CN110106235A - 一种基于数字微滴pcr无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法 - Google Patents
一种基于数字微滴pcr无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，包括以下步骤：采集孕妇血浆样本并分离出游离DNA；用去离子水洗脱游离DNA，形成待测染色体；将正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，形成参照染色体；对待测染色体及参照染色体进行定量标记，形成靶标区域；在靶标区域内选择目标序列设计引物和探针；选择具有相同探针的引物对目标序列中潜在的二级结构进行筛选，形成靶向区域；通过PCR反应体系对靶向区域进行PCR扩增和结果定量分析；确定靶向区域中DNA分子的拷贝数；判断孕妇血浆样本中胎儿是否存在非整倍体染色体。有益效果：在保证准确率的同时，降低设备门槛。
Description
技术领域
本发明涉及数字PCR技术领域，具体来说，涉及一种基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法。
背景技术
染色体非整倍体是是染色体疾病中最常见的一种，主要是染色体数目和结构异常，其中三体比例最高，即21、18和13三体(t21、t18和t13)。胎儿非整倍体诊断的新标准是通过绒毛膜取样或羊水穿刺术获得胎儿样本进行核型分析。这些侵入性操作可能导致医源性流产和感染。因此，标准的产前护理使用孕妇血清筛查和超声测量来识别高危妊娠的妇女，然后提供诊断。然而，在筛查中，由于高比例的假阳性(约5％)，经常需要对正常胎儿进行侵入性取样。此外，这些筛查方法的检测率相对较低(50％-95％)。基于这些原因，世界各地的研究人员正在致力于开发一种无创、准确的产前检测方法。
母体血液中胎儿游离DNA(cff DNA)的发现为产前诊断提供了新的可能性，但母体血浆中cff DNA含量低，给产前诊断的发展带来了挑战。在妊娠10至21周期间，cff DNA平均占母体血浆DNA的10％-20％。下一代测序技术的发展推动了无创产前技术的发展，基于二代测序的无创产前在2011年被引入临床实验，现已成为诊断非整倍体(t21、t18和t13)最广泛的选择。
数字微滴PCR(dd PCR)作为一种能对核酸进行绝对定量的方法，自2007年以来一直被尝试用于胎儿非整倍体的无创筛查。尽管基于dd PCR的无创产前比基于二代测序的无创产前具有更直接、快速和成本效益的巨大潜力，但有一个障碍影响了基于dd PCR的无创产前在临床实验中的应用，需要大量的PCR阳性反应来保障临床应用的可靠性(由于母亲体内cffDNA的比例较低)，同时二代测序方法设备运行一次需要较多样本，时间相对长，成本相对较高。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明提出一种基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，使用cff DNA样本进行无创产前筛查，采样方式无创简便，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
为此，本发明采用的具体技术方案如下：
一种基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法。
该基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法包括以下步骤：
采集孕妇血浆样本，并从中分离出游离DNA；
采用预先准备好的去离子水洗脱所述游离DNA，形成待测染色体，并放置在-80℃下保存备用；
将预先制备的正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，形成参照染色体；
使用荧光计对所述待测染色体及所述参照染色体进行定量标记，形成靶标区域；
在所述靶标区域内选择目标序列设计引物和探针；
选择具有相同探针的引物对所述目标序列中潜在的二级结构进行筛选，形成靶向区域；
通过预先配置的PCR反应体系对靶向区域进行微滴式数字PCR扩增和结果定量分析；
读取并分析每滴液滴中FAM和VIC荧光强度，确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数；
根据所述靶向区域中DNA分子的拷贝数，判断孕妇血浆样本中胎儿是否存在非整倍体染色体。
进一步的，采集孕妇血浆样本，并从中分离出游离DNA的步骤还包括：
所述孕妇的妊娠期为12-25周；
所述血浆样本的份数为60份；
分离游离DNA所采用的试剂盒为magmax cff DNA提取试剂盒。
进一步的，采用预先准备好的去离子水洗脱所述游离DNA，形成待测染色体，并放置在-80℃下保存备用的步骤还包括：
所述去离子水体积为30μL。
进一步的，将预先制备的正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，形成参照染色体的步骤还包括：
采用Covaris M220声波仪将正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，放入100μl AFA Fiber Snap-Cap管中，运行峰值入射功率50W、每次爆发200个周期、处理时间160s及温度E20℃的程序。
进一步的，使用荧光计对所述待测染色体及所述参照染色体进行定量标记，形成靶标区域的步骤还包括：
