CN110108773B - 电化学传感器电极及其制法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种电化学传感器电极及其制法和应用。所述的制备方法包括：1)在电极基体表面形成超分子水凝胶修饰层，获得水凝胶修饰的电极基体；2)在所述超分子水凝胶修饰层上孵育生物标志物的核酸适体，进而获得所述电化学传感器电极。本发明利用天然鸟苷和吡啶‑4‑硼酸化合物形成的超分子凝胶为载体，利用其较高的生物分子亲和性及3D水凝胶微环境，实现了生物活性分子核酸适体在电极界面的有效固定；该方法步骤简单、适用性强，并且可以适用于多种生物标志物核酸适体传感器电极的制备，在科学研究和临床应用中具有广泛的前景。

Description

电化学传感器电极及其制法和应用
技术领域
本发明特别涉及一种电化学传感器电极及其制法和应用，属于水凝胶、电化学传感器技术领域。
背景技术
电化学生物传感器检测方法具有价格低廉、快速检测、选择性好、超低检测底限、等优点，因而被广泛用于对多种生物标志物的检测。为了提高传感器的灵敏度、生物负载量及实验效率，多种纳米材料，如金属/金属氧化物纳米材料、碳基纳米材料、金属有机框架材料等，由于具有比表面积大、生物分子负载量大和导电性高等优点，被广泛应用于电化学生物传感器的制备过程中以构筑不同的电化学传感器界面。然而，上述材料存在生物溶液行为复杂、生物相容性差、电化学活性低和在水体系中稳定性差、分散性差等缺点，使其在实际应用中受到限制。由于具有良好的生物相容性、高亲水性和渗透性，水凝胶材料作为一种新兴的生物电化学界面材料，受到研究者的广泛关注。目前报道的水凝胶基电化学传感界面主要为共价交联的聚合物网络结构，构筑过程复杂；且聚合物存在分子结构不确定、批次-批次差异大等问题，导致所构筑传感器的可重复性差。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种简单易行的电化学传感器电极的制备方法，解决目前水凝胶基电化学传感器构筑过程复杂、重现性差、检测目标单一等问题；本发明的目的之二是提供一种快速、低成本、通用的生物标志物检测方法，为电化学核酸适体传感器在临床中的应用提供技术基础。
发明人前期研究工作发现，在KCl水溶液中，通过简单混合商业来源的鸟苷和吡啶-4-硼酸化合物，即可得到具有优异自愈性和良好导电性的超分子水凝胶；本发明利用超分子水凝胶为载体，利用其较高的生物分子亲和性及3D水凝胶微环境，构筑了一种电化学传感器电极，该方法步骤简单、操作容易、适用性强，解决了现有水凝胶基电化学传感器构筑过程复杂、重现性差、检测目标单一等问题。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种电化学传感器电极，包括金属电极基体和核酸适体，该核酸适体通过超分子水凝胶固定于电极基体表面。
进一步的，所述超分子水凝胶中至少含有天然鸟苷和吡啶-4-硼酸化合物。
进一步的，所述的电极基体包括金属电极基体。
进一步的，所述电极基体包括金电极。
本发明实施例提供了一种电化学传感器电极的制备方法，其包括：
1)在电极基体表面形成超分子水凝胶修饰层，获得水凝胶修饰的电极基体；
2)在所述超分子水凝胶修饰层上孵育生物标志物的核酸适体，进而获得所述的电化学传感器电极。
在一些较为具体的实施方案中，所述步骤1)包括：将超分子水凝胶的储备液滴加在电极基体的表面，待所述超分子水凝胶的储备液干燥后形成所述的超分子水凝胶修饰层。
在一些较为具体的实施方案中，所述步骤1)还包括：将鸟苷、吡啶-4-硼酸化合物与KCl的水溶液混合，待所述鸟苷和吡啶-4-硼酸化合物完全溶解后形成所述的超分子水凝胶储备液。
进一步的，在所述超分子水凝胶储备液中，鸟苷、吡啶-4-硼酸与KCl的摩尔比为1∶1∶0.125-1∶1∶1。
进一步的，所述鸟苷、吡啶-4-硼酸与KCl于所述超分子水凝胶储备液中的总质量浓度为0.1-10mg mL-1。
在一些较为具体的实施方案中，所述的步骤2)包括：将所述水凝胶修饰的电极基体置于生物标志物的核酸适体溶液中孵育处理1-3h，使所述生物标志物的核酸适体固定附着在所述超分子水凝胶修饰层上。
进一步的，所述生物标志物的核酸适体溶液的浓度为0.1-10ng mL-1。
进一步的，所述的生物标志物包括癌胚抗原、甲胎蛋白、CA125、CA153、MUC1中的任意一种，但不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述的步骤2)还包括：采用pH 7.0 tris-HCl缓冲液对孵育处理后的水凝胶修饰的电极基体进行清洗，以除去金电极表面非特异性吸附的核酸适体。
