CN110093329B

CN110093329B - 萜类合酶及其应用

Info

Publication number: CN110093329B
Application number: CN201810091964.XA
Authority: CN
Inventors: 叶紫玲
Original assignee: Shenzhen Aigexin Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Aigexin Technology Co ltd
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2038-01-30
Also published as: CN110093329A; WO2019148609A1

Abstract

本发明公开了萜类合酶及其应用。具体地，提供了该萜类合酶及表达该萜类合酶的质粒和载体用于催化萜类的合成或用于制备催化合成萜类的反应的催化剂的用途，还提供了制备萜类的方法。该萜类合酶可以特异性和高效地以萜类化合物前体物质为底物合成多种倍半萜化合物。

Description

萜类合酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地，涉及萜类合酶及其应用。

背景技术

倍半萜化合物是由2分子的异戊烯焦磷酸(IPP)以及1分子的二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)在法尼烯焦磷酸合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase)催化下合成法尼烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP)，随后在倍半萜合酶催化下形成的。迄今为止，人们已至少发现122种不同的倍半萜类化合物骨架(Klapschinski et al.,2016)。其中一些骨架化合物，如5-7双元环和3-5-6三元环倍半萜化合物具有抑菌、抗肿瘤等多种生物活性。但由于倍半萜类化合物仅含有3个异戊二烯单元，碳链的长度限制了其骨架的多样性，这也大大增加了挖掘新的倍半萜骨架的难度。

由此，合成倍半萜的方法有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种新的萜类合酶，将其转入含有高产萜类化合物前体物质的重组细胞内，能分离得到多个萜类化合物，尤其是倍半萜化合物，其中包括C₅-C₇双元环倍半萜和C₃-C₅-C₆三元环倍半萜新骨架化合物，丰富了倍半萜化合物的骨架组成。

因而，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所述分离的多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该分离的多肽具有萜类合酶的活性，可以催化合成萜类化合物。

MPHKHVPLRPVKLTFDPVGSNTLGVPTLDFESLFREDSVSEDAPLVIYPEDMGVPWNTSLPWTRQSKFWAYAEAAGYEMANGISLDKASERGTLPMELMDERRKWKIDELVEDAISCCAYLYPTSSPTRLALLTQSVLLLFLHDDVIERGATQNETTVVDEFLSMAPKNRHLKKFWSDVLECDPVLGPDLLYAIHAFVRDGRVKSPFKQDHYATLADYMLYRRNDVGKTFMIAAIRFGSGVQQTREELAPFDELADLYVRHSILINDLYSYDKEVHEVKTIDASIVNAVAVTEQLLSVSPDLAKNLTRAITFDMEKEFYGICEKFMHSPDINDRQRVFVTALFDALTGNIFHSATLSRYVRHGERPLPCKC(SEQ ID NO：1)

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

“萜”为脂肪族或环状的基于异戊二烯单元(C₅H₈)的烃。“萜”包括但不限定为禾谷镰刀二烯(fusariumdiene)，反式-禾谷镰刀醇(trans-fusagramineol)，禾谷镰刀醇(fusagramineol)、橙花叔醇、菖蒲醇(acorenol)，β-法尼烯，没药醇(bisabolol)，菖蒲二烯(Acoradiene)，顺式-α-香柠檬烯，反式-α-香柠檬烯，(+)-epi-β-檀香萜，β-红没药烯，和反式-γ-红没药烯。

本发明的“萜”，和“萜类化合物”包括萜和萜的衍生物，包括经过一步或多步的如羟基化，异构化，氧化还原，二甲基化或酰化等官能化的化合物。在此使用的“倍半萜”为基于C15结构的萜并且包括经过一个或多个官能化步骤的化合物的倍半萜和倍半萜衍生物。

本发明的“萜类合酶”为催化萜类合成的任意的酶，前述分离的多肽即为该萜类合酶，在本文中二者可以互换使用。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述分离的核酸为选自下组的序列：

(1)编码前述的分离的多肽的核苷酸序列，其中，需要说明的是，该核苷酸序列可以是包括编码此多肽的核苷酸序列，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的核苷酸序列。

