针对靶抗原的免疫反应。在特定实施例中，靶抗原可以是野生型蛋白质、其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，靶抗原包括如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合，其片段、变体或变体片段。
关于对于Ad的预存免疫，这可使用所属领域中已知的方法来测定，所述方法如对Ad抗体的存在进行测试的基于抗体的分析。此外，在某些实施例中，如本文所描述的方法包含首先确定个体对于Ad具有预存免疫，随后施用如本文所描述的E2b缺失的腺病毒载体。
一个实施例提供一种在个体中针对一种或更多种靶抗原产生免疫反应的方法，所述方法包括：向个体施用包括复制缺陷型腺病毒载体的第一腺病毒载体，其中腺病毒载体具有E2b区中的缺失和编码至少一种靶抗原的核酸；向个体施用包括复制缺陷型腺病毒载体的第二腺病毒载体，其中腺病毒载体具有E2b区中的缺失和编码至少一种靶抗原的核酸，其中第二腺病毒载体的所述至少一种靶抗原与第一腺病毒载体的所述至少一种靶抗原相同或不同。在特定实施例中，靶抗原可以是野生型蛋白质、其片段、变体或变体片段。在一些实施例中，靶抗原包括肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合；其片段、变体或变体片段。
因此，某些实施例涵盖用相同E2b缺失的腺病毒载体的多次免疫或用不同E2b缺失的腺病毒载体的多次免疫。在每一种情况下，腺病毒载体可包括编码如本文其它地方所描述的一种或更多种靶抗原的核酸序列。在某些实施例中，方法包括用编码一种靶抗原的E2b缺失的腺病毒的多次免疫，和再施用相同腺病毒载体多次，从而诱导针对靶抗原的免疫反应。在一些实施例中，靶抗原包括肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合；其片段、变体或变体片段。
在另一实施例中，方法包括用编码一种或更多种靶抗原的第一腺病毒载体免疫，且随后施用编码可与由第一腺病毒载体编码的那些抗原相同或不同的一种或更多种靶抗原的第二腺病毒载体。在这点上，所编码靶抗原中的一个可为不同的，或所有所编码的抗原可为不同的，或一些可相同且一些可不同。此外，在某些实施例中，方法包含施用第一腺病毒载体多次和施用第二腺病毒多次。在这点上，方法包括施用第一腺病毒载体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次，和施用第二腺病毒载体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次。施用次序可包括连续施用第一腺病毒一次或多次，随后连续施用第二腺病毒载体一次或多次。在某些实施例中，方法包含交替施用第一和第二腺病毒载体，如每次施用一个、每次施用两个、每次施用三个等。在某些实施例中，第一和第二腺病毒载体同时施用。在其它实施例中，第一和第二腺病毒载体依序施用。在一些实施例中，靶抗原包括肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合；其片段、变体或变体片段。
如所属领域的技术人员将容易地理解，在如本文所描述的方法中，可使用超过两种腺病毒载体。在如本文所描述的方法中，可使用3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同腺病毒载体。在某些实施例中，方法包括在某一时间施用超过一种E2b缺失的腺病毒载体。在这点上，可通过同时施用多种不同腺病毒载体，来产生针对所关注的多种靶抗原的免疫反应，所述腺病毒载体各自包含编码一种或更多种靶抗原的核酸序列。
腺病毒载体可用于产生针对癌症的免疫反应，所述癌症如癌瘤或肉瘤(例如实体肿瘤、淋巴瘤和白血病)。腺病毒载体可用于产生针对癌症的免疫反应，所述癌症如：神经癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏疾病、白血病、浆细胞瘤、腺瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、***癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰脏癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、***、睾丸癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝细胞瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或其它癌症。
还提供用于治疗或改善如本文所描述的传染性疾病或癌症中的任一种的症状的方法。治疗方法包括向罹患如本文所描述的传染性疾病或癌症、或处于罹患所述传染性疾病或癌症的风险下的个体，施用腺病毒载体一次或多次。因此，某些实施例提供用于在处于发展传染性疾病或癌症的风险下个体中，针对这种疾病进行接种的方法。处于风险下的个体可为有时可能暴露于传染剂或先前已暴露但尚未具有感染症状的个体，或具有发展癌症或尤其对传染剂敏感的遗传倾向性的个体。可确定罹患本文所描述的传染性疾病或癌症的个体表达和/或存在靶抗原，这可用于指导本文中的疗法。举例来说，可找到表达和/或存在靶抗原实例，随后可施用编码靶抗原、其变体、片段或变体片段的腺病毒载体。
某些实施例涵盖腺病毒载体的用途，其用于活体内递送编码靶抗原或其片段、变体或变体片段的核酸。一旦注射到个体中，表达核酸序列，产生针对由所述序列编码的抗原的免疫反应。可以“有效量”施用腺病毒载体疫苗，所述有效量即以所选择的途径或施用途径，有效引起如本文其它地方所描述的免疫反应的腺病毒载体的量。有效量可诱导对促进保护或治疗宿主的目标传染剂或癌症有效的免疫反应。选择每一疫苗剂量中载体的量为，诱导免疫、免疫保护性或其它免疫治疗性反应而无一般与典型疫苗相关联的显著不良效果的量。一旦疫苗接种，可监测个体以测定疫苗治疗的功效。可以通过所属领域的一般技术人员已知的任何方法，来监测疫苗接种的功效。在一些实施例中，可分析血液或流体样本，以检测抗体水平。在其它实施例中，可以进行ELISpot分析，以从循环血细胞或从淋巴组织细胞检测细胞介导的免疫反应。
在某些实施例中，可在52周时段内，施用1到10次的剂量。在某些实施例中，以以下间隔施用6次剂量：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22、23或24个月，或从其可得出的任何范围或值；且此后，可以以下间隔定期给予另外增强疫苗接种：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22、23或24个月，或从其可得出的任何范围或值。替代方案可能适合于个别患者。因此，可在1年时段内或在较短或较长时段内，如在35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100周时段内，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次剂量。可以1、2、3、4、5或6周间隔或较长间隔，施用剂量。
可在小于约4小时的时段内，且更优选在小于约3小时时段内，输注疫苗。举例来说，可在30分钟内，优选地甚至15min，输注第一25-50mg，且在接下来2-3小时内输注其余部分。更一般来说，可以每2或3周一次剂量，施用所施用疫苗构建体的剂量，重复总共至少3次剂量。或者，可每周施用构建体两次，持续4-6周。给药时间表可任选地以其它间隔重复，且可通过各种肠胃外途径来给予剂量，其中剂量和时间表进行适当调整。可结合任何数量的相关治疗模式(例如之前、同时或之后)，向患者施用如本文所描述的组合物。
合适的剂量为当如上文所描述施用时，腺病毒载体能够如本文其它地方所描述促进靶抗原免疫反应的量。在某些实施例中，免疫反应高于基础(即，未处理的)水平至少10-50％。在某些实施例中，免疫反应高于基础水平至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、125、150、200、250、300、400、500或更多。这类反应可通过以下来监测：测量患者中靶抗原的抗体，或能够活体外杀伤患者肿瘤或受感染细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖性产生，或监测免疫反应领域中已知的其它方法。相较于未被接种疫苗的患者，这类疫苗还应能够在疫苗接种患者中引起免疫反应，所述免疫反应引起所讨论的疾病的改进的临床结果。在一些实施例中，改进的临床结果包括治疗疾病、减少疾病症状、改变疾病的进展或延长生命。
可向个体施用本文所提供的组合物中的任一种。“个体(Individual)”可与“对象(subject)或“患者(patient)”互换使用。个体可以是哺乳动物，例如人类或动物，如非人类灵长类、啮齿动物、兔、大鼠、小鼠、马、驴、山羊、猫、狗、牛、猪或绵羊。在实施例中，个体为人类。在实施例中，个体为胎儿、胚胎或儿童。在一些情况下，离体向细胞施用本文所提供的组合物。在一些情况下，作为治疗疾病或病症的方法，向个体施用本文所提供的组合物。在一些实施例中，个体具有遗传病。在一些情况下，个体处于患病风险下，所述疾病如本文所描述的疾病中的任一种。在一些实施例中，个体为处于增加的患疾病或病症风险下，所述疾病或病症由不充足量的蛋白质或不充足的蛋白质活性引起。如果个体“处于增加的”患疾病或病症“风险下”，那么方法涉及预防性或防治性治疗。举例来说，个体可能因为家族疾病病史而处于增加的患这种疾病或病症风险下。通常，处于增加的患这种疾病或病症风险下的个体从防治性治疗获益(例如通过预防或延迟疾病或病症的发作或进展)。
在一些情况下，个体未患疾病。在一些情况下，在疾病发作之前，施用如本文所描述的治疗。个体可患有未检测到的疾病。个体可具有低疾病负荷。个体也可具有高疾病负荷。在某些情况下，可根据定级量表，向个体施用如本文所描述的治疗。定级量表可以是Gleason分级。Gleason分级反映肿瘤组织与正常***组织如何不同。其使用1到5级。基于癌细胞的模式和生长，医生对某一癌症给出一数值。数值越低，癌细胞看起来越正常且等级越低。数值越高，癌细胞看起来越不正常且等级越高。在某些情况下，可向具有低Gleason评分的患者施用治疗。优选地，可向Gleason评分为3或更低的患者，施用如本文所描述的治疗。
各种实施例涉及用于在所选择患者群体中提高针对一种或更多种特定靶抗原的免疫反应的组合物和方法，所述靶抗原如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合。因此，如本文所描述的方法和组合物可靶向患有癌症的患者，所述癌症包含(但不限于)***癌、癌瘤或肉瘤，如神经癌、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金氏疾病、白血病、浆细胞瘤、腺瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、子宫癌、胰脏癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、***、睾丸癌、胃癌、多发性骨髓瘤、肝细胞瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，或疗法可靶向其它癌症。
