CN110106204A - 多功能特异性dna杂化-门控介孔二氧化硅基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents

多功能特异性dna杂化-门控介孔二氧化硅基因载体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多功能特异性DNA杂化‑门控介孔二氧化硅基因载体及其制备方法和应用。以介孔二氧化硅颗粒为载体，出粒径在50‑100纳米的颗粒；在表面修饰锚定DNA并于DNA杂化体形成门控结构，实现了纳米颗粒的可以实现药物特定靶点释放。同时在颗粒表面修饰聚醚酰亚胺负载质粒，实现药物与基因联合治疗。本发明合成过程简便，无毒，快捷，产量大。在体外细胞毒性试验中，细胞存活率为75.1％～95％，这种多功能特异性DNA杂化‑门控介孔二氧化硅基因载体具有良好的生物安全性。

Description

多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及一种多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
具有特异性识别和零过早释放的理想药物递送***的设计，特别是由独特的内源性刺激引发的受控和特异性释放，在纳米载体的设计中一直是一个巨大的挑战。介孔二氧化硅纳米粒子(MSNPs)由于其可控的介孔结构，高比表面积，良好的生物相容性被广泛应用于药物递送***。同时其表面具有的丰富可修饰集团，可用于开发其零过早释放，时空控释的功能。然而常规的载药介孔二氧化硅纳米颗粒在体外储存和体内运输的过程中都存在药物释放的问题，造成了药物的大量损失，同时可能产生一定的副作用。
微小RNA(miRNA)是短的非编码RNA分子，在各种细胞过程中调节基因表达。特别是在癌症发生，发展和转移期间，肿瘤与其正常组织对应物相比显示出不同的miRNA表达，因此为癌症诊断和分类以及潜在的治疗靶标提供了新的生物标志物。通过一般分子设计，抗miRNA 链可与DNA适体偶联形成DNA杂交体，对靶肿瘤细胞表面过表达的受体具有特异性识别能力，并通过互补碱基配对的方式对miRNA链具有排斥反应。由于适配体的二级结构，可能是双链体，四链体或发夹茎，设计的DNA杂合体不仅是一种有前途的双重识别生物分子和细胞的靶标剂，而且是受控药物的理想守门人。一旦通过DNA-杂化-门控纳米载体递送到肿瘤细胞中识别和内吞作用，过表达的内源性miRNA作为通过与DNA杂交体的竞争性杂交解锁纳米载体，并可以通过microRNA控制药物释放，从而导致肿瘤细胞的持续致死性。如果筛选出在特定病理细胞中专门表达的microRNA，化学疗法和基因疗法的组合应该为有针对性和个性化治疗人类疾病铺平道路。
同时，单一的药物治疗通常无法达到预想的治疗效果，基因转染作为一种非常常规的生物和医药技术，常与化学药物治疗进行联合治疗，从而实现更好的治疗效果。
由此我们设计了一种多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。其同时具有药物及基因荷载的功能，细胞毒性相对较小，并且可以实现药物特定靶点释放等优势。该新型多功能基因纳米载体具有重大的意义，在生物技术和医药技术领域具有重要的科研和临床应用前景。
发明内容
本发明为解决背景技术中提出的技术问题，提出一种多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体的制备方法及应用。
本发明的第一个技术方案是多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体的制备方法，主要步骤包括：
1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制备，制得的直径为50～100纳米；
2)采用两步法制备水溶性羧基的介孔二氧化硅纳米颗粒；
3)在羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面修饰DNA杂化交联体，制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体。
4)DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺，制备多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
所述的步骤1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法步骤如下：
1)介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制得：1)在反应容器中配制浓度为1％～ 2％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液10～20毫升；
2)加入5～10毫升的无水乙醇和100～200微升的乙二醇，于400～500转/分钟，50～ 60℃加热条件下，搅拌反应10～30分钟；
3)向反应容器中加入200～300微升的正硅酸乙酯于600～700转/分钟，60～70℃加热条件下搅拌反应10～20分钟，然后关闭加热再于400～500转/分钟条件下，搅拌反应30～ 40分钟；
4)反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心20～30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
5)取制得的二氧化硅纳米颗粒10～20毫克，用无水乙醇配制成5～20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
6)向反应容器中加入0.5～0.6克氯化钠，于400～500转/分钟，50～60℃加热条件下搅拌反应3～5小时；
7)反应结束后，静止20～30分钟，将上清转移至一离心管中，以12,000～13,000转/ 分钟，离心20～30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀1～3遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒；
所述的步骤2)采用两步法制备水溶性羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒，具体步骤如下：
1)取介孔二氧化硅纳米颗粒10～20毫克，用二甲基亚砜制成5～20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
2)加入10～20微升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，于400～500转/分钟，搅拌6～10小时；
3)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心20～30分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
4)取氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒10～20毫克，用N，N-二甲基甲酰胺制成5～20 毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
5)加入100毫克的丁二酸酐，于400～500转/分钟，搅拌6～10小时；
6)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心20～30分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
所述的步骤3)采用酰胺反应制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体，具体步骤如下：
