CN110106256B - 一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其应用 - Google Patents

一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其应用，有助于解决海洋种类混杂等问题，为鲳鲹养殖，鲳鲹资源保护、合理利用以及生物多样性研究提供技术支撑。一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物，包括引物CSF和引物CSR，具体序列如下：CSF：GTCATACGCTCCCGAAGAT；CSR：TAGGGCTAAGCATAGTGGG。分子标记引物用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹;将包括所述的分子标记引物以及PCR反应体系试剂的试剂盒应用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹；还包括所述分子标记用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹，还包括鉴别其苗种。从结果来看两种鱼类存在2个碱基的差异，表现为1个转换，1个颠换，其结果稳定，可重复性强。

Description

一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种鉴别卵形鲳鲹苗种和布氏鲳鲹苗种的分子标记引物及其应用。
背景技术
卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)与布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)均隶属于鲈形目(Perciformes)，鲹科(Carangidae)，鲳鲹属(Trachinotus)，广泛分布于印度洋、太平洋和大西洋的温带、热带海域。卵形鲳鲹与布氏鲳鲹均属经济价值较高的海产鱼类，我国海南、广东和福建沿岸自上世纪90年代起就开展了这两种鲳鲹的网箱养殖。由于两种鲳鲹外形极为相似，中国沿海各地均称为黄腊鲳、海水白鲳或金鲳。虽然两种鲳鲹极为相似，但布氏鲳鲹的适温性较卵形鲳鲹差，仅能在海南顺利越冬，在较寒冷的广东以及福建沿岸难以越冬养殖，每当遭遇强寒潮时就会发生大批量死亡，造成严重的经济损失。
在实际生产中，由于无法从外观上区分两种鲳鲹苗种，许多布氏鲳鲹苗种会被当成卵形鲳鲹苗种来销售与养殖，无疑会造成经济损失。目前用于卵形鲳鲹与布氏鲳鲹苗种直观的方法还未见正式报道。因此寻找卵形鲳鲹与布氏鲳鲹的可靠分子标记，从混杂的种质中鉴别区别两种鲳鲹成为一个亟待解决的问题。
发明内容
针对以上问题，本发明的目的在于提供一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其应用，有助于解决海洋种类混杂等问题，为鲳鲹养殖，鲳鲹资源保护、合理利用以及生物多样性研究提供技术支撑。
本发明的技术方案如下：
一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物，包括引物CSF和引物CSR，引物CSF的序列如SEQ ID NO:1所示，引物CSR的序列如SEQ ID NO:2所示，具体序列如下：
CSF：GTCATACGCTCCCGAAGAT；
CSR：TAGGGCTAAGCATAGTGGG。
一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物的应用，其特征在于，分子标记引物用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹，还包括鉴别其苗种。
鉴别的方法包括如下步骤：
1)选取卵形鲳鲹和布氏鲳鲹物种组成样本群体，分别提取两个样本群体的DNA；
2)分别以步骤1)提取的DNA为模板，将引物CSF和引物CSR通过PCR反应体系进行扩增；
3)对步骤2)所得的扩增产物进行纯化、测序，分别得到卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记的序列；
4)比对测序结果，鉴别其种类；
其中，步骤3)所述的卵形鲳鲹的分子标记的序列如SEQ ID NO:3所示，布氏鲳鲹的分子标记的序列如SEQ ID NO:4所示；
步骤2)中所述PCR反应体系的试剂组成包括：超纯水17.5ul、10×buffer2.5ul、dNTPs 2ul、rTaq 0.15ul、DNA模板1ul、Primer各1ul；
所述扩增的程序包括：94℃预变性2～5min、然后94℃变性35sec、50℃～53℃退火30～35sec、72℃延伸35sec、进行30～38个循环、最后72℃延伸3～10min，4℃保存。
进一步地，所述的鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物的应用，将包括所述的分子标记引物以及PCR反应体系试剂的试剂盒应用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹；还包括所述分子标记用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹。
本发明的有益效果如下：
本发明利用所设计的鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记的引物进行PCR扩增，得到分子标记的序列，从结果来看两种鱼类存在2个碱基的差异，表现为1个转换，1个颠换，其结果稳定，可重复性强；
本发明从基因组的层面上、采用分子标记的技术提供一种有利于应用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹两个不同物种的方法，有效避免了因外观形态难以区分等可能造成经济损失、生态环境破坏等问题，有助于解决海洋种质混杂问题，为鲳鲹养殖，鲳鲹资源保护、合理利用以及生物多样性研究提供技术支撑；
本发明的鉴别方法上的操作简单，引物特异性强，利用PCR扩增的效率高，易于掌握，其鉴别结果具有较高的准确性和稳定性。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其鉴别方法：
1)选取采集自海南三亚沿岸海域内的卵形鲳鲹和布氏鲳鲹物种各5个个体，组成样本群体，分别提取两个样本群体的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，以引物CSF和引物CSR分别通过PCR反应体系进行扩增；
所述的PCR反应体系的组成为：
0.2ml离心管中依次加入：
Figure BDA0002032602550000031
PCR扩增程序为94℃预变性2min，(94℃变性15sec，50℃退火15sec，72℃延伸15sec)×38个循环，72℃延伸3min，4℃保存，可长期保存。
3)对PCR产物进行纯化后测序，并对2个群体的测序结果进行比对，鉴别其种类。
实施例2
一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其鉴别方法：
1)选取采集自海南三亚沿岸海域内的卵形鲳鲹和布氏鲳鲹苗种各5个个体，组成样本群体，分别提取两个样本群体的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，以引物CSF和引物CSR分别通过PCR反应体系进行扩增；
所述的PCR反应体系的组成为：
0.2ml离心管中依次加入：
Figure BDA0002032602550000041
PCR扩增程序为94℃预变性4min，(94℃变性35sec，53℃退火30sec，72℃延伸15sec)×30个循环，72℃延伸10min，4℃保存，可长期保存。
3)对PCR产物进行纯化后测序，并对2个群体的测序结果进行比对，鉴别其种类。
实施例3
一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其鉴别方法：
1)选取采集自海南三亚沿岸海域内的卵形鲳鲹和布氏鲳鲹苗种各5个个体，组成样本群体，分别提取两个样本群体的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，以引物CSF和引物CSR分别通过PCR反应体系进行扩增；
所述的PCR反应体系的组成为：
0.2ml离心管中依次加入：
Figure BDA0002032602550000042
PCR扩增程序为94℃预变性5min，(94℃变性35sec，50℃退火35sec，72℃延伸35sec)×38个循环，72℃延伸10min，4℃保存，可长期保存。
3)对PCR产物进行纯化后测序，并对2个群体的测序结果进行比对，鉴别其种类。
由卵形鲳鲹苗种和布氏鲳鲹苗种mtDNA CS基因75bp序列排序结果可以看出卵形鲳鲹苗种和布氏鲳鲹苗种存在2个碱基的差异，表现为1个转换，1个颠换。
卵形鲳鲹苗种和布氏鲳鲹苗种的mtDNA CS基因75bp序列比对结果为：
卵形鲳鲹苗种：ATGAAGCCCA ACCACGAAAG TGACTTTACA TAACCTGAAC
布氏鲳鲹苗种：********** ********** **********CT********
Ruler：.........10.........20.........30.........40
卵形鲳鲹苗种：CCACGAAAGC TAAGAAACAA ACTGGGATTA GATAC
布氏鲳鲹苗种：********** ********** ********** *****
Ruler：.........50.........60.........70....75
(其中“*”表示相同的碱基序列位点)
测序结果表明，5尾卵形鲳鲹苗种样品扩增结果一致，同时5尾布氏鲳鲹苗种样品扩增结果一直，结果稳定且可重复性强。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物及其应用
<141> 2019-04-18
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gtcatacgct cccgaagat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tagggctaag catagtggg 19
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atgaagccca accacgaaag tgactttaca taacctgaac ccacgaaagc taagaaacaa 60
actgggatta gatac 75
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
atgaagccca accacgaaag tgactttaca ctacctgaac ccacgaaagc taagaaacaa 60
actgggatta gatac 75