进一步的，所述的电极基体的直径为1-6mm。
进一步的，所述的电极基体包括金电极。
本发明实施例还提供了一种生物标志物检测的方法，其包括：将所述的超分子水凝胶基电化学核酸适体传感器传感界面置于不同浓度的生物标志物样品溶液中浸泡处理后作为三电极体系中的工作电极，以交流阻抗模式测定工作电极表面电荷转移阻抗，进而实现对生物标志物的检测。
进一步的，所述的三电极体系中的参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为Pt电极，电解液为5.0mM的[Fe(CN)6]3-/4-溶液(含0.1M的KCl溶液)。
进一步的，所述的生物标志物包括癌胚抗原、甲胎蛋白、CA125、CA153、MUC1中的任意一种，但不限于此。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明提供的电化学传感器电极的制备方法，无需借助聚合物材料，构筑方法简单，操作容易；鸟苷超分子水凝胶较高的生物分子亲和性及水凝胶3D立体微环境便于进行核酸适体的高效固定，避免了复杂的核酸适体固定过程及由此引起的失活问题；
2)本发明提供的电化学传感器电极的制备方法，适用性强，应用广泛；核酸适体稳定性高、特异性好，能够识别多种目标化合物；通过改变生物标志物核酸适体的种类，利用本发明所提出的构筑方法，可实现多种生物标志物核酸适体传感器传感界面的制备；
3)本发明提出的电化学传感器电极的制备方法中，鸟苷和硼酸化合物均为商业来源、价格便宜、成本低廉，无需繁琐的合成和纯化步骤，适用于大规模生产。
附图说明
图1是本发明实施例1中所制备的水凝胶修饰的金电极的扫描电镜图；
图2是本发明试验例1中所采用的等效电路图；
图3是本发明实施例1中所制备的超分子水凝胶基电化学核酸适体传感器不同构筑步骤的交流阻抗谱图；
图4是本发明实施例1中采用制备的水凝胶电极检测不同浓度甲胎蛋白的交流阻抗谱图；
图5是本发明实施例1中采用制备的水凝胶电极对不同浓度甲胎蛋白响应的线性关系图；
图6是本发明实施例1中制备的水凝胶电极的选择性测试结果；
图7是本发明实施例1中制备的水凝胶电极的重现性测试结果。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将结合附图以及具体实施例对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种检测甲胎蛋白的方法，包括：
电化学传感器电极的制备：
1)将30.0mg鸟苷，12.5mg吡啶-4-硼酸加入至50mL 0.002mol/L的KCl水溶液中形成混合体系，加热至完全溶解后，自然冷却，即得水凝胶储备液；该水凝胶储备液中，鸟苷、吡啶-4-硼酸、KCl的摩尔比为1∶1∶1；该水凝胶储备液中鸟苷、吡啶-4-硼酸与KCl的总质量浓度为1mgmL-1。
2)将10μL步骤1)制得的水凝胶储备液滴在活化处理后的的金电极(金电极的直径为3mm)表面，自然晾干后形成水凝胶修饰层，进而得到水凝胶修饰的金电极(Gel/AE)，其扫描电镜如图1所示，形成的水凝胶修饰层为典型的水凝胶交叉缠绕的网状结构；
3)将水凝胶修饰的金电极浸泡在浓度为1ng·mL-1甲胎蛋白核酸适体溶液中孵育2h，之后用tris-HCl缓冲溶液多次冲洗水凝胶修饰的金电极表面，并用氮气缓慢吹干，置于4℃环境保存，得到所述超分子水凝胶基电化学核酸适体传感器传感界面，即核酸适体吸附的水凝胶电极(Apt/Gel/AE)；
甲胎蛋白的电化学检测：
4)将步骤3)所制备的Apt/Gel/AE电极浸泡在不同浓度的甲胎蛋白样品溶液中2h，之后氮气缓慢吹干后作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt电极作为对电极，采用5.0mM的[Fe(CN)6]3-/4-溶液(含0.1M的KCl溶液)作为电解液，在电化学工作站上以交流阻抗模式测定其表面电荷转移阻抗(Rct)，实现对甲胎蛋白的检测。
图3为实施例1所制备的超分子水凝胶基电化学核酸适体传感器不同构筑步骤的交流阻抗谱图，由图3可以看出，随着电极的逐步修饰，Rct值逐渐增加；这是由于越来越厚的不导电的有机层锚固在金电极表面，导致电极表面的电化学活性下降，电子转移减少。
图4为实施例1所制备的Apt/Gel/AE工作电极检测不同浓度甲胎蛋白(AFP)的阻抗谱图；从图中可以看出，Rct随AFP浓度的增加而不断升高，这可能是由于逐渐增多的AFP与适配体结合，形成了越来越厚的有机层，阻碍了电子转移所致；ΔRct值的变化可以用来评价Apt/Gel/AE电极对不同浓度AFP的响应，ΔRct和浓度的线性关系如图5所示，插图是ΔRct和浓度的线性拟合曲线，线性响应范围为0.001～0.5ng mL-1，相关系数为0.990，相应的线性回归方程为ΔRct＝2282.48+693.211 LogCAFP；根据信噪比为3计算得出检测限为0.51pgmL-1，这表明，基于Apt/Gel/AE电极制备的电化学传感器对甲胎蛋白具有优异的传感性能。