1)将上述步骤2)中的羧基化介孔二氧化硅与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以摩尔比1:4:1在pH＝7.4的PBS中搅拌反应10～20分钟，活化羧基；
2)在100μL,5.0mg mL-1硅球中加入10～75微升100μM锚定DNA,37℃下震荡反应4～10小时；
3)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心8～10分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍；
4)将上述载体配成1～10毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为 1:2～1:20的药物，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6～12小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到载药的介孔二氧化硅纳米颗粒。
5)加入为1nmol～6nmol的杂化DNA杂化体10μL～60μL，37℃下震荡反应1～2小时；
6)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心8～10分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米颗粒。
所述的步骤4)DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下：
1)将水溶性DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体溶解至2～3毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入75～100微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于300～400转/分钟磁力条件下，室温搅拌反应10～12小时，然后以12,000～13,000转/分钟，离心8～ 10分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体；
2)将上述沉淀全部加入去离子水中，将质粒按照质量份数比＝0.5:0.5～1，继续搅拌3～ 4小时后离心纯化，制得吸附质粒的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
本发明的第二个技术方案是：采用上述方法制备得到的功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体：其直径为50～100纳米，细胞存活率为80％～95％。
本发明的第三个技术方案是：采用上述方法制备得到的功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体的应用被特定的miRNA竞争从而将DNA杂化门控打开实现药物特异性释放。
本发明的优势在于：
1)制备的基因纳米载体的粒径在50～100纳米，细胞存活率为80％～95％。
2)可以被特定的miRNA竞争从而将DNA杂化门控打开实现药物特异性释放。
3)可以负载质粒，从而实现基因联合治疗或表达荧光。
4)可负载的药物具有多样性，也可用于包载荧光素用作荧光探针。
附图说明
图1：用CTAB模板法制备的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体的透射电子显微镜照片(形貌分析)。
图2：加入与DNA杂化体碱基互补配对的miRNA竞争从而将DNA杂化门控打开实现药物特异性释放的药物释放曲线。
图3：多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体细胞毒性分析柱状图。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1
步骤1)介孔二氧化硅纳米颗粒的采用CTAB模板法制备方法步骤如下：
1)在反应容器中配制浓度为1％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液20毫升；
2)加入5毫升的无水乙醇和100微升的乙二醇，于400转/分钟，60℃加热条件下，搅拌反应30分钟；
3)向反应容器中加入300微升的正硅酸乙酯于700转/分钟，70℃加热条件下搅拌反应 10分钟，然后关闭加热再于400转/分钟条件下，搅拌反应30分钟；
4)反应结束后，以12,000转/分钟，离心20分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
5)取制得的二氧化硅纳米颗粒10～20毫克，用无水乙醇配制成20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
6)向反应容器中加入0.6克氯化钠，于500转/分钟，60℃加热条件下搅拌反应5小时；
7)反应结束后，静止30分钟，将上清转移至一离心管中，以12,000转/分钟，离心20～ 30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀1～3遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒；
步骤2)采用两步法制备水溶性羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒，具体步骤如下：
1)取介孔二氧化硅纳米颗粒20毫克，用二甲基亚砜制成5毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
2)加入10微升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，于400转/分钟，搅拌6小时；
3)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心30分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
4)取氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒20毫克，用N，N-二甲基甲酰胺制成5毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
5)加入100毫克的丁二酸酐，于400转/分钟，搅拌6小时；
6)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤3)采用酰胺反应制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体，具体步骤如下：
1)将上述步骤2)中的羧基化介孔二氧化硅与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以摩尔比1:4:1在pH＝7.4的PBS中搅拌反应10分钟，活化羧基；
2)在100μL,5.0mg mL-1硅球中加入20微升100μM锚定DNA,37℃下震荡反应6小时；
3)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍；
4)将上述载体配成1～10毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:4 的药物，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀3遍，得到载药的介孔二氧化硅纳米颗粒。
5)加入为1nmol的杂化DNA杂化体60μL，37℃下震荡反应1小时；
6)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤4)DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下：