(2)具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

ATGCCTCACAAGCACGTTCCTCTTAGACCAGTCAAGTTGACATTTGATCCTGTAGGATCAAACACCCTAGGTGTGCCAACCTTGGACTTTGAGTCTCTGTTCCGGGAAGACAGCGTCTCTGAGGATGCCCCTCTTGTTATCTACCCAGAGGATATGGGTGTCCCATGGAACACCTCTCTTCCTTGGACCAGACAATCCAAGTTCTGGGCTTACGCCGAGGCAGCTGGATATGAAATGGCCAACGGAATCAGCCTTGACAAGGCATCAGAGCGTGGCACACTACCCATGGAGTTGATGGATGAGCGTCGCAAGTGGAAGATTGATGAGCTAGTTGAGGATGCCATCTCTTGCTGTGCTTATCTTTACCCTACATCATCTCCTACCAGATTGGCGTTGTTGACCCAGTCTGTTCTGCTTCTATTCCTCCACGACGATGTTATTGAGCGAGGAGCTACTCAAAACGAAACCACAGTGGTAGACGAATTTCTTAGCATGGCTCCCAAGAACAGGCATCTTAAGAAATTCTGGTCAGACGTATTGGAATGTGATCCCGTCCTTGGACCTGATCTGCTTTATGCTATCCATGCTTTCGTCCGTGATGGTCGTGTAAAGTCACCCTTTAAGCAGGATCACTATGCCACATTGGCTGATTACATGCTTTACCGTCGCAATGATGTTGGCAAGACATTTATGATTGCAGCTATCCGCTTCGGCTCTGGCGTGCAACAAACACGCGAAGAACTTGCTCCCTTTGACGAGCTTGCTGATCTTTACGTCAGACACTCAATTCTTATCAACGATCTCTACTCGTATGATAAGGAGGTGCACGAGGTCAAGACTATCGACGCGTCCATCGTGAACGCAGTTGCTGTCACAGAGCAGCTCCTTTCCGTGTCGCCTGACCTGGCCAAGAACTTAACCAGAGCTATTACCTTTGACATGGAGAAGGAGTTTTACGGCATTTGTGAGAAGTTTATGCACAGCCCTGATATCAACGATCGCCAGCGCGTGTTCGTTACTGCGCTCTTTGATGCGTTGACAGGCAATATCTTCCATTCTGCTACTTTGAGCAGATACGTTCGTCACGGCGAGAGACCACTTCCTTGCAAGTGTTAG(SEQ ID NO：2)

本发明中的多肽和核酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本领域技术人员了解，一旦获得了本发明实施例有关的核酸，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关核酸序列。

进一步地，应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，所述载体含有前述的分离的核酸。

本发明的“载体”可以包括任何重组载体，包括但不限定为病毒载体、噬菌体和质粒。技术人员能够根据表达***选择合适的载体。在一些实施方式中，所述表达载体包括编码可操作地连接到调节序列、mRNA核糖体结合位点、以及调控转录和翻译起始和终止的合适的序列等的多肽的cDNA序列，该调节序列例如为转录启动子、终止子、操纵基因或增强子。当调控序列与本发明的cDNA序列功能性相连时，那么核苷酸序列就是“可操作地连接”。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有前述的多肽、前述的分离的核酸或前述的载体。

根据本发明的实施例，用于制备重组细胞的宿主细胞的种类不受特别的显著，只要核酸能在宿主细胞中表达即可，既可以是原核细胞，如细菌细胞、大肠杆菌；也可以是真核细胞，例如酵母、真菌。根据本发明的实施例，宿主细胞可以为酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或真菌。

根据本发明的第五方面，本发明提供了前述的分离的多肽、前述的分离的核酸、前述的载体或前述的重组细胞用于催化萜类的合成或用于制备催化合成萜类的反应的催化剂的用途。发明人发现，前述分离的多肽，即萜类合酶，以及表达该萜类合酶的载体和重组细胞，在含有高产萜类化合物前体物质的重组细胞内，能分离得到多个萜类化合物，尤其是倍半萜化合物，其中包括C₅-C₇双元环倍半萜和C₃-C₅-C₆三元环倍半萜新骨架化合物，丰富了倍半萜化合物的骨架组成。

根据本发明的实施例，萜类可以为倍半萜。根据本发明的优选实施例，所述萜类为选自下列的至少一种。

其中1-8号化合物分别为禾谷镰刀二烯(fusariumdiene)，反式-禾谷镰刀醇(trans-fusagramineol)，禾谷镰刀醇(fusagramineol)，反式-橙花叔醇(nerolidol)，(-)-α-菖蒲醇(acorenol)，(E)-β-法尼烯(farnesene),(+)-α-没药醇(bisabolol),(-)-菖蒲二烯(acoradiene)。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种制备萜类的方法。根据本发明的实施例，所述方法是在前述的多肽、前述的载体或前述的重组细胞存在的条件下进行的。发明人发现，前述分离的多肽，即萜类合酶，表达萜类合酶的载体和重组细胞，以高产萜类化合物前体物质为底物，能分离得到多个萜类化合物，尤其是倍半萜化合物，其中包括C₅-C₇双元环倍半萜和C₃-C₅-C₆三元环倍半萜新骨架化合物，丰富了倍半萜化合物的骨架组成。

发明人发现，本发明实施例的萜类合酶含有萜类环化(TC)结构域而不含有异戊烯基转移酶(PT)结构域，根据本发明的一些实施例，该方法的底物含有香叶酯焦磷酸(GPP)、法呢基焦磷酸(FPP)和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)中的至少一种，产物为前述底物反应形成的含有2个异戊二烯单元的单萜、3个异戊二烯单元的倍半萜和4个异戊二烯单元的二萜中的至少一种，而无法合成相应的二倍半萜。

根据本发明实施例的萜类合酶至少具有下列优点之一：

(1)本发明实施例的萜类合酶可以特异性和高效地以萜类化合物前体物质为底物合成多种倍半萜化合物；

(2)本发明实施例的萜类合酶，以GPP、FPP和GGPP为底物，可以合成多种高经济价值的萜类化合物，例如，橙花叔醇(nerolidol)，该化合物广泛应用于作调味剂和香水生产等行业，同时，该化合物能够增强皮肤对那些经皮肤渗透方式治疗疾病的药物的吸收能力；β-法尼烯(farnesene)，该化合物可用作新型航空燃油和合成维生素E；没药醇(bisabolol)，该化合物具有抗菌抗炎、抗微生物和治疗牛皮癣等生物学功效。

