CN110092771A - 一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针及其制备方法、荧光试剂盒 - Google Patents

一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针及其制备方法、荧光试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针及其制备方法、荧光试剂盒，所述用于人血清白蛋白检测的荧光探针的结构式为其中，R1，R2，R3独立地选自H、NO2中的一种。本发明的荧光探针结构新颖，其对人血清白蛋白的荧光响应性能高，抗血脂干扰能力强，能够准确测定血清中人血清白蛋白的浓度，具有很好的应用前景。

Description

一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针及其制备方法、荧光 试剂盒
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针及其制备方法、荧光试剂盒。
背景技术
人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是人体血液循环***中重要的蛋白质，它主要在人体的肝脏中进行合成；健康成人的血清中，血清白蛋白的浓度为35～55g/L，占到了血清中总蛋白量的2/3。人血清白蛋白具有重要的生理功能，是体内输运小分子疏水药物，人体新陈代谢产物的主要载体，它还具有维持血液胶体渗透压，作为自由基捕获剂的功能。因此，人血清白蛋白在人体血液中的浓度与人体健康状态密切相关。在临床血液检查中发现，心血管疾病、糖尿病和肾病等患者的早期症状往往是具有异常的人血清白蛋白浓度。因此，发展高特异性测定人血清白蛋白浓度的方法对于心血管疾病等这类严重威胁人类健康疾病的早期诊断和个体化治疗具有重要的意义。
目前，文献上报道的人血清白蛋白的方法包括免疫测定法、表面增强的拉曼散射法、气质联用的蛋白组学法、毛细管电泳法等。这些方法具有很明显的缺陷，例如免疫法需要用到昂贵的抗原抗体试剂，拉曼散射法所用到的信号基底材料制备过程复杂，气质联用的方法样品预处理过程复杂，毛线管电泳法测试结果重现性差。现在临床上常用的人血清白蛋白浓度的测定方法是基于溴甲酚绿的比色法，但是人血清白蛋白和溴甲酚绿形成的复合物稳定性差，并且比色法灵敏度不高。近年来，荧光检测法由于其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快的优势受到了人们的关注，大部分检测人血清白蛋白的荧光探针是基于极性敏感机理而设计，其检测机理是：荧光探针进入人血清白蛋白的疏水空腔，染料分子周围所处环境的极性发生改变，荧光强度增加。但对于血清这一类复杂样品来说，其除了含有人血清白蛋白以外，还含有血脂；血脂中的主要成分是甘油三酯和胆固醇，血脂中还含有脂肪酸等，这些生物小分子也会形成低极性的微区，引发荧光探针的信号响应，从而干扰荧光探针对人血清白蛋白浓度的准确测定。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针及其制备方法、荧光试剂盒，旨在解决现有荧光探针在测定血清中人血清白蛋白浓度时易受血脂干扰的问题。
本发明的技术方案如下：
一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针，其中，所述用于人血清白蛋白检测的荧光探针的结构式为其中，R1，R2，R3独立地选自H、NO2中的一种。
所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针，其中，所述用于人血清白蛋白检测的荧光探针为
一种如上所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其中，包括步骤：
A、将邻羟基苯乙酮、对吗啉苯甲醛以及有机碱溶于有机溶剂，室温搅拌，得到查尔酮；
B、在冰水浴下，将查尔酮和双氧水加入碱性混合液中进行反应2～6h，加入稀盐酸至反应液呈弱酸性，得到荧光探针中间体；
C、在碳酸铯存在的条件下，R1、R2、R3取代的苄基卤与荧光探针中间体在乙腈中80～100℃进行反应，得到荧光探针。
所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其中，步骤A 中，所述有机溶剂是体积比为1:1～10的二氯甲烷与乙醇的混合溶剂；所述有机碱为四氢吡咯、哌啶或4-哌啶基哌啶。
所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其中，步骤B 中，所述碱性混合液是指含有NaOH的乙醇与水的混合溶液，其中，NaOH 的质量浓度为10-20wt％。
所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其中，步骤C 中，所述R1、R2、R3取代的苄基卤为R1、R2、R3取代的苄基氯，R1、R2、 R3取代的苄基溴或R1、R2、R3取代的苄基碘。
所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其中，步骤C 中，所述R1、R2、R3取代的苄基卤、荧光探针中间体、碳酸铯的摩尔比为 1:1:2～10。
一种用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其中，包含荧光探针和溶剂，所述荧光探针为如上所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针。