所述荧光计的型号为Qubit3.0。
进一步的，在所述靶标区域内选择目标序列设计引物和探针的步骤还包括：
在与所述参照染色体多态性或拷贝数变异不一致的保守区选择目标序列通用探针库分析设计中心设计引物和探针。
进一步的，选择具有相同探针的引物对所述目标序列中潜在的二级结构进行筛选，形成靶向区域的步骤还包括：
对潜在的二级结构进行筛选时采用primer软件。
进一步的，通过预先配置PCR反应体系对靶向区域进行微滴式数字PCR扩增和结果定量分析的步骤还包括：
所述PCR反应体系由15μL的TaqMan Universal Master Mix、0.75μL的40mmol/Ldntp、1.2μL的Droplet Stabilizer、0.1μM的primers及0.05μM的FAM和VIC probes构成；
所述PCR反应体系的反应条件包括依次进行的第一反应阶段、第二反应阶段、第三反应阶段、第四反应阶段、第五反应阶段、第六反应阶段及第七反应阶段；
其中，第三反应阶段与所述第四反应阶段之间往复循环40次；
第一反应阶段的反应温度25℃和反应时间10min；
第二反应阶段的反应温度95℃和反应时间10min；
第三反应阶段的反应温度94℃和反应时间20s；
第四反应阶段的反应温度60℃和反应时间60s；
第五反应阶段的反应温度72℃和反应时间5min；
第六反应阶段的反应温度98℃和反应时间10min；
第七反应阶段的反应温度12℃和反应时间+∞；
所述结果定量分析包括液滴的数量分析、完整性分析和荧光信号分析；
所述PCR反应体系的质量控制标准为每30μl样品形成400-500万个液滴，包括至少98％的完整液滴。
进一步的，读取并分析每滴液滴中FAM和VIC荧光强度，确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数的步骤还包括：
确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数的公式为：
R21：18＝(21号染色体胎儿数)×(f)+(21染色体母亲人数)×(1-f)/(18染色体胎儿数)×(f)+(18染色体母亲人数)×(1-f)；
其中，f是母体血浆中游离DNA的拷贝数。
进一步的，所述靶向区域中DNA分子的拷贝数，判断孕妇血浆样本中胎儿是否存在非整倍体染色体的步骤还包括：
使用z值来确定测试样本的整倍体状态，z值表示与整倍体样本数据集平均值的标准差，z值cut-off为3用于将样本分类为整倍体或非整倍体。
本发明的有益效果为：
(1)、本发明以t13、t21和t18为模型，利用通用锁定核酸探针(LNA)建立了多重ddPCR分析方法，能够可靠地区分整倍体和非整倍体样本。并且依据泊松分布进行了统计分析，为获得可靠结果假定了理想的条件，建立了多重dd PCR分析的判读cut-off值。
(2)、本发明使用cff DNA样本进行无创产前筛查，采样方式无创简便。数字微滴PCR运行一次需要样本较少，便于中小实验室操作，快速，运行时间短，与基于二代测序方法无创产前相比更直接、快速，并有助于降低成本。
(3)、本发明基于数字微滴PCR的无创产前胎儿染色体非整倍体筛选在保证准确率的同时，降低了设备门槛，且能够降低成本及单次运行样本，使得基于数字微滴PCR的无创产前胎儿染色体非整倍体筛选的开展更为灵活。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例的一种基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法的流程图。
具体实施方式
为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。
根据本发明的实施例，提供了一种基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法。
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明，如图1所示，根据本发明实施例的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法。
该基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法包括以下步骤：
步骤S101，采集孕妇血浆样本，并从中分离出游离DNA；
步骤S102，采用预先准备好的去离子水洗脱所述游离DNA，形成待测染色体，并放置在-80℃下保存备用；
步骤S103，将预先制备的正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，形成参照染色体；
步骤S104，使用荧光计对所述待测染色体及所述参照染色体进行定量标记，形成靶标区域；
其中，通过设计引物和探针来定量21号染色体(chr21)、13号染色体(chr13)和18号染色体(chr18)的DNA拷贝数。
步骤S105，在所述靶标区域内选择目标序列设计引物和探针；
步骤S106，选择具有相同探针的引物对所述目标序列中潜在的二级结构进行筛选，形成靶向区域；从而最大限度地减少多重PCR反应中不必要的引物间相互作用，进行了碱基基复合优化。
步骤S107，通过预先配置的PCR反应体系对靶向区域进行微滴式数字PCR扩增和结果定量分析；
本发明所涉及数字微滴PCR实验均在the RainDrop Digital PCR System上进行；在配置PCR反应体系后使用RainDrop微滴生成器进行乳液生产，从而提供小的反应室。