在一些情况下，所靶向的患者群体可限于患有以下疾病的个体：结肠直肠腺癌；转移性结肠直肠癌；晚期表达PSA、PSMA、MUC1、MUC1c、MUC1n、T或CEA的癌症；***癌；结肠直肠癌；头颈癌；肝癌；乳腺癌；肺癌；膀胱癌或胰脏癌。可使用组织学上确认的所选择癌症(例如结肠直肠腺癌)的诊断。可选择特定疾病阶段或进展，例如，对于用如本文所描述的方法和组合物的疗法，可选择患有转移性、复发性、阶段III或阶段IV癌症中的一个或更多个的患者。在一些实施例中，患者可能需要已接受和任选地进行其它疗法，包含(但不限于)含有氟嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗的疗法。在一些情况下，个体拒绝接受这类疗法，可以允许患者包含于用如本文所描述的方法和组合物的疗法资格库(therapy eligible pool)中。在一些实施例中，接受使用如本文所描述的方法和组合物的个体，可能需要具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、18、21或24个月的估计寿命预期。接受使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的患者库可能受年龄限制。举例来说，年龄大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、30、35、40、50、60或更大岁数的个体，可能对于用如本文所描述的方法和组合物的疗法为符合条件的。对于另一实例，年龄小于75、70、65、60、55、50、40、35、30、25、20或更小岁数的个体，可能对于用如本文所描述的方法和组合物的疗法为符合条件的。
在一些实施例中，接受使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的患者，限于具有适当血液学功能的个体，例如具有以下中的一个或更多个：白细胞(WBC)计数为至少1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个/微升；血红蛋白水平为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更高g/dL；血小板计数为至少50,000、60,000、70,000、75,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000或更多个/微升；PT-INR值小于或等于0.8、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0或更高；PTT值小于或等于1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0×ULN或更多。在不同实施例中，对于不同性别和年龄组中的个体，选择不同的血液学功能指示剂界限值，所述年龄组例如0-5、5-10、10-15、15-18、18-21、21-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80或大于80岁。
在一些实施例中，接受使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的患者，限于具有适当肾功能和/或肝功能的个体，例如具有以下中的一个或更多个的个体：血清肌酐水平小于或等于0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL或更多；胆红素水平为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL或更多；同时允许更高的吉伯特氏综合征界限值，例如小于或等于1.5、1.6、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3或2.4mg/dL；ALT和AST值小于或等于1.5、2.0、2.5、3.0×正常值上限(ULN)或更多。在不同实施例中，对于不同性别和年龄组中的个体，选择不同的肾或肝功能指示剂界限值，所述年龄组例如0-5、5-10、10-15、15-18、18-21、21-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80或大于80岁。
在一些实施例中，可测定个体的K-ras突变情况，所述个体为使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的候选者。具有预选择K-ras突变情况的个体可包含于使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的符合条件的患者库中。
在不同实施例中，接受使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的患者限于以下的个体：无并行细胞毒性化疗或放射疗法；大脑癌转移病史或正患大脑癌转移；自身免疫疾病病史，所述自身免疫疾病如(但不限于)发炎性肠病、全身性红斑狼疮症、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性硬化、甲状腺疾病和白癜风；严重间发慢性或急性病痛，如心脏疾病(III或IV类NYHA)或肝病；对于方案的可能顺应性有医学或心理障碍；并发(或在最近5年内)第二恶性疾病，除非黑素瘤皮肤癌、原位***、受控表层膀胱癌或已治疗的其它原位癌以外；活动性急性或慢性感染，包含泌尿道感染、HIV(例如如通过ELISA确定和通过蛋白质印迹确认)和慢性肝炎；或并行甾类疗法(或其它免疫抑制剂，如硫唑嘌呤或环孢菌素A)。在一些情况下，中止至少3、4、5、6、7、8、9或10周任何甾类疗法(除对于化疗或造影增强研究用作预药物治疗以外)的患者，可包含于使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的符合条件的个体库中。在一些实施例中，接受使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的患者，包含患有甲状腺疾病和白癜风的个体。
在不同实施例中，可从使用如本文所描述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体，收集样本，例如血清或尿液样本。可在疗法之前、期间和/或之后收集样本，例如在疗法开始之前2、4、6、8、10周内；在从疗法开始1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周或12周内；在疗法开始之前2、4、6、8、10周内；在从疗法开始1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周内；在疗法期间以1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周间隔；在疗法之后以1个月、3个月、6个月、1年、2年间隔；在疗法之后1个月、3个月、6个月、1年、2年或更长内，持续6个月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间。可测试样本的以下中的任一种：本文所描述的血液学、肾或肝功能指示剂，以及所属领域中已知的合适的其它，例如对于具有生育可能的女性，β-HCG。在这一点上，在某些方面涵盖：血液学和生物化学测试，其包含具有差异、PT、INR和PTT的细胞血液计数；测量Na、K、Cl、CO2、BUN、肌酐、Ca、总蛋白质、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT和葡萄糖的测试。在一些实施例中，测定样本中的HIV抗体、肝炎BsAg或C型肝炎抗体的存在或量，所述样本来自使用本文所描述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体。
可测试样本(如血清)中的生物标记，如针对靶抗原的抗体或针对Ad5载体的中和抗体，所述样本来自使用本文所描述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体。在一些情况下，可从使用本文所描述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体，收集一个或更多个样本(如血液样本)，且存档。可分析所收集样本，以进行免疫评价。可在成像研究中，例如使用胸、腹部或骨盘的CT扫描或MRI，评价使用本文所描述的方法和组合物的疗法的个体或候选个体。成像研究可在使用本文所描述的方法和组合物的疗法之前、期间或之后进行，例如在疗法开始之前2、4、6、8、10周内；在从疗法开始1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周或12周内；在疗法开始之前2、4、6、8、10周内；在从疗法开始1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周内；在疗法期间以1周、10天、2周、3周、4周、6周、8周、9周或12周间隔；在疗法之后以1个月、3个月、6个月、1年、2年间隔；在疗法之后1个月、3个月、6个月、1年、2年或更长内，持续6个月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间。
本文所描述的组合物和方法涵盖在疗法期间的各种剂量和施用方案。患者可接受一种或更多种复制缺陷型腺病毒或腺病毒载体，例如Ad5[E1-、E2B-]-载体，其包括能够提高个体中针对本文所描述的靶抗原的免疫反应的靶抗原。
在不同实施例中，以适合于实现这种免疫反应的剂量施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×108个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×109个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些情况下，以约1×108个病毒颗粒到约5×108个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×108个病毒颗粒到约1×109个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×109个病毒颗粒到约5×109个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×109个病毒颗粒到约1×1010个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1010个病毒颗粒到约5×1010个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×1010个病毒颗粒到约1×1011个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1011个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×1011个病毒颗粒到约1×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1012个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约5×1012个病毒颗粒到约1×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1013个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×108个病毒颗粒到约5×1010个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1010个病毒颗粒到约5×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×108个病毒颗粒到约1×1010个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1010个病毒颗粒到约1×1012个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些实施例中，以约1×1011个病毒颗粒到约5×1013个病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在一些情况下，以大于或等于以下个病毒颗粒(VP)/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、1.5×1012、2×1012、3×1012或更多。