CN110106144B - 一种诱导造血干细胞向前t系细胞分化的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导造血干细胞向前T系细胞分化的方法和试剂盒，属于生物医学技术领域。本发明将成纤维细胞过表达DLL4蛋白后与造血干细胞共培养，诱导造血干细胞向前T系细胞分化发育；或采用过表达DLL4蛋白的细胞与造血干细胞共培养，诱导纤维化疾病中的造血干细胞向前T系细胞分化发育。本发明诱导获得的T细胞处于胸腺发育DN2或DN3两个重要阶段。诱导的异体DN2或DN3阶段T细胞具有定植胸腺并发育成为功能完全的成熟T细胞，同时细胞数量也在异体胸腺内得到有效大量扩增，并通过异体胸腺内的发育成为具有对受体耐受的T细胞，因此成为通用型Car‑T细胞来源的基础。

Description

一种诱导造血干细胞向前T系细胞分化的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种诱导造血干细胞向前T系细胞分化的方法和试剂盒，属于生物医学技术领域。

背景技术

机体免疫***，特别是T细胞群的重建，是治疗艾滋病、肿瘤、衰老的重大临床问题之一。当前HIV-1感染所致的获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiencysyndrome,AIDS)是一个重大的公共健康威胁，艾滋病往往伴随着免疫功能下降或受到抑制，进而导致一系列临床症状。在完全抑制HIV病毒繁殖和清除病毒后，CD4⁺ T细胞数量和功能逐渐恢复与重建，一直是艾滋病治疗的终极目标。目前抗逆转录病毒治疗(anti-retroviral therapy,ART)能改善患者的生活质量并延长寿命，降低了机会性感染率和早期死亡率，这种效果与病毒引起的免疫退化终止，以及其在一定程度上免疫功能的重建有关。但是该法治疗后短期内，机体免疫重建并不快，外周血CD4⁺T淋巴细胞数增加有限。此外，临床上约有16％患者在ART长期治疗后，病毒得到抑制的情况下仍不能取得良好的免疫重建，导致发生免疫重建不良现象。另一方面，感染艾滋病毒患者随着免疫功能下降，往往合并感染乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)，以及ART治疗过程中药物产生的肝毒性，所以常会导致病人严重的肝硬化和肝功能的丧失。因此，也很有必要寻找有效的治疗策略以满足这些艾滋病合并肝炎病毒感染患者的治疗。

众所周知，胸腺是T淋巴细胞发育和分化的主要场所。本质上，它可被视为一个由高度特化的胸腺上皮细胞构成的三维网络，其间充满着不同发育阶段T细胞。在上皮细胞所提供的各种信号的支持下，从骨髓迁入胸腺的造血祖细胞展开既定的发育程序，经历增殖、定向分化、TCR重排、β选择、阳性选择和阴性选择等复杂发育过程，最终形成一个具有高度多样性，并能有效区分“自我”与“非我”的T细胞库。T细胞在胸腺内的发育是一个高度有序的、多阶段、极为复杂的过程，不同的发育阶段有赖于胸腺微环境所提供的各异的信号。附图1是细胞胸腺发育的流程示意图，淋巴前体细胞(Common lymphoid progenitor,CLP)由骨髓迁入胸腺，遵从一定的发育程序向成熟T细胞分化。根据CD4和CD8表达如否，胸腺T细胞发育分为三个主要阶段，即双阴性(Double Negative,DN)、双阳性(Double Positve,DP)和单阳性(Single Positive,SP)阶段。基于CD117、CD44及CD25表达情况，DN细胞又分作DN1～DN4四群，分别代表不同发育阶段。

不同的体外研究体系已用来模拟淋巴细胞分化发育，OP9体系最为成熟。OP9细胞是取自新生osteopetrotic(op9/op9)小鼠骨髓的基质细胞。该细胞株存在细胞因子M-CSF(Macrophage colony-stimulating factor)的基因缺陷。M-CSF有支持髓系(myeloid)分化的作用，即向CMP(Common myeloid progenitor)细胞方向分化发育，因此缺乏M-CSF表达的OP9细胞可通过限制造血干细胞髓系发育转而向CLP(Common lymphoid progenitor)即淋巴前体细胞方向分化发育，来达到支持B细胞等淋系细胞发育的目的，但不能支持T细胞的体外分化。2002年，Schmitt和