1)将水溶性DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体溶解至2毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入75微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400转/分钟磁力条件下，室温搅拌反应10小时，然后以12,000～13,000转/分钟，离心8分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体；
2)将上述沉淀全部加入去离子水中，将质粒按照质量份数比＝0.5：0.5，继续搅拌3小时后离心纯化，制得吸附质粒的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
实施例2
步骤1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法步骤如下：
1)介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制得：1)在反应容器中配制浓度为1％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液15毫升；
2)加入5毫升的无水乙醇和100微升的乙二醇，于500转/分钟，60℃加热条件下，搅拌反应10分钟；
3)向反应容器中加入200微升的正硅酸乙酯于600转/分钟，60℃加热条件下搅拌反应 10～20分钟，然后关闭加热再于450转/分钟条件下，搅拌反应30分钟；
4)反应结束后，以12,000转/分钟，离心20分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
5)取制得的二氧化硅纳米颗粒10毫克，用无水乙醇配制成5毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
6)向反应容器中加入0.5克氯化钠，于450转/分钟，60℃加热条件下搅拌反应3小时；
7)反应结束后，静止20分钟，将上清转移至一离心管中，以12,000转/分钟，离心20分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀3遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒；
步骤2)采用两步法制备水溶性羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒，具体步骤如下：
1)取介孔二氧化硅纳米颗粒10毫克，用二甲基亚砜制成5毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
2)加入10微升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，于400转/分钟，搅拌7小时；
3)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
4)取氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒10毫克，用N，N-二甲基甲酰胺制成10毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
5)加入100毫克的丁二酸酐，于500转/分钟，搅拌6小时；
6)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤3)采用酰胺反应制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体，具体步骤如下：
1)将上述步骤2)中的羧基化介孔二氧化硅与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以摩尔比1:4:1在pH＝7.4的PBS中搅拌反应15分钟，活化羧基；
2)在100μL,5.0mg mL-1硅球中加入45微升100μM锚定DNA,37℃下震荡反应6小时；
3)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心8分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍；
4)将上述载体配成5毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:5的药物，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀1～ 3遍，得到载药的介孔二氧化硅纳米颗粒。
5)加入为3nmol的杂化DNA杂化体30μL，37℃下震荡反应1小时；
6)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀 3遍，得到DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤4)DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下：
1)将水溶性DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体溶解至2毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入80微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400转/分钟磁力条件下，室温搅拌反应10小时，然后以12,000转/分钟，离心8分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体；
2)将上述沉淀全部加入去离子水中，将质粒按照质量份数比＝0.5:0.6，继续搅拌3小时后离心纯化，制得吸附质粒的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
实施例3
步骤1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法步骤如下：
1)介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制得：1)在反应容器中配制浓度为1.5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液10～20毫升；
2)加入7毫升的无水乙醇和200微升的乙二醇，于500转/分钟，50℃加热条件下，搅拌反应15分钟；
3)向反应容器中加入250微升的正硅酸乙酯于650转/分钟，65℃加热条件下搅拌反应15分钟，然后关闭加热再于500转/分钟条件下，搅拌反应30分钟；
4)反应结束后，以12,000转/分钟，离心25分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
5)取制得的二氧化硅纳米颗粒10毫克，用无水乙醇配制成15毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
6)向反应容器中加入0.55克氯化钠，于500转/分钟，55℃加热条件下搅拌反应3小时； 7)反应结束后，静止25分钟，将上清转移至一离心管中，以12,000转/分钟，离心25分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀3遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒；
步骤2)采用两步法制备水溶性羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒，具体步骤如下：