在一些情况下，以小于或等于以下个病毒颗粒(VP)/免疫的剂量施用复制缺陷型腺病毒：1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、1.5×1012、2×1012、3×1012或更多病毒颗粒/免疫的剂量，施用复制缺陷型腺病毒。在不同实施例中，以合适体积的调配物缓冲液，例如约0.1-10mL、0.2-8mL、0.3-7mL、0.4-6mL、0.5-5mL、0.6-4mL、0.7-3mL、0.8-2mL、0.9-1.5mL、0.95-1.2mL或1.0-1.1mL的体积，施用本文所描述的所需剂量。所属领域的技术人员应了解，体积可在以这些值中任一者为界的任何范围(例如约0.5mL到约1.1mL)内。病毒颗粒的施用可通过各种合适的递送路径进行，例如其可通过注射(例如真皮内、肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内(例如通过抽吸)、以丸剂形式(例如吞咽)、用于***或直肠递送的栓剂。在一些实施例中，皮下递送可为优选的，且可提供到树突状细胞的更高通路。
可重复向个体施用病毒颗粒。可按照时间表重复传递病毒颗粒，或替代地，可以根据需要来进行。举例来说，个体针对靶抗原(例如肿瘤抗原，如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合，其片段、变体或变体片段)的免疫可进行测试，且根据需要补充额外递送。在一些实施例中，递送时间表包含每隔一定间隔施用病毒颗粒。联合递送方案可设计成包括以下中的一个或更多个：具有时间表的时段；和/或基于需要在施用之前所评定的施用时段。举例来说，疗法方案可包含施用，如每三周皮下施用一次，随后每三个月施用另一免疫疗法治疗，直到出于任何原因(包含死亡)退出疗法为止。另一实例方案包括每三周一次，三次施用，随后每三个月施用另一组三次免疫疗法治疗。
另一实例方案包括：第一时段，以第一频率进行第一数量的施用；第二时段，以第二频率进行第二数量的施用；第三时段，以第三频率进行第三数量的施用等；和任选地一个或更多个时段，按需要进行未确定数量的施用。各时段中的施用数量可独立地进行选择，且可例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。各时段中的施用频率也可独立地进行选择，可例如为约每天、每隔一天、每隔两天、一周两次、一周一次、每隔一周一次、每隔两周、每月、每六周、每隔一月、每隔两个月、每隔三个月、每隔四个月、每隔五个月、一年一次等。疗法可耗费上至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36个月或更多的总时段。
免疫之间的安排间隔可进行调整，以使得免疫之间的间隔修改上至间隔的五分之一、四分之一、三分之一或一半。举例来说，对于3-周间隔时间表，免疫可在第20天到28天(3周-1天到3周+7天)进行重复。对于最先3次免疫，如果第二和/或第三免疫延迟，那么随后免疫可偏移，允许免疫之间的最小量缓冲区。举例来说，对于三间隔时间表，如果免疫延迟，那么随后免疫可安排为不早于前一免疫后17、18、19或20天发生。
本文所描述的组合物可以各种状态提供，例如在室温下、在冰上或冷冻。组合物可提供于合适大小的容器中，例如2mL小瓶。在一个实施例中，具有1.0mL可提取疫苗的2ml小瓶含有5×1011个总病毒颗粒/毫升。包含温度和湿度的存储条件可变化。举例来说，用于疗法中的组合物可存储在室温、4℃、-20℃或更低温度下。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物的治疗的个体，进行一般评估。可以按需要或在安排基础上，如在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时和在无免疫时间点进行不同测试组。
一般评估可包含以下中的一个或更多个：病史、ECOG性能评分、Karnofsky性能情况和由主治医生进行的全面身体检查(含有体重)。可记录患者正接受或自上次问诊起已接受的任何其它治疗、药品、生物制剂或血液产品。可在诊所追踪患者合适时段，例如在接受疫苗后大致30分钟，以监测任何不良反应。
在一些实施例中，可每天一次评定在每一疫苗剂量之后局部和***反应原性一段选择时间，例如3天(免疫当天和其后2天)。日记卡可用于报告症状，且直尺可用于测量局部反应原性。可评定免疫注射位点。可以进行胸、腹部和骨盘的CT扫描或MRI。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物的治疗的个体，进行血液学和生物化学评估。可以按需要或在安排基础上，如在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时和在无免疫时间点进行不同测试组。血液学和生物化学评估可包含以下中的一个或更多个：化学和血液学的血液测试、具有差异的CBC、Na、K、Cl、CO2、BUN、肌酐、Ca、总蛋白、白蛋白、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、ALT、葡萄糖和ANA。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物的治疗的个体，评价生物标记。可以按需要或在安排基础上，如在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时和在无免疫时间点进行不同测试组。
生物标记评估可包含测量来自适当体积的血清样本的本文中所描述的靶抗原或病毒载体的抗体中的一个或更多个，例如如果确定和可获得，那么可审查约5ml生物标记。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物治疗的个体，进行免疫评定。可以按需要或在安排基础上，如在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时和在无免疫时间点进行不同测试组。
可在每次免疫之前和在至少一些免疫后的时候，抽取外周血液，例如约90mL，来测定在研究期间和/或在特定数量的免疫之后特定时间点时，对于免疫反应是否有效果。免疫评定可包含以下中的一个或更多个：使用ELISpot分析外周血液单核细胞(PBMC)对于靶抗原的T细胞反应、增殖分析、多参数流式细胞测量分析和细胞毒性分析。可将来自每一抽血的血清存档，且发送和测定。
在不同实施例中，对于接受根据如本文所描述的方法和组合物的治疗的个体，进行肿瘤评定。可以按需要或在安排基础上，如在治疗之前，在0、3、6周等，进行任何测试中的一个或更多个。可以在免疫同时和在无免疫时间点进行不同测试组。肿瘤评定可包含：在治疗之前、在至少一些免疫之后的某一时间和在完成所选择数量(例如2、3或4)的第一治疗之后大致每三个月和例如直到退出治疗为止，进行胸、腹部或骨盘的CT或MRI扫描中的一个或更多个。
可从样本，如个体的外周血液样本，使用一种或更多种合适的免疫反应测试，如ELISpot、细胞因子流式细胞测量术或抗体反应，评价针对靶抗原(如PSA、PSMA、MUC1、Brachyury、CEA或其组合)的免疫反应。可通过测量T细胞反应来测定阳性免疫反应。如果六个具有抗原的孔中针对背景进行调整的斑点的平均数量超过六个对照孔中的斑点的数量10个，且使用斯氏t检验(Student's t-test)，含有抗原的六个孔与六个对照孔的单一值之间的差异，在p≤0.05水平下统计学上显著，那么T细胞反应可被视为阳性。免疫原性分析可在每一免疫之前和在治疗时段期间的安排时间点时发生。举例来说，可安排在约治疗的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、20、24、30、36或48周的时间点进行免疫原性分析，即使此时无安排的免疫。在一些情况下，如果个体接受至少最小数量的免疫，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次免疫，那么个体可被视为可进行免疫反应评价。
在一些实施例中，根据患有可测量/可评价疾病的患者中的RECIST 1.1标准，进行疾病进展或临床反应测定。在一些实施例中，使用如本文所描述的方法和组合物的疗法在接受疗法的个体中实现完全反应(CR；目标病变的所有目标病变消失或所有非目标病变消失，和非目标病变的肿瘤标记水平正常化)。在一些实施例中，使用如本文所描述的方法和组合物的疗法在接受疗法的个体中实现部分反应(PR；考虑目标病变的基线总LD，目标病变的LD的总和降低至少30％)。
在一些实施例中，使用如本文所描述的方法和组合物的疗法在接受疗法的个体中实现稳定疾病(SD；考虑自治疗开始，目标病变的最小总LD，既没有足够缩小以获准PR又没有足够增加以获准PD)。在一些实施例中，使用如本文所描述的方法和组合物疗法在接受疗法的个体中实现不完全反应/稳定疾病(SD；持续一个或更多个非目标病变或/和维持肿瘤标记水平高于非目标病变的正常界限)。在一些实施例中，使用如本文所描述的方法和组合物的疗法在接受疗法的个体中实现进展性疾病(PD；考虑自开始治疗记录的最小总LD，目标病变的LD的总和增加至少20％，或出现目标病变的一个或更多个新病变，或持续一个或更多个非目标病变，或/和维持肿瘤标记水平高于非目标病变的正常界限)。
试剂盒
本文所描述的组合物、免疫疗法或疫苗可呈试剂盒形式提供。本公开的试剂盒可进一步包括关于剂量和或施用的说明书，所述说明书包含治疗方案信息。
在一些实施例中，试剂盒包括用于提供所描述的免疫疗法或疫苗的组合物和方法。在一些实施例中，试剂盒可进一步包括适用于施用试剂盒组分的组分和关于如何制备所述组分的说明书。在一些实施例中，试剂盒可进一步包括用于在治疗前后用适当实验室测试监测患者的软件，或与医务人员的交流结果和个体数据。
包括组分的试剂盒可呈干燥或液体形式。如果其呈干燥形式，那么试剂盒可包含溶解干燥材料的溶液。试剂盒还可包含呈液体或干燥形式的转移因子。在一些实施例中，如果转移因子呈干燥形式，那么试剂盒包含溶解转移因子的溶液。试剂盒还可包含用于混合和制备组分的容器。试剂盒还可包含用于辅助施用的仪器，例如针、导管、施用器、吸入器、注射器、移液管、镊子、标准匙(measured spoon)、滴眼器或任何这类医学上批准的递送媒介物。如本文所描述的试剂盒或药物传递***还将通常包含用于容纳本公开的组合物的装置，密封以用于商业销售和配送。