-Pflücker用Notch配体分子DLL1(Delta-likeligand 1)的逆转录病毒表达载体转染OP9细胞，建立了稳定表达DLL1分子的OP9-DL1细胞；DLL1分子在OP9基质细胞表面的过表达提供了T细胞定向分化所需的Notch信号，从而使该基质细胞失去了支持B细胞分化的能力，反而可高效诱导T淋巴细胞的体外生成。随后的研究也表明OP9-DL4(过表达DLL4)也能够发挥同样的作用。OP9-DL1细胞可使与其共培养的造血干细胞产生大量T前体细胞(约扩增1000～4000倍)，并按正常的发育程序分化为功能完全成熟的T淋巴细胞(包括αβTCR⁺和γδTCR⁺T细胞)。而OP9-DL1作为一种贴壁生长的基质细胞则十分易于培养和扩增，用于T细胞的体外诱导更为方便和有效。另外，采用流式分选该共培养体系中的CD45⁺CD44⁺CD25⁺的DN2(Double Negative stage 2)细胞，采用尾静脉注射入Rag2敲除小鼠后，可在Rag2敲除小鼠外周血中检测到CD4⁺T和CD8⁺T的存在，表明共培养获得的DN2细胞具有定植胸腺并进而发育成为成熟T细胞的能力，同时也表明该体外培养体系具有用于体内T细胞重建的潜力。OP9-DL1诱导模型的建立不仅粉碎了长期控制免疫学领域的一种观点即：从淋巴祖细胞发育成为T细胞的过程需要完整的胸腺，T细胞不可能在单层基质细胞的支持下从造血干细胞分化而来；并且使在非胸腺环境下的T细胞体外大规模诱生成为现实。

虽然OP9-DL1基质细胞诱导T细胞培养体系已被越来越多的实验室采纳和使用。但是我们也要看到，该体外诱导***尚存在一些理论上和实际应用方面的问题。首先，OP9细胞不表达MHC分子和CD1d分子，无法实现发育过程中T细胞或NKT细胞的阳性选择和阴性选择；另外，OP9是鼠源的骨髓基质细胞，因此尚需对其诱导产生的人源T淋巴细胞的确切性质做进一步的研究，如：T细胞表面TCR分子的表达谱型、T细胞的体内外功能等。因此也有必要寻找与OP9类似能产生相同作用的细胞类型。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种体外诱导小鼠或人造血干细胞向胸腺T系细胞分化的方法，原代肝成纤维细胞能够通过某种机制，限定造血干细胞向T/B淋巴细胞系分化，并在过表达DLL4后能够促进T细胞的分化和发育，采用肝脏来源的原代成纤维细胞，过表达DLL4后与造血干细胞共培养，能够促进T细胞的分化和发育。人原代肝脏成纤维细胞在过表达DLL4后也具有同样的促进作用，能够促进人脐带来源的造血干细胞向DN2-DN3细胞分化。

本发明的第一个目的是提供一种DLL4在制备诱导造血干细胞向前T细胞系分化药物中的应用。

进一步地，所述的应用具体为将成纤维细胞过表达DLL4蛋白后与造血干细胞共培养，获得诱导造血干细胞向前T系细胞分化的药物。

进一步地，所述的应用具体为将过表达DLL4蛋白的细胞与造血干细胞共培养，获得诱导纤维化疾病中造血干细胞向前T系细胞分化的药物。

进一步地，所述的成纤维细胞为原代肝成纤维细胞。

进一步地，所述的过表达DLL4蛋白的细胞为过表达DLL4蛋白的间充质干细胞、过表达DLL4蛋白的胸腺上皮基质细胞、过表达DLL4蛋白的成纤维细胞中的一种或一种以上组合。

