CN110093334A - 一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，包括大豆和黑豆预处理、固体发酵培养基制备、蒸煮、纳豆菌种子液制备、接种发酵、后熟、分离纯化：大豆和黑豆的配比为大豆：黑豆＝5:1‑1:1，清洗浸泡为20‑25℃浸泡8‑10小时，破碎采用破碎机破碎大豆，破碎度为每个大豆破裂为5‑10片。本发明具有工艺简单、流程短、成本低的特点，适合大中小不同规模豆制品加工企业。

Description

一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法
技术领域
本发明涉及纳豆激酶制作技术领域，具体为一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法。
背景技术
纳豆激酶的分离纯化工艺常采用传统的蛋白质纯化方法，如：有机溶剂沉淀、盐析、离心、凝胶色谱、疏水色谱、离子交换色谱等纯化方法。从固体发酵纳豆中分离纯化纳豆激酶的一种先前技术的工艺为：生理盐水抽提纳豆激酶，加入硫酸铵(硫酸氨铵)在25％饱和度下过夜，再于4℃，7000转/分钟离心40分钟，收集上清上5Butyl-Toyoperal疏水柱，收集活性峰再次进行饱和度25％的硫酸铵沉淀，取上清进行饱和度60％的硫酸铵沉淀，然后上CM- Toyopearl离子交换柱，收集活性峰再上Sephadex-G50，收集活性峰并透析过夜。采用上述工艺制造纳豆激酶，收率低，最终获得的产品很少；为此我们提出一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，用以解决上述的问题。
发明内容
本发明提供一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法可以有效解决上述背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，包括大豆和黑豆预处理、固体发酵培养基制备、蒸煮、纳豆菌种子液制备、接种发酵、后熟、分离纯化：
A.所述大豆和黑豆预处理为：大豆和黑豆以一定配比混合、清洗浸泡、适度破碎；
B.所述固体发酵培养基制备为：发酵培养基质量组成为：预处理大豆和黑豆85％—90％、葡萄糖10％-15％、硫酸镁0.5％- 5％、氯化钙0.3％-3％，PH值为7.1-7.5；
C.所述蒸煮为：采用蒸煮罐蒸煮；
D.所述纳豆菌种子液制备为：斜面培养基配制：琼脂16g/L、蛋白胨8g/L、牛肉粉3g/L、氯化钠2.5g/L，121℃灭菌20分钟；种子液培养基配制：蛋白胨8g/L、牛肉膏6g/L、氯化钠2.5g/L、葡萄糖12g/L、酵母膏6g/L，121℃灭菌20分钟；
E.所述接种发酵为：按照6％的比例加入发酵种子液，36- 40℃发酵24h-30h；
F.所述后熟为：后熟温度为4℃，后熟时间为18-24h；
G.所述分离纯化为：包括浸提、过滤、淳沉步骤。
进一步，所述步骤A中大豆和黑豆的配比为大豆：黑豆＝5:1- 1:1，清洗浸泡为20-25℃浸泡8-10小时，破碎采用破碎机破碎大豆，破碎度为每个大豆破裂为5-10片。
进一步，所述步骤C蒸煮罐中0.08-0.1MPa蒸汽蒸煮，30- 40min。蒸煮后冷却至45℃以下。
进一步，所述步骤D中纳豆菌种子液制备：在无菌环境下，将纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环接种到斜面培养基上，在35- 38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌，将活化的纳豆芽孢杆菌在在无菌环境下挑取1-2环到种子液培养基中，在 35-38℃、200r/min条件下振荡培养16小时制备发酵种子液。
进一步，所述步骤G中浸提时间为20-25h，醇沉加入冷乙醇至饱和度70％-85％。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明收获率高，且具有工艺简单、流程短、成本低的特点，适合大中小不同规模豆制品加工企业。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，包括大豆和黑豆预处理、固体发酵培养基制备、蒸煮、纳豆菌种子液制备、接种发酵、后熟、分离纯化：