1)取介孔二氧化硅纳米颗粒17毫克，用二甲基亚砜制成10毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
2)加入20微升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，于500转/分钟，搅拌9小时；
3)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心30分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
4)取氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒15毫克，用N，N-二甲基甲酰胺制成10毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
5)加入100毫克的丁二酸酐，于500转/分钟，搅拌8小时；
6)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心25分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，得到羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤3)采用酰胺反应制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体，具体步骤如下：
1)将上述步骤2)中的羧基化介孔二氧化硅与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以摩尔比1:4:1在pH＝7.4的PBS中搅拌反应20分钟，活化羧基；
2)在100μL,5.0mg mL-1硅球中加入45微升100μM锚定DNA,37℃下震荡反应6小时；
3)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心8分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍；
4)将上述载体配成8毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:7的药物，在磁力搅拌条件下，搅拌反应7小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀2遍，得到载药的介孔二氧化硅纳米颗粒。
5)加入为4nmol的杂化DNA杂化体20μL，37℃下震荡反应1.5小时；
6)待反应结束后，以12,000转/分钟，离心9分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，得到DNA 杂化-门控介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤4)DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下：
1)将水溶性DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体溶解至3毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入80微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400转/分钟磁力条件下，室温搅拌反应12小时，然后以12,000转/分钟，离心9分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的 DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体；
2)将上述沉淀全部加入去离子水中，将质粒按照质量份数比＝0.5:0.7，继续搅拌3.5小时后离心纯化，制得吸附质粒的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
实施例4
步骤1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法步骤如下：
1)介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制得：1)在反应容器中配制浓度为1.5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液20毫升；
2)加入7毫升的无水乙醇和150微升的乙二醇，于500转/分钟，55℃加热条件下，搅拌反应25分钟；
3)向反应容器中加入300微升的正硅酸乙酯于650转/分钟，60℃加热条件下搅拌反应 20分钟，然后关闭加热再于500转/分钟条件下，搅拌反应35分钟；
4)反应结束后，以13,000转/分钟，离心25分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
5)取制得的二氧化硅纳米颗粒10毫克，用无水乙醇配制成20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
6)向反应容器中加入0.5克氯化钠，于500转/分钟，55℃加热条件下搅拌反应5小时；
7)反应结束后，静止30分钟，将上清转移至一离心管中，以13,000转/分钟，离心30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀3遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒；
步骤2)采用两步法制备水溶性羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒，具体步骤如下：
1)取介孔二氧化硅纳米颗粒10毫克，用二甲基亚砜制成10毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
2)加入20微升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，于500转/分钟，搅拌10小时；
3)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
4)取氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒10毫克，用N，N-二甲基甲酰胺制成10毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
5)加入100毫克的丁二酸酐，于500转/分钟，搅拌6小时；
6)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心30分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤3)采用酰胺反应制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体，具体步骤如下：
1)将上述步骤2)中的羧基化介孔二氧化硅与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以摩尔比1:4:1在pH＝7.4的PBS中搅拌反应15分钟，活化羧基；
2)在100μL,5.0mg mL-1硅球中加入70微升100μM锚定DNA,37℃下震荡反应5小时；
3)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心8～10分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍；