(3)在重组细胞(例如酵母)中构建了萜类合成途径，尤其是橙花叔醇、法尼烯和没药醇等高经济价值萜类的合成途径，从而实现了以GPP、FPP和GGPP为底物，用酵母发酵来生成萜类，尤其是高经济价值萜类化合物，生产成本显著降低。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的J1-018-A的体外反应产物分析检测结果示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的J1-018A体外反应及体内发酵产物分析检测结果示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的J1-018-A的发酵产物分析检测结果示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物2的结果示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物3的结果示意图；

图6显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物4的结果示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物5的结果示意图；

图8显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物7的结果示意图；

图9a-图9f显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物1的核磁结果示意图，其中，图9a为¹H NMR图谱，图9b为¹³C NMR图谱，图9c为HMQC图谱，图9d为¹H-¹H COSY图谱，图9e为HMBC图谱，图9f为化合物1结构以及关键的¹H-¹H COSY、HMBC相关信号示意图；

图10a-图10g显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物2的核磁结果图，其中，图10a为¹H NMR图谱，图10b为¹³C NMR图谱，图10c为HSQC图谱，图10d为¹H-¹H COSY图谱，图10e为HMBC图谱，图10f为NOESY图谱，图10g为化合物2结构以及关键的¹H-¹H COSY、HMBC及NOESY相关信号示意图；

图11显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物3的核磁结果图，其中，图11a为¹H NMR图谱，图11b为¹³C NMR图谱，图11c为HSQC图谱，图11d为¹H-¹H COSY图谱，图11e为HMBC图谱，图11f为NOESY图谱,图11g为化合物3结构以及关键的¹H-¹H COSY、HMBC及NOESY相关信号示意图；

图12显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物4的核磁结果图，其中，图12a为¹H NMR图谱，图12b为¹³C NMR图谱；

图13显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物5的核磁结果图，其中，图13a为¹H NMR图谱，图13b为¹³C NMR图谱；

图14显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物6的核磁结果图，其中，图14a为¹H NMR图谱，图14b为¹³C NMR图谱；

图15显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物7的核磁结果图，其中，图15a为¹H NMR图谱，图15b为¹³C NMR图谱；

图16显示了根据本发明一个实施例的纯化化合物8的核磁结果图，其中，图16a为¹H NMR图谱，图16b为¹³C NMR图谱图16c为HSQC图谱，图16d为¹H-¹H COSY图谱，图16e为HMBC图谱，图16f为化合物8结构以及关键的¹H-¹H COSY、HMBC相关信号示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

本实施例中，通过PCR法扩增得到萜类合酶J1-018-A(简称为J1-018-A)的cDNA序列，并利用该cDNA序列构建质粒和高产倍半萜酵母平台，其中，本实施例中所用的菌株及质粒见表1，构建相关质粒所用的引物见表2.

表1所用菌株及质粒的主要特性

表2质粒构建所用引物

1、J1-018-A质粒构建及蛋白纯化

以反转录的F.graminearumJ1-012的cDNA为模板，用引物P1/P2扩增获得J1-018-A的cDNA序列并酶切酶连到质粒pET28a(+)上获得质粒pGB152，具体如下：

(1)获得cDNA：真菌RNA提取选用QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit，并按说明书操作进行。根据测定的RNA浓度，取等量的总RNA，加入试剂盒自带引物混合物，1μL dNTP，用无菌水调整体积至13μL，反应条件为：65℃ 5min，4℃ 1min，冰浴2min。短暂离心后，加入4μL5×第一链合成反应缓冲液，1μL 0.1M DTT，1μL RNA酶抑制剂和1μL SuperScriptTM IIIRT反转录酶(200U/μL)，反应程序为25℃ 5min，55℃ 60min，70℃ 15min。反应结束后用QIAGEN PCR产物纯化试剂盒将产物进行纯化得到cDNA。

(2)酶切酶连反应：提取的质粒或者纯化回收的DNA片段可直接进行酶切酶连，采用的限制性内切酶为Fermentas公司的DNA限制性内切酶进行酶切。酶切体系如下：

混匀后37℃反应0.5-1h，电泳检测酶切结果。

载体DNA和基因DNA片段经相应的限制性内切酶酶切后可直接用于连接，使用Fermentous公司的T4DNA连接酶进行酶连，反应体系如下：

混匀后22℃反应30min或4℃过夜酶连。连接产物直接用于转化。

(3)将质粒pGB152转化到E.coli BL21(DE3)中用于蛋白表达。

(4)菌体裂解，并用Ni-NTA亲和层析对蛋白进行纯化，得到纯化的蛋白，该蛋白即为J1-018-A。

2、J1-018-A底物识别能力的检测

为了充分了解J1-018-A催化不同链长的底物合成萜类化合物的潜力，设立了以下体外酶促反应体系，具体方法如下：

(1)向200μL终浓度为50mM含有10％甘油的PB buffer(pH 7.6)缓冲液中添加10μM纯化的蛋白(J1-018-A)，再分别添加100μM的底物(底物分别为GPP、FPP、GGPP、GFPP和IPP+DMAPP)，以及2mM的Mg²⁺，分别得到GPP、FPP、GGPP、GFPP和IPP+DMAPP底物溶液；