图6为实施例1所制备电极的选择性测试结果，由图中可以看出，Apt/Gel/AE电极对0.001ng mL-1的甲胎蛋白具有较高的响应，而对于1ng mL-1的其它干扰物(包括溶菌酶、小鼠免疫球蛋白G(lg G)、人类血清白蛋白(rHSA)、牛血清蛋白(BSA)和癌胚抗原(CEA)没有显著的响应，表明该复合材料修饰的电极在甲胎蛋白测时具有较高的选择性。
图7为实施例1所制备电极的重现性测试结果，由图中可以看出，利用五个分别制备的电极对0.001ng·mL-1的AFP样品进行测试，ΔRct值相对标准偏差为1.65％，表明构筑的适配体传感器具有良好的重现性。
实施例2
一种检测癌胚抗原的方法，包括：
电化学传感器电极的制备：
1)将30.0mg鸟苷、2.5mg吡啶-4-硼酸加入至50mL 0.002mol/L的KCl水溶液中形成混合体系，加热至完全溶解后，自然冷却，即得水凝胶储备液；该水凝胶储备液中，鸟苷、吡啶-4-硼酸、KCl的摩尔比为1∶1∶1；该水凝胶储备液中，鸟苷、吡啶-4-硼酸与KCl的总质量浓度为1mg/mL；
2)将10μL步骤1)制得的水凝胶储备液滴加在活化处理后的的金电极(金电极的直径为3mm)表面，自然晾干后形成水凝胶修饰层，进而得到水凝胶修饰的金电极(Gel/AE)；
3)将水凝胶修饰的金电极浸泡在浓度为1ng·mL-1癌胚抗原核酸适体溶液中孵育2h，之后用pH 7.0 tris-HCl缓冲溶液多次冲洗水凝胶修饰的金电极表面以除去金电极表面非特异性吸附的核酸适体，并用氮气缓慢吹干，置于4℃环境保存，得到所述超分子水凝胶基电化学核酸适体传感器传感界面，即核酸适体吸附的水凝胶电极(Apt/Gel/AE)；
癌胚抗原的检测：
4)将步骤3)所制备的电极浸泡在不同浓度癌胚抗原样品溶液中2h，用氮气缓慢吹干后作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt电极作为对电极，采用5.0mM的[Fe(CN)6]3-/4-溶液(含0.1M的KCl溶液)作为电解液，在电化学工作站上以交流阻抗模式测定其表面电荷转移阻抗(Rct)，实现对癌胚抗原的检测。
实施例3
本发明实施例的过程与参数与实施例1基本一致，不同之处在于，本发明实施例中的制备的水凝胶储备液中鸟苷、吡啶-4-硼酸、KCl的摩尔比为1∶1∶0.125；该中，鸟苷、吡啶-4-硼酸与KCl的总质量浓度为0.1mg/mL。
实施例4
本发明实施例的过程与参数与实施例2基本一致，不同之处在于，本发明实施例中的制备的水凝胶储备液中鸟苷、吡啶-4-硼酸、KCl的摩尔比为1∶1∶0.5；该中，鸟苷、吡啶-4-硼酸与KCl的总质量浓度为10mg/mL。
试验例1
本试验例使用电化学工作站(Solartron Analytical Modulab XM CHAS 08)在室温下进行电化学阻抗谱(EIS)分析；采用三电极***，以实施例1所制备的电极(即核酸适体吸附的水凝胶电极)为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，Pt电极作为对电极，用5.0mM的[Fe(CN)6]3-/4-溶液(含0.1M的KCl溶液)作为电解液，进行交流阻抗测试；交流阻抗测试频率为100-0.1Hz，振幅为5mV；利用Zview软件对EIS谱图进行分析，使用非线性最小二乘法对数据进行拟合，确定等效电路中的元件参数；采用的等效电路如图2所示，图中Rs代表溶液阻抗，Rct是代表电荷转移阻抗，CPE为常相位元件，Wo是Warburg阻抗；典型的阻抗谱图是由代表电荷转移电阻的高频半圆部分和对应扩散过程中的低频线性部分组成，Rct值是阻抗谱图在高频范围内的半圆直径，可由数据拟合软件分析得到。
本发明利用天然鸟苷和吡啶-4-硼酸化合物形成的超分子凝胶为载体，利用其较高的生物分子亲和性及3D水凝胶微环境，实现了生物活性分子(包括前述生物标志物)核酸适体在电极界面的有效固定。该方法步骤简单、操作容易、适用性强，解决了现有水凝胶基电化学传感器构筑过程复杂、重现性差、检测目标单一等问题；该方法可以适用于多种生物标志物核酸适体传感器电极的制备，在科研和临床中具有广泛的应用前景。