上文所描述的不同的实施例可以组合以提供另外的实施例。本说明书参考和/或应用数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开案、美国专利申请案、国外专利、国外专利申请案和非专利公开案，以全文引用的方式并入本文中，其程度如同每一个别公开案、专利或专利申请案具体和独立地指示以引用的方式并入一般。
必要时可以修改实施例的各方面，以使用不同专利、申请案以及公开案的观点来提供其它实施例。
可以根据以上详细说明对这些实施例作出这些和其它改变。总体而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应理解为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的具体实施例，但应理解为包含所有可能的实施例以及这份权利要求书所有权获得的等效物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。
实例
包含以下实例以显示本发明的优选实施例。所属领域的技术人员应了解，以下实例中所公开的技术表示本发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，并且因此可以视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，所属领域的技术人员应了解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施例作出许多改变且仍获得相同或类似结果。
实例1
小鼠中的Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗
本实例描述Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗在小鼠模型中的临床前测试。进行研究，以评定Ad5[E1-、E2b-]-PSA作为癌症疫苗在BALB/c小鼠模型中的用途。Ad5[E1-、E2b-]-PSA在小鼠中诱导针对PSA的强效CMI。还进行研究，以显示疫苗在表达PSA的癌症的鼠类模型中的抗肿瘤活性。这些数据指示，活体内递送Ad5[E1-、E2b-]-PSA，可诱导针对表达PSA的癌症的PSA定向抗肿瘤免疫。
在BALB/c鼠类模型中进行临床前研究，以显示Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗的免疫原性。
在Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫之后，CMI反应的诱导
为了通过流式细胞术评定在用Ad5[E1-、E2b-]-PSA多次同源免疫之后的CMI诱导，以1周间隔，用1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSA的VP，SC免疫Ad5免疫BALB/c小鼠组(n＝5只/组)三次。仅用缓冲溶液注射对照小鼠。在最后一次免疫两周之后，收集脾细胞，且将其暴露于PSA蛋白，并通过ELISpot评定IFN-γ或IL-2分泌脾细胞的CMI反应。
在疫苗接种小鼠中诱导出PSA定向CMI反应，但对照小鼠中未诱导出PSA定向CMI反应(图1A和图1B)。使用无关HIV-gag或巨细胞病毒(CMV)抗原，在ELISpot分析中，证明CMI反应的特异性(图2A和图2B)。还测试抗体反应，且在免疫小鼠中检测到PSA定向抗体反应，但在对照小鼠中未检测到(图3)。
为了测定受感染人类DC是否能刺激人类抗原特异性T细胞系分泌IFN-γ，将特异性感染的DC与抗原特异性T细胞系一起温育，且测试IFN-γ分泌活性作为刺激的测量值。人类DC用Ad5载体感染，温育48小时，洗涤，且用于刺激人类抗原特异性T细胞。如表4中所示，用编码转基因的重组Ad5-PSA载体感染人类树突状细胞(来自HLA-A2供体)，可活化PSA特异性T细胞系产生IFN-γ。
这些以上结果表明，Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗，在诱导PSA定向免疫反应上有效。
表4–活化PSA特异性T细胞系产生IFN-γ
用以下来感染树突状细胞 肽 抗原特异性 T细胞
T-PSA-(HLA-A2) T-CEA-(HLA-A2)
Ad5[E1、E2b]-PSA(20,000MOI) 无 >3,000 <0.732
Ad5[E1、E2b]-PSA(10,000MOI) 无 >3,000 0.84
Ad5[E1、E2b]-Null(20,000MOI) 无 0.9 0.89
DC 无 4.24 0.78
无DC(仅PSA T细胞) 无 <0.732 ND
无DC(仅CEA T细胞) 无 ND <0.732
结果以IFN-γ皮克数/5×105个T细胞/ml表示。仅DC＝<0.732。
Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗的抗肿瘤活性
在表达PSA的癌症的鼠类模型中，测试Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗的抗肿瘤活性。以两周间隔，用1x1010个Ad5[E1-、E2b-]-null(空白载体对照)的VP或1x1010个Ad5[E1-、E2b-]-PSA的VP疫苗，皮下(SC)免疫BALB/c小鼠三次。在最后一次免疫(疫苗接种)两周之后，向小鼠植入5×105个表达PSA的鼠类肿瘤细胞。监测所有小鼠的肿瘤生长，且计算肿瘤体积，以测定用Ad5[E1-、E2b-]-PSA的预免疫是否在免疫小鼠中抑制肿瘤生长，但在对照小鼠中不抑制。根据式V＝(肿瘤宽度2×肿瘤长度)/2，计算肿瘤体积。相较于注射Ad5[E1-、E2b-]-null的对照小鼠，用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫的小鼠经历较慢肿瘤生长(图4)。这些结果指示，Ad5[E1-、E2b-]-PSA载体平台，具有用作治疗表达PSA的肿瘤的免疫治疗剂的可能。
通过ELISPOT，抗原特异性反应的评定
在实验结束(肿瘤接种后37天)时，收集脾细胞，且将其离体暴露于PSA肽库、阴性对照(SIV-Nef肽库)或阳性对照(伴刀豆球蛋白A(Con A))。在离体刺激之后，使用ELISPOT分析，测量细胞因子分泌，如图14中所显示。数据报告为斑点形成细胞(SFC)数/106个脾细胞，且误差棒显示SEM。图14A图示在离体刺激之后的IFN-γ分泌细胞。图14B图示在离体刺激之后的IL-2分泌细胞。图14C图示在离体刺激之后的颗粒酶B分泌细胞。
通过胞内细胞因子染色和流式细胞测量术，抗原特异性反应的评定
在实验结束(肿瘤接种后37天)时，收集脾细胞，且将脾细胞离体暴露于PSA肽库或阴性对照抗原(培养基或SIV-Nef肽库)。对细胞进行表面标记物和胞内细胞因子分泌染色，且通过流式细胞术进行分析，如图15中所显示。图15A图示分泌IFN-γ的CD8β+脾细胞的百分比。图15B图示分泌IFN-γ的CD4+脾细胞的百分比。图15C图示分泌IFN-γ和TNF-α的CD8β+脾细胞的百分比。图15D图示分泌IFN-γ和TNF-α的CD4+脾细胞的百分比。
通过ELISA，针对PSA的抗原特异性抗体的评定
在实验结束(肿瘤接种后37天)时，收集血清，且使用酶联免疫吸附分析(ELISA)，分析抗体的存在，如图16中所显示。图16A图示针对PSA的IgG特异性抗体的质量。图16B图示针对PSA的IgG1特异性抗体的质量。
Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗的毒性的评定
进行广泛临床前毒理学研究，以评定Ad5[E1-、E2b-]-PSA在SC注射后于BALB/c小鼠中的毒性。评定在注射后不同时间点的毒性指标。在第1、22和43天，用媒剂对照或Ad5[E1-、E2b-]-PSA，考虑身体质量上的差异，以与用于临床试验一致的剂量，向动物施用最多3次SC注射。评估由以下组成：对于体重的效果、体重增加、食物消耗病理学、血液血液学分析、血液化学分析和关于凝血时间的测试。
总之，Ad5[E1-、E2b-]-PSA，为一种诱导稳定免疫反应、靶向PSA的治疗性疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-PSA在小鼠中诱导针对PSA的强效CMI，如在针对IFN-γ和IL-2分泌脾细胞的ELISpot分析中所评定。另外，通过用Ad5[E1-、E2b-]-PSA感染的人类DC，来刺激人类抗原特异性T细胞系。
重要的是，Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗，在表达PSA PSA癌症的临床前鼠类模型中，产生抗肿瘤活性。
实例2
患有晚期***癌的个体中的Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗的I/IIa期研究
本实例描述患有晚期***癌的个体中的Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗的I/IIa期研究。目标是为了临床上测试这种针对PSA的治疗性疫苗，所述疫苗利用克服了在其它Ad5***存在的屏障的Ad5载体***。临床研究的结果可确立使用这种Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗作为免疫治疗剂的安全性和免疫原性。
研究的特定目标是为了，评价用Ad5[E1-、E2b-]-PSA免疫治疗剂的治疗性免疫疗法，在患有晚期***癌的患者中的安全性和可行性。Ad5[E1-、E2b-]-PSA，设计成诱导抗肿瘤T细胞介导的免疫反应。
Ad5[E1-、E2b-]-PSA为一种腺病毒血清型5(Ad5)载体，其已通过去除早期1(E1)、早期2b(E2b)和早期3(E3)基因区和***人类***特异性抗原(PSA)基因，来进行修饰。所得重组复制缺陷型载体在最新工程改造的基于专属人类293的细胞系(E.C7)中繁殖，所述细胞系以反式提供载体生产所需的E1和E2b基因功能。未对于此方案提出基因转移***；产物以游离型起作用且保持游离型。
进行空心标记、剂量递增的I/IIa期研究，其中总共最多24名患有表达PSA的***癌的患者。评价5×109、5×1010和5×1011个腺病毒VP剂量水平。在I期中，患者参与到3或6名患者的连续剂量浓度组中，且监测剂量限制性毒性(DLT)。通过每3周，SC注射，3次免疫，给予每名个体Ad5[E1-、E2b-]-PSA。在组中的所有患者已在接受其最后剂量的疫苗至少3周之后进行研究问诊之后，针对剂量递增，进行DLT的评定。针对这种疫苗的任何组分具有过敏性反应病史的患者，不包含在试验中。
产品的描述
Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗，为一种填充在2mL琥珀色小瓶中的澄清无色液体，所述小瓶含有1mL可提取的疫苗。在1mL产品中，总共存在5.0×1011个VP。每一小瓶用橡胶塞密封，且具有白色翻盖密封。产品的终端用户用其拇指向上翻/翻开盖的白色塑料部分以将橡胶塞子暴露，且随后用注射针头穿刺塞子以抽取液体。用铝卷曲密封件，将橡胶塞子紧固到小瓶。
Ad5[E1-、E2b-]-PSA表征为在经转染的细胞内高水平表达PSA。
剂量和投予
取决于患者参与哪个组，Ad5[E1-、E2b-]-PSA的剂量为5×109、5×1010或5×1011个VP。在剂量递增研究中，测定最大耐受剂量。
将Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗存储在≤-20℃下。在注射之前，将适当小瓶从冷冻柜移出，且允许在受控室温(20-25℃，68-77℉)下解冻至少20分钟且不大于30分钟，此后其保持在2-8℃(35-46℉)下。在从冷冻柜移出之后，当冷藏在2-8℃(35-46℉)下时，疫苗在至少8小时内是稳定的。
将已解冻小瓶涡旋，且随后使用无菌技术，药剂师使用1mL注射器，从小瓶抽取适当体积(1mL)。使用1到1/2英寸、20到25号针，尽快注射疫苗。如果疫苗不能立即注射，那么将注射器存储在2-8℃(35-46℉)下。
在用酒精准备位点之后，所有疫苗注射，均以1mL的体积，通过皮下注射给予到上臂中。任一条臂用于每一注射。
当在注射器中准备剂量且施用所述剂量时，考虑在施用剂量之后可能残留在针中的溶液容积，确保施用在方案中规定的全剂量。
以于2mL单一剂量小瓶中的无菌澄清溶液形式，提供Ad5[E1-、E2b-]-PSA疫苗。每一小瓶含有单次剂量的疫苗，其以5×1011个VP/mL提供。每一小瓶含有1.3mL总体积。将产品存储在≤-20±10℃下，直到使用为止。
将各别瓶(以所需数量)的Ad5[E1-、E2b-]-PSA，封装于纸板盒中，且在包含温度监测装置的情况下，通过隔日快递，于干冰(<-20℃)上运送。在接收后，有人检查包装内含物的任何明显损坏或瑕疵。将运送内含物解包，且将含有Ad5[E1-、E2b-]-PSA瓶的纸板盒放置到温度控制在<-20℃的冷冻柜中。接收人通过断开电源开关停止温度监测装置(包装内提供操控和操作温度监测装置的说明书)。
剂量制备的说明：5×109个病毒颗粒
从5.0mL的0.9％无菌生理盐水小瓶，移出0.05mL流体，留下4.95mL。随后，从Ad5[E1-、E2b-]-PSA标记小瓶移出0.05mL，且将这个体积递送到5mL无菌生理盐水小瓶中。通过倒置5mL稀释药物，来将内含物混合。随后，抽取1mL稀释药物，且通过皮下注射向患者递送(剂量制备的详细描述在包装***物中描述)。
剂量制备的说明：5×1010个病毒颗粒
从5.0mL的0.9％无菌生理盐水小瓶，移出0.5mL流体，留下4.5mL。随后，从Ad5[E1-、E2b-]-PSA标记小瓶移出0.5mL，且将这个体积递送到5mL无菌生理盐水小瓶中。通过倒置5mL稀释药物，来将内含物混合。随后，抽取1mL稀释药物，且通过皮下注射向患者递送(剂量制备的详细描述在包装***物中描述)。
剂量制备的说明：5×1011个病毒颗粒
从小瓶抽取1mL内含物，且通过皮下注射向患者递送，而无任何其它操作。
实例3
多靶向疫苗的生产
本实例描述多靶向疫苗的生产，所述疫苗包括超过一种抗原靶标。
多靶向载体的生产
构建和生产Ad5[E1-、E2b-]-brachyury、Ad5[E1-、E2b-]-PSA(和/或PSMA)和Ad5[E1-、E2b-]-MUC1。简单来说，使用基于同源重组的方法，将转基因亚克隆到Ad5[E1-、E2b-]载体的E1区中。在E.C7包装细胞系中，繁殖复制缺陷型病毒，CsCl2纯化且滴定。病毒感染性滴度测定为E.C7细胞单层上的斑块形成单元(PFU)。通过十二烷基硫酸钠(SDS)破坏和在260nm和280nm下的分光光度法，来测定VP浓度。
构建编码如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:35中的人类PSA抗原的序列，且随后克隆到Ad5载体中，产生Ad5[E1-、E2b-]-PSA构建体。类似地，构建编码如SEQ ID NO:11中的人类PSMA抗原的序列，且随后克隆到Ad5载体中，产生Ad5[E1-、E2b-]-PSMA构建体。
通过引入增强子T细胞HLA-A2表位(WLLPGTSTV；SEQ ID NO:7)和去除涉及DNA结合的25个氨基酸片段，来对编码人类Brachyury蛋白(T，NM_003181.3)的序列进行修饰。随后，将所得构建体亚克隆到Ad5载体中，产生Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury构建体。
MUC1分子由两个区组成：N端(MUC1-n)，其为MUC1的大型胞外结构域；和C端(MUC1-c)，其具有三个区：小型胞外结构域、单一跨膜结构域和细胞质尾区。细胞质尾区含有：与信号传导蛋白相互作用的位点，且所述位点充当致癌基因；和癌症运动、侵袭性和癌转移的驱动子。对于Ad5[E1-、E2b-]-MUC1的构建，将整个MUC1转基因(包含八个激动剂表位)亚克隆到Ad5载体中。包含于Ad5[E1-、E2b-]-MUC1载体中的激动剂表位与以下结合：HLA-A2(N端中的表位P93L；VNTR区中的V1A和V2A；和C端中的C1A、C2A和C3A)、HLA-A3(表位C5A)和HLA-A24(C端中的表位C6A)。
通过将1010个Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury、Ad5[E1-、E2b-]-PSA(或替代地Ad5[E1-、E2b-]-PSMA)和Ad5[E1-、E2b-]-MUC1的VP，以1:1:1的比率(总共3×1010个VP)组合，产生Tri-Ad5疫苗。
多靶向疫苗的GLP生产
以下显示使用良好实验室实践(GLP)标准生产临床等级的多靶向疫苗。Ad5[E1-、E2b-]-PSA(和/或PSMA)、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1和Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury产品，可在5L细胞生物反应器中生产。
简单来说，将数瓶E.C7生产细胞系解冻，转移到T225烧瓶中，且最初在37℃、5％CO2下，于含有10％FBS/4mML-谷氨酰胺的DMEM中培养。在扩增之后，使用10分层CellSTACKS(CS-10)将E.C7细胞扩增，且转换到自由式无血清培养基(SFM)中。在37℃、5％CO2下，于SFM中培养E.C7细胞24小时，到细胞生物反应器中5×105个细胞/毫升的目标密度。随后，E.C7细胞将分别用Ad5[E1-、E2b-]-PSA、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1或Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury感染，且培养48小时。
在收集之前30分钟，进行中间流处理，且向培养物中添加Benzonase核酸酶，以促进较佳细胞粒化以用于浓缩。在通过离心粒化之后，丢弃上清液，且在室温下，将离心块(pellet)再悬浮于含有1％聚山梨醇酯-20的裂解缓冲液中90分钟。随后，裂解物用Benzonase处理，且通过添加5M NaCl淬灭反应。将浆液离心，且丢弃离心块。通过过滤使裂解物澄清，且进行两柱离子交换程序。
为了纯化疫苗产物，进行两柱阴离子交换程序。第一柱填充Q Sepharose XL树脂，消毒，且用上样缓冲液平衡。将已澄清裂解物装载到柱上，且用上样缓冲液洗涤。洗脱疫苗产物，且将含有以下的主要洗脱峰(洗脱物)用于下一步骤：Ad5[E1-、E2b-]-PSA(和/或PSMA)、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1或Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury。第二柱填充Source 15Q树脂，消毒，且用上样缓冲液平衡。将来自第一阴离子交换柱的洗脱物装载到第二柱上，且以100％缓冲液A(20mM Tris，1mM MgCl2，pH 8.0)开始，运行到50％缓冲液B(20mM Tris，1mM MgCl2，2M NaCl，pH 8.0)，对疫苗产物进行梯度洗脱。收集含有Ad5[E1-、E2b-]-PSA(和/或PSMA)、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1或Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury的洗脱峰，且存储在2-8℃下隔夜。将峰洗脱份通过切向流过滤(TFF)***处理以进行浓缩和相对于调配物缓冲液(20mM Tris，25mM NaCl，2.5％(v/v)甘油，pH 8.0)进行透滤。在处理之后，将最终疫苗产物无菌过滤，施配成等分试样，且存储在≤-60℃下。通常产生接近100％纯度的高度纯化产物，且对于这些产物预测到类似结果。
以分光光度法来测定所生产的VP产物的浓度和总数。通过HPLC，评定产物纯度。通过使用试剂盒，执行感染性颗粒的Ad5六联体染色分析，测定感染活性。
使用从载体转染的A549细胞的裂解物，进行蛋白质印迹，以验证PSA、PSMA、MUC1或Brachyury表达。进行质量控制测试，以确定最终疫苗产物无支原体，不具有微生物生物负荷且呈现小于2.5内毒素单位(EU)/mL的内毒素水平。为了确认免疫原性，如下文所描述，在小鼠中测试个别载体(实例4)。
实例4
多靶向PSA(和/或PSMA)、MUC1、Brachyury病毒载体的免疫原性
本实例描述使用针对PSA(和/或PSMA)、MUC1和T(即，Brachyury)的多靶向疫苗的免疫原性结果。如本文所描述，测试每一病毒载体产物的纯度、感染性和抗原表达，且每一个都通过这些标准。
疫苗接种和脾细胞制备
向雌性C57BL/6小鼠(n＝5只)，SC注射1010个Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury或Ad5[E1-、E2b-]-PSA(和/或PSMA)或Ad5[E1-、E2b-]-MUC1VP，或以1:1:1的比率1010个VP的所有三种病毒的组合(具有PSA和/或PSMA、MUC1和Brachyury的Tri-Ad5)。向对照小鼠注射3×1010个Ad-null(无转基因***)VP。剂量是以25μl注射缓冲液(具有3％蔗糖的20mM HEPES)形式施用，且以14天间隔疫苗接种小鼠三次。在最终注射十四天之后，收集脾和血清。将血清冷冻在-20℃下。通过平缓地挤压脾通过70μM尼龙细胞过滤器(BDFalcon,San Jose,CA)，产生脾细胞悬浮液。通过添加红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)来去除红细胞，且洗涤脾细胞两次并再悬浮于R10(RPMI 1640，补充有L-谷氨酰胺(2mM)、HEPES(20mM)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素以及10％胎牛血清)中。通过ELISpot和流式细胞测量术，分析脾细胞的细胞因子产生。
免疫原性研究：
用Ad5[E1-、E2b-]载体的免疫是剂量依赖性的，且使用1×1010个VP/剂量。使用C57BL/6小鼠组(N＝5)。
在本研究中，以一周间隔或2周间隔，用以下皮下注射C57BL/6小鼠3次：三重免疫，其包括1×1010个Ad5[E1-、E2b-]-null(空白载体对照)病毒颗粒(VP)；或含有1:1:1的Ad5[E1-、E2b-]-PSA(和/或PSMA)、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1和Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury的混合物的1×1010个VP。
在最后一次免疫两周之后，采用ELISpot分析，测定在分别将脾细胞暴露于PSA、MUC1或Brachyury肽库之后，IFN-γ分泌细胞(SFC)的CMI活性。
