CN110093326A

CN110093326A - 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用

Info

Publication number: CN110093326A
Application number: CN201910369609.9A
Authority: CN
Inventors: 丁少军; 时玥欣; 陈凯翔
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-05-06
Filing date: 2019-05-06
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2039-05-06
Also published as: CN110093326B

Abstract

本发明提供了一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用，该胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的EpLPMOa具有广泛的底物特异性，可氧化作用于纤维素、木葡聚糖等多种底物，对其糖苷键进行C1/C4位氧化切割产生C1和C4混合氧化产物。该酶与木霉纤维素酶协同作用，可分别将木霉纤维素酶在降解磷酸膨涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆等还原糖产量最高提高45％、108％和34％，而对木葡聚糖混合的磷酸膨涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆等还原糖产量最高提高81％，121％，和56％，显示该酶在木质纤维生物炼制中具有重要应用前景。

Description

一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用

技术领域

本发明属于生酶工程领域，尤其是涉及一种胞外AA9家族多糖单加氧酶 EpLPMOa及其应用。

背景技术

由纤维素、半纤维和木质素等多聚物组成的木质纤维是地球上含量最丰富的可再生生物质资源，如何通过生物炼制技术将木质纤维制备为生物基能源和化学品是当今生物技术研究的热点。基于生物法的木质纤维生物炼制主要包括预处理、酶解和发酵等个过程，传统酶解是利用纤维素酶、半纤维素酶等糖苷水解酶将纤维素、半纤维素水解为可发酵的还原糖的过程，但是，由于木质纤维中纤维素分子之间的氢键以及它和其他二种多聚物相互交联组成复杂的网状结构，大大降低了纤维素酶和半纤维素酶的作用效率，导致酶解成本很高，成为限制木质纤维生物炼制工业化应用的关键因素。

AA9家族裂解性多糖单加氧酶(LPMO)是近年来发现的一种以氧化方式降解纤维素、半纤维素等多糖糖苷键的新型辅助蛋白。它和纤维素酶、半纤维素酶等糖苷水解酶存在高效的协同作用，因此添加外源的裂解性多糖单加氧酶可以极大地提高木质纤维的酶解效率。目前，已报道的AA9的来源仍然有限，挖掘新的来源的AA9家族多糖单加氧酶对AA9的研究以及提高木质纤维素的酶解效率有很重要的意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种胞外AA9 家族多糖单加氧酶EpLPMOa，满足降解纤维素和/或木质纤维素的使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的应用。

技术方案：为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

编码所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

所述胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa来自于微细正青霉Eupenicilliumparvum4-14。

用于表达所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的载体或宿主菌。

所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达方法，采用Trichoderma reeseiTrCel61A的信号肽来实现EpPMOa在酵母的高效分泌。

所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达载体的构建方法，步骤如下：

S1：采用Trichoderma reesei TrCel61A的信号肽序列取代pPICZαA中alpha 信号肽序列；

S2：以PMOa_f1/PMOa_r1为引物，以cDNA为模板通过PCR扩增得到目的基因片段，并将该基因克隆到载体pEASY-Blunt中得到pEASY-EpLPMOa；再以pEASY-EpLPMOa为模板和引物PMOa_f2和PMOa_r2，通过PCR扩增N-端和C-端分别含部分TrCel61A的信号肽序列和6xHis标签的EpLPMOa基因片段，割胶纯化，后通过试剂盒Hieff CloneTM One StepCloning Kit，同源重组到 pPICZ-TrS载体中获得表达载体pPICZ-EpLPMOa；

引物PMOa_f1和PMOa_r1序列分别为：

5’-TACCTCCACTGCGAACAACA-3’，

5’-AGCCAGCCAGCTATACATCAT-3’；

引物PMOa_f2和PMOa_r2序列分别为：

5’-TTGCTACTGGTGTTGTGGGACATGGCTACGTCTCCAGCAT-3’，

5’-AGATGAGTTTTTGTtctagaTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGACCGC TATACAGCGC-3’。

步骤S1的具体方法为：含TrCe161A信号肽序列的DNA片段通过互补引物 pTrS_f和pTrS_r退火合成，再用限制性核酸内切酶BstBI和EcoRI酶切，连接到同样经过BstBI和EcoRI酶切pPICZαA载体中获得载体pPICZ-TrS；其中，引物pTrS_f和pTrS_r序列分别为：