A.所述大豆和黑豆预处理为：大豆和黑豆以一定配比混合、清洗浸泡、适度破碎；大豆和黑豆的配比为大豆：黑豆＝5:1-1:1，清洗浸泡为20-25℃浸泡8-10小时，破碎采用破碎机破碎大豆，破碎度为每个大豆破裂为5-10片；
B.所述固体发酵培养基制备为：发酵培养基质量组成为：预处理大豆和黑豆85％—90％、葡萄糖10％-15％、硫酸镁0.5％-5％、氯化钙0.3％-3％，PH值为7.1-7.5；
C.所述蒸煮为：采用蒸煮罐蒸煮；蒸煮罐中0.08-0.1MPa蒸汽蒸煮，30-40min。蒸煮后冷却至45℃以下；
D.所述纳豆菌种子液制备为：斜面培养基配制：琼脂16g/L、蛋白胨8g/L、牛肉粉3g/L、氯化钠2.5g/L，121℃灭菌20分钟；种子液培养基配制：蛋白胨8g/L、牛肉膏6g/L、氯化钠2.5g/L、葡萄糖12g/L、酵母膏6g/L，121℃灭菌20分钟；纳豆菌种子液制备：在无菌环境下，将纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环接种到斜面培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌，将活化的纳豆芽孢杆菌在在无菌环境下挑取1-2环到种子液培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16小时制备发酵种子液；
E.所述接种发酵为：按照6％的比例加入发酵种子液，36- 40℃发酵24h-30h；
F.所述后熟为：后熟温度为4℃，后熟时间为18-24h；
G.所述分离纯化为：包括浸提、过滤、淳沉步骤；浸提时间为 20-25h，醇沉加入冷乙醇至饱和度70％-85％。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，其特征在于，包括大豆和黑豆预处理、固体发酵培养基制备、蒸煮、纳豆菌种子液制备、接种发酵、后熟、分离纯化：
A.所述大豆和黑豆预处理为：大豆和黑豆以一定配比混合、清洗浸泡、适度破碎；
B.所述固体发酵培养基制备为：发酵培养基质量组成为：预处理大豆和黑豆85％—90％、葡萄糖10％-15％、硫酸镁0.5％-5％、氯化钙0.3％-3％，PH值为7.1-7.5；
C.所述蒸煮为：采用蒸煮罐蒸煮；
D.所述纳豆菌种子液制备为：斜面培养基配制：琼脂16g/L、蛋白胨8g/L、牛肉粉3g/L、氯化钠2.5g/L，121℃灭菌20分钟；种子液培养基配制：蛋白胨8g/L、牛肉膏6g/L、氯化钠2.5g/L、葡萄糖12g/L、酵母膏6g/L，121℃灭菌20分钟；
E.所述接种发酵为：按照6％的比例加入发酵种子液，36-40℃发酵24h-30h；
F.所述后熟为：后熟温度为4℃，后熟时间为18-24h；
G.所述分离纯化为：包括浸提、过滤、淳沉步骤。
2.根据权利要求1所述的一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤A中大豆和黑豆的配比为大豆：黑豆＝5:1-1:1，清洗浸泡为20-25℃浸泡8-10小时，破碎采用破碎机破碎大豆，破碎度为每个大豆破裂为5-10片。
3.根据权利要求1所述的一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤C蒸煮罐中0.08-0.1MPa蒸汽蒸煮，30-40min。蒸煮后冷却至45℃以下。
4.根据权利要求1所述的一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤D中纳豆菌种子液制备：在无菌环境下，将纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环接种到斜面培养基上，在35-38℃培养箱中培养24-30小时得到活化后的纳豆芽孢杆菌，将活化的纳豆芽孢杆菌在在无菌环境下挑取1-2环到种子液培养基中，在35-38℃、200r/min条件下振荡培养16小时制备发酵种子液。
5.根据权利要求1所述的一种利用大豆和黑豆发酵制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤G中浸提时间为20-25h，醇沉加入冷乙醇至饱和度70％-85％。
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