在免疫小鼠中，检测到对于多靶向载体的显著CMI反应。在暴露于PSA和/或PSMA肽之后，使用胞内细胞因子染色，对于脾细胞进行流式细胞测量术，以评定活化CD4+和CD8+T细胞的数量。
简单来说，在多靶向免疫小鼠中，检测到针对PSA、PSMA、MUC1和Brachyury的CMI反应，如通过IFN-γ分泌脾细胞(SFC)的ELISpot分析所评定，但在对照小鼠(注射Ad5-Null空白载体)中未检测到。通过对于无关SIV-nef或SIV-vif肽抗原不具有反应性，而确认ELISpot分析反应的特异性。阳性对照包含暴露于伴刀豆球蛋白A(Con A)的细胞。
抗肿瘤免疫疗法研究：
进行研究，以在免疫疗法研究中测试Ad5[E1-、E2b-]-类三重疫苗(Tri-Ad5，即，Ad5[E1-、E2b-]-PSA(和/或PSMA)、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1和/或Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury)，在形成有分别表达PSA、MUC1、或Brachyury的肿瘤的小鼠中的抗肿瘤能力。在本研究中，评定Ad5[E1-、E2b-]-类三重疫苗的个别组分的抗肿瘤活性。
对于活体内肿瘤治疗研究，用5×105个表达PSA(和/或PSMA)、MUC1和/或Brachyury的鼠类肿瘤细胞，皮下注射到C57BL/6小鼠组(n＝7)的右侧腹中。在检测到可触知的肿瘤之后，以一周间隔，分别以1×1010个VP的以下中的每一个皮下注射小鼠3次：Ad5[E1-、E2b-]-null(无转基因，例如空白载体)、Ad5[E1-、E2b-]-PSA(和/或PSMA)、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1和/或Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury。向对照小鼠注射3×1010个Adeno-null VP。计算肿瘤体积，且绘制肿瘤生长曲线。7-10只小鼠/组足够用于治疗的统计评价。当肿瘤达到1500m3或变成严重溃疡时，终止肿瘤研究。
处理较大数量的小鼠，以显示显著抗肿瘤活性，且将免疫疗法与免疫路径检查点调节剂(如抗检查点抑制剂抗体)组合，以测定抗肿瘤活性是否增强。
实例5
在疫苗接种之后的PSA抗体活性
本实例描述在疫苗接种之后，PSA抗体活性的诱导。从用Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗接种的小鼠的血清，评定PSA抗体活性。通过ELISA，测定用Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗接种三次的小鼠中的PSA IgG水平。
通过测试个体，证实在相同小鼠组中针对表达PSA的肿瘤细胞的互补依赖性细胞细胞毒性(CDCC)。在疫苗接种小鼠中，观测到细胞毒性活性，但在对照小鼠中或在暴露于仅互补物的细胞中未观测到。
实例6
Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3组合免疫疗法临床试验
本实例描述Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3作为组合疗法的临床试验。临床试验在***癌患者中，采用Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗与抗PDL1抗体的组合，以用于免疫疗法。研究的I期部分，测定用Ad5[E1-、E2B-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3的免疫，在患有***癌的患者中的安全性。研究的II期部分，评估对于免疫的患者免疫反应和，结合抗PDL1抗体，用Ad5[E1-、E2B-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗治疗***癌的临床可行性。
研究群体由组织学上确认***癌(即PSA阳性)诊断的患者组成。通过研究确定以下：三个剂量水平的Ad5[E1-、E2B-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗(I期组分)的安全性；和结合抗PDL1抗体使用Ad5[E1-、E2B-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗(II期组分)用于治疗***癌的安全性和适合性。
I期研究药物为Ad5[E1-、E2B-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3，其以每3周一次，通过皮下(SC)注射给予，3次免疫。II期研究药物为Ad5[E1-、E2B-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3与抗PDL1抗体组合，其以每3周一次，通过皮下(SC)注射给予，3次免疫。在前一组中的最后一名患者已接受其第一次注射至少3周之后，评价每一组中的安全性。如果在剂量浓度下处理的<33％患者经历DLT(例如0/3、≤1/6、≤3/12或≤5/18名患者)，那么给药流程视为安全的。
实例7
Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3和抗PDL1抗体组合免疫疗法临床试验
本实例描述Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3和抗PDL1抗体作为组合疗法的临床试验。临床试验在表达PSA的晚期***癌患者中采用以下的组合以用于免疫疗法：Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗和抗PDL1抗体。研究的I期部分测定用以下的免疫在患有***癌的患者中的安全性：Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗。研究的II期部分评估对于免疫的患者免疫反应，和用以下治疗***癌的临床可行性：Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗与抗PDL1抗体组合。
研究群体由组织学上确认***癌(即PSA阳性)诊断的患者组成。通过研究确定以下：三个剂量水平的Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗(I期组分)的安全性；和使用以下用于治疗***癌的安全性和适合性：Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗与抗PDL1抗体组合(II期组分)。
I期研究药物为以下的组合：Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗，其每3周，通过皮下(SC)注射给予，3次免疫。II期研究药物为以下：Ad5[E1-、E2b-]-PSA/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-、E2b-]-PSMA/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗、Ad5[E1-、E2b-]-MUC1/B7-1/ICAM-1/LFA-3、Ad5[E1-,E2b-]-Brachyury/B7-1/ICAM-1/LFA-3疫苗与抗PDL1抗体组合，其每3周，通过皮下(SC)注射给予，3次免疫。在前一组中的最后一名患者已接受其第一次注射至少3周之后，评价每一组中的安全性。如果在剂量浓度下处理的<33％患者经历DLT(例如0/3、≤1/6、≤3/12或≤5/18名患者)，那么给药流程视为安全的。
实例8
用Ad5[E1-、E2b-]-PSA和/或Ad5[E1-、E2b-]-PSMA对癌症的治疗
本实例描述在有需要的个体中的癌症的治疗，所述癌症包含表达PSA和/或表达PSMA的癌症。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，向有需要的个体皮下施用编码PSA或PSMA的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，每两个月(每两月一次)给予增强注射。个体为任何动物，例如哺乳动物，如小鼠、人类或非人类灵长类。在施用疫苗后，起始针对表达PSA或表达PSMA的癌症的细胞和体液反应，且消除癌症。
实例9
用Ad5[E1-、E2b-]-PSA和/或Ad5[E1-、E2b-]-PSMA和共刺激分子对癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中的癌症的组合治疗，所述癌症包含表达PSA和/或表达PSMA的癌症。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，向有需要的个体，结合共刺激分子，皮下施用编码PSA或PSMA的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，每两月一次施用增强注射。共刺激分子为B7-1、ICAM-1或LFA-3。个体为任何动物，例如哺乳动物，如小鼠、人类或非人类灵长类。在施用疫苗和共刺激分子后，起始针对表达PSA或表达PSMA的癌症的细胞和体液反应，且消除癌症。
实例10
用Ad5[E1-、E2b-]-PSA和/或Ad5[E1-、E2b-]-PSMA和检查点抑制剂对癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中的癌症的治疗，所述癌症包含表达PSA和/或表达PSMA的癌症。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，向有需要的个体，结合检查点抑制剂，皮下施用编码PSA和/或PSMA的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，每两月一次施用增强注射。检查点抑制剂为抗PDL1抗体，如阿维鲁单抗。按照药品说明书标注，以10mg/kg，给药和施用阿维鲁单抗。个体为任何动物，例如哺乳动物，如小鼠、人类或非人类灵长类。在施用疫苗和检查点抑制剂后，起始针对表达PSA或表达PSMA的癌症的细胞和体液反应，且消除癌症。
实例11
用Ad5[E1-、E2b-]-PSA和/或Ad5[E1-、E2b-]-PSMA和经工程改造的NK细胞对癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中的癌症的组合治疗，所述癌症包含表达PSA和/或表达PSMA的癌症。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，向有需要的个体，结合共刺激分子，皮下施用编码PSA和/或PSMA的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，每两月一次施用增强注射。向个体另外施用工程改造的NK细胞、特异性活化的NK细胞(aNK细胞)。在第-2、12、26和40天，以2×109个细胞/治疗的剂量，输注aNK细胞。有需要的个体具有表达CEA的癌细胞，如结肠直肠癌。个体为任何哺乳动物，如人类或非人类灵长类。
实例12