步骤S108，读取并分析每滴液滴中FAM和VIC荧光强度，确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数；
步骤S109，根据所述靶向区域中DNA分子的拷贝数，判断孕妇血浆样本中胎儿是否存在非整倍体染色体。
在一个实施例中，采集孕妇血浆样本，并从中分离出游离DNA的步骤还包括：
所述孕妇的妊娠期为12-25周；
所述血浆样本的份数为60份；
分离游离DNA所采用的试剂盒为magmax cff DNA提取试剂盒。
在一个实施例中，采用预先准备好的去离子水洗脱所述游离DNA，形成待测染色体，并放置在-80℃下保存备用的步骤还包括：
所述去离子水体积为30μL。
在一个实施例中，将预先制备的正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，形成参照染色体的步骤还包括：
采用Covaris M220声波仪将正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，放入100μl AFA Fiber Snap-Cap管中，运行峰值入射功率50W、每次爆发200个周期、处理时间160s及温度E20℃的程序。
在一个实施例中，使用荧光计对所述待测染色体及所述参照染色体进行定量标记，形成靶标区域的步骤还包括：
所述荧光计的型号为Qubit3.0。
在一个实施例中，在所述靶标区域内选择目标序列设计引物和探针的步骤还包括：
在与所述参照染色体多态性或拷贝数变异不一致的保守区选择目标序列通用探针库分析设计中心设计引物和探针。
在一个实施例中，选择具有相同探针的引物对所述目标序列中潜在的二级结构进行筛选，形成靶向区域的步骤还包括：
对潜在的二级结构进行筛选时采用primer软件。
在一个实施例中，通过预先配置PCR反应体系对靶向区域进行微滴式数字PCR扩增和结果定量分析的步骤还包括：
所述PCR反应体系由15μL的TaqMan Universal Master Mix、0.75μL的40mmol/Ldntp、1.2μL的Droplet Stabilizer、0.1μM的primers及0.05μM的FAM和VIC probes构成；
所述PCR反应体系的反应条件包括依次进行的第一反应阶段、第二反应阶段、第三反应阶段、第四反应阶段、第五反应阶段、第六反应阶段及第七反应阶段；
其中，第三反应阶段与所述第四反应阶段之间往复循环40次；
第一反应阶段的反应温度25℃和反应时间10min；
第二反应阶段的反应温度95℃和反应时间10min；
第三反应阶段的反应温度94℃和反应时间20s；
第四反应阶段的反应温度60℃和反应时间60s；
第五反应阶段的反应温度72℃和反应时间5min；
第六反应阶段的反应温度98℃和反应时间10min；
第七反应阶段的反应温度12℃和反应时间+∞；
所述结果定量分析包括液滴的数量分析、完整性分析和荧光信号分析；
所述PCR反应体系的质量控制标准为每30μl样品形成400-500万个液滴，包括至少98％的完整液滴。
在一个实施例中，读取并分析每滴液滴中FAM和VIC荧光强度，确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数的步骤还包括：
确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数的公式为：
R21：18＝(21号染色体胎儿数)×(f)+(21染色体母亲人数)×(1-f)/(18染色体胎儿数)×(f)+(18染色体母亲人数)×(1-f)；
其中，f是母体血浆中游离DNA的拷贝数。
对于正常整倍体胎儿和21三体胎儿，理论R21：18值应分别为1和大于1；R21：18值大小取决于母体血浆中cff DNA的含量；例如母体血浆中含有来自t21胎儿的10％cff DNA时，理论比值变为1.05。
在一个实施例中，所述靶向区域中DNA分子的拷贝数，判断孕妇血浆样本中胎儿是否存在非整倍体染色体的步骤还包括：
使用z值来确定测试样本的整倍体状态，z值表示与整倍体样本数据集平均值的标准差，z值cut-off为3用于将样本分类为整倍体或非整倍体。
本发明所选择的具体靶向区域以及引物探针见表1，
表1选择的靶向区域以及引物探针
为了方便理解本发明的上述技术方案，以下结合表格对本发明的上述方案进行详细说明，该基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法的具体实施方案见表2：
表2
如表2所示，表中F代表女性胎儿，M代表男性胎儿，根据实验具体需求设置10组样本，当R21：R18>1.05且Z值>3时，判读为非整倍体。
在表2中样本1、样本2、样本3及样本4的数字微滴结果为T21，判读为21三体，且与下一代测序结果保持一致。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明以t13、t21和t18为模型，利用通用锁定核酸探针(LNA)建立了多重dd PCR分析方法，能够可靠地区分整倍体和非整倍体样本。并且依据泊松分布进行了统计分析，为获得可靠结果假定了理想的条件，建立了多重ddPCR分析的判读cut-off值。本发明使用cff DNA样本进行无创产前筛查，采样方式无创简便。数字微滴PCR运行一次需要样本较少，便于中小实验室操作，快速，运行时间短，与基于二代测序方法无创产前相比更直接、快速，并有助于降低成本。本发明基于数字微滴PCR的无创产前胎儿染色体非整倍体筛选在保证准确率的同时，降低了设备门槛，且能够降低成本及单次运行样本，使得基于数字微滴PCR的无创产前胎儿染色体非整倍体筛选的开展更为灵活。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：