(2)将GPP、FPP、GGPP、GFPP和IPP+DMAPP底物溶液在30℃条件下过夜反应，得到各底物对应的反应溶液。

(3)将各反应溶液用等体积的正己烷萃取2次，合并有机相并用GC-MS检测各底物经酶催化生成的产物。

GC-MS检测结果如图1所示，其中，图a为以GPP为底物的反应溶液的产物分析结果，图b为以FPP为底物的反应溶液的产物分析结果，图c为以GGPP为底物的反应溶液的产物分析结果，图d为以GFPP为底物的反应溶液的结果，图e为以IPP+DMAPP为底物的反应溶液结果。结果表明，J1-018-A能够利用GPP、FPP以及GGPP这3种底物合成对应的单萜、倍半萜以及二萜，但不能利用GFPP和IPP+DMAPP合成二倍半萜，显示了J1-018-A具有较为宽泛的底物及反应杂泛性。同时，体外反应结果显示J1-018-A不能够以IPP和DMAPP为底物进行链的延伸，说明J1-018-A仅含有萜类环化(TC)结构域而不含有异戊烯基转移酶(PT)结构域。

3、高产倍半萜酵母平台的构建

3.1突变株S.cerevisiae YZL141的构建

(1)以P46/P47为引物以CENPK2-1D为模板扩增GaL1710左侧同源臂；

以P48/P49为引物以pRS424为模板扩增Trp标签；

以P50/P51为引物以S288C为模板扩增ACT1终止子标签；

以P52/P53为引物以S288C为模板扩增tHMG1标签；

以P54/P55为引物以CENPK2-1D为模板扩增PGAL10-PGAL1标签；

以P56/P57为引物以CENPK2-1D为模板扩增CPS1终止子；

以P58/P59为引物以CENPK2-1D为模板扩增Gal1710右侧同源臂；

以P60/P61为引物以pRS426为模板扩增质粒骨架pRS426；

(2)以P46/P51为引物，通过OE-PCR将Gal1710左侧同源臂、Trp标签以及ACT1终止子三者连接起来；

(3)以P52/P57为引物，通过OE-PCR将tHMG1、PGAL10-PGAL1、CPS1终止子三者连接起来。

(4)利用酵母组装方法将上述通过OE-PCR获得的两个片段，Gal1710右侧同源臂以及质粒骨架pRS426连接起来得到质粒pZY141。酵母组装方法是基于S.cerevisiae具有高效的同源重组效率，该方法可以实现多个片段的一步组装，其操作步骤如下：

①两个组装片段之间需要包含40-80bp的重叠序列(同源片段越长越利于组装)，通过PCR方法获得含有同源臂的组装片段和载体片段。

②PCR产物经过纯化后，用Nanodrop测定其浓度。

③分别取300ng需要组装的片段并计算总体积。

④加入10％体积的3M NaAc，2％体积的10mg/mL糖原并混匀，随后加入2倍体积预冷的无水乙醇，混合均匀。

⑤置于-80℃冰箱中2h左右。

⑥4℃，13 200rpm离心20min，弃上清。

⑦加入500μL 70％乙醇，13 200rpm，室温下离心3min，弃上清。

⑧冷冻干燥沉淀，勿长时间干燥，加入10μL的去离子水重溶沉淀。

⑨转化酿酒酵母，并涂布相应平板。

⑩待长出单菌落后，接种带有相应筛选条件的培养基，过夜培养提取质粒并转化大肠杆菌感受态细胞，用于目的质粒的扩增。提取质粒并酶切验证。

(5)将上述过表达了tHMG1的质粒pZY141线性化并通过同源重组整合到S.cerevisiae 30000B的Gal1710位点处，获得突变株S.cerevisiae YZL141，从而构建了高产萜类化合物的S.cerevisiae平台，为在S.cerevisiae体内高效合成萜类化合物奠定了坚实的基础。

3.2突变株S.cerevisiae T16的构建

(1)以pGB152为模板，用引物P3/P4扩增获得J1-018-A片段；

以S.cerevisiae 30000B为模板，以P7/P8为引物PCR扩增获得ERG20片段；

以S.cerevisiae 30000B为模板，用引物P5/P6扩增获得启动子GAL1-GAL10；

以pRS426为模板，用引物P9/P10扩增获得质粒骨架；

(2)通过Gibson法将上述4个片段连接起来获得质粒pYeastJ1-018；

(3)用NotI将质粒pYeast J1-018线性化，整合到过表达了tHMG1的S.cerevisiaeYZ141基因组的His3位点，最终获得过表达了tHMG1，ERG20(FPPS)以及J1-018-A的突变株S.cerevisiae T16，用于倍半萜化合物的高效合成。

4、J1-018-A突变株的发酵及检测

挑取突变株S.cerevisiae T16单克隆转接至含有YPD培养基的PA瓶中，30℃过夜培养，按终浓度为0.25OD₆₀₀的接种量转接至含有1％半乳糖的YPD培养基中发酵72h。GC-MS检测产物并收集菌体及发酵液。随后用等体积的正己烷萃取2次，减压蒸馏后甲醇复溶(加入甲醇前先加入少量DMSO助溶)，用于产物纯化。