进一步地，所述的造血干细胞是将脐带血细胞红细胞裂解后，用谱系细胞耗竭试剂盒阴选后，采用流式分选人造血干细胞。

进一步地，所述的前T系细胞为DN2细胞和/或DN3细胞。

进一步地，所述的药物为注射剂。

进一步地，所述的药物中还包括诱导分化的试剂。

进一步地，包括成纤维细胞和造血干细胞共培养的试剂。

进一步地，所述的共培养在体外培养时，具体包括如下步骤：

(1)配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7，分装后于-20℃保存；

(2)培养皿提前24h采用小鼠或人DLL4重组蛋白进行包被，包被浓度为10μg/ml 4℃24h或37℃4h；(可选步骤)

(3)复苏DLL4过表达的细胞株，并以1×10⁵细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml；

(4)复苏细胞株，并以5×10⁵细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml，养24h；(实施步骤2请选此步骤)

(5)将1×10⁵分选获得的造血干细胞加入培养皿的培养基中并混匀，置37℃，5％CO₂培养箱培共培养；

(6)每间隔72h半量换液；

(7)并在共培养一定天数后收获细胞将细胞吹散；过70μm孔径筛网，然后采用CD25+磁珠分选或者CD44+CD25+流式抗体标记后流式分选获得DN2或DN3细胞。

本发明的有益效果是：

本发明的方法成功在体外诱导小鼠造血干细胞或人造血干细胞向胸腺T系细胞分化，诱导得到的DN2或DN3是T细胞胸腺发育的两个重要阶段。DN2到DN3是一个相对连续的过程，并且从DN1到DN2细胞经过10次***细胞总数增加1000倍左右，并且在DN2阶段细胞分化已完全限定在T系，同时Υσ和αβT细胞定向分化也已完成；并且DN2与DN3阶段细胞位于T细胞发育的β选择、阳性选择和阴性选择之前，在体外诱导的异体DN2或DN3细胞具有定植胸腺并发育成为功能完全的成熟T细胞同时细胞数也在异体胸腺内得到大量扩增，并通过异体胸腺的阴选和阳选成为没有对受体耐受的T细胞，因此成为通用型Car-T的基础。

附图说明

图1为T细胞胸腺发育流程示意图；

图2为小鼠不同程度肝纤维化下肝组织DLL4mRNA表达水平；

图3为不同临床标本冰冻连续切片分别染色CD31和DLL4抗体；

图4为不同临床标本冰冻连续切片分别染色αSMA和DLL4抗体；

图5为不同临床标本冰冻连续切片分别染色CK18和DLL4抗体；

图6为不同临床标本DLL4的mRNA表达水平；

图7为过表达DLL4的MSCs mRNA表达水平；

图8为OP9-DLL4与造血干细胞共培养实验结果；

图9为MSC-DLL4和3T3-DLL4与造血干细胞共培养实验结果；

图10为MSC-DLL4促使造血干细胞分化发育为CD11b⁺巨噬细胞；

图11为TSC过表达DLL4的TSC-DLL4细胞与HSC体外共培养6天和10天的结果；

图12为MSCs作为阴性对照、原代肝成纤维细胞、P5代肝成纤维细胞，破膜后分别采用αSMA-FITC染色后流式分析结果；

图13为P5代、原代的肝脏成纤维细胞以及OP9细胞与HSC共培养9天后以CD45⁺设门分析CD19⁺B系细胞比例；

图14为P5代、原代的肝脏成纤维细胞过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45+设门分析DN阶段细胞比例；

图15为原代肝成纤维细胞和过表达DLL4的肝实质细胞系AML12混合后与造血干细胞共培养结果；

图16为qPCR比较不同细胞、不同传代次数表达谱；

图17为阻断CXCL12-CXCR4信号通路抑制DLL4过表达细胞对T细胞发育的促进作用效果；

图18为添加重组CXCL12蛋白恢复DLL4过表达的P5传代肝成纤维细胞对T细胞发育的促进作用效果。

具体实施方式

本发明将根据具体事例做进一步的描述，但其仅为例证性的目的而不祈祷限制性作用。本领域技术人员可由本说明书所解释的内容清楚的了解本发明的特点与功效，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或运用。实施例中未说明具体条件的实验，通常按照常规条件如厂商说明书、实验指南或教科书内容的条件。