采集孕妇血浆样本，并从中分离出游离DNA；
采用预先准备好的去离子水洗脱所述游离DNA，形成待测染色体，并放置在-80℃下保存备用；
将预先制备的正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，形成参照染色体；
使用荧光计对所述待测染色体及所述参照染色体进行定量标记，形成靶标区域；
在所述靶标区域内选择目标序列设计引物和探针；
选择具有相同探针的引物对所述目标序列中潜在的二级结构进行筛选，形成靶向区域；
通过预先配置的PCR反应体系对靶向区域进行微滴式数字PCR扩增和结果定量分析；
读取并分析每滴液滴中FAM和VIC荧光强度，确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数；
根据所述靶向区域中DNA分子的拷贝数，判断孕妇血浆样本中胎儿是否存在非整倍体染色体。
2.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，采集孕妇血浆样本，并从中分离出游离DNA的步骤还包括：
所述孕妇的妊娠期为12-25周；
所述血浆样本的份数为60份；
分离游离DNA所采用的试剂盒为magmax cff DNA提取试剂盒。
3.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，采用预先准备好的去离子水洗脱所述游离DNA，形成待测染色体，并放置在-80℃下保存备用的步骤还包括：
所述去离子水体积为30μL。
4.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，将预先制备的正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，形成参照染色体的步骤还包括：
采用Covaris M220声波仪将正常女性基因组DNA剪切成200bp的片段DNA，放入100μlAFA Fiber Snap-Cap管中，运行峰值入射功率50W、每次爆发200个周期、处理时间160s及温度E20℃的程序。
5.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，使用荧光计对所述待测染色体及所述参照染色体进行定量标记，形成靶标区域的步骤还包括：
所述荧光计的型号为Qubit3.0。
6.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，在所述靶标区域内选择目标序列设计引物和探针的步骤还包括：
在与所述参照染色体多态性或拷贝数变异不一致的保守区选择目标序列通用探针库分析设计中心设计引物和探针。
7.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，选择具有相同探针的引物对所述目标序列中潜在的二级结构进行筛选，形成靶向区域的步骤还包括：
对潜在的二级结构进行筛选时采用primer软件。
8.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，通过预先配置PCR反应体系对靶向区域进行微滴式数字PCR扩增和结果定量分析的步骤还包括：
所述PCR反应体系由15μL的TaqMan Universal Master Mix、0.75μL的40mmol/L dntp、1.2μL的Droplet Stabilizer、0.1μM的primers及0.05μM的FAM和VIC probes构成；
所述PCR反应体系的反应条件包括依次进行的第一反应阶段、第二反应阶段、第三反应阶段、第四反应阶段、第五反应阶段、第六反应阶段及第七反应阶段；
其中，第三反应阶段与所述第四反应阶段之间往复循环40次；
第一反应阶段的反应温度25℃和反应时间10min；
第二反应阶段的反应温度95℃和反应时间10min；
第三反应阶段的反应温度94℃和反应时间20s；
第四反应阶段的反应温度60℃和反应时间60s；
第五反应阶段的反应温度72℃和反应时间5min；
第六反应阶段的反应温度98℃和反应时间10min；
第七反应阶段的反应温度12℃和反应时间+∞；
所述结果定量分析包括液滴的数量分析、完整性分析和荧光信号分析；
所述PCR反应体系的质量控制标准为每30μl样品形成400-500万个液滴，包括至少98％的完整液滴。
9.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，读取并分析每滴液滴中FAM和VIC荧光强度，确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数的步骤还包括：
确定所述靶向区域中DNA分子的拷贝数的公式为：
R21：18＝(21号染色体胎儿数)×(f)+(21染色体母亲人数)×(1-f)/(18染色体胎儿数)×(f)+(18染色体母亲人数)×(1-f)；
其中，f是母体血浆中游离DNA的拷贝数。
10.根据权利要求1所述的基于数字微滴PCR无创产前胎儿染色体非整倍体筛查方法，其特征在于，所述靶向区域中DNA分子的拷贝数，判断孕妇血浆样本中胎儿是否存在非整倍体染色体的步骤还包括：
使用z值来确定测试样本的整倍体状态，z值表示与整倍体样本数据集平均值的标准差，z值cut-off为3用于将样本分类为整倍体或非整倍体。
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