GC-MS检测结果如图2所示，其中，图a为J1-018A体外反应的产物检测结果示意图，图b为J1-018A体内发酵产物检测结果示意图，结果表明，S.cerevisiae T16突变株中倍半萜的产物种类与体外反应结果一致，能够合成8种倍半萜化合物。体外反应与体内发酵结果的产物组成比例有所差异，但由于本实施例构建的S.cerevisiae T16突变株能够高效地合成倍半萜产物，从而能够分离出那些含量很低的产物。由此，本实施例以代谢工程改造的高产异戊二烯前体物质的S.cerevisiae YZ141为平台，验证酶的生物学功能和挖掘产物提供了必要的基础。

实施例2

本实施例对本实施例1得到的J1-018-A发酵产物进行纯化和鉴定，具体如下：

1、S.cerevisiae T16突变株产物纯化

纯化的流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，紫外吸收波长为210nm，按表1描述的条件利用半制备HPLC对J1-018-A发酵产物进行纯化，通过GC-MS确定目标产物在HPLC上的出峰时间，收集含有倍半萜产物F1-F7组分，其中，F1-F4为主要倍半萜组分，结果详见图3。

表1S.cerevisiae T16突变株中化合物的纯化条件

分析结果显示，组分F4中化合物1，组分F6中的化合物6以及组分F7中的化合物8的纯度可以直接用于NMR检测，无需进一步纯化，化合物1-8的结构如表2所示。

表2J1-018-A发酵产物中8个倍半萜化合物

2、纯化化合物2

利用半制备高效液相色谱，流动相为75％的乙腈，流速设置为0.75mL/min，从组分F1中纯化目标化合物2，结果如图4所示。

3、纯化化合物3

利用半制备高效液相色谱，流动相为70％的乙腈，流速设置为2mL/min，从组分F2中纯化目标化合物3，结果如图5所示。

4、纯化化合物4

利用半制备高效液相色谱，流动相为80％的乙腈，流速设置为0.6mL/min，从组分F2中纯化目标化合物4，结果如图6所示。

5、纯化化合物5

利用半制备高效液相色谱，流动相为92％的甲醇，流速设置为0.6mL/min，从组分F3中纯化目标化合物5，结果如图7所示。

6、纯化化合物7

利用半制备高效液相色谱，流动相为96％的乙腈，流速设置为0.6mL/min，从组分F5中纯化目标化合物7，结果如图8所示。

7、纯化结果总结

GC-MS分析结果显示，突变株S.cerevisiaeT16的发酵产物中共含有8个倍半萜化合物。随后我们对其中的上述8个化合物进行分离后并减压蒸馏浓缩后并通过NMR技术对它们进行鉴定。

(1)化合物1：

¹H NMR数据如表1和图9a所示，显示化合物1存在2个单峰的甲基信号(Me-12,Me-13)，2个双峰的甲基信号(Me-14,Me-15)，以及1个烯次甲基信号(H-4)。¹³C NMR和HMQC光谱数据显示化合物1含有15个碳原子，其中有1个sp³杂化的季碳原子(C-10)，3个sp²杂化的季碳原子(C-3,C-6,C-7)，1个烯次甲基，1个脂肪族次甲基，5个脂肪族亚甲基，和4个甲基(图9b，图9c)。这些数据显示化合物1为双环结构。¹H-¹H COSY提示的耦合关系有：H-1/H-2,H-4/H-5,H-8/H-9和H-14/H-11/H-15(图9d)。HMBC图谱可以看到甲基氢的相关信号有Me-12与C-2,C-3和C-4；Me-13与C-6,C-7和C-8；Me-14与C-10,C-11和C-15；M-15与C-10,C-11和C-14。另外，HMBC图谱提示H-1与C-3,C-6,C-10；H-5与C-3,C-4,C-6,C-7,C-10；H-9与C-10,C-11之间存在耦合关系(图9e)。因此，化合物1的平面结构为一个5-7元双环倍半萜烯,如图9f所示。

表1.化合物1的NMR数据

化合物2：

¹H NMR数据显示到1个单线态甲基(Me-12)，3个双峰的甲基信号(Me-13,Me-14和Me-15)(表2和图10a)。¹³C NMR光谱和HSQC光谱证实了化合物2有15个碳原子，其中包括3个sp³杂化季碳(C-4,C-6,C-10)，3个脂肪族次甲基，5个脂族亚甲基和4个甲基(图10b，图10c)。这些数据显示化合物2的三环骨架。¹H-¹H COSY提示的耦合关系有H-1/H-2，H-4/H-5，H-8/H-7/H13和H-14/H-11/H-15(下图，图10d)。此外，HMBC图谱可以看到甲基氢的相关信号有Me-12与C-2；C-3和C-4；Me-13与C-6；C-7和C-8；Me-14与C-10,C-11和C-15；M-15与C-10,C-11和C-14。另外，HMBC图谱可以看到甲基氢的相关信号有：H-11与C-1,C-9之间，H-7与C-4,C-5之间，H-5与C-6,C-7之间，H-8与C-9,C-10之间(图10e)。因此，平面结构的化合物2被认定为5-6-3元三环倍半萜烯。NOESY图谱分析结果显示，H-5/H-11,H7/Me-14,Me-12以及H-4/H-1α之间存在着耦合关系(图10f，图10g)，可以进一步确定化合物2的相对构型为3R*,4S*,6S*,7R*,10R*。