5’-cgaaATGATTCAAAAATTGTCTAACTTACTTGTTACTGCTTTGGCAGTTGCTACTGGTGTTGTGGGAg-3’，

5’-aattcTCCCACAACACCAGTAGCAACTGCCAAAGCAGTAACAAGTAAGTTAGACAATTTTTGAATCATtt-3’。

采用构建的表达载体pPICZ-EpLPMOa表达胞外AA9家族多糖单加氧酶 EpPMOa的方法，包括如下步骤：

S1：表达载体pPICZ-EpLPMOa先经限制性核酸内切酶SacI线性化，得到线性酶切产物；

S2：以毕赤酵母KM71H为宿主菌，将步骤S1得到的线性酶切产物转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组毕赤酵母工程菌株 KM71H-pPICZ-EpLPMOa，诱导表达胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa。

所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa在降解纤维素和/或木质纤维素中的应用。

所述的应用，胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa与纤维素酶系协同降解纤维素和/或木质纤维素。

微细正青霉Eupenicillium parvum4-14(保藏号CCTCC M2015404)是由申请人实验室筛选获得的高效木质纤维降解真菌(CN104988077B)，通过转录组分析首次克隆一种新的编码AA9家族多糖单加氧酶的基因(EpLPMOa)，通过其编码的蛋白功能研究，发现它具有氧化降解纤维素和半纤维素的能力，可以显著提高纤维素酶对复杂木质纤维素的酶解效率，因此具有重要研究和应用价值。

有益效果：相对于现有技术，本发明的胞外AA9家族多糖单加氧酶 EpLPMOa及其应用具有以下优势：

1)EpLPMOa与来自里氏木霉的商品纤维素酶协同作用，提高对磷酸润涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆的降解效果，分别可以将商品纤维素酶降解磷酸润涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆的还原糖产量提高45％，27％，22％(对磷酸润涨纤维素)，108％，76％，33％(对滤纸)，18％，34％，31％(对脱木质素麦秆)，当商品纤维素酶的用量为0.1U-0.5U(对磷酸膨涨纤维素)，0.5U-2U(对滤纸)，和1U-3U(对脱木质素麦秆)，表明该酶在生物能源和生物基化学品工业中具有很大的应用潜力和经济效益。

2)EpLPMOa与来自里氏木霉的商品纤维素酶协同作用，还可以提高对被木葡聚糖包裹的磷酸润涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆的降解效果，对应的还原糖产量提高量为81％，36％，20％(对磷酸膨涨纤维素)，121％，60％，35％(对滤纸)，56％，30％，41％(对脱木质素麦秆)。

附图说明

图1是纯化后EpLPMOa蛋白的SDS-PAGE分析结果图；图中，泳道1，纯化后的EpLPMOa；泳道2，Endo Hf对EpLPMOa的去糖基化(70kDa)；M，蛋白marker；

图2是酶解产物的HPAEC-PAD分析结果图；

图3是多糖单加氧酶EpLPMOa水解磷酸润膨涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆得到的还原糖产量分析结果图；

图4是多糖单加氧酶EpLPMOa水解被木葡聚糖包裹的磷酸膨涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆得到的还原糖产量分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：多糖单加氧酶EpLPMOa目的基因的克隆

(1)取约10mg微细正青霉4-14菌株的菌丝孢子混合物接入50mL PDA液体培养基中，37℃、180rpm培养4天。取1mL培养物接入一瓶固态发酵培养基(L.Long，D.Ding，Z.Han，H.Zhao，Q.Lin，S.Ding，Thermotolerant hemicellulolytic and cellulolytic enzymesfrom Eupenicillium parvum4-14display high efficiency upon release of ferulicacid from wheat bran，J.App1.Microbiol.121 (2016)422-434.)中，摇匀后置于37℃、70％湿度条件下静置培养3天。

(2)取白色菌丝体以无菌水漂洗干净后，滤纸吸干水分，液氮速冻后置于 -70℃保存。以TransZolTM Plant试剂盒(TransGen，北京)提取菌体总RNA。

(3)基因克隆：取适量总RNA以EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒(TransGen，北京)和oligo(dT)为引物进行反转录反应获得cDNA。以获得cDNA为模板，以引物PMOa_f1/PMOa_r1进行常规PCR反应，获得目标基因片段。进一步，将目标基因片段克隆到载体 pEASY-Blunt(TransGen，北京)，并由苏州金唯智生物技术有限公司完成序列分析。引物PMOa_f1和PMOa_r1序列分别为：