4)将上述载体配成9毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:6的药物，在磁力搅拌条件下，搅拌反应12小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀 3遍，得到载药的介孔二氧化硅纳米颗粒。
5)加入为5nmol的杂化DNA杂化体15μL，37℃下震荡反应2小时；
6)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤4)DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下：
1)将水溶性DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体溶解至3毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入90微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于300转/分钟磁力条件下，室温搅拌反应12小时，然后以13,000转/分钟，离心9分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体；
2)将上述沉淀全部加入去离子水中，将质粒按照质量份数比＝0.5:0.8，继续搅拌4小时后离心纯化，制得吸附质粒的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
实施例5
步骤1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法步骤如下：
1)介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制得：1)在反应容器中配制浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液20毫升；
2)加入10毫升的无水乙醇和200微升的乙二醇，于450转/分钟，55℃加热条件下，搅拌反应25分钟；
3)向反应容器中加入300微升的正硅酸乙酯于650转/分钟，70℃加热条件下搅拌反应 10分钟，然后关闭加热再于450转/分钟条件下，搅拌反应35分钟；
4)反应结束后，以13,000转/分钟，离心30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
5)取制得的二氧化硅纳米颗粒20毫克，用无水乙醇配制成15毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
6)向反应容器中加入0.6克氯化钠，于500转/分钟，55℃加热条件下搅拌反应4小时；
7)反应结束后，静止30分钟，将上清转移至一离心管中，以13,000转/分钟，离心20分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀2遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒；
步骤2)采用两步法制备水溶性羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒，具体步骤如下：
1)取介孔二氧化硅纳米颗粒16毫克，用二甲基亚砜制成15毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
2)加入20微升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，于500转/分钟，搅拌9小时；
3)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心25分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
4)取氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒20毫克，用N，N-二甲基甲酰胺制成17毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
5)加入100毫克的丁二酸酐，于500转/分钟，搅拌8小时；
6)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心25分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤3)采用酰胺反应制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体，具体步骤如下：
1)将上述步骤2)中的羧基化介孔二氧化硅与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以摩尔比1:4:1在pH＝7.4的PBS中搅拌反应17分钟，活化羧基；
2)在100μL,5.0mg mL-1硅球中加入35微升100μM锚定DNA,37℃下震荡反应10 小时；
3)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心9分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍；
4)将上述载体配成7毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:10 的药物，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀 3遍，得到载药的介孔二氧化硅纳米颗粒。
5)加入为5nmol的杂化DNA杂化体15μL，37℃下震荡反应2小时；
6)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心9分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤4)DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下：
1)将水溶性DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体溶解至2.5毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入80微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400转/分钟磁力条件下，室温搅拌反应11小时，然后以13,000转/分钟，离心10分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体；
2)将上述沉淀全部加入去离子水中，将质粒按照质量份数比＝0.5:0.9，继续搅拌3.5小时后离心纯化，制得吸附质粒的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
实施例6
步骤1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法步骤如下：
1)介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制得：1)在反应容器中配制浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液18毫升；
2)加入9毫升的无水乙醇和180微升的乙二醇，于500转/分钟，60℃加热条件下，搅拌反应10～30分钟；
3)向反应容器中加入280微升的正硅酸乙酯于700转/分钟，70℃加热条件下搅拌反应 15分钟，然后关闭加热再于450转/分钟条件下，搅拌反应40分钟；
4)反应结束后，以13,000转/分钟，离心28分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