造血干细胞分选：小鼠骨髓细胞或人脐带血细胞红细胞裂解液完全裂红后，用Lineage Cell Depletion Kit(Miltenyi Biotec)阴选后，采用流式分选小鼠造血干细胞(Lin^-Sca1⁺cKit⁺)或人造血干细胞(Lin^-CD34⁺CD38⁺)。所用的Lineage cocktail由标记的B220,CD3e,CD4,CD8α,CD19,CD11b,Gr1,Ter119,CD11c,and NK1.1抗体组成。

共培养操作步骤：

(1)配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7，分装后于-20℃保存；

(2)培养皿提前24h采用小鼠或人DLL4重组蛋白进行包被，包被浓度为10μg/ml 4℃24h或37℃4h；(可选步骤)

(3)复苏DLL4过表达的细胞株，并以1×10⁵细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml；

(4)复苏细胞株，并以5×10⁵细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml，养24h；(实施步骤2请选此步骤)

(5)将1×10⁵分选获得的造血干细胞加入培养皿的培养基中并混匀，置37℃，5％CO₂培养箱培共培养；

(6)每间隔72h半量换液；

(7)并在共培养一定天数后收获细胞将细胞吹散；过70μm孔径筛网，然后采用CD25+磁珠分选或者CD44+CD25+流式抗体标记后流式分选获得DN2或DN3细胞。

实施例1：小鼠被诱导肝纤维化能上调肝组织DLL4表达水平

采用CCl₄诱导8周的C57BL/6小鼠肝纤维化模型作为受体实验组，并设正常肝脏老鼠作为对照组。供体小鼠为CD45.1C57BL/6小鼠，收集左右大腿肱骨与小腿胫骨，采用灌注冲洗获得骨髓细胞，经红细胞裂解液裂红后计数，并以1×10⁶个骨髓单核细胞采用脾内注射法200μl体积，注射进入受体小鼠脾脏，通过脾脏内血管经受体小鼠肝门静脉入肝；受体小鼠移植前经9.5Gy的致死剂量辐照。

考虑到notch信号通路DLL1和DLL4在T细胞发育过程中的重要作用，我们采用qPCR对CCl₄肝纤维化老鼠和正常老鼠肝组织的DLL1和DLL4的mRNA表达水平进行检测，并与β-actin比较计算相对值，结果表明只有DLL4在小鼠肝脏中有表达。并且发现在肝纤维化C57BL/6小鼠肝组织中DLL4分子的mRNA表达水平显著高于正常肝组织，并且随着肝纤维化程度逐渐升高。结果见图2。

实施例2：肝实质细胞是肝脏纤维化下被上调DLL4表达的主要细胞

(1)考虑到notch信号通路在T细胞发育中起到重要作用，我们对艾滋病合并肝硬化病人肝脏组织标本进行DLL1与DLL4蛋白免疫组化染色，结果表明：只有DLL4在肝脏中得到表达。同时肝实质细胞是表达DLL4的主要细胞，肝脏成纤维细胞不能表达DLL4。我们随后对临床标本采用冰冻连续切片，进行DLL4免疫组化染色以及CD31(血管内皮细胞标志物)、CK18(肝脏实质细胞标志物)、αSMA(成纤维细胞标志物)免疫组化染色，并进行共定位分析(图3-5)。表明肝实质细胞是表达DLL4的主要细胞，而血管内皮和纤维化组织均不表达DLL4；并且随着病人肝纤维化程度的加重，肝实质细胞DLL4蛋白表达升高。

图3为冰冻连续切片后分别染色CD31和DLL4抗体，并对同一位置进行拍摄以共定位，A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图中可见CD31做为血管内皮细胞标志物，在其阳性表达区域，DLL4表达均呈阴性。

图4为冰冻连续切片后分别染色αSMA和DLL4抗体，并对同一位置进行拍摄以共定位，A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图中可见αSMA做为肝成纤维细胞标志物，在其阳性表达区域，DLL4表达均呈阴性。表明肝成纤维细胞不是表达DLL4的细胞。