5’-TACCTCCACTGCGAACAACA-3’，

5’-AGCCAGCCAGCTATACATCAT-3’。

得到含有溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa的基因全长的片段。测序结果显示，该溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa基因全长750bp，DNA序列见SEQ ID NO.1，表达的蛋白(溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa)序列见SEQ ID NO.2，其阅读框包含249个氨基酸，其中前21个氨基酸为信号肽。经蛋白同源性比对发现其属于辅酶AA9家族成员，并属于PMO3型溶解性多糖单加氧酶，成熟蛋白的理论分子量为26.34kDa。

实施例2：溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa的毕赤酵母表达及纯化

(1)分别设计合成溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa的特异性引物PMOa_f2 和PMOa_r2。通过PCR扩增N-端和C-端分别含部分TrCel61A的信号肽序列和 6xHis标签的EpLPMOa基因片段，割胶纯化，后通过试剂盒Hieff CloneTM One Step Cloning Kit(Yeasen，Shanghai，China)，将pPICZ-TrS载体经限制性核酸内切酶EcoRI和XbaI消化，取9μL消化后的产物和1μL的含部分TrCe161A的信号肽序列和6xHis标签的EpLPMOa基因片段与10μL的2xHieff clone Enzyme Premix试剂混合，用枪头上下轻轻吹打几次混匀各组分，该过程避免产生气泡。置50℃反应15min，待反应结束后立即置于冰上冰浴冷却5min，取5μL的连接产物运用热击法转化至top感受态细胞中，利用含有100μg/mL Zeocin (Invitrogen)抗生素的LB平板进行阳性克隆的筛选。用菌落PCR筛选重组质粒的阳性克隆，将筛选到的阳性克隆转化子接入3mL LB和100μg/mL抗生素 Zeocin的试管中37℃，200rpm摇床培养过夜，取1mL送至测序公司测序验证序列正确性。测序比对正确的质粒即为表达载体pPICZ-EpLPMOa。引物 PMOa_f2和PMOa_r2序列分别为：

5’-TTGCTACTGGTGTTGTGGGACATGGCTACGTCTCCAGCAT-3’，

5’-AGATGAGTTTTTGTtctagaTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGACCGC TATACAGCGC-3’。

(2)重组质粒pPICZ-EpLPMOa经限制性内切酶SacI线性化后电击转入 Pichiapastoris KM71H后，利用含有1M山梨醇和100μg/mL Zeocin(Invitrogen) 抗生素的YPD平板进行阳性克隆的筛选。将筛选到的阳性克隆接入装有5mL YPD和100μg/mL抗生素Zeocin的试管中28℃，200rpm摇床培养，20h后将菌液分别转接到50mL BMGY培养液中28℃，200rpm摇床培养至其OD₆₀₀达到6.0后，离心收集菌体，再转接到25mL BMMY培养液中28℃，200rpm摇床培养，每隔24h补加甲醇，甲醇浓度为1.0％(v/v)，连续培养7d后离心收集粗酶液。将粗酶液先装入透析袋中，4℃在pH8.0的磷酸缓冲液中轻微搅拌透析24h。酶液的纯化参照Ni-NTAAgarose(Qiagen)的方法。将纯化得到的蛋白利用SDS-PAGE进行检测。结果如图1所示，可见重组溶解性多糖单加氧酶 EpLPMOa在毕赤酵母中得到了表达，经纯化后为单一条带，分子量接近36kDa。实际分子量大小比理论分子量大，推测是由糖基化引起的。

实施例3：溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa的活性测定方法

溶解单加氧酶的酶活测定按照Kittl等人所述文献(Kittl R，Kracher D，Burgstaller D，Haltrich D，Ludwig R.Production of four Neurospora crassa lyticpolysaccharide monooxygenases in Pichia pastoris monitored by a fluorimetricassay. Biotechnol Biofuels.2012；5：79.)。在30℃下，在96微孔板上操作。将36μg的溶解性多糖单加氧酶与包含作为还原剂的30μM抗坏血酸，50μM Amplex Red (Invitrogen，Eugene，USA)和7.14U/mL辣根过氧化物酶。总体系为200μL。用酶标仪测定560nm下的吸光值，以不同浓度的过氧化氢做标曲线。