5)取制得的二氧化硅纳米颗粒15毫克，用无水乙醇配制成15毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
6)向反应容器中加入0.55克氯化钠，于500转/分钟，60℃加热条件下搅拌反应4.5小时；
7)反应结束后，静止24分钟，将上清转移至一离心管中，以13,000转/分钟，离心28分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀3遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒；
步骤2)采用两步法制备水溶性羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒，具体步骤如下：
1)取介孔二氧化硅纳米颗粒18毫克，用二甲基亚砜制成15毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
2)加入18微升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，于500转/分钟，搅拌8小时；
3)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心23分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
4)取氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒17毫克，用N，N-二甲基甲酰胺制成20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
5)加入100毫克的丁二酸酐，于500转/分钟，搅拌10小时；
6)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心25分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤3)采用酰胺反应制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体，具体步骤如下：
1)将上述步骤2)中的羧基化介孔二氧化硅与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以摩尔比1:4:1在pH＝7.4的PBS中搅拌反应14分钟，活化羧基；
2)在100μL,5.0mg mL-1硅球中加入75微升100μM锚定DNA,37℃下震荡反应7小时；
3)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍；
4)将上述载体配成10毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:18 的药物，在磁力搅拌条件下，搅拌反应10小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀3遍，得到载药的介孔二氧化硅纳米颗粒。
5)加入为2nmol的杂化DNA杂化体40μL，37℃下震荡反应2小时；
6)待反应结束后，以13,000转/分钟，离心10分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，得到DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米颗粒。
步骤4)DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下：
1)将水溶性DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体溶解至2.5毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入100微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于400转/分钟磁力条件下，室温搅拌反应11小时，然后以13,000转/分钟，离心10分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体；
2)将上述沉淀全部加入去离子水中，将质粒按照质量份数比＝0.5:0.8，继续搅拌4小时后离心纯化，制得吸附质粒的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
实施例7
形态观察、粒径及其分布测定。取DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅载体溶液经离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅载体呈均匀规则的球形粒子，其直径在50～100nm范围内可控。所制得的纳米载体如图1所示。
实施例8
1)以PH 7.4磷酸盐缓冲液作为释药介质,将以上述方法制备的载药DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅载体原液分成多份。取一部分做空白组在室温下静置,定时测试，计算药物释放。另一部分加入一定量与DNA杂化碱基互补配对的miRNA做实验组,混匀，室温下静置，定时测试，计算药物释放。
2)颗粒体外释药用紫外可见光光谱仪载药DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅载体的体外释药规律，计算释药率。
取30μl的载药DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅载体溶液，12,000转/分钟，离心8 分钟，将上清取出测其紫外吸收峰值。紫外光谱法测定颗粒原液中药物的吸收峰面积以及离心液中药物的吸收峰面积。由药物吸收峰面积比值的关系从而求出药物的释药率，则
原液的吸收峰面积S0，之后不同时间点缓释的离心液吸收峰面积记为S1、S2、S3、S4、S。根据计算，空白组4h释放2％，24h释放4％；实验组4h释放60％，24h释放90％。根据计算结果作药物缓释曲线(如图2所示)。验证了多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体特异靶点药物释放的功能。
实施例9
MTT法测试多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体的细胞毒性：
1)取处于对数生长期的海拉细胞，0.125％胰蛋白酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为5×104/m1。
2)向96孔板的每孔中加入100μl细胞悬液，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
3)将100μl含有不同浓度(0.03mg/ml、0.01mg/ml、0.003mg/ml、0.001mg/ml、0.0003mg/ml、0.0001mg/ml)的DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅载体溶液加入到新鲜培养基中，并在37℃，5％CO2培养箱中通细胞共培养24h。
4)24h后取出培养板，向每个孔中加入10μl MTT溶液，在37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h后，小心吸取培养孔中的培养基，向每个孔中加入200μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，在摇床上摇动20min，使DMSO溶液充分地溶解Formazan晶体。
5)用酶联免疫检测仪在570nm波长处，以空白孔调零，测定各孔的吸光值A，按下式计算细胞存活率。每组设8个平行，计算其平均值。
细胞存活率(％)＝实验细胞组吸光值(A2)/空白细胞组吸光值(A1)*100％