表2化合物2的NMR数据

化合物3：

¹H NMR数据显示到单线态甲基(Me-12)，3个双峰的甲基信号(Me-13,Me-14,Me-15)(表3和图11a)。¹³C NMR，DEPT135和HSQC光谱证实了化合物2有15个碳原子，其中包括3个sp3杂化的季碳(C-4,C-6,C-10)，3个脂肪族次甲基，5个脂族亚甲基和4个甲基(图11b，图11c)。这些数据显示化合物3的三环骨架。¹H-¹H COSY提示的耦合关系有H-1/H-2,H-4/H-5,H-8/H-7/H13和H-14/H-11/H-15(图11d)。此外，HMBC图谱可以看到甲基氢的相关信号有Me-12与C-2,C-3和C-4；Me-13与C-6,C-7和C-8；Me-14与C-10,C-11和C-15；M-15与C-10C-11和C-14。HMBC光谱表明了H-2与C-10之间，H-5与C-6,C-7和C-10之间，H-7与C-10之间，H-8与C-9,C-10之间的相关性(图11e)。因此，平面结构的化合物3被认定为5-6-3元三环倍半萜烯。NOESY图谱分析结果显示，H-5b/H-11/Me-12/Me-14,H-7/Me-14,Me-13以及H-4之间存在着耦合关系(图11f、11g)，可以进一步确定化合物2的相对构型为3S*,4S*,6S*,7R*,10R*。

表3.化合物3的NMR数据

化合物4：

根据GC-MS保留时间(11.11min)以及碎片离子与标准库对比，化合物4为线性的trans-橙花叔醇(trans-nerolidol)，核磁结果显示¹H NMR(400MHz，chloroform-d)δ5.91(dd,17.3,10.8,1H),5.21(dd,17.3,1.3,1H),5.13(t,5.8,1H),5.10–5.05(m,1H),5.06(dd,10.8,1.3,1H),2.11–2.00(m,4H),1.99–1.95(m,2H),1.67(s,3H),1.59(s,6H),1.58(m,2H),1.27(s,3H)(图12a)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ145.02,135.60,131.46,124.20,124.17,111.66,73.52,42.01,39.69,27.90,26.62,25.70,22.71,17.69,16.01(图12b)。C₁₅H₂₅[M-OH]⁺的m/z理论值为205.1951；m/z(HRMS,ESI)实际值为205.1939。

化合物5：

为菖蒲醇(acorenol)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.45-5.39(m,1H),2.40-2.30(m,1H),2.03-1.90(m,3H),1.89-1.85(m,2H),1.85-1.80(m,1H),1.80-1.70(m,1H),1.67-1.64(m,3H),1.55-1.45(m,2H),1.43-1.35(m,1H),1.26-1.24(m,1H),1.21(s,3H),1.21(s,3H),0.85(d,6.8,3H)(图13a)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ135.24,121.22,73.79,54.77,45.01,41.76,31.53,30.64,30.19,29.08,27.92,27.86,26.11,23.34,14.94(图13b)。该结果与文献报道的菖蒲醇核磁数据一致(Brock et al.,2013,Braun et al.,2003)。

化合物6：

化合物6为(E)-β-法尼烯((E)-β-farnesene)，在GC-MS上的保留时间为9.72min。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.38(dd,17.6,10.8,1H),5.25(dd,17.6,1.1,1H),5.19–5.08(m,2H),5.08–4.98(m,3H),2.28–2.15(m,3H),2.12–1.96(m,5H),1.68(d,1.5,3H),1.60(d,1.5,6H)(图14a)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ146.09,138.97,135.37,131.31,124.32,123.99,115.73,113.04,39.69,31.37,26.69,26.58,25.70,17.69,16.02(图14b)。该结果与Simionatto报道的(E)-β-法尼醇核磁数据一致(Simionatto et al.,2007)。

化合物7：

化合物7为α-没药醇(α-bisabolol)，在GC-MS上的保留时间为12.72min。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.42–5.31(m,1H),5.12(m,1H),1.67(s,3H),1.64(s,3H),1.61(s,3H),1.09(s,3H)(图15a).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ134.10,131.70,124.47,120.45,74.28,42.86,40.03,30.95,26.86,25.66,23.31,23.21,23.14,21.99,17.62(图15b)。该结果与Miyazawa报道的α-没药醇核磁数据一致(Miyazawa et al.,1995)。

化合物8：

¹H NMR数据显示化合物8含有1个单线态甲基(Me-12)，3个双峰的甲基(Me-13,Me-14,Me-15)以及1个烯次甲基(H-2)(表4和图16a)。¹³C NMR和HSQC光谱证实了化合物8含有15个碳原子，其中包括1个sp3杂化的季碳(C-6)，3个sp²杂化的季碳(C-3,C-9,C-10)。2个脂肪族以及2个烯次甲基，4个脂肪族的亚甲基，4个甲基(图16b，图16c)。这些数据显示化合物8含有双环骨架。¹H-1H COSY提示的耦合关系有H-1/H-2,H-4/H-5,H-13/H-7/H-8/H-9和H-14/H-11/H-15(图16d)。此外，HMBC图谱可以看到甲基氢的相关信号有Me-12与C-2,C-3,C-4；Me-13与C-6,C-7,C-8；Me-14与C-10,C-11,C-15；M-15与C-10,C-11,C-14。HMBC光谱表明了H-5与C-1,C-6以及C-7；H-9与C-6以及C-7；H-11与C-9之间有相关性(图16e)。因此，如图16f所示，平面结构的化合物8被认定为5-6元双环倍半萜烯。该结果与Marx等报道的acoradiene结果所一致，我们将其命名为菖蒲二烯J1(acoradiene J1)(Marx and Norman,1975)。