Claims (3)

1.一种鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物的应用，其特征在于，鉴别的方法包括如下步骤：1）选取卵形鲳鲹和布氏鲳鲹物种组成样本群体，分别提取两个样本群体的DNA；2）分别以步骤1）提取的DNA为模板，将分子标记引物通过PCR反应体系进行扩增；3）对步骤2）所得的扩增产物进行纯化、测序，分别得到卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记的序列；4）比对测序结果，鉴别其种类；
步骤2）所述的分子标记引物包括引物CSF和引物CSR，引物CSF的序列如SEQ ID NO:1所示，引物CSR的序列如SEQ ID NO:2所示；
步骤3）所述的卵形鲳鲹的分子标记的序列如SEQ ID NO:3所示，布氏鲳鲹的分子标记的序列如SEQ ID NO:4所示；
所述分子标记引物用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹；
所述分子标记用于鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹。
2.由权利要求1所述的鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物的应用，其特征在于，步骤2）中所述PCR反应体系的试剂组成包括：超纯水17.5ul、10×buffer 2.5ul、dNTPs2ul、rTaq 0.15ul、DNA模板 1ul、Primer各1ul。
3.由权利要求1所述的鉴别卵形鲳鲹和布氏鲳鲹的分子标记引物的应用，其特征在于，步骤2）中所述扩增的程序包括：94℃预变性2~5min、然后94℃变性35sec、50℃~53℃退火30~35sec、72℃延伸35sec、进行30~38个循环、最后72℃延伸3~10min，4℃保存。
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