空白组吸光值为0.1486，实验组细胞吸光值为0.1116-0.1412，计算所得细胞存活率分别为75.1％、80.75％、89.83％、91.5％、92.3％、95％。根据不同浓度细胞组计算的存活率做多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅细胞毒性分析柱状图(如图3所示)。
本发明公开和提出的多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅的制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (7)

1.多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体的制备方法,其特征是,主要步骤如下：
1)介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：介孔二氧化硅纳米颗粒采用CTAB模板法制备，制得的直径为50～100纳米；
2)采用两步法制备水溶性羧基的介孔二氧化硅纳米颗粒；
3)在羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒表面修饰DNA杂化交联体，制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体。
4)DNA杂化-门控多功能介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺，制备多功能特异性DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体。
2.根据权利要求1所述的多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体的制备方法,其特征是,所述步骤1)具体为:
(1)在反应容器中配制浓度为1％～2％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的溶液10～20毫升；
(2)加入5～10毫升的无水乙醇和100～200微升的乙二醇，于400～500转/分钟，50～60℃加热条件下，搅拌反应10～30分钟；
(3)向反应容器中加入200～300微升的正硅酸乙酯于600～700转/分钟，60～70℃加热条件下搅拌反应10～20分钟，然后关闭加热再于400～500转/分钟条件下，搅拌反应30～40分钟；
(4)反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心20～30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀，产物真空干燥后得到二氧化硅纳米颗粒；
(5)取制得的二氧化硅纳米颗粒10～20毫克，用无水乙醇配制成5～20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
(6)向反应容器中加入0.5～0.6克氯化钠，于400～500转/分钟，50～60℃加热条件下搅拌反应3～5小时；
(7)反应结束后，静止20～30分钟，将上清转移至一离心管中，以12,000～13,000转/分钟，离心20～30分钟，并用无水乙醇洗涤沉淀1～3遍，得到介孔二氧化硅纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体的制备方法,其特征是,所述步骤2)具体为:
(1)取介孔二氧化硅纳米颗粒10～20毫克，用二甲基亚砜制成5～20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
(2)加入10～20微升的3-氨丙基三乙氧基硅烷，于400～500转/分钟，搅拌6～10小时；
(3)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心20～30分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(4)取氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒10～20毫克，用N，N-二甲基甲酰胺制成5～20毫克/毫升的溶液并转移至一反应容器中；
(5)加入100毫克的丁二酸酐，于400～500转/分钟，搅拌6～10小时；
(6)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心20～30分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体的制备方法,其特征是,所述步骤3)具体为:采用酰胺反应制备DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体，具体步骤如下：
(1)将上述步骤2)中的羧基化介孔二氧化硅与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以摩尔比1:4:1在pH＝7.4的PBS中搅拌反应10～20分钟，活化羧基；
(2)在100μL,5.0mg mL-1硅球中加入10～75微升100μM锚定DNA,37℃下震荡反应4～10小时；
(3)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心8～10分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍；
(4)将上述载体配成1～10毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:2～1:20的药物，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6～12小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到载药的介孔二氧化硅纳米颗粒。
(5)加入为1nmol～6nmol的杂化DNA杂化体10μL～60μL，37℃下震荡反应1～2小时；
(6)待反应结束后，以12,000～13,000转/分钟，离心8～10分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体的制备方法,其特征是,所述的步骤4)DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体表面连接分子量为600的聚醚酰亚胺方法如下：
(1)将水溶性DNA杂化-门控介孔二氧化硅纳米载体溶解至2～3毫升的去离子水中并转移至玻璃瓶中，然后加入75～100微升、相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并于300～400转/分钟磁力条件下，室温搅拌反应10～12小时，然后以12,000～13,000转/分钟，离心8～10分钟，得到表面吸附有聚醚酰亚胺的DNA杂化-门控介孔二氧化硅基因载体；
(2)将上述沉淀全部加入去离子水中，将质粒按照质量份数比＝0.5:0.5～1，继续搅拌3～4小时后离心纯化，制得吸附质粒的多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法制备得到的多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体,其特征是,制备的基因纳米载体的粒径在50～100纳米，细胞存活率为80％～95％。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法制备得到的多功能DNA杂化-门控靶向介孔二氧化硅基因载体的应用,其特征是,被特定的miRNA竞争从而将DNA杂化门控打开实现药物特异性释放。
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