图5为冰冻连续切片后分别染色CK18和DLL4抗体，并对同一位置进行拍摄以共定位，A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。图中可见CK18做为肝实质细胞标志物，在其阳性表达区域，DLL4表达均呈阳性。表明肝实质细胞是DLL4高表达的主要细胞，而不是肝成纤维细胞。同时其表达程度随病人肝纤维化程度的增加而升高。

(2)采用qPCR对艾滋病合并肝硬化病人标本和正常人肝组织的DLL4的mRNA表达水平进行检测，并与β-actin比较计算相对值，结果见图6。A1为艾滋病合并肝硬化病人具有较高程度的肝纤维化标本，A2为艾滋病合并肝硬化病人具有中等程度的肝纤维化标本，A3为一正常肝脏标本。发现在艾滋病合并肝硬化病人肝组织中DLL4分子的mRNA表达水平显著高于正常肝组织，并且随着肝纤维化程度逐渐升高。

实施例3：构建DLL4慢病毒载体及其过表达细胞

构建过表达DLL4蛋白的MSCs细胞：采用Infusion技术高效构建表达质粒pLVX-IRES-Puro-DLL4。根据Genebank中鼠DLL4 cDNA序列设计引物Forward(5’-ATCCCGCGACTCTAGAT GACGCCTGCGTCCCG-3’)Reverse(5’-GGTAGAATTATCTAGTTATACCTCTGTGGCAATCACAC-3’，下划线部分表示与质粒***位置互补的15bp碱基)，用于扩增成熟C57BL/6鼠源DLL4cDNA基因。

用Trizol法提取C57BL/6小鼠肝脏的总RNA，并经逆转录获得cDNA文库，AccuPrime^TM Pfx SuperMix(Invitrogen公司)PCR扩增cDNA文库获得目的片段，PCR产物用1％琼脂糖胶切胶回收。pLVX-IRES-Puro质粒(Invitrogen公司)分别用BamHI和XbaI双酶切过夜，将PCR产物与质粒酶切产物采用

HD Cloning Plus试剂进行连接。然后转化DH5α感受态菌，涂氨苄抗性LB平板，挑阳性克隆送测序。提质粒获得过表达质粒pLVX-IRES-Puro-DLL4。

过表达质粒pLVX-IRES-Puro-DLL4与包装质粒按比例混合，加入lipo2000感染293T细胞，于24h和48h后收集上清过滤并超滤离心浓缩获得病毒，然后将浓缩的病毒感染MSCs细胞，于感染48h后加入嘌呤霉素进行筛选。筛选两周待其稳定后，收集贴壁细胞提取RNA，逆转录为cDNA后采用qPCR分析结果表明过表达的细胞DLL4mRNA转录水平，其表达量相对β-actin的平均值高达28％，显著高于转染空质粒MSCs细胞和对照MSCs细胞，见图7。在此基础上分别构建了OP9、3T3/NIH、TSC、AML12、原代肝成纤维细胞、传代肝成纤维细胞等的DLL4过表达细胞株。

实施例4：特定的DLL4过表达细胞具有促进T细胞发育的作用

构建过表达DLL4的OP9细胞株OP9-DLL4，与流式分选的造血干细胞(Lin^-Sca1⁺cKit⁺)细胞共培养6天、10天、14天、18天。如图8所示，图A-D分别为共培养6天、10天、14天、18天后的流式分析DN阶段的发育状况，结果表明，在CD45设门下分析，共培养后非常明显的出现了DN2(CD44⁺CD25⁺)和DN3(CD44^-CD25⁺)俩群，并随着共培养时间的延长其比例逐步增加。图E为共培养18天后分析其CD4和CD8的表达，表明其中有部分DP细胞的出现。