Ad5[E1-、E2b-]-PSA和/或Ad5[E1-、E2b-]-PSMA和ALT-803对癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中的癌症的组合治疗，所述癌症包含表达PSA和/或表达PSMA的癌症。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，向有需要的个体，结合共刺激分子，皮下施用编码PSA和/或PSMA的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，每两月一次施用增强注射。分别在第1、2、4、5、7和8周，还以10μg/kg SC的剂量，向个体施用超激动剂/超激动剂复合物，如ALT-803。有需要的个体具有表达CEA的癌细胞，如结肠直肠癌。个体为任何哺乳动物，如人类或非人动物。
实例13
Ad5[E1-、E2b-]-PSA和/或Ad5[E1-、E2b-]-PSMA和低剂量化疗对癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中的癌症的组合治疗，所述癌症包含表达PSA和/或表达PSMA的癌症。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，向有需要的个体，结合共刺激分子，皮下施用编码PSA和/或PSMA的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，每两月一次施用增强注射。
还向个体施用低剂量化疗。化疗为环磷酰胺。化疗可以低于临床护理给药标准的剂量施用。举例来说，化疗在每2周的第1-5天和第8-12天，以50mg，一日两次(BID)施用，总共8周。有需要的个体具有表达CEA的癌细胞，如结肠直肠癌。个体为任何哺乳动物，如人类或非人动物。
实例14
Ad5[E1-、E2b-]-PSA和/或Ad5[E1-、E2b-]-PSMA和低剂量放射对癌症的组合治疗
本实例描述在有需要的个体中的癌症的组合治疗，所述癌症包含表达PSA和/或表达PSMA的癌症。以1×109-5×1011个病毒颗粒(VP)的剂量，向有需要的个体，结合共刺激分子，皮下施用编码PSA和/或PSMA的Ad5[E1-、E2b-]载体。施用疫苗总共3次，且每次疫苗接种相隔3周间隔。其后，每两月一次施用增强注射。
还向个体施用低剂量放射。低剂量放射以低于临床护理给药标准的剂量施用。在第8、22、36、50天，给予在8Gy下的并行立体定向身体放射(SBRT)(每2周，4次剂量)。使用SBRT向所有可行的肿瘤位点施用放射。有需要的个体具有表达CEA的癌细胞，如结肠直肠癌。个体为任何哺乳动物，如人类或非人动物。
虽然已经在本文中显示和描述了本发明的优选实施例，但所属领域的技术人员应清楚，这类实施例仅是作为举例而提供的。所属领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下想到众多变型、变化和取代。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。预期随附权利要求界定本发明的范围，并且因此涵盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

Claims (88)

1.一种组合物，其包括复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性抗原(PSA)的核酸序列和/或编码***特异性膜抗原(PSMA)的核酸序列，其中所述PSA具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:34至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列，或所述PSMA具有与SEQ ID NO:11至少80％同一的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括编码PSA的核酸序列，所述PSA具有与SEQ ID NO:35至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列，或编码PSA的所述核酸序列具有与SEQ ID NO:2至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体包括编码PSMA的核酸序列，所述PSMA具有与SEQ ID NO:36至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包括：第二复制缺陷型病毒载体，其包括编码Brachyury抗原的第二核酸序列；第三复制缺陷型病毒载体，其包括编码MUC1抗原的第三核酸序列；或其组合。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述Brachyury抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合结合。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述Brachyury抗原为经修饰的Brachyury抗原，其包括WLLPGTSTV(SEQ ID NO:7)中所阐述的氨基酸序列。
7.根据权利要求4到6中任一项所述的组合物，其中所述Brachyury抗原为经修饰的Brachyury抗原，其包括与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的氨基酸序列。
8.根据权利要求4到7中任一项所述的组合物，其中所述第二复制缺陷型载体包括与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4的位置13到1242、SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。
9.根据权利要求4到8中任一项所述的组合物，其中所述第二复制缺陷型载体包括与SEQ ID NO:12(具有编码经修饰的Brachyury抗原的序列的Ad载体)、SEQ ID NO:12的位置1033-2083或SEQ ID NO:42至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的核苷酸序列。
10.根据权利要求4到9中任一项所述的组合物，其中所述MUC1抗原包括与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:41至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一的序列。
11.根据权利要求4到10中任一项所述的组合物，其中编码MUC1抗原的所述第三核酸序列包括与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:41至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一性。
12.根据权利要求4到11中任一项所述的组合物，其中所述MUC-1抗原与HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24或其组合结合。
13.根据权利要求4到12中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型病毒载体、所述第二复制缺陷型病毒载体和/或所述第三复制缺陷型病毒载体为腺病毒载体。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述载体包括E1区、E2b区、E3区、E4区或其组合中的缺失。
15.根据权利要求13或14所述的组合物，其中所述腺病毒载体包括E2b区中的缺失。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的组合物，其中所述载体包括E1区、E2b区和E3区中的缺失。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少1×109个病毒颗粒到至少5×1012个病毒颗粒。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少5×109个病毒颗粒。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少5×1010个病毒颗粒。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少5×1011个病毒颗粒。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括至少5×1012个病毒颗粒。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的组合物，其中所述组合物或所述复制缺陷型病毒载体进一步包括编码共刺激分子的核酸序列。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1、LFA-3或其组合。
24.根据权利要求22或23所述的组合物，其中所述共刺激分子包括B7、ICAM-1和LFA-3的组合。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括位于同一复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括位于单独复制缺陷型病毒载体中、编码多个共刺激分子的多个核酸序列。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括编码一种或更多种额外靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型病毒载体进一步包括编码一种或更多种额外靶抗原或其免疫表位的核酸序列。
29.根据权利要求27或28所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为肿瘤新抗原、肿瘤新表位、肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、组织特异性抗原、细菌抗原、病毒抗原、酵母菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原、寄生虫抗原、丝裂原或其组合。
30.根据权利要求27到29中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为CEA、叶酸受体α、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSCA、PSMA、PAP、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、Her2/neu、BRCA1、BRACHYURY、BRACHYURY(TIVS7-2，多态性)、BRACHYURY(IVS7T/C多态性)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、Her2/neu、Her3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、或TEL/AML1、或经修饰的变体、剪接变体、功能性表位、表位激动剂，或其组合。
31.根据权利要求27到30中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为CEA。