蛋白质的浓度采用Bradford法测定。取12.5μL适量稀释的蛋白质溶液，加入345μL Reagent A(Thermo Tech，USA)与4.9μL Reagent B(Thermo Tech，USA)，混合均匀，37℃静置30min后，测定562nm吸光值。

磷酸膨涨纤维素的制备方法：称取微晶纤维素0.2g到50mL离心管中，加入0.6mLdd H₂O搅拌至浆糊状态。加入浓度为83.2％的磷酸溶液10mL，涡旋混匀后冰浴1h。加入冰水10mL并将其搅匀，4℃5000g离心20min，去除含有磷酸的上清液，该过程重复4次。加入0.5mL 2M的Na₂CO₃除去残留的磷酸，接着用45mL冰水对沉淀进行悬浮，离心除去上清。该过程一直重复至pH在 5-7范围内。按照底物浓度需求选择合适体积的缓冲液悬浮沉淀备用。

实施例4：溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa氧化不同底物产物的 HPAEC-PAD分析和MALDI-TOF/TOF分析

(1)酶反应：1％的底物，底物分别为羧甲基纤维素，磷酸膨胀纤维素，木葡聚糖，加入适量的纯化后蛋白，加入抗坏血酸使其终浓度达到1mM，添加CuSO₄至终浓度1mM，用50mM，pH5.0做醋酸钠缓冲溶液定容至200μL，45℃，850rpm 金属震荡仪上反应18h后，100℃加热5min终止反应，12000rpm离心1min收集上清液。以不加1mM抗坏血酸为对照。

(2)HPAEC-PAD分析：HPAEC洗脱速度为0.4mL/min，洗脱条件(流动相)： 0.1mMNaOH+Sodium Acetate，Sodium Acetate浓度变化为：0-140mM(14min)， 140-300mM(8min)，300-400mM(4min)，500mM(3min)。

实施例5：溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa与里氏木霉纤维素酶的协同降解磷酸润涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆。

协同降解磷酸润涨纤维素的实验：0.1-0.5U的商品里氏木霉纤维素酶(Sigma，celluclast 1.5L)，20μg/mLEpLPMOa蛋白，1mM的抗坏血酸，1mM的CuSO₄， 0.02％NaN₃用来抑制微生物污染，并用50mM，pH5.0的醋酸钠缓冲溶液做缓冲溶液，单独或共同作用于1mL1％(w/v)磷酸膨胀纤维素。45℃，200rpm条件下反应24h，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心1min，取上清，用HPLC 分析还原糖产量。结果如图4所示，可见，EpLPMOa的加入，可以将商品纤维素酶水解磷酸膨胀纤维素的还原糖产量分别提高45％，27％，22％。

协同降解滤纸的实验：0.5-2U的商品里氏木霉纤维素酶(Sigma，celluclast1.5L)，20μg/mL EpLPMOa蛋白，1mM的抗坏血酸，1mM的CuSO₄，0.02％NaN₃用来抑制微生物污染，并用50mM，pH5.0的醋酸钠缓冲溶液做缓冲溶液，单独或共同作用于50mg滤纸。45℃，200rpm条件下反应24h，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心1min，取上清，用HPLC分析还原糖产量。结果如图4 所示，可见，EpLPMOa的加入，可以将商品纤维素酶水解滤纸的还原糖产量分别提高108％，76％，33％。

协同降解脱木质素麦秆的实验：1U-3U的商品里氏木霉纤维素酶(Sigma，celluclast 1.5L)，20μg/mL EpLPMOa蛋白，1mM的抗坏血酸，1mM的CuSO₄， 0.02％NaN₃用来抑制微生物污染，并用50mM，pH5.0的醋酸钠缓冲溶液做缓冲溶液，单独或共同作用于50mg脱木质素麦秆。45℃，200rpm条件下反应24h，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心1min，取上清，用HPLC分析还原糖产量。结果如图4所示，可见，EpLPMOa的加入，可以将商品纤维素酶水解滤纸的还原糖产量分别提高56％，30％，41％。