所述的用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其中，所述荧光探针的质量浓度为0.1～10mM。
所述的用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其中，所述溶剂是体积比为1:99～999的二甲基亚砜和水的混合物。
有益效果：本发明的荧光探针结构新颖，其对人血清白蛋白的荧光响应性能高，抗血脂干扰能力强，能够准确测定血清中人血清白蛋白的浓度，具有很好的应用前景。本发明的荧光探针的制备方法简单，制备条件不不苛刻，适用于实际工业中扩大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例1的荧光探针对HSA的滴定荧光强度变化图。
图2为本发明实施例1的荧光探针对等摩尔浓度的不同生物质的荧光响应对比图。
图3为本发明实施例1的荧光探针对含有不同血脂模拟物的HSA溶液的荧光响应对比图。
具体实施方式
本发明提供一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针及其制备方法、荧光试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针，其中，所述用于人血清白蛋白检测的荧光探针的结构式为其中，R1，R2，R3独立地选自H、NO2中的一种。
进一步，所述用于人血清白蛋白检测的荧光探针为
本发明的荧光探针结构新颖，其对人血清白蛋白的荧光响应性能高，抗血脂干扰能力强，能够准确测定人血清白蛋白的浓度，具有很好的应用前景。
本发明还提供一种如上所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其中，包括步骤：
A、将邻羟基苯乙酮、对吗啉苯甲醛以及有机碱溶于有机溶剂，室温搅拌，得到查尔酮；
B、在冰水浴下，将查尔酮和双氧水加入碱性混合液中进行反应，加入稀盐酸至反应液呈弱酸性，得到荧光探针中间体；
C、在碳酸铯存在的条件下，R1、R2、R3取代的苄基卤与荧光探针中间体在乙腈中80～100℃进行反应，得到荧光探针。
本发明的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备路线为
本发明先通过“酮醛缩合”反应制得查尔酮类化合物，再通过“Algar-Flynn-Oyamada氧化环化反应”制得荧光探针中间体(黄酮类化合物)，最后通过“脱卤化氢”反应制得荧光探针。
本发明的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，具体包括步骤：
A'、将邻羟基苯乙酮、对吗啉苯甲醛以及有机碱溶于有机溶剂，室温搅拌24～96h，经离心、洗涤、干燥，得到查尔酮；
B'、在冰水浴下，将查尔酮和双氧水加入碱性混合液中进行反应2～6h，加入稀盐酸至反应液呈弱酸性，经离心、洗涤、干燥，得到荧光探针中间体；
C'、在碳酸铯存在的条件下，R1、R2、R3取代的苄基卤与荧光探针中间体在乙腈中80～100℃进行反应2～72h，得到荧光探针。
进一步，步骤A'中，所述有机溶剂是体积比为1:1～10的二氯甲烷与乙醇的混合溶剂；所述有机碱为四氢吡咯、哌啶或4-哌啶基哌啶，其中，有机碱用作催化剂；所述洗涤用的溶剂为冰乙醇。
进一步，步骤B'中，所述碱性混合液是指含有NaOH的乙醇与水的混合溶液，其中，NaOH的质量浓度为10-20wt％；所述稀盐酸的质量浓度为 2wt％；所述洗涤用的溶剂为冰的乙醇与水的混合物。
进一步，步骤C'中，所述R1、R2、R3取代的苄基卤为R1、R2、R3取代的苄基氯，R1、R2、R3取代的苄基溴或R1、R2、R3取代的苄基碘；所述 R1、R2、R3取代的苄基卤、荧光探针中间体、碳酸铯的摩尔比为1:1:2～10；所述柱层析用的溶剂为体积比为1:1～10的乙酸乙酯和正已烷的混合物。
本发明的荧光探针的制备方法简单，制备条件不苛刻，适用于实际工业中扩大规模生产。
一种用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其中，包含荧光探针和溶剂，所述荧光探针为如上所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针。
进一步，所述荧光探针的质量浓度为0.1～10mM；所述溶剂是体积比为 1:99～999的二甲基亚砜和水的混合物。
本发明的上述荧光试剂盒可以直接用来测定血清中人血清白蛋白的浓度，不受血清中血脂的干扰，准确度高，使用方便，且便于携带。
下面通过实施例对本发明的用于人血清白蛋白检测的荧光探针、荧光试剂盒的制备方法及其性能进行详细说明。
实施例1
(1)将邻羟基苯乙酮(10mmol)、对吗啉苯甲醛(10mmol)加入反应器中，加入10mL乙醇和2mL二氯甲烷进行溶解，然后加入少量的(例如3滴)四氢吡咯，在室温下反应36h，反应结束后，离心，并用冰乙醇洗涤沉淀，干燥，得到查尔酮：1-(2-羟基苯基)-3-(4-吗啉苯基)丙-2- 烯-1-酮，产率为80％，该查尔酮的结构式为
(2)向上述查尔酮中加入30mL氢氧化钠的水溶液(氢氧化钠的质量浓度为20wt％)，并加入30mL乙醇进行溶解，在冰水浴条件下，向反应体系中加入10mL双氧水(H2O2的质量浓度为30wt％)，反应6h后，加入质量浓度为2wt％的稀盐酸至反应液呈弱酸性，离心，并用冰乙醇的水溶液洗涤沉淀，干燥，得到荧光探针中间体：3-羟基-2-(4-吗啉代)-4H-苯并吡喃-4- 酮，产率为31％，该荧光探针中间体的结构式为