MSC-DLL4或3T3-DLL4与骨髓来源的造血干细胞共培养，发现其并没有出现OP9-DLL4相同的促进T细胞发育的作用。随后我们尝试将OP9细胞与MSC-DLL4细胞或3T3-DLL4细胞1:1比例混合后，重复与造血干细胞共培养的实验，结果见图9，图A-C分别为MSCs细胞、MSC-DLL4细胞、MSC-DLL4与OP9 1:1比例混合细胞与HSC共培养后的实验结果，结果表明MSC-DLL4不具有促进T细胞发育的作用，但与OP9细胞混合后有能够出现促进作用。图E-G分别为3T3/NIH细胞、3T3-DLL4细胞、3T3-DLL4与OP9 1:1比例混合细胞与HSC共培养后的实验结果，结果表明3T3-DLL4不具有促进T细胞发育的作用，但与OP9细胞混合后有能够出现促进作用。提示OP9细胞能够提供某些因子或条件，使得原来不具备促进T系细胞发育作用的MSC-DLL4或3T3-DLL4出现了该功能。

进一步分析表明，MSC-DLL4细胞不能限定造血干细胞向T/B细胞系发育，其高表达的M-SCF促进了其发育为CD11b⁺巨噬细胞(图10)。表明OP9细胞能够提供某些因子或条件，阻断M-SCF的作用，从而限定造血干细胞向T/B系分化发育。

胸腺上皮基质细胞系(thymic epithelial stomal cell lines,TSCs)由上海中科院健康所张笑人教授馈赠，其尾静脉注射裸鼠体内能形成胸腺上皮样组织，并能在裸鼠体内检测到CD4⁺和CD8⁺SP T细胞(Established Thymic Epithelial Progenitor/StemCell-Like Cell Lines Differentiate into Mature Thymic Epithelial Cells andSupport T Cell Development.PLOS one,2013.8(9):p.e75222)。但是我们在体外采用与OP9-DLL4相同的体系与造血干细胞共培养，却没有出现相同的促进T细胞分化和发育的作用；qPCR显示TSCs表现为DLL4低表达状态，我们对TSCs进行病毒转染，构建了DLL4过表达的TSC-DLL4细胞，并再次重复与造血干细胞共培养实验，结果见图11，A-B分别为TSC过表达DLL4的TSC-DLL4细胞与HSC体外共培养6天和10天的结果，结果表明TSCs过表达DLL4后能够出现与OP9-DLL4相同的效果。TSC与OP9细胞具有相同的可以限定造血干细胞向T/B系细胞分化的作用。

实施例5：分离获得小鼠肝脏成纤维细胞

对CCl₄肝纤维化小鼠或正常小鼠肝脏经Liver Dissociation Kit处理分离成单细胞，筛网过滤去除大部分实质细胞，采用免疫磁珠阳选CD140α⁺细胞，然后再用流式抗体CD140α-APC、CD11b-FITC、CD146-PE、F4/80-PerCP-Cy5.5标记，流式细胞仪分选获得CD140α⁺CD11b^-CD146^-F4/80^-细胞；含10％FBS的DMEM重悬后采用差速贴附法去除贴壁慢的非成纤维细胞，并DMEM换液后获得αSMA表达阳性的贴壁原代细胞；同时连续传代获得αSMA阳性表达纯度很高的肝成纤维细胞，见图12，图A-C分别为MSCs作为阴性对照、原代肝成纤维细胞、P5代肝成纤维细胞，破膜后分别采用αSMA-FITC染色后流式分析结果。可见原代肝成纤维细胞和传代肝成纤维细胞均具有较高比例的αSMA阳性细胞，P5代传代肝成纤维细胞具有更高的纯度。

实施例6：原代肝脏成纤维细胞具有与OP9相似的促进T系发育作用

原代肝成纤维细胞与造血干细胞共培养，与OP9细胞相似在CD45⁺设门下分析能够出现一群CD19⁺的细胞，而传代的肝成纤维细胞却没有。结果见图13，图A为P5代的肝脏成纤维细胞与HSC共培养9天后以CD45⁺设门分析CD19⁺B系细胞比例；图B为原代的肝脏成纤维细胞与HSC共培养9天后以CD45⁺设门分析CD19⁺B系细胞比例；图C为OP9细胞与HSC共培养9天后以CD45+设门分析CD19⁺B系细胞比例。结果可见，只有原代肝脏成纤维细胞和OP9细胞的共培养体系中能够出现CD19⁺细胞，表明原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似能够限定造血干细胞向T/B细胞系即CLP细胞分化，而不是向CMP细胞分化，并在DLL4缺乏的情况下进一步发育为CD19⁺B系细胞。而传代肝脏成纤维细胞不具有该功能。