实施例6：溶解性多糖单加氧酶EpLPMOa与里氏木霉纤维素酶的协同降解被木葡聚糖包裹的磷酸润涨纤维素、滤纸和脱木质素麦秆

协同降解被木葡聚糖包裹的磷酸润涨纤维素实验：0.1-0.5U的商品里氏木霉纤维素酶(Sigma，celluclast 1.5L)，20μg/mL EpLPMOa蛋白，1mM的抗坏血酸， 0.5mM的CuSO₄，0.02％NaN₃用来抑制微生物污染，并用50mM，pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液做缓冲溶液，单独或共同作用于被1mL 1％(w/v)木葡聚糖包裹的 1mL 1％(w/v)磷酸膨胀纤维素。45℃，200rpm条件下反应24h，沸水浴加热5min 终止反应，12000rpm离心1min，取上清，用HPLC分析还原糖产量。结果如图 4所示，可见，EpLPMOa的加入，可以将商品纤维素酶水解被木葡聚糖包裹的磷酸膨胀纤维素的还原糖产量分别提高81％，36％，20％。

协同降解被木葡聚糖包裹的滤纸实验：0.1-0.5U的商品里氏木霉纤维素酶(Sigma，celluclast 1.5L)，20μg/mL EpLPMOa蛋白，1mM的抗坏血酸，0.5mM 的CuSO₄，0.02％NaN₃用来抑制微生物污染，并用50mM，pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液做缓冲溶液，单独或共同作用于被1mL 1％(w/v)木葡聚糖包裹的50mg滤纸。45℃，200rpm条件下反应24h，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心 1min，取上清，用HPLC分析还原糖产量。结果如图4所示，可见，EpLPMOa 的加入，可以将商品纤维素酶水解被木葡聚糖包裹的滤纸的还原糖产量分别提高 121％，60％，35％。

协同降解被木葡聚糖包裹的脱木质素麦秆的实验：1U-3U的商品里氏木霉纤维素酶(sigma，celluclast 1.5L)，20μg/mL EpLPMOa蛋白，1mM的抗坏血酸， 0.5mM的CuSO₄，并用50mM，0.02％NaN₃用来抑制微生物污染，pH 5.0的醋酸钠缓冲溶液做缓冲溶液，单独或共同作用于被1mL 1％(w/v)木葡聚糖包裹的 50mg脱木质素麦秆。45℃，200rpm条件下反应24h，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心1min，取上清，用HPLC分析还原糖产量。结果如图4所示，可见，EpLPMOa的加入，可以将商品纤维素酶水解被木葡聚糖包裹的脱木质素麦秆的还原糖产量分别提高56％，30％，41％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用

<130> 100

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> Eupenicillium parvum

<400> 1

atggccttgt cgaagattgc tgccttgtcg acaatcctcg cctcagcctc tctggttgca 60

ggacatggct acgtctccag cattgtagcc aatggccaga actacacggg ctacctggcc 120

gactcctacc cctacatgtc caacccaccc aagagcgtcg gctgggcgac aacagccaca 180

gacctgggct tcgaagacgg caccgaatac gcagacccaa acataatctg ccaccgcaac 240

ggaaccaacg cccaactctc cgcgcctgtg caagcaggct caaaggtcga gatccaatgg 300

acgccctggc ctgactcgca ccacggtccc gtcatcacct acctcgcctc ctgcaacggg 360

gactgcagca ccgtcgacaa gagcacgctt gaattcttca agattgatgc tgttggtctg 420

atcgatgata gttctgttcc cggtacgtgg ggaactgaca agctgattga ggctgggaac 480

cggtggacgg tgacgattcc ggacagcatt gcggcgggga actatgtgat gcggcatgag 540

attattgcgc tgcattctgc gtcgcagaag gatggcgcgc agaattatcc tcagtgcttg 600

aatttgcagg ttaccggtgg tggggagggt gtgccgcagg ggacgttggg ggagaagttg 660

tataaggata ctgatccggg gatcttggtc aatatctata ctactctctc gaactatgtc 720

atccctggac cggcgctgta tagcggttag 750

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> Eupenicillium parvum

<400> 2

Met Ala Leu Ser Lys Ile Ala Ala Leu Ser Thr Ile Leu Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ser Leu Val Ala Gly His Gly Tyr Val Ser Ser Ile Val Ala Asn Gly

20 25 30

Gln Asn Tyr Thr Gly Tyr Leu Ala Asp Ser Tyr Pro Tyr Met Ser Asn

35 40 45

Pro Pro Lys Ser Val Gly Trp Ala Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly Phe