(3)将上述荧光探针中间体(8mmol)、对硝基苄基氯(12mmol)溶解于15mL乙腈中，并加入碳酸铯(30mmol)，升温至80℃反应12h，经浓缩、柱层析(洗脱剂是体积比为8:1的正己烷和乙酸乙酯的混合物)，得到荧光探针：2-(4-吗啉代苯基)-3-((4-硝基苄基)氧基)-4H-苯并吡喃-4- 酮，产率为72％，该荧光探针为深黄色粉末，其结构式为其结构鉴定数据为：1H NMRδ＝8.27(1H),8.16 (2H),8.01(2H),7.67(1H),7.61(2H),7.53(1H),7.40(1H),6.80(2H),5.22 (2H),3.76(4H),3.27(4H).13C NMR(150MHz,CDCl3):174.46,157.24, 155.15,151.45,147.54,144.61,138.41,133.20,130.20,128.83,125.63,124.62, 124.15,123.43,117.87,111.72,72.26,66.37,47.71。
(4)荧光试剂盒的制备及其性能测定：
将该实施例制得的荧光探针以10mM的浓度溶于二甲基亚砜中，再加入去离子水将荧光探针的浓度稀释一千倍至0.01mM。
如图1所示，在415nm的激发光源照射下，随着荧光试剂盒中人血清白蛋白加入量的增加，荧光试剂盒中的荧光探针的荧光强度逐渐增强，最大发射波长位于491nm，表现为蓝绿光。
向10个相同的荧光试剂盒分别加入等摩尔量的不同生物质：谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、二硫苏糖醇、胸腺嘧啶核苷5'-三磷酸钠盐、溶菌酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、酯酶、人血清白蛋白，荧光试剂盒中的荧光探针对含有不同生物质的荧光响应对比结果如图2所示，可知除人血清白蛋白之外，其它荧光试剂盒中的荧光探针的荧光强度几乎没有增强，说明该荧光探针对人血清白蛋白优异的选择性。
向5个相同的荧光试剂盒中分别加入人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)至其浓度均为0.45mg/mL，以其中1个作为对比实验，再向其余4个荧光试剂盒中分别加入等摩尔量的不同血脂模拟物：胆固醇、三油酸甘油酯、棕榈酸、油酸，测得5个荧光试剂盒中的荧光探针的荧光响应对比结果如图3所示，可知与只含有HSA的荧光试剂盒相比，其余4 个含有不同血脂模拟物的荧光试剂盒中的荧光探针的荧光发射强度没有明显变化，说明该荧光探针对血脂的抗干扰能力强。
综上所述，本发明提供的荧光探针结构新颖，其对人血清白蛋白的荧光响应性能高，抗血脂干扰能力强，能够准确测定血清中人血清白蛋白的浓度，具有很好的应用前景。本发明的荧光探针的制备方法简单，制备条件不不苛刻，适用于实际工业中扩大规模生产。本发明的上述荧光试剂盒可以直接用来测定血清中人血清白蛋白的浓度，不受血清中血脂的干扰，准确度高，使用方便，且便于携带。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于人血清白蛋白检测的荧光探针，其特征在于，所述用于人血清白蛋白检测的荧光探针的结构式为其中，R1，R2，R3独立地选自H、NO2中的一种。
2.根据权利要求1所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针，其特征在于，所述用于人血清白蛋白检测的荧光探针为
3.一种如权利要求1或2所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A、将邻羟基苯乙酮、对吗啉苯甲醛以及有机碱溶于有机溶剂，室温搅拌，得到查尔酮；
B、在冰水浴下，将查尔酮和双氧水加入碱性混合液中进行反应，加入稀盐酸至反应液呈弱酸性，得到荧光探针中间体；
C、在碳酸铯存在的条件下，R1、R2、R3取代的苄基卤与荧光探针中间体在乙腈中80～100℃进行反应，得到荧光探针。
4.根据权利要求3所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述有机溶剂是体积比为1:1～10的二氯甲烷与乙醇的混合溶剂；所述有机碱为四氢吡咯、哌啶或4-哌啶基哌啶。
5.根据权利要求3所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述碱性混合液是指含有NaOH的乙醇与水的混合溶液，其中，NaOH的质量浓度为10-20wt％。
6.根据权利要求3所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述R1、R2、R3取代的苄基卤为R1、R2、R3取代的苄基氯，R1、R2、R3取代的苄基溴或R1、R2、R3取代的苄基碘。
7.根据权利要求3所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤C中，所述R1、R2、R3取代的苄基卤、荧光探针中间体、碳酸铯的摩尔比为1:1:2～10。
8.一种用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其特征在于，包含荧光探针和溶剂，所述荧光探针为权利要求1或2所述的用于人血清白蛋白检测的荧光探针。
9.根据权利要求8所述的用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的质量浓度为0.1～10mM。
10.根据权利要求8所述的用于人血清白蛋白检测的荧光试剂盒，其特征在于，所述溶剂是体积比为1:99～999的二甲基亚砜和水的混合物。
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