将分离获得的原代肝成纤维细胞和P5代肝成纤维细胞，进行慢病毒转染获得过表达DLL4的原代肝成纤维细胞和P5代肝成纤维细胞，并将其与分离的造血干细胞细胞共培养。如图14所示，图A为P5代的肝脏成纤维细胞过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45⁺设门分析DN阶段细胞比例；图B为原代的肝脏成纤维细胞过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45⁺设门分析DN阶段细胞比例；结果可见，只有过表达DLL4的原代肝脏成纤维细胞和OP9-DLL4细胞的共培养体系中能够出现DN2细胞，进一步表明原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似能够限定造血干细胞向T/B细胞系分化，同时在DLL4存在的情况下进一步促进其发育为T系细胞。

AML12为肝实质细胞系，进行慢病毒转染获得过表达DLL4的AML12-DLL4细胞，并将其与分离的造血干细胞细胞共培养。见图15，图A为原代的肝脏成纤维细胞和过表达DLL4的肝实质细胞系AML12 1:1比例混合后与HSC共培养6天后以CD45⁺设门分析DN阶段细胞比例；图B为OP9细胞过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45+设门分析DN阶段细胞比例，作为阳性对照；图C为小鼠肝实质细胞系AML12过表达DLL4后与HSC共培养6天后以CD45+设门分析DN阶段细胞比例。结果可见，AML12-DLL4不具有促进T系细胞发育的作用。但是当其与原代肝成纤维细胞混合后，能够在其共培养体系中出现和OP9-DLL4共培养体系相同的DN2和DN3细胞。进一步表明原代肝成纤维细胞与OP9细胞相似能够限定造血干细胞向T/B细胞系分化，同时在DLL4存在的情况下进一步促进其发育为T系细胞。而肝实质细胞不具有该作用。

采用流式分选共培养体系中的DN2和DN3细胞，采用尾静脉注射入Rag2敲除小鼠后，可在Rag2敲除小鼠外周血中检测到CD4⁺和CD8⁺的存在，而Rag2小鼠由于Rag基因的缺陷外周是不可能出现T细胞的，表明该培养体系获得的DN2和DN3细胞是可以通过定植胸腺，并进而发育成为成熟的CD4+和CD8+T的，具有非常广泛的应用前景，能成为通用Car-T细胞的一种基础。

实施例7：肝纤维化微环境中的CXCL12-CXCR4信号通路可能参与DLL4促进T系发育的作用

进一步采用qPCR比较能够促进T细胞发育的OP9细胞、TSC细胞、原代肝成纤维细胞不同蛋白表达谱，与NIH/3T3、AML12、MSCs、原代肝实质、传代肝成纤维细胞等不具有该促进作用的细胞系之间的差异，结果见图16，图A为不同细胞表达谱，图B为CXCL12在不同传代次数的肝成纤维细胞中的表达水平。重点关注炎症相关因子与趋化因子，我们发现CXCL12在具有促进作用的OP9、TSC和原代肝成纤维细胞中具有很高程度的表达，而在不具有该促进作用的细胞系：NIH/3T3细胞、AML12细胞、MSCs细胞、原代肝实质细胞、传代肝成纤维细胞中表达量很低。并且CXCL12在原代肝成纤维细胞(P0)中表达水平，随着传代的次数增加(P1-P5代)而呈比例下降。显示CXCL12可能参与到这种体外T细胞发育的过程，并起到重要的作用。

为了进一步证明，采用CXCL12-CXCR4信号通路化学阻断剂AMD3100(其作用机制在于能够优势竞争结合CXCR4，从而封闭了CXCL12的结合位点。)加入到共培养体系中，见图17，图A-D:CXCL12-CXCR4信号通路抑制剂AMD3100从高到低(10μM-0μM)不同浓度，加入过表达DLL4的原代肝成纤维细胞与骨髓造血干细胞的共培养体系中。可见AMD3100的加入显著抑制了DN2和DN3细胞的分化，并且随着AMD3100浓度的增加DN2和DN3逐渐减少。结果表明阻断CXCL12-CXCR4信号通路，能够有效抑制过表达DLL4的原代肝成纤维细胞或OP9细胞的促进T细胞发育的作用，进一步证明CXCL12在DLL4促进造血干细胞向T系细胞发育的过程中发挥了重要作用。