32.根据权利要求27到30中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为CEA、Brachyury和MUC1。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中CEA与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％或至少99％同一。
34.根据权利要求27到30中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为HER3。
35.根据权利要求27到30中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种额外靶抗原为HPV E6或HPV E7。
36.根据权利要求1到35中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型病毒载体进一步包括可选标记。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述可选标记为lacZ基因、胸苷激酶、gpt、GUS、或牛痘K1L宿主范围基因，或其组合。
38.一种组合物，其包括一种或更多种复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性抗原(PSA)的核酸序列、编码***特异性膜抗原(PSMA)的核酸序列、编码Brachyury抗原的核酸序列、编码MUC1抗原的核酸序列或其组合。
39.一种组合物，其包括一种或更多种复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性抗原(PSA)的核酸序列、编码Brachyury抗原的核酸序列和编码MUC1抗原的核酸序列。
40.一种组合物，其包括一种或更多种复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性膜抗原(PSMA)的核酸序列、编码Brachyury抗原的核酸序列和编码MUC1抗原的核酸序列。
41.一种组合物，其包括一种或更多种复制缺陷型病毒载体，所述病毒载体包括编码***特异性抗原(PSA)的核酸序列、编码***特异性膜抗原(PSMA)的核酸序列、编码Brachyury抗原的核酸序列、编码MUC1抗原的核酸序列和编码CEA抗原的核酸序列。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的组合物，其中所述复制缺陷型病毒载体进一步包括编码免疫融合配偶体的核酸序列。
43.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到42中任一项所述的组合物和药学上可接受的载剂。
44.一种宿主细胞，其包括根据权利要求1到42中任一项所述的组合物。
45.一种制备肿瘤疫苗的方法，所述方法包括制备根据权利要求43所述的药物组合物。
46.一种增强有需要的个体中的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1到42中任一项所述的组合物或根据权利要求43所述的药物组合物。
47.一种治疗有需要的个体的表达PSA或表达PSMA的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据权利要求1到42中任一项所述的组合物或根据权利要求43所述的药物组合物。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其进一步包括向所述个体再施用所述药物组合物。
49.根据权利要求46到48中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用免疫检查点抑制剂。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA或CD244。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制PD1或PDL1。
52.根据权利要求49到51中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗PD1或抗PDL1抗体。
53.根据权利要求49到52中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂为抗PDL1抗体。
54.根据权利要求46到53中任一项所述的方法，其中施用途径为静脉内、皮下、***内、肿瘤内、皮内、肌肉内、腹膜内、直肠内、***内、鼻内、口服、经膀胱滴注或经划痕。
55.根据权利要求46到54中任一项所述的方法，其中所述增强的免疫反应为细胞介导的反应或体液反应。
56.根据权利要求46到55中任一项所述的方法，其中所述增强的免疫反应为B细胞增殖、CD4+T细胞增殖、CD8+T细胞增殖或其组合增强。
57.根据权利要求46到55中任一项所述的方法，其中所述增强的免疫反应为IL-2产生、IFN-γ产生或其组合增强。
58.根据权利要求46到55中任一项所述的方法，其中所述增强的免疫反应为抗原呈递细胞增殖、功能或其组合增强。
59.根据权利要求46到58中任一项所述的方法，其中所述个体先前已施用腺病毒载体。
60.根据权利要求46到59中任一项所述的方法，其中所述个体对于腺病毒载体具有预存免疫。
61.根据权利要求46到60中任一项所述的方法，其中确定所述个体对于腺病毒载体具有预存免疫。
62.根据权利要求46到61中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用化疗、放射、不同免疫疗法或其组合。
63.根据权利要求46到62中任一项所述的方法，其中所述个体为人类或非人动物。
64.根据权利要求46到63中任一项所述的方法，其中所述个体先前已针对癌症进行治疗。
65.根据权利要求46到64中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量重复至少三次。
66.根据权利要求46到65中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量包括1×109到5×1012个病毒颗粒/剂量。
67.根据权利要求46到66中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量包括5×109个病毒颗粒/剂量。
68.根据权利要求46到67中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量包括5×1010个病毒颗粒/剂量。
69.根据权利要求46到68中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量包括5×1011个病毒颗粒/剂量。
70.根据权利要求46到69中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量包括5×1012个病毒颗粒/剂量。
71.根据权利要求46到70中任一项所述的方法，其中每一、二或三周重复施用治疗有效量。
72.根据权利要求46到71中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量，随后施用包括相同组合物或药物组合物的一次或更多次加强免疫。
73.根据权利要求72所述的方法，其中每一个月、两个月或三个月施用所述加强免疫。
74.根据权利要求72或73所述的方法，其中重复所述加强免疫三次或更多次。
75.根据权利要求46到74中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量为初次免疫，每一周、两周或三周重复三次；随后加强免疫，每一个月、两个月或三个月重复三次或更多次。
76.根据权利要求46到75中任一项所述的方法，其进一步包括向所述个体施用包括工程改造的自然杀伤(NK)群体的细胞的药物组合物。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述工程改造的NK细胞包括：一个或更多个NK细胞，其已经修饰为基本上缺乏KIR(杀伤抑制性受体)的表达；一个或更多个NK细胞，其已经修饰以表达高亲和力CD16变体；和一个或更多个NK细胞，其已经修饰以表达一种或更多种CAR(嵌合抗原受体)，或其任何组合。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述工程改造的NK细胞包括已经修饰为基本上缺乏KIR表达的一个或更多个NK细胞。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述工程改造的NK细胞包括已经修饰以表达高亲和力CD16变体的一个或更多个NK细胞。
80.根据权利要求77所述的方法，其中所述工程改造的NK细胞包括已经修饰以表达一种或更多种CAR的一个或更多个NK细胞。
81.根据权利要求77或80所述的方法，其中所述CAR为针对以下的CAR：肿瘤新抗原、肿瘤新表位、WT1、HPV E6、HPV E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、叶酸受体α、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her2/neu、Her3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2，多态性)、Brachyury(IVS7T/C多态性)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多态性)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-连环蛋白/m、胱天蛋白酶-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1，或其任何组合。
82.根据权利要求46到81中任一项所述的方法，其中细胞包括所述复制缺陷型腺病毒载体。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述细胞为树突状细胞(DC)。
84.根据权利要求46到83中任一项所述的方法，其进一步包括施用药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的IL-15或包括编码IL-15的核酸序列的复制缺陷型载体。
85.根据权利要求46到84中任一项所述的方法，其中所述个体患有***癌。
86.根据权利要求46到85中任一项所述的方法，其中所述个体患有晚期***癌。
87.根据权利要求46到86中任一项所述的方法，其中所述个体患有不可切除性局部晚期或转移性癌症。
88.根据权利要求46到87中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量的根据权利要求1到42中任一项所述的组合物或根据权利要求43所述的药物组合物包括呈1:1:1:1比率的以下病毒载体：第一复制缺陷型病毒载体，其包括编码PSA抗原的第一核酸序列；第二复制缺陷型病毒载体，其包括编码PSMA抗原的第二核酸序列；第三复制缺陷型病毒载体，其包括编码Brachyury抗原的第三核酸序列；第四复制缺陷型病毒载体，其包括编码MUC1抗原的第四核酸序列。
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