表4化合物8的NMR数据

综上所述，化合物1(保留时间为9.65min)、化合物2(保留时间为11.64min)为新骨架化合物。化合物3(保留时间为11.27min)为化合物2的顺反异构体。对其中的2个化合物通过在GC-MS上与标准品保留时间以及碎片离子峰比对鉴定。其中保留时间为11.11min的化合物4为橙花叔醇(nerolidol)，该化合物被广泛应用于作调味剂和香水生产等行业。同时，该化合物能够增强皮肤对那些经皮肤渗透方式治疗疾病的药物的吸收能力。保留时间为12.23min的化合物5为菖蒲醇(acorenol)，其生物学功能有待于进一步研究开发。化合物6(保留时间为9.72min)为可用作新型航空燃油的法尼烯(farnesene)。化合物7(保留时间为12.72min)为具有抗菌抗炎、抗微生物、治疗牛皮癣等生物学功效的没药醇(bisabolol)，广泛应用于皮肤保护和皮肤护理化妆品生产行业(Kim et al.,2016)。化合物8(保留时间为9.42min)为菖蒲二烯(Acoradiene)，与化合物5具有相似的结构。

将上文所分离得到的化合物1-3做核磁鉴定，最终确定其化学结构如表2中的化合物1-3所示，分别命名为禾谷镰刀二烯(fusariumdiene)，反式-禾谷镰刀醇(trans-fusagramineol)和禾谷镰刀醇(fusagramineol)，对应的基因J1-018-A命名为fusariumdiene synthase(FgFS)。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉臻智生物科技有限公司

<120> 萜类合酶及其应用

<130> PIDC3180372

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 371

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 分离的多肽

<400> 1

Met Pro His Lys His Val Pro Leu Arg Pro Val Lys Leu Thr Phe Asp

1 5 10 15

Pro Val Gly Ser Asn Thr Leu Gly Val Pro Thr Leu Asp Phe Glu Ser

20 25 30

Leu Phe Arg Glu Asp Ser Val Ser Glu Asp Ala Pro Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Pro Glu Asp Met Gly Val Pro Trp Asn Thr Ser Leu Pro Trp Thr Arg

50 55 60

Gln Ser Lys Phe Trp Ala Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Tyr Glu Met Ala