在另外一项实验中，在DLL4过表达的P5传代肝成纤维细胞与造血干细胞共培养体系中添加不同浓度的重组CXCL12蛋白，见图18，图A-D:CXCL12重组蛋白从高到低(100ng/ml-0ng/ml)不同浓度，加入过表达DLL4的P5代肝成纤维细胞与骨髓造血干细胞的共培养体系中。可见CXCL12重组蛋白的加入，能够促进原本不具有的DN2和DN3细胞出现，并且随着浓度的增加而更为显著，但是依然达不到原代肝成纤维共培养的效果。结果表明添加重组蛋白后只能有限的恢复其促进T细胞的发育作用，表明DLL4与CXCL12虽然在这一过程中起到重要作用，但也并不是唯一起作用的蛋白，表明该过程比想象中要复杂的多，肝脏微环境下还有很多未知的因素与蛋白参与其中。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种DLL4在制备诱导造血干细胞向前T细胞系分化药物中的应用，其特征在于，将人原代肝成纤维细胞过表达DLL4蛋白后与人造血干细胞共培养，获得诱导人造血干细胞向前T系细胞分化的药物，

增强CXCL12-CXCR4信号通路以促进人造血干细胞向T系细胞的发育；

所述的共培养在体外培养时，具体包括如下步骤：

(1)配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7，分装后于-20℃保存；

(2)培养皿提前24h采用小鼠或人DLL4重组蛋白进行包被，包被浓度为10μg/ml 4℃24h或37℃4h，其中，该步骤(2)是可选的；

(3)复苏DLL4过表达的细胞株，并以1×10⁵细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml；

(4)复苏细胞株，并以5×10⁵细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml，养24h，其中，当实施步骤(2)时需实施该步骤(4)；

(5)将1×10⁵分选获得的造血干细胞加入培养皿的培养基中并混匀，置37℃，5％CO₂培养箱共培养；

(6)每间隔72h半量换液；

(7)并在共培养一定天数后收获细胞将细胞吹散；过70μm孔径筛网，然后采用CD25+磁珠分选或者CD44+CD25+流式抗体标记后流式分选获得DN2或DN3细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的造血干细胞是将脐带血细胞红细胞裂解后，用谱系细胞耗竭试剂盒阴选后，采用流式分选人造血干细胞。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的前T系细胞为DN2细胞和/或DN3细胞。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为注射剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物中还包括诱导分化的试剂。

6.一种诱导造血干细胞向前T系细胞分化的试剂盒，其特征在于，包括人原代肝成纤维细胞和人造血干细胞共培养的试剂，

所述试剂盒还包括增强CXCL12-CXCR4信号通路以促进人造血干细胞向T系细胞的发育的试剂；

其中，所述的共培养在体外培养时，具体包括如下步骤：

(1)配制含15％FBS的MEMα培养基，并添加终浓度为25-50ng/mL的SCF、5-10ng/mL的Flt3L、1-20ng/mL的IL-7，分装后于-20℃保存；

(2)培养皿提前24h采用小鼠或人DLL4重组蛋白进行包被，包被浓度为10μg/ml 4℃24h或37℃4h，其中，该步骤(2)是可选的；

(3)复苏DLL4过表达的细胞株，并以1×10⁵细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml；

(4)复苏细胞株，并以5×10⁵细胞量铺设培养皿，并添加培养基到10ml，养24h，其中，当实施步骤(2)时需实施该步骤(4)；

(5)将1×10⁵分选获得的造血干细胞加入培养皿的培养基中并混匀，置37℃，5％CO₂培养箱共培养；

(6)每间隔72h半量换液；

(7)并在共培养一定天数后收获细胞将细胞吹散；过70μm孔径筛网，然后采用CD25+磁珠分选或者CD44+CD25+流式抗体标记后流式分选获得DN2或DN3细胞。

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