本发明提供的电化学传感器电极的制备方法，无需借助聚合物材料，构筑方法简单，操作容易；鸟苷超分子水凝胶较高的生物分子亲和性及水凝胶3D立体微环境便于进行核酸适体的高效固定，避免了复杂的核酸适体固定过程及由此引起的失活问题；以及，本发明提供的电化学传感器电极的制备方法，适用性强，应用广泛；核酸适体稳定性高、特异性好，能够识别多种目标化合物；通过改变生物标志物核酸适体的种类，利用本发明所提出的构筑方法，可实现多种生物标志物核酸适体传感器传感界面的制备；并且，本发明提出的电化学传感器电极的制备方法中，鸟苷和硼酸化合物均为商业来源、价格便宜、成本低廉，无需繁琐的合成和纯化步骤，适用于大规模生产。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种电化学传感器电极，其特征在于包括金属电极基体和核酸适体，该核酸适体通过超分子水凝胶固定于电极基体表面，所述超分子水凝胶中至少含有天然鸟苷和吡啶-4-硼酸化合物，并且，所述电化学传感器电极至少通过如下方法制备获得：
1）将鸟苷、吡啶-4-硼酸化合物与KCl的水溶液混合，待所述鸟苷和吡啶-4-硼酸化合物完全溶解后形成超分子水凝胶储备液，将超分子水凝胶的储备液滴加在电极基体的表面，待所述超分子水凝胶的储备液干燥后形成超分子水凝胶修饰层，获得水凝胶修饰的电极基体；
2）将所述水凝胶修饰的电极基体置于生物标志物的核酸适体溶液中孵育处理1-3 h，使所述生物标志物的核酸适体固定附着在所述超分子水凝胶修饰层上，进而获得电化学传感器电极。
2.根据权利要求1所述的电化学传感器电极，其特征在于，所述电极基体包括金电极。
3.一种电化学传感器电极的制备方法，其特征在于包括：
1）将鸟苷、吡啶-4-硼酸化合物与KCl的水溶液混合，待所述鸟苷和吡啶-4-硼酸化合物完全溶解后形成超分子水凝胶储备液，将超分子水凝胶的储备液滴加在电极基体的表面，待所述超分子水凝胶的储备液干燥后形成超分子水凝胶修饰层，获得水凝胶修饰的电极基体；
2）将所述水凝胶修饰的电极基体置于生物标志物的核酸适体溶液中孵育处理1-3 h，使所述生物标志物的核酸适体固定附着在所述超分子水凝胶修饰层上，进而获得电化学传感器电极，其中，所述电极基体包括金属电极基体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：在所述超分子水凝胶储备液中，鸟苷、吡啶-4-硼酸与KCl的摩尔比为1：1：0.125-1：1：1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述鸟苷、吡啶-4-硼酸与KCl于所述超分子水凝胶储备液中的总质量浓度为0.1-10 mg mL-1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述生物标志物的核酸适体溶液的浓度为0.1-10 ng mL-1。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的生物标志物包括癌胚抗原、甲胎蛋白、CA125、CA153、MUC1中的任意一种。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤2）还包括：采用缓冲液对孵育处理后的水凝胶修饰的电极基体进行清洗，以除去电极基体表面非特异性吸附的核酸适体。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液包括pH7.0 tris-HCl。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的电极基体的直径为1-6 mm。
11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的电极基体为金电极。
12.一种非诊断目的的生物标志物检测的方法，其特征在于包括：将权利要求1-2中任一项所述的电化学传感器电极置于不同浓度的生物标志物样品溶液中浸泡处理后作为三电极体系中的工作电极，以交流阻抗模式测定工作电极表面电荷转移阻抗，进而实现对生物标志物的检测。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述的三电极体系中的参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为Pt电极，电解液为5.0 mM 的[Fe(CN)6]3-/4-溶液。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述的生物标志物包括癌胚抗原、甲胎蛋白、CA125、CA153、MUC1中的任意一种。
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