65 70 75 80

Asn Gly Ile Ser Leu Asp Lys Ala Ser Glu Arg Gly Thr Leu Pro Met

85 90 95

Glu Leu Met Asp Glu Arg Arg Lys Trp Lys Ile Asp Glu Leu Val Glu

100 105 110

Asp Ala Ile Ser Cys Cys Ala Tyr Leu Tyr Pro Thr Ser Ser Pro Thr

115 120 125

Arg Leu Ala Leu Leu Thr Gln Ser Val Leu Leu Leu Phe Leu His Asp

130 135 140

Asp Val Ile Glu Arg Gly Ala Thr Gln Asn Glu Thr Thr Val Val Asp

145 150 155 160

Glu Phe Leu Ser Met Ala Pro Lys Asn Arg His Leu Lys Lys Phe Trp

165 170 175

Ser Asp Val Leu Glu Cys Asp Pro Val Leu Gly Pro Asp Leu Leu Tyr

180 185 190

Ala Ile His Ala Phe Val Arg Asp Gly Arg Val Lys Ser Pro Phe Lys

195 200 205

Gln Asp His Tyr Ala Thr Leu Ala Asp Tyr Met Leu Tyr Arg Arg Asn

210 215 220

Asp Val Gly Lys Thr Phe Met Ile Ala Ala Ile Arg Phe Gly Ser Gly

225 230 235 240

Val Gln Gln Thr Arg Glu Glu Leu Ala Pro Phe Asp Glu Leu Ala Asp

245 250 255

Leu Tyr Val Arg His Ser Ile Leu Ile Asn Asp Leu Tyr Ser Tyr Asp

260 265 270

Lys Glu Val His Glu Val Lys Thr Ile Asp Ala Ser Ile Val Asn Ala

275 280 285

Val Ala Val Thr Glu Gln Leu Leu Ser Val Ser Pro Asp Leu Ala Lys

290 295 300

Asn Leu Thr Arg Ala Ile Thr Phe Asp Met Glu Lys Glu Phe Tyr Gly

305 310 315 320

Ile Cys Glu Lys Phe Met His Ser Pro Asp Ile Asn Asp Arg Gln Arg

325 330 335

Val Phe Val Thr Ala Leu Phe Asp Ala Leu Thr Gly Asn Ile Phe His

340 345 350

Ser Ala Thr Leu Ser Arg Tyr Val Arg His Gly Glu Arg Pro Leu Pro

355 360 365

Cys Lys Cys

370

<210> 2

<211> 1116

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 分离的核酸

<400> 2

atgcctcaca agcacgttcc tcttagacca gtcaagttga catttgatcc tgtaggatca 60

aacaccctag gtgtgccaac cttggacttt gagtctctgt tccgggaaga cagcgtctct 120

gaggatgccc ctcttgttat ctacccagag gatatgggtg tcccatggaa cacctctctt 180

ccttggacca gacaatccaa gttctgggct tacgccgagg cagctggata tgaaatggcc 240

aacggaatca gccttgacaa ggcatcagag cgtggcacac tacccatgga gttgatggat 300

gagcgtcgca agtggaagat tgatgagcta gttgaggatg ccatctcttg ctgtgcttat 360

ctttacccta catcatctcc taccagattg gcgttgttga cccagtctgt tctgcttcta 420

ttcctccacg acgatgttat tgagcgagga gctactcaaa acgaaaccac agtggtagac 480

gaatttctta gcatggctcc caagaacagg catcttaaga aattctggtc agacgtattg 540

gaatgtgatc ccgtccttgg acctgatctg ctttatgcta tccatgcttt cgtccgtgat 600

ggtcgtgtaa agtcaccctt taagcaggat cactatgcca cattggctga ttacatgctt 660

taccgtcgca atgatgttgg caagacattt atgattgcag ctatccgctt cggctctggc 720

gtgcaacaaa cacgcgaaga acttgctccc tttgacgagc ttgctgatct ttacgtcaga 780

cactcaattc ttatcaacga tctctactcg tatgataagg aggtgcacga ggtcaagact 840

atcgacgcgt ccatcgtgaa cgcagttgct gtcacagagc agctcctttc cgtgtcgcct 900

gacctggcca agaacttaac cagagctatt acctttgaca tggagaagga gttttacggc 960

atttgtgaga agtttatgca cagccctgat atcaacgatc gccagcgcgt gttcgttact 1020

gcgctctttg atgcgttgac aggcaatatc ttccattctg ctactttgag cagatacgtt 1080

cgtcacggcg agagaccact tccttgcaag tgttag 1116

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P1

<400> 3

atatcatatg cctcacaagc acgttcctc 29

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P2

<400> 4

atatggtgac cgaattccta acacttgcaa ggaagtggtc 40

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P3

<400> 5

cataaatcat aagaaattcg cctaacactt gcaaggaagt gg 42

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P4

<400> 6

gaaaattcaa tataagccac catgcctcac aagcacgttc 40

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P5

<400> 7

gtgaggcatg gtggcttata ttgaattttc aaaaattc 38

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P6

<400> 8

ctgaagccat ggtggctata gttttttctc cttgacg 37

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P7

<400> 9

gagaaaaaac tatagccacc atggcttcag aaaaagaaat tag 43

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P8

<400> 10

gtgacataac taattacatg actatttgct tctcttgtaa ac 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P9

<400> 11

gtttacaaga gaagcaaata gtcatgtaat tagttatgtc ac 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P10

<400> 12

ccacttcctt gcaagtgtta ggcgaatttc ttatgattta tg 42

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P46

<400> 13

gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag cgcggccgct tcaccgattc tgagcgaat 59

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P47

<400> 14

ggcatccgct tacagacaag ctgtgaaaag aaagtggaat attcattcat atcatattt 59

<210> 15

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P48

<400> 15

gaaaaaatat gatatgaatg aatattccac tttcttttca cagcttgtct gtaagcgg 58

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P49

<400> 16

gtgttgataa aaaatgttta tccattggac cgtgtagtac ccaattcgcc ctatagtga 59

<210> 17

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P50

<400> 17

gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtactac acggtccaat ggataaaca 59

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P51

<400> 18

atcgtttgaa agatgggtcc gtcacctgca ttaaatccta atctctgctt ttgtgcgcg 59

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P52

<400> 19

gtacatacat aaacatacgc gcacaaaagc agagattagg atttaatgca ggtgacgga 59

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P53

<400> 20

aaaaaagtaa gaatttttga aaattcaata taaatggttt taaccaataa aacagtcat 59

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P54

<400> 21

aaatgactgt tttattggtt aaaaccattt atattgaatt ttcaaaaatt cttactttt 59

<210> 22

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P55

<400> 22

aaaaaaatct ttgactattc aatcattgcg ctatagtttt ttctccttga cgttaaagt 59

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P56

<400> 23

acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actatagcgc aatgattgaa tagtcaaag 59

<210> 24

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P57

<400> 24

gttgttctga acaaagtaaa aaaaagaagt atacatttga cacttgattt gacacttct 59

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P58

<400> 25

aaagaagtgt caaatcaagt gtcaaatgta tacttctttt ttttactttg ttcagaaca 59

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物P59

<400> 26

agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt gcggccgctt aatgatacgg gagttgccg 59

Claims

1.分离的多肽用于催化萜类的合成或用于制备催化合成萜类的反应的催化剂的用途，

所述分离的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，

所述萜类为选自下列的至少一种，

。

2.一种制备萜类的方法，其特征在于，所述方法是在多肽存在的条件下进行的，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，

所述萜类为选自下列的至少一种，

。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法的底物含有香叶酯焦磷酸、法呢基焦磷酸和香叶基香叶基焦磷酸中的至少一种。