50 55 60

Glu Asp Gly Thr Glu Tyr Ala Asp Pro Asn Ile Ile Cys His Arg Asn

65 70 75 80

Gly Thr Asn Ala Gln Leu Ser Ala Pro Val Gln Ala Gly Ser Lys Val

85 90 95

Glu Ile Gln Trp Thr Pro Trp Pro Asp Ser His His Gly Pro Val Ile

100 105 110

Thr Tyr Leu Ala Ser Cys Asn Gly Asp Cys Ser Thr Val Asp Lys Ser

115 120 125

Thr Leu Glu Phe Phe Lys Ile Asp Ala Val Gly Leu Ile Asp Asp Ser

130 135 140

Ser Val Pro Gly Thr Trp Gly Thr Asp Lys Leu Ile Glu Ala Gly Asn

145 150 155 160

Arg Trp Thr Val Thr Ile Pro Asp Ser Ile Ala Ala Gly Asn Tyr Val

165 170 175

Met Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Ser Gln Lys Asp Gly

180 185 190

Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Leu Asn Leu Gln Val Thr Gly Gly Gly

195 200 205

Glu Gly Val Pro Gln Gly Thr Leu Gly Glu Lys Leu Tyr Lys Asp Thr

210 215 220

Asp Pro Gly Ile Leu Val Asn Ile Tyr Thr Thr Leu Ser Asn Tyr Val

225 230 235 240

Ile Pro Gly Pro Ala Leu Tyr Ser Gly

245

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物PMOa_f1序列(Artificial)

<400> 3

tacctccact gcgaacaaca 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物PMOa_r1序列(Artificial)

<400> 4

agccagccag ctatacatca t 21

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物PMOa_f2序列(Artificial)

<400> 5

ttgctactgg tgttgtggga catggctacg tctccagcat 40

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物PMOa_r2序列(Artificial)

<400> 6

agatgagttt ttgttctaga tcagtgatgg tgatggtgat ggtgaccgct atacagcgc 59

Claims

1.一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa，其特征在于：所述胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa来自于微细正青霉Eupenicillium parvum 4-14。

4.用于表达权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的载体或宿主菌。

5.权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达方法，其特征在于：采用Trichoderma reesei TrCel61A的信号肽来实现EpLPMOa在酵母的高效分泌。

6.权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：

S1：采用Trichoderma reesei TrCel61A的信号肽序列取代pPICZαA中alpha信号肽序列；

S2：以PMOa_f1/PMOa_r1为引物，以cDNA为模板通过PCR扩增得到目的基因片段，并将该基因克隆到载体pEASY-Blunt中得到pEASY-EpLPMOa；再以pEASY-EpLPMOa为模板和引物PMOa_f2和PMOa_r2，通过PCR扩增N-端和C-端分别含部分TrCel61A的信号肽序列和6xHis标签的EpPMOa基因片段，割胶纯化，后通过试剂盒Hieff CloneTM One Step Cloning Kit，同源重组到pPICZ-TrS载体中获得表达载体pPICZ-EpLPMOa；

引物PMOa_f1和PMOa_r1序列分别为：

5’-TACCTCCACTGCGAACAACA-3’

5’-AGCCAGCCAGCTATACATCAT-3’

引物PMOa_f2和PMOa_r2序列分别为：

5’-TTGCTACTGGTGTTGTGGGACATGGCTACGTCTCCAGCAT-3’，

5’-AGATGAGTTTTTGTtctagaTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGACCGCTATACAGCGC-3’。

7.根据权利要求6所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的表达载体的构建方法，其特征在于：步骤S1的具体方法为：含TrCel61A信号肽序列的DNA片段通过互补引物pTrS_f和pTrS_r退火合成，再用限制性核酸内切酶BstBI和EcoRI酶切，连接到同样经过BstBI和EcoRI酶切pPICZαA载体中获得载体pPICZ-TrS；其中，引物pTrS_f和pTrS_r序列分别为：

8.采用权利要求6或7构建的表达载体pPICZ-EpLPMOa表达胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：表达载体pPICZ-EpLPMOa先经限制性核酸内切酶SacI线性化；

S2：通过电转化转入P.pastoris KM71H菌株，诱导表达胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa。

9.权利要求1所述的胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa在降解纤维素和/或木质纤维素中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa与纤维素酶系协同降解纤维素和/或木质纤维素。